Końcowe pomiary H-refleksu u myszy
16 czerwca 2022
Kliniczna ocena spastyczności oparta na odruchu Hoffmanna (H-odruch) i wykorzystująca elektryczną stymulację nerwów obwodowych jest uznaną metodą. W tym miejscu przedstawiamy protokół końcowej i bezpośredniej stymulacji nerwów w celu ilościowego określenia odruchu H w przedniej łapie myszy.
H-odruch umożliwia elektrofizjologiczną walidację integralności obwodów nerwowych. Przedstawiamy protokół końcowy do ilościowego określenia odruchu H bezpośrednio na nerwach przedniej łapy u myszy. W przeciwieństwie do konwencjonalnych, raczej niespecyficznych dla nerwów nagrań przezskórnych, wyniki są mniej zmienne między myszami a dniami pomiaru.
Podobnie jak w przypadku zapisów H-odruchu u pacjentów, ponieważ precyzyjna kwantyfikacja umożliwia elektrofizjologiczną charakterystykę w modelach choroby, np. urazu rdzenia kręgowego i udaru. Protokół wymaga solidnych umiejętności eksperymentalnych w pracy ze sprzętem chirurgicznym u myszy.
Jeśli nie masz pewności, jak oddzielić nerwy od tkanki łącznej i naczyń krwionośnych, najpierw poćwicz. Procedurę zademonstruje Frederique Wieters, doktorantka z mojego laboratorium. Na początek umieść znieczuloną dorosłą, znieczuloną 8-16-tygodniową mysz C57 black/6J na zakrytej poduszce grzewczej i poczekaj, aż mysz się uspokoi, oddech będzie stabilny, a odruchy nie będą miały odruchów.
Obróć mysz na plecy. Następnie przymocuj przednie łapy taśmą. Ustaw taśmę tak, aby elektrody pomiarowe można było łatwo włożyć do przednich łap.
Aby zmierzyć temperaturę myszy, włóż sondę doodbytniczą i przymocuj ją taśmą. Nałóż maść do oczu, aby zapobiec wysuszeniu oczu. Ostrożnie usuń sierść cienkimi, zaokrąglonymi nożyczkami, jednocześnie podnosząc skórę pęsetą.
Następnie wykonaj jednocentymetrowe nacięcie w skórze wzdłuż brzuszno-tylnej osi przedniej łapy za pomocą cienkich, zaokrąglonych nożyczek. Ostrożnie usuń tkankę łączną i odsłoń znajdujące się pod spodem mięśnie i nerwy. Następnie usuń odsłonięty mięsień piersiowy głęboki za pomocą kleszczy, aby ocenić nerw pośrodkowy.
Usuń niewielkie ilości krwi i płynu tkankowego za pomocą miękkiej bibuły. Następnie ostrożnie przetnij pierś lub mięsień pachowy od góry do dołu, aby odsłonić pęczek nerwowy. Uwolnij wiązkę nerwową z tkanki łącznej i mięśniowej na długości około 1,5 centymetra.
Ostrożnie oddziel nerw łokciowy i pośrodkowy przedniej łapy za pomocą wygiętej szklanej pipety. Nerw górny to nerw łokciowy, a dolny to nerw pośrodkowy. Ułóż elektrody haka stymulatora równolegle w odległości od 0,5 do jednego milimetra i za pomocą mikromanipulatora umieść podwójny haczyk blisko nerwu.
Użyj szklanego haczyka, aby podnieść nerw łokciowy na elektrody haka stymulacyjnego. Następnie odciągnij elektrodę z nerwem i oddziel ją od innych nerwów. Umieść elektrody wzdłuż długiej osi łapy, aby zmniejszyć przesłuch między mięśniami.
Powierzchownie osusz haczyki elektrod przymocowane do nerwu i nałóż wazelinę za pomocą strzykawki, aby zapewnić izolację elektryczną od sąsiedniej tkanki. Aby zmierzyć odruch H, umieść elektrody elektromiografii domięśniowo w przedniej łapie. Następnie umieść elektrodę referencyjną podskórnie w kończynie tylnej, przytrzymywaną przez miniaturowy zacisk krokodylkowy.
Gdy stymulator jest włączony, obserwuj udaną stymulację jako drobne drgania przedniej łapy. Minimalny prąd stymulacyjny do wywołania fali M i drobnych widocznych drgań w przedniej łapie wynosi od 10 do 50 mikroamperów. Wykonaj stymulację nerwów 15 razy z impulsami o długości 0,2 milisekundy każdy.
Przy dwuminutowych przerwach między zestawami bodźców częstotliwość zwiększa się z 0,1, 0,5, 1,0, 2,0 do 5 herców. Ilustracja zapisu ustawionego w ścieżkach do pomiaru odruchu Hoffmana i reakcji mięśni jest pokazana tutaj. Oceniono stosunek amplitudy fali H i M.
Bodziec i odpowiedni artefakt stymulacji zostały ustawione na zero milisekund, po których nastąpiła bezpośrednia fala M i następujący po niej mniejszy szczyt reprezentujący falę H. Załamek M występuje około dwóch milisekund po stymulacji, a załamek H po sześciu do ośmiu milisekundach ze względu na dłuższy czas przejścia przez rdzeń kręgowy. Oprócz oddzielenia nerwów, kluczowe znaczenie ma nałożenie wazeliny na elektrodę, a także między dwoma haczykami.
To jest eksperyment terminalny. W naszym laboratorium technika ta zapewniła nowy złoty standard odniesienia dla przezskórnych nagrań H-reflex.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejsze badanie przedstawia protokół ilościowej oceny odruchu Hoffmana (odruchu H) w przedniej łapie myszy z wykorzystaniem terminalnej i bezpośredniej stymulacji nerwów. Metoda ta stanowi udoskonalenie konwencjonalnych pomiarów przezskórnych, zapewniając bardziej spójne wyniki pomiędzy różnymi myszami i dniami eksperymentalnymi, co ma na celu ułatwienie charakterystyki elektrofizjologicznej w modelach chorób, takich jak uszkodzenia rdzenia kręgowego i udary.
Kluczowe elementy badania
Obszar badań
- Elektrofizjologia
- Neurobiologia
- Modelowanie chorób
Wstęp
- Odruch H jest uznaną metodą oceny spastyczności.
- Integralność obwodów neuronalnych można ocenić elektrofizjologicznie.
- Celem protokołu jest zmniejszenie zmienności pomiarów związanych z biologią myszy.
Zastosowane metody
- Rejestracja odruchu H poprzez bezpośrednią stymulację nerwu
- Myszy (C57 black/6J) w wieku 8–16 tygodni
- Elektromiografia do oceny odpowiedzi nerwowej i mięśniowej
Główne wyniki
- Nowy protokół końcowy wykazuje zmniejszoną zmienność w porównaniu z metodami tradycyjnymi.
- Skuteczna stymulacja doprowadziła do obserwowalnych reakcji przedniej łapy, co potwierdziło prawidłowość zapisów odruchu H.
- Kluczowe pomiary obejmują stosunki amplitud fali H i fali M.
Wnioski
- Badanie dostarcza niezawodnej metody ilościowego pomiaru odruchu H w badaniach naukowych.
- Niniejszy protokół może wspomagać badanie schorzeń neurologicznych wpływających na spastyczność.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Bezpośredni pomiar elektrofizjologiczny integralności obwodów neuronalnych wspiera walidację celów w modelach chorób neurologicznych. Protokół odruchu H w zakończeniach zmniejsza zmienność w ocenie spastyczności, zwiększając pewność prognostyczną w badaniach translacyjnych. Umożliwia to podejmowanie bardziej wiarygodnych decyzji go/no-go w portfelach przedklinicznych nakierowanych na urazy rdzenia kręgowego i udary.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Wartość naukowa: Umożliwia weryfikację hipotez terapeutycznych poprzez ilościowe określenie stopnia zachowania integralności dróg odruchów rdzeniowych.
- Wartość operacyjna: Zapewnia biologiczną redukcję ryzyka dzięki bezpośrednim pomiarom stymulacji nerwów.
- Wartość prognostyczna: Wspiera selekcję projektów w portfolio poprzez identyfikację modeli chorób z elektrofizjologicznymi fenotypami spastyczności.
Przesiewanie i rozwój testów
- Gotowość analizy: Zapewnia zestandaryzowane, o niskiej zmienności pomiary odruchu H u myszy w różnych dniach eksperymentu.
- Wynik ilościowy: Generuje stosunki amplitud fali H do fali M w celu obiektywnej oceny spastyczności.
- Ponowne wykorzystanie platformy: Możliwość adaptacji do nerwów łokciowego, pośrodkowego, piszczelowego i kulszowego przy niewielkich modyfikacjach.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Znaczenie dla choroby: Modeluje spastyczność po udarze poprzez wzmocnienie odruchu H, co koreluje z hipertonią i skurczami niekontrolowanymi.
- Ciągłość translacyjna: Odzwierciedla kliniczne zapisy odruchu H u pacjentów, umożliwiając walidację międzygatunkową.
- Postęp z uwzględnieniem ryzyka: Wspiera redukcję ryzyka mechanistycznego poprzez potwierdzenie oddziaływania na cele w szlakach rdzeniowych.
Integracja potoków i przepływów pracy
Metoda ta wpisuje się w kontinuum procesu odkrywania leków, od walidacji celu po przedkliniczne badania skuteczności w modelach chorób neurologicznych.
- Biologia odkrywcza: Weryfikacja mechanizmów szlaków poprzez izolację wkładu odruchów rdzeniowych w odpowiedzi mięśniowej.
- Przesiewanie: Zapewnienie powtarzalności analizy poprzez bezpośrednią stymulację nerwów oraz izolację za pomocą wazeliny.
- Analityka: Wykorzystanie stosunku fali H do fali M jako ilościowego odczytu do porównywania warunków eksperymentalnych.
- Badania translacyjne: Zgodność z klinicznymi biomarkerami spastyczności poprzez homologię elektrofizjologiczną.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Ustanowienie złotego standardu referencyjnego dla walidacji elektrofizjologicznej w różnych laboratoriach.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorczy
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność prognostyczną poprzez redukcję zmienności pomiarów w ocenie integralności obwodów neuronowych.
- Wartość operacyjna: Poprawia standaryzację i odtwarzalność między badanymi osobnikami oraz dniami pomiarowymi.
- Wartość strategiczna: Poprawia efektywność kapitałową, umożliwiając wcześniejszą identyfikację celów niepodatnych na translację.
- Wpływ na portfolio: Ułatwia priorytetyzację związków z uwzględnieniem ryzyka w oparciu o elektrofizyczną walidację celu.
Uwagi dotyczące wdrożenia
- Wymaga doświadczenia w chirurgii myszy, dyssekcji nerwów oraz rejestracji elektrofizjologicznej.
- Wymaga precyzyjnego instrumentarium, w tym micromanipulatorów, stymulatorów i wzmacniaczy EMG.
- Konieczna jest standaryzacja technik izolacji nerwów i rozmieszczania elektrod pomiędzy zespołami.
- Wymaga uwzględnienia modyfikacji podczas stosowania protokołu w przypadku nerwów tylnych łap.
- Ograniczenie wynika z terminalnego charakteru procedury, co wyklucza badania podłużne na tym samym zwierzęciu.
Najczęściej zadawane pytania dotyczące biofarmaceutyki
Chapters in this video
0:04
Introduction
1:15
Preparation
1:53
Surgery
2:54
Electrode Placement
3:34
Placement of the Recording and Reference Electrodes and Measurement
4:25
Results: Terminal H-Reflex Quantification at the Ulnar and Median Nerves of the Mouse Forepaw
5:04
Conclusion
