Name: Różnicowanie ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych w prekursory komórek beta trzustki w systemie hodowli 2D (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-12-16T14:45:00.000+00:00
Duration: 10 min 12 s
Description: Poznaj zoptymalizowaną metodę różnicowania ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych w prekursory komórek beta trzustki w systemie 2D. Technika zwiększa ekspresję PDX1 i NKX6.1, wspierając badania nad terapią komórkową cukrzycy.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca została sfinansowana z grantu z Qatar National Research Fund (QNRF) (Grant No. NPRP10-1221-160041).

<ol><li>Rickels, M. R., Robertson, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pancreatic+islet+transplantation+in+humans%3A+Recent+progress+and+future+directions%5BTitle%5D)+AND+%22Endocrine+Reviews%22%5BJournal%5D)">Pancreatic islet transplantation in humans: Recent progress and future directions.</a> Endocrine Reviews. 40 (2), 631-668 (2019).</li>
<li>Latres, E., Finan, D. A., Greenstein, J. L., Kowalski, A., Kieffer, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Navigating+two+roads+to+glucose+normalization+in+diabetes%3A+Automated+insulin+delivery+devices+and+cell+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Navigating two roads to glucose normalization in diabetes: Automated insulin delivery devices and cell therapy.</a> Cell Metabolism. 29 (3), 545-563 (2019).</li>
<li>Vaithilingam, V., Tuch, B. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Islet+transplantation+and+encapsulation%3A+An+update+on+recent+developments%5BTitle%5D)+AND+%22Review+of+Diabetic+Studies%22%5BJournal%5D)">Islet transplantation and encapsulation: An update on recent developments.</a> Review of Diabetic Studies. 8 (1), 51-67 (2011).</li>
<li>Abdelalim, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modeling+different+types+of+diabetes+using+human+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+and+Molecular+Life+Sciences%22%5BJournal%5D)">Modeling different types of diabetes using human pluripotent stem cells.</a> Cellular and Molecular Life Sciences. 78 (6), 2459-2483 (2021).</li>
<li>Memon, B., Abdelalim, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stem+cell+therapy+for+diabetes%3A+Beta+cells+versus+pancreatic+progenitors%5BTitle%5D)+AND+%22Cells%22%5BJournal%5D)">Stem cell therapy for diabetes: Beta cells versus pancreatic progenitors.</a> Cells. 9 (2), 283(2020).</li>
<li>Balboa, D., Iworima, D. G., Kieffer, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+pluripotent+stem+cells+to+model+islet+defects+in+diabetes%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Endocrinology+%28Lausanne%29%22%5BJournal%5D)">Human pluripotent stem cells to model islet defects in diabetes.</a> Frontiers in Endocrinology (Lausanne). 12, 642152(2021).</li>
<li>Gaertner, B., Carrano, A. C., Sander, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+stem+cell+models%3A+Lessons+for+pancreatic+development+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+%26+Development%22%5BJournal%5D)">Human stem cell models: Lessons for pancreatic development and disease.</a> Genes & Development. 33 (21-22), 1475-1490 (2019).</li>
<li>Abdelalim, E. M., Bonnefond, A., Bennaceur-Griscelli, A., Froguel, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pluripotent+stem+cells+as+a+potential+tool+for+disease+modelling+and+cell+therapy+in+diabetes%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Reviews+and+Reports%22%5BJournal%5D)">Pluripotent stem cells as a potential tool for disease modelling and cell therapy in diabetes.</a> Stem Cell Reviews and Reports. 10 (3), 327-337 (2014).</li>
<li>Rezania, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reversal+of+diabetes+with+insulin-producing+cells+derived+in+vitro+from+human+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Reversal of diabetes with insulin-producing cells derived in vitro from human pluripotent stem cells.</a> Nature Biotechnology. 32 (11), 1121-1133 (2014).</li>
<li>Pagliuca, F. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+functional+human+pancreatic+beta+cells+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Generation of functional human pancreatic beta cells in vitro.</a> Cell. 159 (2), 428-439 (2014).</li>
<li>Nair, G. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recapitulating+endocrine+cell+clustering+in+culture+promotes+maturation+of+human+stem-cell-derived+%CE%B2+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Recapitulating endocrine cell clustering in culture promotes maturation of human stem-cell-derived β cells.</a> Nature Cell Biology. 21 (2), 263-274 (2019).</li>
<li>Russ, H. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Controlled+induction+of+human+pancreatic+progenitors+produces+functional+beta-like+cells+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Journal%22%5BJournal%5D)">Controlled induction of human pancreatic progenitors produces functional beta-like cells in vitro.</a> EMBO Journal. 34 (13), 1759-1772 (2015).</li>
<li>Veres, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Charting+cellular+identity+during+human+in+vitro+%CE%B2-cell+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Charting cellular identity during human in vitro β-cell differentiation.</a> Nature. 569 (7756), 368-373 (2019).</li>
<li>Hrvatin, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differentiated+human+stem+cells+resemble+fetal%2C+not+adult%2C+%CE%B2+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Differentiated human stem cells resemble fetal, not adult, β cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (8), 3038-3043 (2014).</li>
<li>Rezania, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Maturation+of+human+embryonic+stem+cell-derived+pancreatic+progenitors+into+functional+islets+capable+of+treating+pre-existing+diabetes+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Maturation of human embryonic stem cell-derived pancreatic progenitors into functional islets capable of treating pre-existing diabetes in mice.</a> Diabetes. 61 (8), 2016-2029 (2012).</li>
<li>Rezania, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enrichment+of+human+embryonic+stem+cell-derived+NKX6.1-expressing+pancreatic+progenitor+cells+accelerates+the+maturation+of+insulin-secreting+cells+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+Journal%22%5BJournal%5D)">Enrichment of human embryonic stem cell-derived NKX6.1-expressing pancreatic progenitor cells accelerates the maturation of insulin-secreting cells in vivo.</a> Stem Cells Journal. 31 (11), 2432-2442 (2013).</li>
<li>Rezania, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enrichment+of+human+embryonic+stem+cell-derived+NKX6.1-expressing+pancreatic+progenitor+cells+accelerates+the+maturation+of+insulin-secreting+cells+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+Journal%22%5BJournal%5D)">Enrichment of human embryonic stem cell-derived NKX6.1-expressing pancreatic progenitor cells accelerates the maturation of insulin-secreting cells in vivo.</a> Stem Cells Journal. 31 (11), 2432-2442 (2013).</li>
<li>Bruin, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+polyhormonal+insulin-producing+cells+derived+in+vitro+from+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Research%22%5BJournal%5D)">Characterization of polyhormonal insulin-producing cells derived in vitro from human embryonic stem cells.</a> Stem Cell Research. 12 (1), 194-208 (2014).</li>
<li>Toyoda, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+aggregation+optimizes+the+differentiation+of+human+ESCs+and+iPSCs+into+pancreatic+bud-like+progenitor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Research%22%5BJournal%5D)">Cell aggregation optimizes the differentiation of human ESCs and iPSCs into pancreatic bud-like progenitor cells.</a> Stem Cell Research. 14 (2), 185-197 (2015).</li>
<li>Memon, B., Abdelalim, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+efficient+differentiation+of+human+pluripotent+stem+cells+into+pancreatic+progenitors+co-expressing+PDX1+and+NKX6.1%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Highly efficient differentiation of human pluripotent stem cells into pancreatic progenitors co-expressing PDX1 and NKX6.1.</a> Methods in Molecular Biology. , (2020).</li>
<li>Memon, B., Karam, M., Al-Khawaga, S., Abdelalim, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+differentiation+of+human+pluripotent+stem+cells+into+pancreatic+progenitors+co-expressing+PDX1+and+NKX6.1%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Research+%26+Therapy%22%5BJournal%5D)">Enhanced differentiation of human pluripotent stem cells into pancreatic progenitors co-expressing PDX1 and NKX6.1.</a> Stem Cell Research & Therapy. 9 (1), 15(2018).</li>
<li>Aigha, I. I., Memon, B., Elsayed, A. K., Abdelalim, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differentiation+of+human+pluripotent+stem+cells+into+two+distinct+NKX6.1+populations+of+pancreatic+progenitors%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Research+%26+Therapy%22%5BJournal%5D)">Differentiation of human pluripotent stem cells into two distinct NKX6.1 populations of pancreatic progenitors.</a> Stem Cell Research & Therapy. 9 (1), 83(2018).</li>
<li>Ali, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Keratinocytes+derived+from+patient-specific+induced+pluripotent+stem+cells+recapitulate+the+genetic+signature+of+psoriasis+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+and+Development%22%5BJournal%5D)">Keratinocytes derived from patient-specific induced pluripotent stem cells recapitulate the genetic signature of psoriasis disease.</a> Stem Cells and Development. 29 (7), 383-400 (2020).</li>
<li>Elsayed, A. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+a+human+induced+pluripotent+stem+cell+line+%28QBRIi009-A%29+from+a+patient+with+a+heterozygous+deletion+of+FOXA2%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Research%22%5BJournal%5D)">Generation of a human induced pluripotent stem cell line (QBRIi009-A) from a patient with a heterozygous deletion of FOXA2.</a> Stem Cell Research. 42, 101705(2020).</li>
<li>Davenport, C., Diekmann, U., Budde, I., Detering, N., Naujok, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anterior-posterior+patterning+of+definitive+endoderm+generated+from+human+embryonic+stem+cells+depends+on+the+differential+signaling+of+retinoic+acid%2C+Wnt-%2C+and+BMP-signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Anterior-posterior patterning of definitive endoderm generated from human embryonic stem cells depends on the differential signaling of retinoic acid, Wnt-, and BMP-signaling.</a> Stem Cells. 34 (11), 2635-2647 (2016).</li>
<li>Schroeder, I. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+and+selection+of+Sox17-expressing+endoderm+cells+generated+from+murine+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cells+Tissues+Organs%22%5BJournal%5D)">Induction and selection of Sox17-expressing endoderm cells generated from murine embryonic stem cells.</a> Cells Tissues Organs. 195 (6), 507-523 (2012).</li>
<li>Nostro, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+generation+of+NKX6-1%2B+pancreatic+progenitors+from+multiple+human+pluripotent+stem+cell+lines%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Efficient generation of NKX6-1+ pancreatic progenitors from multiple human pluripotent stem cell lines.</a> Stem Cell Reports. 4 (4), 591-604 (2015).</li>
<li>Elsayed, A. K., Younis, I., Ali, G., Hussain, K., Abdelalim, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aberrant+development+of+pancreatic+beta+cells+derived+from+human+iPSCs+with+FOXA2+deficiency%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+%26+Disease%22%5BJournal%5D)">Aberrant development of pancreatic beta cells derived from human iPSCs with FOXA2 deficiency.</a> Cell Death & Disease. 12 (1), 103(2021).</li>
<li>Mfopou, J. K., Chen, B., Mateizel, I., Sermon, K., Bouwens, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Noggin%2C+retinoids%2C+and+fibroblast+growth+factor+regulate+hepatic+or+pancreatic+fate+of+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Noggin, retinoids, and fibroblast growth factor regulate hepatic or pancreatic fate of human embryonic stem cells.</a> Gastroenterology. 138 (7), 1-14 (2010).</li>
<li>Mfopou, J. K., De Groote, V., Xu, X., Heimberg, H., Bouwens, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sonic+hedgehog+and+other+soluble+factors+from+differentiating+embryoid+bodies+inhibit+pancreas+development%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Sonic hedgehog and other soluble factors from differentiating embryoid bodies inhibit pancreas development.</a> Stem Cells. 25 (5), 1156-1165 (2007).</li>
<li>Gattazzo, F., Urciuolo, A., Bonaldo, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+matrix%3A+A+dynamic+microenvironment+for+stem+cell+niche%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta%22%5BJournal%5D)">Extracellular matrix: A dynamic microenvironment for stem cell niche.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1840 (8), 2506-2519 (2014).</li>
<li>Watt, F. M., Huck, W. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+the+extracellular+matrix+in+regulating+stem+cell+fate%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Role of the extracellular matrix in regulating stem cell fate.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 14 (8), 467-473 (2013).</li>
<li>Shih, H. P., Panlasigui, D., Cirulli, V., Sander, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ECM+signaling+regulates+collective+cellular+dynamics+to+control+pancreas+branching+morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">ECM signaling regulates collective cellular dynamics to control pancreas branching morphogenesis.</a> Cell Reports. 14 (2), 169-179 (2016).</li>
<li>Raza, A., Ki, C. S., Lin, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+influence+of+matrix+properties+on+growth+and+morphogenesis+of+human+pancreatic+ductal+epithelial+cells+in+3D%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">The influence of matrix properties on growth and morphogenesis of human pancreatic ductal epithelial cells in 3D.</a> Biomaterials. 34 (21), 5117-5127 (2013).</li>
<li>Lin, H. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fibronectin+and+laminin+promote+differentiation+of+human+mesenchymal+stem+cells+into+insulin+producing+cells+through+activating+Akt+and+ERK%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomedical+Science%22%5BJournal%5D)">Fibronectin and laminin promote differentiation of human mesenchymal stem cells into insulin producing cells through activating Akt and ERK.</a> Journal of Biomedical Science. 17, 56(2010).</li>
<li>Boretti, M. I., Gooch, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+extracellular+matrix+and+3D+morphogenesis+on+islet+hormone+gene+expression+by+Ngn3-infected+mouse+pancreatic+ductal+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Engineering+Part+A%22%5BJournal%5D)">Effect of extracellular matrix and 3D morphogenesis on islet hormone gene expression by Ngn3-infected mouse pancreatic ductal epithelial cells.</a> Tissue Engineering Part A. 14 (12), 1927-1937 (2008).</li>
<li>Boretti, M. I., Gooch, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induced+cell+clustering+enhances+islet+beta+cell+formation+from+human+cultures+enriched+for+pancreatic+ductal+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Engineering%22%5BJournal%5D)">Induced cell clustering enhances islet beta cell formation from human cultures enriched for pancreatic ductal epithelial cells.</a> Tissue Engineering. 12 (4), 939-948 (2006).</li>
<li>Beattie, G. M., Rubin, J. S., Mally, M. I., Otonkoski, T., Hayek, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+proliferation+and+differentiation+of+human+fetal+pancreatic+islet+cells+by+extracellular+matrix%2C+hepatocyte+growth+factor%2C+and+cell-cell+contact%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Regulation of proliferation and differentiation of human fetal pancreatic islet cells by extracellular matrix, hepatocyte growth factor, and cell-cell contact.</a> Diabetes. 45 (9), 1223-1228 (1996).</li>
<li>Gage, B. K., Webber, T. D., Kieffer, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Initial+cell+seeding+density+influences+pancreatic+endocrine+development+during+in+vitro+differentiation+of+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Initial cell seeding density influences pancreatic endocrine development during in vitro differentiation of human embryonic stem cells.</a> PLoS One. 8 (12), 82076(2013).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

W pracy opisano ulepszony protokół generowania komórek progenitorowych trzustki z hPSC o wysokiej koekspresji PDX1 i NKX6.1. Dysocjacja i ponowne powlekanie endodermy pochodzącej z hPSC w połowie gęstości na świeżej matrycy skutkowało wyższymi PDX1 i NKX6.1 w progenitorach trzustki pochodzących z hPSC.
Chociaż koktajl czynników wzrostu dla każdego etapu jest bardzo podobny do P1-ND27, wykazano, że bardziej rozszerzone leczenie etapu 3, w tym sygnalizacja FGF i retinoidó...

Cukrzyca to złożone zaburzenie metaboliczne, które dotyka miliony ludzi na całym świecie. Suplementacja insuliny jest uważana za jedyną opcję leczenia cukrzycy. Bardziej zaawansowane przypadki są leczone terapią zastępczą komórek beta, osiąganą poprzez przeszczepienie całej trzustki zwłok lub wysp trzustkowych1,2. Terapia transplantacyjna wiąże się z kilkoma kwestiami, takimi jak ograniczenie dostępności i jakości tkanki, inwazyjność procedur transplantacyjnych oraz ciągłe zapotrzebowanie na leki immunosupresyjne. Wymaga to odkrycia nowych i alternatywnych opcji terapii zastępczej komórkami beta2,3. Ludzkie pluripotencjalne komórki macierzyste (hPSC) stały się ostatnio obiecującym narzędziem do zrozumienia biologii ludzkiej trzustki oraz niewyczerpującym i potencjalnie bardziej spersonalizowanym źródłem terapii transplantacyjnej4,5,6,7. hPSC, w tym ludzkie embrionalne komórki macierzyste (hESC) i pluripotencjalne komórki macierzyste indukowane przez człowieka (hiPSC), mają wysoką zdolność do samoodnawiania się i dają początek każdemu typowi tkanki ludzkiego ciała. hESC pochodzą z wewnętrznej masy komórkowej zarodka, a hiPSC są przeprogramowywane z dowolnej komórki somatycznej4,8.
Protokoły ukierunkowanego różnicowania są zoptymalizowane do generowania komórek beta trzustki z hPSC, które sekwencyjnie kierują hPSC przez etapy rozwoju trzustki in vitro. Protokoły te generują organoidy wysp trzustkowych pochodzących z hPSC. Chociaż znacznie poprawiły się w zwiększaniu udziału komórek beta trzustki w tym obszarze, skuteczność protokołów jest bardzo zmienna. Nie wzrasta do więcej niż ~40% komórek NKX6.1+/INSULIN+ lub C-PEPTIDE +5,9,10,11,12,13. Jednak wygenerowane komórki beta nie są całkowicie identyczne z dorosłymi ludzkimi komórkami beta pod względem ich profili transkrypcyjnych i metabolicznych oraz odpowiedzi na glukozę4,5,14. Komórki beta pochodzące z hPSC nie mają ekspresji genów kluczowych markerów komórek beta, takich jak PCSK2, PAX6, UCN3, MAFA, G6PC2 i KCNK3 w porównaniu z dorosłymi ludzkimi wyspami wysepkowym5. Ponadto komórki beta pochodzące z hPSC mają zmniejszoną sygnalizację wapnia w odpowiedzi na glukozę. Są one zanieczyszczone współgenerowanymi komórkami polihormonalnymi, które nie wydzielają odpowiednich ilości insuliny w odpowiedzi na wzrost poziomu glukozy5. Z drugiej strony, progenitorzy trzustki pochodzący z hPSC, które są prekursorami wysp trzustkowych, mogą być generowane bardziej efektywnie in vitro w porównaniu z komórkami beta, a po przeszczepieniu in vivo mogą dojrzeć do funkcjonalnych, wydzielających insulinę komórek beta 15,16. Badania kliniczne koncentrują się obecnie na wykazaniu ich bezpieczeństwa i skuteczności po przeszczepieniu u pacjentów z cukrzycą typu 1.
Zauważalnie, ekspresja czynników transkrypcyjnych PDX1 (Homeobox 1 trzustki i dwunastnicy) oraz NKX6.1 (NKX6 Homeobox 1) w tej samej genetyce progenitorowej trzustki jest kluczowa dla zaangażowania w linię komórek beta5. Przodkowie trzustki, którzy nie wykazują ekspresji NKX6.1, powodują powstawanie polihormonalnych komórek endokrynnych lub niefunkcjonalnych komórek beta17,18. Dlatego wysoka koekspresja PDX1 i NKX6.1 w stadium progenitorowym trzustki jest niezbędna do ostatecznego wytworzenia dużej liczby funkcjonalnych komórek beta. Badania wykazały, że ciało zarodka lub hodowla 3D wzmacnia PDX1 i NKX6.1 w progenitorach trzustki, w których agregowane są komórki różnicujące, wahając się między 40%-80% populacji PDX1+/NKX6.1+12,19. Jednak w porównaniu z kulturami zawiesinowymi, kultury różnicujące 2D są bardziej opłacalne, wykonalne i wygodne do stosowania na wielu liniach komórkowych5. Niedawno wykazaliśmy, że kultury różnicowania jednowarstwowego dają ponad 90% współekspresji PDX1+/NKX6.1+ progenitorów trzustki pochodzących z hPSC20,21,22. Opisana metoda nadała wysoką zdolność replikacji wygenerowanym komórkom progenitorowym trzustki i zapobiegła alternatywnym specyfikacjom losu, takim jak linia wątrobowa21. Dlatego w niniejszym dokumencie protokół ten demonstruje wysoce skuteczną metodę różnicowania hPSC do prekursorów komórek beta trzustki współeksprymujących PDX1 i NKX6.1. Metoda ta wykorzystuje technikę dysocjacji endodermy pochodzącej z hPSC i manipulowania gęstością komórek, a następnie rozszerzonej sygnalizacji FGF i retinoidów, a także hamowania Hedgehog w celu promowania koekspresji PDX1 i NKX6.1 (<silna klasa = "xfig" >Figura 1). Metoda ta może ułatwić skalowalne wytwarzanie prekursorów komórek beta trzustki pochodzących z hPSC do terapii transplantacyjnej i modelowania chorób.

<table><tbody><tr><td>15 mL, stożkowe, probówki wirówkowe</td><td>Thermo Scientific</td><td>339651</td><td></td></tr><tr><td>20X TBS Tween 20</td><td>Thermo Scientific</td><td>28360</td><td></td></tr><tr><td>24-dołkowe płytki hodowlane, płaskie dno z pokrywką</td><td>Costar</td><td>3524</td><td></td></tr><tr><td>50 mL, stożkowe, probówki wirówkowe</td><td>Thermo Scientific</td><td>339652</td><td></td></tr><tr><td>6-dołkowe płytki hodowlane, wielotalerzowe</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td></td>140685</tr><tr><td>Technologie komórek macierzystych</td><td>Accutase</td><td>0-7920</td><td></td></tr><tr><td>Activin A</td><td>R& D</td><td>338-AC</td><td>Odtworzony w 4 mM HCl</td></tr><tr><td>przeciwciałie anty NKX6.1, mysi monoklonalny</td><td>DSHB</td><td>F55A12-C</td><td>Rozcieńczony do 1:100 dla cytometrii przepływowej i 1:2000 dla barwienia immunologicznego</td></tr><tr><td>Przeciwciało anty-PDX1, poliklonalne Abcam</td><td></td><td>ab47308</td><td>rozcieńczone do 1:100 dla cytometrii przepływowej i 1:1000 dla barwienia immunologicznego</td></tr><tr><td>B27 minus Vit A</td><td>ThermoFisher</td><td>12587010</td><td></td></tr><tr><td>Albumina surowicy bydlęcej, frakcja szoku cieplnego, bez kwasów tłuszczowych</td><td>Sigma</td><td>A7030</td><td></td></tr><tr><td>CHIR 99021</td><td>Tocris</td><td>4423</td><td>Rozpuszczony w DMSO</td></tr><tr><td>DMEM, wysoka zawartość glukozy</td><td>ThermoFisher</td><td>41965047</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało anty-mysie IgG (H + L) o wysokiej adsorbcji krzyżowej, Alexa Fluor 568</td><td>Invitrogen</td><td>A10037</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało drugorzędowe o wysokiej adsorpcji krzyżowej przeciwko królikowi IgG (H + L) osła, Alexa Fluor 488</td><td></td><td>A-21206</td><td></td></tr><tr><td>DPBS 1X</td><td>ThermoFisher</td><td>14190144</td><td></td></tr><tr><td>EGF</td><td>ThermoFisher</td><td>PHG0313</td><td>Rozpuszczony w 0,1% BSA w PBS</td></tr><tr><td>FGF10</td><td>R& D</td><td>345-FG</td><td>Rozpuszczony w PBS</td></tr><tr><td>Glukoza</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G8644</td><td></td></tr><tr><td>Hoechst 33258</td><td>Sigma</td><td>23491-45-4</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop odwrócony</td><td>Olympus</td><td>IX73</td><td></td></tr><tr><td>KnockOut DMEM/F-12 (1X)</td><td>Gibco</td><td>12660-012</td><td></td></tr><tr><td>Zamiennik surowicy KnockOut SR</td><td>Gibco</td><td>10828-028</td><td></td></tr><tr><td>Kwas L-askorbinowy (witamina C)</td><td>Sigma</td><td>A92902</td><td>Rozpuszczony w wodzie destylowanej</td></tr><tr><td>Matrigel Growth Factor Reduced (GFR) Podstawna membrana Matrix</td><td>Corning</td><td>354230</td><td>Podwielokrotność rozmrożonego bulionu i zamrozić w temperaturze -20C.</td></tr><tr><td>MCDB131</td><td>ThermoFisher</td><td>10372019</td><td></td></tr><tr><td>Mysz anty-SOX17</td><td>ORIGENE</td><td>CF500096</td><td>Rozcieńczony w stosunku 1:100 do cytometrii przepływowej i 1:2000 do barwienia immunologicznego</td></tr><tr><td>mTeSR Plus</td><td>Stem Cell Technologies</td><td>85850</td><td>Wymieszać podłoże podstawowe z suplementem. Podwielokrotność i przechowywać w temperaturze -20 & C przez dłuższy czas lub przy 4 & stopniach; C do natychmiastowego użytku</td></tr><tr><td>Jednostki filtrujące Nalgene, 0,2 i mikro; m PES</td><td>ThermoFisher</td><td>566-0020</td><td></td></tr><tr><td>Nikotynamid</td><td>Sigma</td><td>72340</td><td>Rozpuszczony w wodzie destylowanej</td></tr><tr><td>NOGGIN</td><td>R& D</td><td>6057-NG</td><td>Rozpuszczony w 0,1% BSA w</td></tr><tr><td>PBS Roztwór paraformaldehydu 4% w PBS</td><td>ChemCruz</td><td>sc-281692</td><td></td></tr><tr><td>Penicylina-Streptomycyna (10 000 U/ml)</td><td>ThermoFisher</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>Przenośny aspirator</td><td></td><td></td><td></td>próżniowy</tr><tr><td>Królik anty-FOXA2</td><td>Technologia sygnalizacji komórkowej</td><td>3143</td><td>Rozcieńczony do 1:100 dla cytometrii przepływowej i 1:500 dla cytometrii przepływowej barwienie immunologiczne</td></tr><tr><td>Kwas retinowy</td><td>Sigma Aldrich</td><td>R2625</td><td>Odtworzony w DMSO</td></tr><tr><td>Inhibitor skał (Y-27632)</td><td>ReproCell</td><td>04-0012-02</td><td>Odtworzony w DMSO</td></tr><tr><td>Probówki z polistyrenu okrągłodennego FACS z nakrętkami, STERYLNE</td><td>Stellar Scientific</td><td>FSC-9010</td><td></td></tr><tr><td>SANT-1</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S4572</td><td>Rozpuszczony w DMSO</td></tr><tr><td>Sód wodorowęglan</td><td>Sigma</td><td>S5761-500G</td><td></td></tr><tr><td>StemFlex</td><td>ThermoFisher</td><td>A3349401</td><td>Wymieszaj podłoże podstawowe z suplementem. Podwielokrotność i przechowywać w temperaturze -20 & C przez dłuższy czas lub przy 4 & stopniach; C do natychmiastowego użycia</td></tr><tr><td>Szkiełko do analizy komórkowej TALI</td><td>Invitrogen</td><td>T10794</td><td></td></tr><tr><td>Tali cytometr obrazowy automatyczny licznik komórek</td><td>Invitrogen</td><td>T10796</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma</td><td>9002-93-1</td><td></td></tr><tr><td>TrypLE 100 mL</td><td>ThermoFisher</td><td>12563011</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Sigma</td><td>P2287</td><td></td></tr><tr><td>UltraPure 0,5 M EDTA, pH 8,0</td><td>Invitrogen</td><td>15575-038</td><td></td></tr></tbody></table>

różnicowanie ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych w prekursory komórek beta trzustki w systemie hodowli 2d

Differentiation of Human Pluripotent Stem Cells Into Pancreatic Beta-Cell Precursors in a 2D Culture System

Ludzkie pluripotencjalne komórki macierzyste (hPSC) są doskonałym narzędziem do badania wczesnego rozwoju trzustki i badania genetycznych czynników przyczyniających się do cukrzycy. Komórki wydzielające insulinę pochodzące z hPSC mogą być generowane do terapii komórkowej i modelowania chorób, jednak o ograniczonej wydajności i właściwościach funkcjonalnych. Progenitory trzustkowe pochodzące z hPSC, które są prekursorami komórek beta i innych komórek endokrynnych, gdy jednocześnie wyrażają dwa czynniki transkrypcyjne PDX1 i NKX6.1 określają prekursorów funkcjonalnych, wydzielających insulinę komórek beta zarówno in vitro, jak i in vivo. Progenitory trzustki pochodzące z hPSC są obecnie stosowane w terapii komórkowej u pacjentów z cukrzycą typu 1 w ramach badań klinicznych. Jednak obecne procedury nie generują wysokiego odsetka NKX6.1 i komórek progenitorowych trzustki, co prowadzi do kogeneracji niefunkcjonalnych komórek endokrynnych i niewielu komórek reagujących na glukozę i wydzielających insulinę. W ramach tych prac opracowano ulepszony protokół generowania progenitorów trzustki pochodzących z hPSC, które maksymalizują koekspresję PDX1 i NKX6.1 w monowarstwie 2D. Czynniki takie jak gęstość komórek, dostępność świeżej macierzy i dysocjacja komórek endodermalnych pochodzących z hPSC są modulowane, co zwiększa poziomy PDX1 i NKX6.1 w generowanych progenitorach trzustki i minimalizuje zaangażowanie w alternatywną linię wątroby. Badanie podkreśla, że manipulowanie fizycznym środowiskiem komórki podczas różnicowania in vitro może wpływać na specyfikację linii i ekspresję genów. W związku z tym obecnie zoptymalizowany protokół ułatwia skalowalne generowanie progenitorów koeksprymujących PDX1 i NKX6.1 na potrzeby terapii komórkowej i modelowania chorób.

Wyniki wykazują, że zoptymalizowany protokół P2-D (Rysunek 1A) zwiększył wydajność różnicowania progenitorów trzustki poprzez upregulację koekspresji PDX1 i NKX6.1 (Rysunek 2A,B oraz Rysunek 3A). W szczególności wyniki pokazały, że dysocjacja komórek endodermalnych i ich ponowne wysianie na świeżą macierz błoniastą wraz z wydłużeniem czasu trwania etapu 3 (Stage 3) zwiększyły ekspresję NKX6.1 w progenitorach trzustk...

Obecny protokół opisuje ulepszoną metodę zwiększania koekspresji czynników transkrypcyjnych PDX1 i NKX6.1 w progenitorach trzustki pochodzących z ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych (hPSC) w płaskich monowarstwach. Osiąga się to poprzez uzupełnienie świeżej macierzy, manipulowanie gęstością komórek i dysocjację komórek endodermalnych.

Różnicowanie ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych w prekursory komórek beta trzustki w systemie hodowli 2D

Human pluripotent stem cells (hPSCs) are an excellent tool for studying early pancreatic development and investigating the genetic contributors to ...

Ten zoptymalizowany protokół przyczynił się do zwiększenia wytwarzania prekursorów komórek beta trzustki z ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych, które mogą być wykorzystywane w terapii komórkowej cukrzycy i badaniu mechanizmów molekularnych leżących u podstaw biogenezy cukrzycy. Jest to wykonalna technika, ponieważ jest stosowana w kulturach jednowarstwowych 2D. Jest łatwy w aplikacji i jest spójny w wielu liniach kontrolnych i pluripotencjalnych komórkach macierzystych pochodzących od pacjenta.Te prekursory komórek beta po przeszczepieniu pacjentowi z cukrzycą mogą dojrzeć do komórek beta wydzielających insulinę i mogą potencjalnie odwrócić hiperglikemię. W związku z tym zwiększony odsetek komórek progenitorowych trzustki wygenerowany przy użyciu naszego protokołu może być wykorzystany w terapii komórkowej cukrzycy. Ten ulepszony protokół może być wykorzystany do badania wczesnego rozwoju trzustki u osób zdrowych, a także u pacjentów z cukrzycą, co jest wyzwaniem ze względu na niedobór próbek tkanek.Gdy ludzkie pluripotencjalne komórki macierzyste lub kolonie hPSC osiągną 70 do 80% konfluencji, umyj je dwukrotnie ciepłym PBS wewnątrz kaptura do hodowli tkankowej. Następnie odessać bufor za pomocą przenośnego aspiratora próżniowego. Następnie dodaj do kolonii pożywkę różnicującą pierwszego etapu zawierającą CHIR-99021 i inkubuj płytkę w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 24 godziny.Następnego dnia zastąp zużyty nośnik pożywką różnicującą pierwszego etapu bez CHIR-99021. Po zassaniu zużytej pożywki i dwukrotnym umyciu ostatecznych komórek endodermy ciepłym PBS, zakręć płytką, aby usunąć wszelkie resztki komórek. Następnie utrwal komórki, dodając 4% paraformaldehydu i umieść płytkę na dwuwymiarowym shakerze.Po utrwaleniu przemyć komórki solą fizjologiczną buforowaną TRIS zawierającą 0,5% Tween, a następnie umieścić płytkę na shakerze. Następnie przeniknij utrwalone komórki, dodając dużą ilość PBS zawierającego 0,5% Triton X-100 i umieść płytkę z powrotem na wytrząsarce. Następnie dodać świeżo przygotowany bufor blokujący do przepuszczalnych komórek i inkubować płytkę przez godzinę na shakerze.Następnie dodaj rozcieńczone przeciwciała pierwszorzędowe do zablokowanych komórek i umieść płytkę na wytrząsarce w temperaturze czterech stopni Celsjusza, delikatnie wstrząsając. Następnego dnia po zasysaniu roztworu przeciwciała pierwszorzędowego przemyć studzienki trzykrotnie TBST przez 10 minut każdy na wytrząsarce. Następnie dodaj przeciwciała drugorzędowe.Przykryj płytkę folią aluminiową, aby chronić ją przed światłem, i umieść płytkę na wytrząsarce w temperaturze pokojowej na godzinę. Następnie odessać wtórny roztwór przeciwciała i przemyć zabarwione studzienki TBST na wytrząsarce przez 10 minut, trzymając płytkę przykrytą folią. Następnie, aby zabarwić jądra, dodaj roztwór Hoechsta do studzienek i umieść płytkę na wytrząsarce.Po dwóch do trzech minutach odessać roztwór Hoechsta i dwukrotnie przepłukać studzienki PBS. Na koniec dodaj PBS do wybarwionych komórek i zobrazuj je za pomocą odwróconego mikroskopu fluorescencyjnego w ciemności. W pierwszym dniu drugiego etapu rozdziel komórki endodermy pochodzące z hPSC, najpierw myjąc je ciepłym PBS, a następnie dodając jeden mililitr ciepłego roztworu enzymatycznego na dołek sześciodołkowej płytki.Umieść płytkę w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla na trzy do pięciu minut lub do momentu, gdy komórki zaczną się od siebie odłączać. Odłącz oderwane arkusze lub monowarstwę komórek w studzienkach i zbierz oderwane komórki razem w 15-mililitrowej probówce polipropylenowej za pomocą pożywki połówkowej w fazie podstawowej. Następnie odwiruj komórki w dół, wyrzuć supernatant i ponownie zawieś osad za pomocą jednego mililitra sterylnego PBS.Po zliczeniu komórek za pomocą automatycznego licznika, ponownie odkręć komórki i odrzuć supernatant. Następnie ponownie zawiesić osad w odpowiedniej objętości pożywki różnicującej drugiego stopnia zawierającej inhibitor skały. Umieść zawieszone komórki na jednej do 50 płytek pokrytych matrycą membranową i inkubuj je w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla.Po 24 godzinach zastąp pożywkę pożywką do różnicowania drugiego stopnia bez inhibitora Rock. Pod koniec czwartego etapu odłącz komórki, jak pokazano wcześniej, i zbierz je w 15-mililitrowej probówce. Następnie odwróć komórki, odrzuć supernatant, umyj komórki PBS i zdysocjuj je na pojedyncze komórki.Po zliczeniu komórek za pomocą automatycznego licznika komórek, ponownie odwiruj komórki i ponownie zawieś granulkę w 200 mikrolitrach schłodzonego PBS. Następnie dodaj kroplami dwa mililitry schłodzonego 80% etanolu za pomocą rurki na wirze ustawionym na niską lub średnią prędkość. Zamknij szczelnie nakrętkę i umieść rurkę lekko przechyloną na wytrząsarce w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez noc.Następnego dnia odwiruj komórki i umyj osad PBS, aby oddzielić wszelkie grudki utrwalonych komórek. Następnie zablokuj utrwalone komórki na co najmniej godzinę w temperaturze pokojowej lub czterech stopniach Celsjusza przez noc na wytrząsarce. Następnie, aby wybarwić markery progenitorowe trzustki, rozprowadź 200 000 komórek na stan, w tym odpowiednie kontrole izotypowe, niebarwione i drugorzędowe kontrole przeciwciał w 96-dołkowej dolnej płytce.Następnie krótko obróć płytkę i odwróć płytkę szybkim ruchem, aby odrzucić supernatant bez utraty granulek. Następnie inkubuj komórki w przeciwciałach pierwszorzędowych przez co najmniej dwie godziny w temperaturze pokojowej na wytrząsarce z delikatnym potrząsaniem. Następnie przemyj zabarwione komórki trzykrotnie TBST, pipetując w górę iw dół w studzienkach.Ponownie odwirować komórki, odrzucić supernatant i dodać do komórek przeciwciała drugorzędowe. Po 30 minutach inkubacji w temperaturze pokojowej przemyć wybarwione komórki dwukrotnie TBST. Następnie obrócić płytkę, zebrać wybarwione komórki w 100 mikrolitrach PBS w lampach faksowych zabezpieczonych światłem i uruchomić próbki na maszynie do cytometrii przepływowej.W porównaniu z metodą niezoptymalizowaną, zoptymalizowany protokół zwiększył skuteczność różnicowania progenitorów trzustki poprzez regulację w górę koekspresji PDX 1 i NKX 6.1. W szczególności dysocjacja komórek endodermalnych i ich ponowne posiew na świeżej macierzy błonowej, wraz z dłuższym czasem trwania etapu trzeciego, zwiększyła ekspresję NKX 6.1 w progenitorach trzustki pochodzących z hPSC w porównaniu z protokołem niedysocjacyjnym. Komórki progenitorowe trzustki wygenerowane przy użyciu zoptymalizowanego protokołu również zwiększyły liczbę komórek SOX9 dodatnich w porównaniu z metodą niedysocjacyjną.Co więcej, zoptymalizowana metoda wygenerowała również wyższy odsetek proliferacyjnych komórek dodatnich NKX 6.1, które wykazywały współekspresję markera proliferacji Ki67. W celu zwiększenia skuteczności kluczowe jest dysocjacja endodermy pochodzącej z HbA1, a następnie wydłużenie czasu trwania trzeciego etapu leczenia sygnalizacją amyloidu FGF i hamowaniem Hedgehog. Skalowalne generowanie komórek progenitorowych trzustki przy użyciu tego ulepszonego protokołu ułatwiło badania nad poprawą wydajności i dojrzewania ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych pochodzących z beta trzustki i umożliwiło modelowanie różnych typów cukrzycy.

differentiation-human-pluripotent-stem-cells-into-pancreatic-beta

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia rozwojowa

Niniejsze badanie opisuje metodę ukierunkowanego różnicowania w celu indukowania różnicowania komórek macierzystych zarodkowych człowieka w kierunku trzustkowym. Szczególnie istotnym odkryciem jest fakt, że kokultura z komórkami śródbłonka pośredniczy w dojrzewaniu pochodzących z ludzkich embrionalnych komórek macierzystych progenitorów trzustkowych do komórek wykazujących ekspresję insuliny.

Kowykultura komórek śródbłonka pośredniczy w dojrzewaniu ludzkich embrionalnych komórek macierzystych do insulinotwórczych komórek trzustki w podejściu ukierunkowanego różnicowania

Metoda hodowli trójwymiarowej opisana w tym protokole podsumowuje rozwój trzustki z rozproszonych embrionalnych przodków trzustki myszy, włączając ich znaczną ekspansję, różnicowanie i morfogenezę do rozgałęzionego organu. Ta metoda jest podatna na obrazowanie, funkcjonalną ingerencję i manipulację niszą.

In vitro Organogeneza trzustki z rozproszonych przodków embrionalnych myszy

Tutaj opisujemy metodę oczyszczania zróżnicowanych ludzkich embrionalnych komórek macierzystych, które są zaangażowane w ostateczną endodermę w celu poprawy dalszych zastosowań i dalszego różnicowania.

Szybka i skuteczna metoda oczyszczania komórek endodermy generowanych z ludzkich embrionalnych komórek macierzystych

Tutaj opisujemy 4-etapowy protokół różnicowania ludzkich embrionalnych komórek macierzystych do komórek progenitorowych trzustki NKX6-1+ in vitro. Protokół ten może być stosowany do różnych linii ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych.

Skuteczne różnicowanie pluripotencjalnych komórek macierzystych do progenitorów trzustki NKX6-1+

Opisano protokoły do generowania linii mutantów hPSC za pomocą platformy iCRISPR i różnicowania hPSC na komórki podobne do β reagujące na glukozę. Połączenie technologii edycji genomu z różnicowaniem ukierunkowanym na hPSC stanowi potężną platformę do systematycznej analizy roli determinantów linii w rozwoju człowieka i postępie choroby.

Edycja genomu i ukierunkowane różnicowanie hPSC w celu badania determinantów linii w rozwoju trzustki człowieka

Tutaj prezentujemy szczegółowy protokół różnicowania ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych (hPSC) w komórki białka homeobox 1+ trzustki/dwunastnicy (PDX1+) w celu wytworzenia linii trzustki w oparciu o jednowarstwowy wzrost pojedynczych komórek bez typu kolonijnego. Metoda ta jest odpowiednia do wytwarzania jednorodnych komórek pochodzących z hPSC, manipulacji genetycznych i badań przesiewowych.

Wydajne wytwarzanie białka homeobox trzustki/dwunastnicy 1+ w tylnym odcinku jelita przedniego/trzustki z hPSC w kulturach adhezyjnych

Ten protokół przedstawia porównanie dwóch różnych protokołów indukcji różnicowania ludzkich komórek macierzystych miazgi zębowej (hDPSC) w kierunku linii trzustki in vitro: protokół integracyjny i protokół nieintegracyjny. Protokół integracyjny generuje więcej komórek produkujących insulinę (IPC).

Metody in vitro Indukcja komórek macierzystych ludzkiej miazgi zębowej w kierunku linii trzustki

Różnicowanie komórek macierzystych w komórki wysp trzustkowych stanowi alternatywne rozwiązanie dla konwencjonalnego leczenia cukrzycy i modelowania chorób. Opisujemy szczegółowy protokół hodowli komórek macierzystych, który łączy komercyjny zestaw różnicujący z wcześniej zwalidowaną metodą, aby pomóc w wytwarzaniu wysp trzustkowych wydzielających insulinę pochodzących z komórek macierzystych w naczyniu.

Różnicowanie ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych w klastry wysp trzustkowych wytwarzających insulinę

Ten artykuł przedstawia protokół ukierunkowanego różnicowania i analizy funkcjonalnej komórek podobnych do komórek β. Opisujemy optymalne warunki hodowli i pasażki dla ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych przed wytworzeniem komórek trzustki produkujących insulinę. Sześcioetapowe różnicowanie postępuje od ostatecznego tworzenia endodermy do funkcjonalnych komórek podobnych do komórek β wydzielających insulinę w odpowiedzi na glukozę.

Zoptymalizowany protokół generowania funkcjonalnych komórek wydzielających insulinę trzustkową z ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych

Oferujemy minimalnie inwazyny protokół do domięśniowej transplantacji wyspików komórek macierzystych trzustki pochodzących z ludzkich komórek macierzystych do szczurów immunodeficytarnych w celu in vivo implantacji i dalszej analizy.

Przeszczep domięśniowy ludzkich pluripotentnych komórek macierzystych pochodzenia trzustkowego do szczurów

Poznaj zoptymalizowaną metodę różnicowania ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych w prekursory komórek beta trzustki w systemie 2D. Technika zwiększa ekspresję PDX1 i NKX6.1, wspierając badania nad terapią komórkową cukrzycy.

Różnicowanie ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych w prekursory komórek beta trzustki w systemie hodowli 2D

Przeglądaj więcej filmów