Różnicowanie ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych w prekursory komórek beta trzustki w systemie hodowli 2D

Ten zoptymalizowany protokół przyczynił się do zwiększenia wytwarzania prekursorów komórek beta trzustki z ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych, które mogą być wykorzystywane w terapii komórkowej cukrzycy i badaniu mechanizmów molekularnych leżących u podstaw biogenezy cukrzycy. Jest to wykonalna technika, ponieważ jest stosowana w kulturach jednowarstwowych 2D. Jest łatwy w aplikacji i jest spójny w wielu liniach kontrolnych i pluripotencjalnych komórkach macierzystych pochodzących od pacjenta.

Te prekursory komórek beta po przeszczepieniu pacjentowi z cukrzycą mogą dojrzeć do komórek beta wydzielających insulinę i mogą potencjalnie odwrócić hiperglikemię. W związku z tym zwiększony odsetek komórek progenitorowych trzustki wygenerowany przy użyciu naszego protokołu może być wykorzystany w terapii komórkowej cukrzycy. Ten ulepszony protokół może być wykorzystany do badania wczesnego rozwoju trzustki u osób zdrowych, a także u pacjentów z cukrzycą, co jest wyzwaniem ze względu na niedobór próbek tkanek.

Gdy ludzkie pluripotencjalne komórki macierzyste lub kolonie hPSC osiągną 70 do 80% konfluencji, umyj je dwukrotnie ciepłym PBS wewnątrz kaptura do hodowli tkankowej. Następnie odessać bufor za pomocą przenośnego aspiratora próżniowego. Następnie dodaj do kolonii pożywkę różnicującą pierwszego etapu zawierającą CHIR-99021 i inkubuj płytkę w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 24 godziny.

Następnego dnia zastąp zużyty nośnik pożywką różnicującą pierwszego etapu bez CHIR-99021. Po zassaniu zużytej pożywki i dwukrotnym umyciu ostatecznych komórek endodermy ciepłym PBS, zakręć płytką, aby usunąć wszelkie resztki komórek. Następnie utrwal komórki, dodając 4% paraformaldehydu i umieść płytkę na dwuwymiarowym shakerze.

Po utrwaleniu przemyć komórki solą fizjologiczną buforowaną TRIS zawierającą 0,5% Tween, a następnie umieścić płytkę na shakerze. Następnie przeniknij utrwalone komórki, dodając dużą ilość PBS zawierającego 0,5% Triton X-100 i umieść płytkę z powrotem na wytrząsarce. Następnie dodać świeżo przygotowany bufor blokujący do przepuszczalnych komórek i inkubować płytkę przez godzinę na shakerze.

Następnie dodaj rozcieńczone przeciwciała pierwszorzędowe do zablokowanych komórek i umieść płytkę na wytrząsarce w temperaturze czterech stopni Celsjusza, delikatnie wstrząsając. Następnego dnia po zasysaniu roztworu przeciwciała pierwszorzędowego przemyć studzienki trzykrotnie TBST przez 10 minut każdy na wytrząsarce. Następnie dodaj przeciwciała drugorzędowe.

Przykryj płytkę folią aluminiową, aby chronić ją przed światłem, i umieść płytkę na wytrząsarce w temperaturze pokojowej na godzinę. Następnie odessać wtórny roztwór przeciwciała i przemyć zabarwione studzienki TBST na wytrząsarce przez 10 minut, trzymając płytkę przykrytą folią. Następnie, aby zabarwić jądra, dodaj roztwór Hoechsta do studzienek i umieść płytkę na wytrząsarce.

Po dwóch do trzech minutach odessać roztwór Hoechsta i dwukrotnie przepłukać studzienki PBS. Na koniec dodaj PBS do wybarwionych komórek i zobrazuj je za pomocą odwróconego mikroskopu fluorescencyjnego w ciemności. W pierwszym dniu drugiego etapu rozdziel komórki endodermy pochodzące z hPSC, najpierw myjąc je ciepłym PBS, a następnie dodając jeden mililitr ciepłego roztworu enzymatycznego na dołek sześciodołkowej płytki.

Umieść płytkę w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla na trzy do pięciu minut lub do momentu, gdy komórki zaczną się od siebie odłączać. Odłącz oderwane arkusze lub monowarstwę komórek w studzienkach i zbierz oderwane komórki razem w 15-mililitrowej probówce polipropylenowej za pomocą pożywki połówkowej w fazie podstawowej. Następnie odwiruj komórki w dół, wyrzuć supernatant i ponownie zawieś osad za pomocą jednego mililitra sterylnego PBS.

Po zliczeniu komórek za pomocą automatycznego licznika, ponownie odkręć komórki i odrzuć supernatant. Następnie ponownie zawiesić osad w odpowiedniej objętości pożywki różnicującej drugiego stopnia zawierającej inhibitor skały. Umieść zawieszone komórki na jednej do 50 płytek pokrytych matrycą membranową i inkubuj je w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla.

Po 24 godzinach zastąp pożywkę pożywką do różnicowania drugiego stopnia bez inhibitora Rock. Pod koniec czwartego etapu odłącz komórki, jak pokazano wcześniej, i zbierz je w 15-mililitrowej probówce. Następnie odwróć komórki, odrzuć supernatant, umyj komórki PBS i zdysocjuj je na pojedyncze komórki.

Po zliczeniu komórek za pomocą automatycznego licznika komórek, ponownie odwiruj komórki i ponownie zawieś granulkę w 200 mikrolitrach schłodzonego PBS. Następnie dodaj kroplami dwa mililitry schłodzonego 80% etanolu za pomocą rurki na wirze ustawionym na niską lub średnią prędkość. Zamknij szczelnie nakrętkę i umieść rurkę lekko przechyloną na wytrząsarce w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez noc.

Następnego dnia odwiruj komórki i umyj osad PBS, aby oddzielić wszelkie grudki utrwalonych komórek. Następnie zablokuj utrwalone komórki na co najmniej godzinę w temperaturze pokojowej lub czterech stopniach Celsjusza przez noc na wytrząsarce. Następnie, aby wybarwić markery progenitorowe trzustki, rozprowadź 200 000 komórek na stan, w tym odpowiednie kontrole izotypowe, niebarwione i drugorzędowe kontrole przeciwciał w 96-dołkowej dolnej płytce.

Następnie krótko obróć płytkę i odwróć płytkę szybkim ruchem, aby odrzucić supernatant bez utraty granulek. Następnie inkubuj komórki w przeciwciałach pierwszorzędowych przez co najmniej dwie godziny w temperaturze pokojowej na wytrząsarce z delikatnym potrząsaniem. Następnie przemyj zabarwione komórki trzykrotnie TBST, pipetując w górę iw dół w studzienkach.

Ponownie odwirować komórki, odrzucić supernatant i dodać do komórek przeciwciała drugorzędowe. Po 30 minutach inkubacji w temperaturze pokojowej przemyć wybarwione komórki dwukrotnie TBST. Następnie obrócić płytkę, zebrać wybarwione komórki w 100 mikrolitrach PBS w lampach faksowych zabezpieczonych światłem i uruchomić próbki na maszynie do cytometrii przepływowej.

W porównaniu z metodą niezoptymalizowaną, zoptymalizowany protokół zwiększył skuteczność różnicowania progenitorów trzustki poprzez regulację w górę koekspresji PDX 1 i NKX 6.1. W szczególności dysocjacja komórek endodermalnych i ich ponowne posiew na świeżej macierzy błonowej, wraz z dłuższym czasem trwania etapu trzeciego, zwiększyła ekspresję NKX 6.1 w progenitorach trzustki pochodzących z hPSC w porównaniu z protokołem niedysocjacyjnym. Komórki progenitorowe trzustki wygenerowane przy użyciu zoptymalizowanego protokołu również zwiększyły liczbę komórek SOX9 dodatnich w porównaniu z metodą niedysocjacyjną.

Co więcej, zoptymalizowana metoda wygenerowała również wyższy odsetek proliferacyjnych komórek dodatnich NKX 6.1, które wykazywały współekspresję markera proliferacji Ki67. W celu zwiększenia skuteczności kluczowe jest dysocjacja endodermy pochodzącej z HbA1, a następnie wydłużenie czasu trwania trzeciego etapu leczenia sygnalizacją amyloidu FGF i hamowaniem Hedgehog. Skalowalne generowanie komórek progenitorowych trzustki przy użyciu tego ulepszonego protokołu ułatwiło badania nad poprawą wydajności i dojrzewania ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych pochodzących z beta trzustki i umożliwiło modelowanie różnych typów cukrzycy.