Name: Końcowe pomiary H-refleksu u myszy (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-06-16T12:30:00.000+00:00
Duration: 5 min 38 s
Description: Poznaj terminalny protokół pomiaru H-refleksu u myszy C57 black/6J poprzez bezpośrednią stymulację nerwów przedniej łapy. Ta metoda elektrofizjologiczna zapewnia mniejszą zmienność wyników niż tradycyjne nagrania przezskórne.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy dziękują za wsparcie ze strony T. Akaya z Uniwersytetu Dalhousie podczas wizyty MG w jego laboratorium. Prace te były finansowane przez Fundację Friebe (T0498/28960/16) oraz Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG, Niemiecka Fundacja Badawcza) - Project-ID 431549029 - SFB 1451.

Wszystkie eksperymenty zostały przeprowadzone zgodnie z europejskimi i krajowymi przepisami dotyczącymi opieki nad zwierzętami oraz wytycznymi instytucjonalnymi, i zostały zatwierdzone przez Landesamt für Natur-, Umwelt-, und Verbraucherschutz Nadrenia Północna-Westfalia (Az: 81-02.04.2019.A309). Protokół jest zoptymalizowany dla dorosłych myszy (ok. 8-16 tygodniowe myszy C57Bl/6J) i zapisu kończyn przednich. Można go łatwo dostosować, stymulując odpowiednie nerwy kończyny tylnej i rejestrując mięśnie tylnej łapy (<silna klasa="xfig">Ryc. 1B). Opis elektrod rejestrujących i stymulujących znajduje się w Tabeli Materiałów. Należy pamiętać, że protokół jest używany tylko do pomiaru terminala.
1. Przygotowanie
<ol>
	<li>Zważyć zwierzę i rozpocząć znieczulenie, wstrzykując przez dozownik mieszaninę ketaminy (100 mg/kg) i ksylazyny (10 mg/kg).</li>
	<li>Trzymaj mysz w pudełku grzewczym, aż zostanie osiągnięta tolerancja chirurgiczna. Poczekaj kilka minut, aż mysz się uspokoi, oddech będzie stabilny, a odruchy nie będą miały odruchów. Sprawdź głębokość znieczulenia, mierząc brak reakcji na uszczypnięcie palca.</li>
	<li>Obróć mysz na plecy i umieść ją na poduszce grzewczej (optymalne byłoby ogrzewanie sterowane sprzężeniem zwrotnym za pomocą sondy temperatury doodbytniczej). Przymocuj przednie łapy taśmą. W tym miejscu należy upewnić się, że taśma jest umieszczona w taki sposób, aby elektrody pomiarowe można było łatwo włożyć do przednich łap.</li>
	<li>Włóż sondę doodbytniczą, aby zmierzyć temperaturę zwierzęcia i przymocuj ją taśmą. Nałóż maść do oczu, aby zapobiec wysuszeniu oczu.</li>
</ol>
2. Chirurgia
UWAGA: Stabilny stan znieczulonego zwierzęcia, tj. oddychanie, temperatura i utrata odruchów, powinien być regularnie monitorowany przez cały czas trwania zabiegu. Procedura pomiaru załamka H nerwu bezpośredniego jest pokazana dla nerwu promieniowego/łokciowego/środkowego łapy przedniej łapy (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 3A). Pomiar można również dostosować do tylnej łapy (nerw kulszowy/piszczelowy) z modyfikacjami.
<ol>
	<li>Aby uzyskać lepszy przegląd obszaru operacyjnego, wcześniej usuń włosy za pomocą elektrycznej maszynki do golenia lub nożyczek w osobnym miejscu. Dla bardziej doświadczonych chirurgów jest to tylko opcjonalne. 
	UWAGA: Dezynfekcja nie jest tutaj konieczna, ponieważ jest to eksperyment końcowy. Zwierzę zostanie później poddane eutanazji.</li>
	<li>Podnieś skórę pęsetą i wykonaj nacięcie o długości około 1 cm w skórze wzdłuż osi brzuszno-tylnej przedniej łapy (obszar nad pachą i klatką piersiową) za pomocą cienkich, zaokrąglonych nożyczek.</li>
	<li>Ostrożnie usuń tkankę łączną i odsłoń mięśnie i nerwy pod spodem. Usuń odsłonięty mięsień piersiowy głęboki za pomocą kleszczy, aby uzyskać dostęp do nerwu pośrodkowego (<silna klasa = "xfig">Rysunek 3E,F). Usuń niewielkie ilości krwi i płynu tkankowego z tkankami miękkimi.</li>
	<li>W następnym kroku ostrożnie przetnij pierś lub mięsień pachowy od góry do dołu, aby odsłonić pęczek nerwowy pod spodem. Uwolnij wiązkę nerwową z tkanki łącznej i mięśniowej na długości około 1,5 cm. 
	UWAGA: W tym przypadku należy zachować szczególną ostrożność, aby nie uszkodzić naczyń krwionośnych biegnących równolegle do nerwu pośrodkowego. Podczas przecinania tkanki zawsze przecinaj wzdłuż nerwu, aby uniknąć jego zranienia. Jeśli tak się stanie, usuń wyciekający płyn i krew za pomocą wacika. Mikroskop stereoskopowy nie jest konieczny do całego eksperymentu, jednak może być przydatny do przygotowania nerwów.</li>
	<li>Ostrożnie oddziel nerw łokciowy i pośrodkowy przedniej łapy za pomocą wygiętej szklanej pipety (<silna klasa="xfig">Rysunek 3E). Górny z dwóch nerwów to nerw łokciowy, a dolny to nerw pośrodkowy. 
	UWAGA: Oddzielając nerwy od siebie, upewnij się, że naczynie krwionośne pod spodem nie jest uszkodzone.</li>
</ol>
3. Umiejscowienie elektrod
<ol>
	<li>Ułóż elektrody haka stymulacyjnego równolegle w odległości 0,5-1,0 mm i za pomocą mikromanipulatora umieść podwójny haczyk w bliskiej odległości od nerwu.</li>
	<li>Użyj szklanego haczyka jako narzędzia do podniesienia nerwu łokciowego na elektrody haka stymulacyjnego. Odciągnij elektrodę wraz z nerwem i oddziel ją od innych nerwów o około 1-2 mm za pomocą mikromanipulatora (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 3D, F).</li>
	<li>Umieść elektrody wzdłuż długiej osi łapy, aby zmniejszyć przesłuch między mięśniami. 
	UWAGA: Rozmieszczenie elektrod jest bardzo ważne, ale trudne do standaryzacji ze względu na indywidualną anatomię. Wymaga doświadczonego chirurga, aby prawidłowo umieścić elektrody. Przewody można również przestawiać, jeśli amplituda sygnału jest niezadowalająca.</li>
	<li>Powierzchownie osusz haczyki elektrod przymocowane do nerwu i nałóż wazelinę za pomocą strzykawki, aby zapewnić izolację elektryczną od sąsiedniej tkanki. 
	UWAGA: Należy zachować ostrożność, aby nałożyć wystarczającą ilość wazeliny na elektrodę, a także między dwoma haczykami, aby zapewnić izolację elektryczną i zapobiec wysychaniu nerwów.</li>
</ol>
4. Umiejscowienie elektrod rejestrujących i referencyjnych
<ol>
	<li>Aby zmierzyć odruch H, umieść elektrody EMG domięśniowo w przedniej łapie. Ponadto umieść elektrodę odniesienia podskórnie w kończynie tylnej (np. za pomocą szpilki minutowej), przytrzymywaną przez miniaturowy zacisk krokodylkowy (<silna klasa = "xfig">Rysunek 3B).</li>
	<li>Gdy stymulator jest włączony, obserwuj udaną stymulację jako drobne drgania przedniej łapy. Minimalny prąd stymulacyjny do wywołania fali M i drobnych widocznych drgań w przedniej łapie powinien mieścić się w zakresie 10-50 μA. 
	UWAGA: Jeśli przy 50 μA nie są widoczne drgania, wyreguluj elektrody stymulacyjne i ponownie nałóż wazelinę. Ponadto u myszy nierzadko zdarza się, że fala M pojawia się przy niższej intensywności stymulacji niż fala H5.</li>
</ol>
5. Pomiar
<ol>
	<li>Powtórz stymulację nerwu 15 razy, z których każdy ma impulsy o długości 0,2 ms. Przy przerwach 2 min między zestawami bodźców częstotliwość wzrasta z 0,1, 0,5, 1,0, 2,0 do 5 Hz. 
	UWAGA: Te częstotliwości są niezbędne przy późniejszym obliczaniu RDD. Wszystkie dane EMG są rejestrowane, digitalizowane i analizowane za pomocą oprogramowania, np. oprogramowania Spike2 (CED, wersja 7.19). Największa amplituda fali H spodziewana jest przy 0,1 Hz. Im wyższa częstotliwość, tym mniejsza staje się amplituda fali H spowodowana RDD.</li>
	<li>Po eksperymencie należy złożyć zwierzę w ofierze zgodnie z protokołem instytutu IACUC. W tym eksperfuzji przezsercowej myszy przeprowadzono przy użyciu PBS i 4% PFA w głębokim znieczuleniu.</li>
</ol>

<ol><li>Palmieri, R. M., Ingersoll, C. D., Hoffman, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Hoffmann+reflex%3A+methodologic+considerations+and+applications+for+use+in+sports+medicine+and+athletic+training+research%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Athletic+Training%22%5BJournal%5D)">The Hoffmann reflex: methodologic considerations and applications for use in sports medicine and athletic training research.</a> Journal of Athletic Training. 39 (3), 268-277 (2004).</li>
<li>Henneman, E., Somjen, G., Carpenter, D. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Excitability+and+inhibitibility+of+motoneurons+of+different+sizes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurophysiology%22%5BJournal%5D)">Excitability and inhibitibility of motoneurons of different sizes.</a> Journal of Neurophysiology. 28 (3), 599-620 (1965).</li>
<li>Toda, T., Ishida, K., Kiyama, H., Yamashita, T., Lee, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Down-regulation+of+KCC2+expression+and+phosphorylation+in+motoneurons%2C+and+increases+the+number+of+in+primary+afferent+projections+to+motoneurons+in+mice+with+post-stroke+spasticity%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Down-regulation of KCC2 expression and phosphorylation in motoneurons, and increases the number of in primary afferent projections to motoneurons in mice with post-stroke spasticity.</a> PLoS ONE. 9 (12), 114328(2014).</li>
<li>Lee, S., Toda, T., Kiyama, H., Yamashita, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Weakened+rate-dependent+depression+of+Hoffmann%E2%80%99s+reflex+and+increased+motoneuron+hyperactivity+after+motor+cortical+infarction+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+%26+Disease%22%5BJournal%5D)">Weakened rate-dependent depression of Hoffmann’s reflex and increased motoneuron hyperactivity after motor cortical infarction in mice.</a> Cell Death & Disease. 5 (1), 1007(2014).</li>
<li>Knikou, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+H-reflex+as+a+probe%3A+Pathways+and+pitfalls%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+Methods%22%5BJournal%5D)">The H-reflex as a probe: Pathways and pitfalls.</a> Journal of Neuroscience Methods. 171 (1), 1-12 (2008).</li>
<li>Wieters, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Introduction+to+spasticity+and+related+mouse+models%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Neurology%22%5BJournal%5D)">Introduction to spasticity and related mouse models.</a> Experimental Neurology. 335, 113491(2020).</li>
<li>Pearson, K. G., Acharya, H., Fouad, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+electrode+configuration+for+recording+electromyographic+activity+in+behaving+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+Methods%22%5BJournal%5D)">A new electrode configuration for recording electromyographic activity in behaving mice.</a> Journal of Neuroscience Methods. 148 (1), 36-42 (2005).</li>
<li>Akay, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+measurement+of+muscle+denervation+and+locomotor+behavior+in+individual+wild-type+and+ALS+model+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurophysiology%22%5BJournal%5D)">Long-term measurement of muscle denervation and locomotor behavior in individual wild-type and ALS model mice.</a> Journal of Neurophysiology. 111 (3), 694-703 (2014).</li>
<li>Haghighi, S. S., Green, D. K., Oro, J. J., Drake, R. K., Kracke, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Depressive+effect+of+isoflurane+anesthesia+on+motor+evoked+potentials%5BTitle%5D)+AND+%22Neurosurgery%22%5BJournal%5D)">Depressive effect of isoflurane anesthesia on motor evoked potentials.</a> Neurosurgery. 26 (6), 993(1990).</li>
<li>Chang, H. -Y., Havton, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+effects+of+urethane+and+isoflurane+on+external+urethral+sphincter+electromyography+and+cystometry+in+rats%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology-Renal+Physiology%22%5BJournal%5D)">Differential effects of urethane and isoflurane on external urethral sphincter electromyography and cystometry in rats.</a> American Journal of Physiology-Renal Physiology. 295 (4), 1248-1253 (2008).</li>
<li>Nolan, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Section+4%3A+Nervous+system+%28Br.+J.+Pharmacol%29%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+pharmacology%22%5BJournal%5D)">Section 4: Nervous system (Br. J. Pharmacol).</a> Clinical pharmacology. , 295-310 (2012).</li>
<li>Struck, M. B., Andrutis, K. A., Ramirez, H. E., Battles, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+a+short-term+fast+on+ketamine-xylazine+anesthesia+in+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Association+for+Laboratory+Animal+Science%3A+JAALAS%22%5BJournal%5D)">Effect of a short-term fast on ketamine-xylazine anesthesia in rats.</a> Journal of the American Association for Laboratory Animal Science: JAALAS. 50 (3), 344-348 (2011).</li>
<li>Zandieh, S., Hopf, R., Redl, H., Schlag, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effect+of+ketamine%2Fxylazine+anesthesia+on+sensory+and+motor+evoked+potentials+in+the+rat%5BTitle%5D)+AND+%22Spinal+Cord%22%5BJournal%5D)">The effect of ketamine/xylazine anesthesia on sensory and motor evoked potentials in the rat.</a> Spinal Cord. 41 (1), 16-22 (2003).</li>
</ol>

Autorzy deklarują brak sprzecznych interesów finansowych.

W przeciwieństwie do wcześniej opisanych przezskórnych pomiarów H-odruchu u myszy6, zapewniamy bardziej bezpośredni i specyficzny dla nerwów pomiar. To nowe podejście można zastosować do nerwów kończyn przednich i tylnych (np. nerwu pośrodkowego, łokciowego i promieniowego oraz odpowiednio nerwu piszczelowego i kulszowego), dzięki czemu metoda ta może być stosowana jako narzędzie diagnostyczne do wielu modeli chorób (np. udar, stwardnienie rozsiane, stwardnienie zanikowe boczne, urazowe uszkodzeni...

Odruch Hoffmanna (H-reflex), nazwany na cześć fizjologa Paula Hoffmanna, może być wywołany przez elektryczną stymulację nerwów obwodowych, które przenoszą aksony neuronów czuciowych i ruchowych powstających z tych samych mięśni i prowadzących do nich. Jest to elektrycznie indukowany analog monosynaptycznego odruchu rozciągania i ma tę samą ścieżkę1. W przeciwieństwie do rozciągania mięśni, odruch H wynika ze stymulacji elektrycznej. Gdy nerwy obwodowe są stymulowane elektrycznie przy niskim natężeniu prądu, włókna doprowadzające Ia są zwykle najpierw depolaryzowane ze względu na ich dużą średnicę aksonów2. Ich potencjały czynnościowe pobudzają neurony ruchowe alfa (αMN) w rdzeniu kręgowym, które z kolei wywołują potencjały czynnościowe, które przemieszczają się w dół aksonów αMN w kierunku mięśnia (<silna klasa = "xfig">Rysunek 1). Kaskada ta generuje odpowiedź mięśniową o małej amplitudzie, odzwierciedloną w tzw. fali H. Poprzez stopniowe zwiększanie intensywności bodźca, amplituda fali H wzrasta ze względu na rekrutację dodatkowych jednostek motorycznych. Z pewnej intensywności bodźca potencjały czynnościowe w cieńszych aksonach αMN są wywoływane bezpośrednio, co jest rejestrowane jako fala M. Ta fala M pojawia się z krótszym opóźnieniem niż fala H (<silna klasa="xfig">Rysunek 2). Jeśli intensywność stymulacji jest dalej zwiększana, amplituda fali M staje się większa ze względu na rekrutację większej liczby aksonów αMN, podczas gdy fala H stopniowo staje się mniejsza. Załamek H może być tłumiony przy dużej intensywności bodźca ze względu na antydromiczną wsteczną propagację potencjałów czynnościowych w aksonach αMN. Te wyzwolone potencjały czynnościowe zderzają się z tymi ze stymulacji Ia i mogą się w ten sposób wzajemnie znosić. Przy supramaksymalnej intensywności bodźca potencjały czynnościowe ortodromiczne (w kierunku mięśnia) i antydromiczne (w kierunku rdzenia kręgowego) występują we wszystkich aksonach MN; pierwszy z nich powoduje powstanie maksymalnej amplitudy fali M (Mmax), podczas gdy drugi powoduje całkowite zniesienie H-reflex3.
Do oceny spastyczności po udarze (PSS) lub uszkodzenia rdzenia kręgowego (SCI), odruch H został wykorzystany do oceny neuronalnych podstaw ruchu i spastyczności u ludzi1. Lepsza kwantyfikacja zmiany w odruchu H między pomiarami i między badanymi jest osiągana dzięki zastosowaniu stosunku fali H i M (stosunek H/M). Alternatywnie, depresja zależna od szybkości (RDD) jest mierzona za pomocą zestawu rosnących częstotliwości (np. 0,1, 0,5, 1,0, 2,0 i 5,0 Hz). RDD odzwierciedla integralność obwodów hamujących, które mogą być zakłócone przez udar lub SCI. Gdy wszystkie obwody nerwowe są nienaruszone, następuje jednolite, niezależne od częstotliwości tłumienie odruchu H. Jeśli jednak w wyniku udaru lub SCI dochodzi do zmniejszenia hamowania neuronalnego, tłumienie odruchu H zmniejsza się wraz ze wzrostem częstotliwości stymulacji4.
Prawidłowy zapis elektrofizjologiczny przy użyciu elektrod powierzchniowych może być trudny i może być uzależniony od zadań motorycznych, mechanizmów hamujących i pobudliwości αMN5. W zapisie przezskórnym u gryzoni elektrodę bodźcową umieszcza się w pobliżu nerwu piszczelowego, a elektrodę rejestrującą umieszcza się w pobliżu powiązanych mięśni łapy przedniej. Z naszego doświadczenia wynika jednak, że prawidłowe ułożenie elektrod przezskórnych (<klasa silna = "xfig" >Rysunek 1A) jest jeszcze bardziej złożone i zmienne u gryzoni niż umieszczenie elektrod powierzchniowych u ludzi. Może to prowadzić do różnic w długości, częstotliwości i intensywności stymulacji niezbędnej do wywołania odruchu H. Te wyzwania metodologiczne mogą wyjaśniać, dlaczego istnieje tylko bardzo ograniczona liczba badań pomiaru H-refleksu (np. w eksperymentalnych modelach udarów3,4 i innych modelach spastyczności6. Precyzyjną (długotrwałą) stymulację i rejestrację odruchu H na poszczególnych nerwach można w zasadzie osiągnąć za pomocą wszczepialnych elektrod otaczających nerw docelowy7,8. Ze względu na trudną operację z potencjalnymi skutkami ubocznymi dla zwierzęcia i potencjalną niestabilnością sondy, podejście to nie stało się standardem w tej dziedzinie. Przedstawiona tutaj metoda wymaga również pewnej wiedzy chirurgicznej. Pozwala jednak na nowatorską, precyzyjną stymulację i rejestrację izolowanych nerwów in vivo przy użyciu niskich intensywności stymulacji, co pozwala uniknąć jednoczesnej stymulacji sąsiednich nerwów.

<table><tbody><tr><td>Chłonny podkład</td><td>Konwerter VWR</td><td>115-0684</td><td></td></tr><tr><td>AD</td><td>Cambridge Electronic Design, Wielka Brytania</td><td>CED 1401mikro</td><td></td></tr><tr><td>Warsztat wzmacniaczy</td><td>Instytut Zoologiczny, UoC-Warsztaty</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>stymulatorów cyfrowych</td><td>Instytut Zoologiczny, UoC</td><td>MS 501</td><td></td></tr><tr><td>Elektrody EMG</td><td>Warsztat Instytut Zoologiczny, UoC</td><td></td><td>Dwa skręcone, izolowane druty miedziane (50 &micro; m średnicy zewnętrznej) zostały przylutowane do męskiej wtyczki i podłączone do wzmacniacza różnicowego.</td></tr><tr><td>Maść do oczu</td><td>Bayer</td><td>Bepanthen</td><td></td></tr><tr><td>Szklana pipeta</td><td>Warsztat Instytut Zoologiczny, UoC-Przygotuj</td><td></td> <td>szklaną pipetę wygiętą w prosty szklany haczyk w płomieniu palnika Bunsena.</td></tr><tr><td>Skrzynka grzewcza</td><td>MediHeat</td><td>MediHeat V1200</td><td></td></tr><tr><td>Poduszka grzewcza</td><td>WPI</td><td>61840 Poduszka</td><td></td>grzewcza</tr><tr><td>Elektrody hakowe</td><td>Warsztat Instytut Zoologiczny, UoC-Aby</td><td></td> <td>wyprodukować elektrody, zegnij miniaturowe kołki ze stali nierdzewnej w haczyki na jednym końcu i włóż do kaniul, aby uzyskać bezpośredni kontakt mechaniczny. końcówkę kaniuli do przewodów miedzianych (długość ok. 50 cm), które są podłączone do urządzenia stymulującego lub nagrywającego.</td></tr><tr><td>Ketamina</td><td>Pfizer</td><td>Ketavet</td><td></td></tr><tr><td>Sonda doodbytnicza</td><td>WPI</td><td>RET-3</td><td></td></tr><tr><td>Jednostka izolacyjna stymulatora</td><td>Warsztat Instytut Zoologiczny, UoC</td><td>MI 401</td><td></td></tr><tr><td>Sterylizator</td><td>CellPoint Scientific</td><td>Germinator 500</td><td>Rutynowa przed- i pooperacyjna dezynfekcja sprzętu chirurgicznego powinna odbywać się poprzez sterylizację termiczną. Odkażaj narzędzia przez 15 s w podgrzewanej kąpieli z kulkami szklanymi (260&deg; C).</td></tr><tr><td>Regulator temperatury</td><td>WPI</td><td>ATC200</td><td></td></tr><tr><td>Wazelina</td><td></td><td></td> Bayer-Xylazine <td></td></tr><tr><td></td><td>Bayer</td><td>Rompun</td><td></td></tr></tbody></table>

końcowe pomiary h-refleksu u myszy

Terminal H-reflex Measurements in Mice

Odruch Hoffmanna (H-odruch), jako elektryczny analog do odruchu rozciągania, umożliwia elektrofizjologiczną walidację integralności obwodów nerwowych po urazach takich jak uszkodzenie rdzenia kręgowego lub udar. Wzrost odpowiedzi H-odruchowej, wraz z objawami, takimi jak niedobrowolne skurcze mięśni, patologicznie zwiększony odruch rozciągania i hipertonia w odpowiednim mięśniu, jest wskaźnikiem spastyczności po udarze (PSS).
W przeciwieństwie do raczej niespecyficznych dla nerwów pomiarów przezskórnych, tutaj prezentujemy protokół do ilościowego określenia odruchu H bezpośrednio na nerwie łokciowym i pośrodkowym przedniej łapy, który ma zastosowanie, z niewielkimi modyfikacjami, do nerwu piszczelowego i kulszowego tylnej łapy. Opierając się na bezpośredniej stymulacji i adaptacji do różnych nerwów, metoda stanowi niezawodne i wszechstronne narzędzie do walidacji zmian elektrofizjologicznych w modelach chorób związanych ze spastycznością.

Z n = 15 prób stymulacji na każdą częstotliwość stymulacji i łapę, wybierz co najmniej n = 10 udanych rejestracji do analizy. Próby z błędami pomiarowymi (np. brak fali M) są wykluczane z analizy. Analizuj każdą próbę oddzielnie, a następnie wylicz średnią do późniejszych porównań grupowych/czasowych. Dla każdej próby rejestruje się opóźnienie między stymulacją a pojawieniem się fali M i fali H. Z naszego doświadczenia wynika, że fala M pojawia się około 2 ms po stymulacji, a fala H po 6-8 ms, ze względu na dłuższy czas ...

Kliniczna ocena spastyczności oparta na odruchu Hoffmanna (H-odruch) i wykorzystująca elektryczną stymulację nerwów obwodowych jest uznaną metodą. W tym miejscu przedstawiamy protokół końcowej i bezpośredniej stymulacji nerwów w celu ilościowego określenia odruchu H w przedniej łapie myszy.

Końcowe pomiary H-refleksu u myszy

The Hoffmann reflex (H-reflex), as an electrical analog to the stretch reflex, allows electrophysiological validation of the integrity of neural circuits ...

H-odruch umożliwia elektrofizjologiczną walidację integralności obwodów nerwowych. Przedstawiamy protokół końcowy do ilościowego określenia odruchu H bezpośrednio na nerwach przedniej łapy u myszy. W przeciwieństwie do konwencjonalnych, raczej niespecyficznych dla nerwów nagrań przezskórnych, wyniki są mniej zmienne między myszami a dniami pomiaru.Podobnie jak w przypadku zapisów H-odruchu u pacjentów, ponieważ precyzyjna kwantyfikacja umożliwia elektrofizjologiczną charakterystykę w modelach choroby, np. urazu rdzenia kręgowego i udaru. Protokół wymaga solidnych umiejętności eksperymentalnych w pracy ze sprzętem chirurgicznym u myszy.Jeśli nie masz pewności, jak oddzielić nerwy od tkanki łącznej i naczyń krwionośnych, najpierw poćwicz. Procedurę zademonstruje Frederique Wieters, doktorantka z mojego laboratorium. Na początek umieść znieczuloną dorosłą, znieczuloną 8-16-tygodniową mysz C57 black/6J na zakrytej poduszce grzewczej i poczekaj, aż mysz się uspokoi, oddech będzie stabilny, a odruchy nie będą miały odruchów.Obróć mysz na plecy. Następnie przymocuj przednie łapy taśmą. Ustaw taśmę tak, aby elektrody pomiarowe można było łatwo włożyć do przednich łap.Aby zmierzyć temperaturę myszy, włóż sondę doodbytniczą i przymocuj ją taśmą. Nałóż maść do oczu, aby zapobiec wysuszeniu oczu. Ostrożnie usuń sierść cienkimi, zaokrąglonymi nożyczkami, jednocześnie podnosząc skórę pęsetą.Następnie wykonaj jednocentymetrowe nacięcie w skórze wzdłuż brzuszno-tylnej osi przedniej łapy za pomocą cienkich, zaokrąglonych nożyczek. Ostrożnie usuń tkankę łączną i odsłoń znajdujące się pod spodem mięśnie i nerwy. Następnie usuń odsłonięty mięsień piersiowy głęboki za pomocą kleszczy, aby ocenić nerw pośrodkowy.Usuń niewielkie ilości krwi i płynu tkankowego za pomocą miękkiej bibuły. Następnie ostrożnie przetnij pierś lub mięsień pachowy od góry do dołu, aby odsłonić pęczek nerwowy. Uwolnij wiązkę nerwową z tkanki łącznej i mięśniowej na długości około 1,5 centymetra.Ostrożnie oddziel nerw łokciowy i pośrodkowy przedniej łapy za pomocą wygiętej szklanej pipety. Nerw górny to nerw łokciowy, a dolny to nerw pośrodkowy. Ułóż elektrody haka stymulatora równolegle w odległości od 0,5 do jednego milimetra i za pomocą mikromanipulatora umieść podwójny haczyk blisko nerwu.Użyj szklanego haczyka, aby podnieść nerw łokciowy na elektrody haka stymulacyjnego. Następnie odciągnij elektrodę z nerwem i oddziel ją od innych nerwów. Umieść elektrody wzdłuż długiej osi łapy, aby zmniejszyć przesłuch między mięśniami.Powierzchownie osusz haczyki elektrod przymocowane do nerwu i nałóż wazelinę za pomocą strzykawki, aby zapewnić izolację elektryczną od sąsiedniej tkanki. Aby zmierzyć odruch H, umieść elektrody elektromiografii domięśniowo w przedniej łapie. Następnie umieść elektrodę referencyjną podskórnie w kończynie tylnej, przytrzymywaną przez miniaturowy zacisk krokodylkowy.Gdy stymulator jest włączony, obserwuj udaną stymulację jako drobne drgania przedniej łapy. Minimalny prąd stymulacyjny do wywołania fali M i drobnych widocznych drgań w przedniej łapie wynosi od 10 do 50 mikroamperów. Wykonaj stymulację nerwów 15 razy z impulsami o długości 0,2 milisekundy każdy.Przy dwuminutowych przerwach między zestawami bodźców częstotliwość zwiększa się z 0,1, 0,5, 1,0, 2,0 do 5 herców. Ilustracja zapisu ustawionego w ścieżkach do pomiaru odruchu Hoffmana i reakcji mięśni jest pokazana tutaj. Oceniono stosunek amplitudy fali H i M.Bodziec i odpowiedni artefakt stymulacji zostały ustawione na zero milisekund, po których nastąpiła bezpośrednia fala M i następujący po niej mniejszy szczyt reprezentujący falę H. Załamek M występuje około dwóch milisekund po stymulacji, a załamek H po sześciu do ośmiu milisekundach ze względu na dłuższy czas przejścia przez rdzeń kręgowy. Oprócz oddzielenia nerwów, kluczowe znaczenie ma nałożenie wazeliny na elektrodę, a także między dwoma haczykami.To jest eksperyment terminalny. W naszym laboratorium technika ta zapewniła nowy złoty standard odniesienia dla przezskórnych nagrań H-reflex.

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Niniejszy artykuł przedstawia protokół testów w labiryncie T z wykorzystaniem zmodyfikowanego zautomatyzowanego aparatu do oceny funkcji uczenia się i pamięci u myszy.

Zadania wymuszonej alternacji w labiryncie T oraz dyskryminacji lewo-prawo w celu oceny pamięci operacyjnej i referencyjnej u myszy

Ten film demonstruje technikę in vivo pomiaru złożonego potencjału czynnościowego mięśni (CMAP) u myszy. Przedstawiono w nim kroki ustawiania elektrod, stymulacji neuronów kończyn przednich, które unerwiają włókna mięśniowe, oraz rejestrowania reakcji mięśni. Technika ta ocenia demielinizację neuronów i funkcjonalną utratę neuronów.

Pomiar złożonych potencjałów czynnościowych mięśni w mięśniach kończyn przednich myszy in vivo

Ten film demonstruje procedurę rejestrowania złożonego potencjału czynnościowego mięśni (CMAP) u szczurów poprzez zastosowanie bodźców elektrycznych do nerwu łokciowego, dostosowanie elektrod do optymalnego sygnału i zwiększenie stymulacji w celu oceny funkcjonalności nerwu. Metoda ta umożliwia badanie in vivo funkcji nerwów obwodowych w zaburzeniach neurologicznych.

Pomiar in vivo złożonego potencjału czynnościowego mięśni u szczura

Elektroniczne pomiary von Freya są skuteczną i ulepszoną alternatywą dla klasycznych filamentów von Freya, ponieważ pozwalają na szybki i precyzyjny pomiar zmian w progach mechanicznego wycofywania gryzoni do stale stosowanych bodźców ciśnieniowych przed i po zdarzeniu zapalnym.

Pomiar zmian wrażliwości dotykowej w tylnej łapie myszy za pomocą elektronicznego aparatu von Freya

Prezentujemy udoskonalone protokoły, które pozwalają na monitorowanie in vivo funkcji jednostki motorycznej u myszy. Opisano techniki pomiaru złożonego potencjału czynnościowego mięśni (CMAP) i szacowania liczby jednostek motorycznych (MUNE) w mięśniach kończyn tylnych myszy unerwionych przez nerw kulszowy.

Elektrofizjologiczne oszacowanie liczby jednostek motorycznych (MUNE) mierzące złożony potencjał czynnościowy mięśni (CMAP) w mięśniach kończyn tylnych myszy

Ten artykuł opisuje, jak wstrzyknąć wektory wirusowe do kory czołowej myszy w celu przetestowania testów behawioralnych, które wymagają tworzenia heteromerycznego GPCR.

Ekspresja transgenu za pośrednictwem HSV konstruktów chimerycznych w celu zbadania funkcji behawioralnej heteromerów GPCR u myszy

To badanie ustanawia eksperymentalny model czystej neuropatii małych włókien z resiniferatoksyną (RTX). Unikalna dawka RTX (50 μg/kg) jest optymalna do opracowania modelu neuropatii małowłóknistych, który naśladuje charakterystykę pacjenta i może pomóc w zbadaniu nocyceptywnego znaczenia molekularnego leżącego u podstaw bólu neuropatycznego.

Ustalenie mysiego modelu czystej neuropatii drobnowłóknistej z ultrasilnym agonistą przejściowego potencjału receptora waniloidowego typu 1

Pomiar przewodnictwa nerwowego jest użytecznym narzędziem do oceny mysich modeli neurodegeneracji, ale często jest stosowany tylko do stymulacji nerwu kulszowego w kończynach tylnych. W tym miejscu opisujemy technikę pomiaru złożonego potencjału czynnościowego mięśni (CMAP) in vivo w mięśniach kończyn przednich myszy unerwionych przez splot ramienny.

In vivo (in vivo) Elektrofizjologiczny pomiar złożonego potencjału czynnościowego mięśni z kończyn przednich w mysich modelach zwyrodnienia neuronów ruchowych

Pomiar funkcji kurczliwości mięśni szkieletowych gryzoni jest użytecznym narzędziem, które może być używane do śledzenia postępu choroby, jak również skuteczności interwencji terapeutycznej. Opisujemy tutaj nieinwazyjną ocenę in vivo mięśni zginaczy grzbietowych, która może być powtarzana w czasie u tej samej myszy.

Nieinwazyjna ocena funkcji mięśni zginacza grzbietowego u myszy

Mechaniczny test unikania konfliktów jest używany jako nierefleksyjny odczyt wrażliwości na ból u myszy, który może być wykorzystany do lepszego zrozumienia reakcji afektywno-motywacyjnych w różnych modelach bólu myszy.

Mechaniczny test unikania konfliktów do pomiaru zachowania bólowego u myszy

Metody prostej, szybkiej indukcji modelu bólu pleców u myszy są tutaj dostępne za pomocą iniekcji aktywatora plazminogenu w moczu do wnętrza więzadła.

Model bólu pleców myszy wywołany aktywatorem plazminogenu typu urokinazy

Poznaj terminalny protokół pomiaru H-refleksu u myszy C57 black/6J poprzez bezpośrednią stymulację nerwów przedniej łapy. Ta metoda elektrofizjologiczna zapewnia mniejszą zmienność wyników niż tradycyjne nagrania przezskórne.

Końcowe pomiary H-refleksu u myszy

Przeglądaj więcej filmów