Izolacja i profilowanie ludzkich pierwotnych komórek śródbłonka tętnic krezkowych na poziomie transkryptomu
March 14th, 2022
Protokół opisuje izolację, hodowlę i profilowanie komórek śródbłonka z ludzkiej tętnicy krezkowej. Dodatkowo opracowano metodę przygotowania tętnicy człowieka do transkryptomiki przestrzennej. Proteomika, transkryptomika i testy funkcjonalne mogą być wykonywane na izolowanych komórkach. Protokół ten można zastosować do każdej tętnicy średniej lub dużej wielkości.
Scharakteryzowanie ekspresji genów na poziomie transkryptomicznym jest kluczem do zrozumienia funkcji komórek w zdrowiu i chorobie. Nasza metoda koncentruje się na wychwytywaniu komórek śródbłonka, kluczowej warstwy ściany naczyniowej, z tętnic menestrowych ludzkich dawców w celu profilowania transkryptomicznego z rozdzielczością jednokomórkową i przestrzenną. Istnieje wzbogacona populacja komórek śródbłonka z naczynia bez etapu sortowania, co może powodować utratę komórek.
Ponadto istnieją inne typy komórek, które pozwalają na badanie interakcji komórka-komórka w kontekście tkankowym. Wykorzystaliśmy tę technikę do zbadania zmian tętniczych w cukrzycy i otyłości. W zależności od dostępności naczynia, techniki te mogą być również wykorzystane do badania biologii w innych naczyniach krwionośnych i innych chorobach.
Jeśli jest to pierwszy raz, dwa kluczowe kroki wymagają najwięcej praktyki. Po pierwsze, skrobanie, chociaż należy wywierać odpowiednią siłę, aby usunąć integralne komórki bez odrywania głębszych warstw. A po drugie, cięcie kriostatu.
Upewnij się, że sekcje są zimne, płaskie i mieszczą się w granicach specjalistycznej zjeżdżalni. Procedurę zademonstrują Yingjun Luo i Xiaofang Tang, dwaj doktoranci z mojego laboratorium. Aby rozpocząć, umyj chusteczkę za pomocą DPBS.
Za pomocą sterylnych kleszczy i nożyczek preparacyjnych usuń tłuszcz i zewnętrzną tkankę łączną, aż naczynie będzie czyste. Zmierz długość naczynia linijką umieszczoną na zewnątrz naczynia i zrób dokumentację fotograficzną. Przeciąć tętnicę krezkową wzdłuż nożyczkami, aby otworzyć światło naczynia w pionie.
Za pomocą igieł przymocuj naczynie do czarnego wosku we wszystkich czterech rogach, odsłaniając błonę wewnętrzną. Dodaj jeden mililitr wstępnie podgrzanego buforu wytrawiającego do błony wewnętrznej. Za pomocą sterylnego skalpela delikatnie zeskrob dwukrotnie światło naczynia.
Przenieść bufor wytrawiający do probówki. Dodać jeden mililitr buforu wytrawiającego do błony wewnętrznej i ostrożnie pipetować w górę iw dół, aby zebrać pozostałe komórki i przenieść zawiesinę komórkową do probówki. Inkubuj komórki w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez pięć minut w inkubatorze lub na kołysce.
Dodaj pożywkę M199 do zawiesiny komórkowej, aby wygasić reakcję enzymatyczną i delikatnie wymieszać. Odwirować zawiesinę przez pięć minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza i 600 razy G.At końcem wirowania, wyjąć i przechowywać supernatant oddzielnie jako kulturę kontrolną w celu obserwacji, czy wszystkie komórki zostały wychwycone w osadzie. Następnie ponownie zawiesić osad komórkowy w jednym mililitrze pożywki M199.
Oceń żywotność komórek, mieszając 10 mikrolitrów błękitu trypanowego z 10 mikrolitrami zapasu komórkowego. Obserwuj morfologię komórek i policz komórki za pomocą hemocytometru. Pokryj dwie studzienki na płytce sześciodołkowej, pipetując 500 mikrolitrów odczynnika przyłączającego do studzienek przez 30 minut w temperaturze pokojowej.
Po umyciu studzienek sterylnym DPBS, należy dozować cały zapas komórek do jednej studzienki, a supernatant jest przechowywany jako kontrola w drugiej studzience. Odwirować wcześniej przygotowany wywar komórkowy w temperaturze czterech stopni Celsjusza i 600 razy G przez pięć minut. Usunąć supernatant i delikatnie zawiesić osad za pomocą pipety P-1000 w 0,04% BSA w DPBS.
Dobrze wymieszaj, aby uzyskać zawiesinę jednokomórkową. Przepuść roztwór przez sitko o średnicy 40 mikrometrów, aby usunąć resztki komórek. Następnie odwirować zawiesinę i usunąć supernatant, jak pokazano.
Ponownie zawiesić osad w 500 mikrolitrach 0,04% BSA w DPBS za pomocą pipety P-1000 i dobrze wymieszać, aby uzyskać zawiesinę jednokomórkową. Jak wykazano wcześniej, oceń żywotność komórek za pomocą błękitu trypanowego. Za pomocą hemocytometru lub automatycznego licznika komórek obserwuj morfologię zawiesiny pojedynczej komórki, sprawdź, czy nie ma resztek tkanek i oblicz liczbę żywych i martwych komórek.
Po dodaniu izopentanu do metalowego kanistra schłodzić w ciekłym azocie lub suchym lodzie. Wlej związek OCT do studzienek z oznakowanej plastikowej formy kriogenicznej, zapobiegając tworzeniu się pęcherzyków. Pozostaw formę kriogeniczną na suchym lodzie do ostygnięcia.
Wytnij co najmniej dwa odcinki czołowe o długości jednego centymetra na długości naczynia. Za pomocą 12-calowych kleszczy zanurz tkankę w izopentanie, aż zostanie zamrożona. Szybko zanurz tkankę w OCT w orientacji z widocznym światłem pośrodku.
Chwyć i umieść formy kriogeniczne na suchym lodzie i obserwuj zamarzanie. OCT stanie się stopniowo biały od zewnątrz w ciągu jednej do dwóch minut. Przechowuj te sekcje w zabezpieczonym pojemniku w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza do sześciu miesięcy.
Ustaw żądaną temperaturę kriostatu dla komory i głowicy próbki. Zrównoważyć sekcje naczyń osadzone w OCT, noże, szczotki i szkiełka do minus 20 stopni Celsjusza w kriostacie przez około 30 minut. Podczas wyrównywania wyczyść maszynę i wszystkie urządzenia, które mogą stykać się z sekcjami, w tym ostrze, 70% etanolem, a następnie roztworem do odkażania RNazy.
Dołączyć próbkę, dozując niewielką ilość OCT na okrągły blok kriostatu i umieszczając próbkę na wierzchu przed jej zamrożeniem. Po umieszczeniu klocka w środku główki próbki, przykręć klocek na miejscu za pomocą wysokiego czarnego uchwytu po lewej stronie. Odciąć nadmiar OCT otaczającego naczynie.
Ustawiając grubość cięcia na 10 mikrometrów na kriostacie, wytnij około 60 odcinków i umieść je we wstępnie schłodzonej 1,5-mililitrowej probówce zawierającej odczynnik do ekstrakcji RNA. Wiruj, aż skrawki całkowicie się rozpuszczą. Wyekstrahuj RNA zgodnie z opisem w manuskrypcie tekstowym i rozpuść oczyszczoną osadkę RNA w pięciu mikrolitrach wody wolnej od RNaz.
Wytnij odcinki o grubości 10 mikrometrów z założoną płytką zabezpieczającą. Odwróć i ostrożnie spłaszcz, delikatnie dotykając sekcji przez otaczający OCT. Wytrzyj szkiełko etanolem i wstępnie rozgrzej palcem tylną część obszaru przechwytywania.
Używając szczotek do kriostatu bez RNaz lub bezpośrednio szkiełka, umieść wycinek tkanki w kwadracie, używając tylko otaczającego OCT. Natychmiast umieść jeden palec z tyłu obszaru przechwytywania, aby stopić sekcję ze szkiełkiem. Gdy sekcja przylgnie, umieść szkiełko na listwie kriogenicznej, aby umożliwić zamrożenie sekcji.
Wytnij skrawki tkanki o grubości 10 mikrometrów, jak pokazano wcześniej, na szkiełkach do optymalizacji tkanek lub ekspresji genów. Przenieś szkiełko do szkiełka umieszczonego na suchym lodzie. Rysunek przedstawia izolowane EC hodowane przy użyciu opisanego protokołu, wykazujące wyraźną morfologię przypominającą bruk z minimalną ilością komórek zanieczyszczających.
Ekspresję markera EC kadheryny śródbłonka naczyniowego potwierdzono za pomocą immunofluorescencji wizualizującej połączenia międzykomórkowe. Około 80% komórek było CD31-dodatnich, co wskazuje, że ludzkie EC tętnicze krezkowe stanowiły większość świeżo wyizolowanej populacji komórek. Nieudane izolacje skutkują powstaniem komórek o zaburzonej morfologii, potencjalnie wykazujących ekspresję markerów mezenchymalnych lub wydłużających się przypominających stan fibroblastyczny.
Rysunek przedstawia reprezentatywną jednorodną aproksymację i projekcję rozmaitości izolowanej dla tętnicy krezkowej przy użyciu obecnego protokołu sekwencjonowania jednokomórkowego RNA na izolowanym ludzkim ECS tętniczym krezkowym, z 34% komórkami zgrupowanymi jako EC przy użyciu PECAM1 i VWF jako markerów. RNA wysokiej jakości powinno wykazywać liczbę integralności RNA nie mniejszą niż sześć, a stosunek prążków rybosomalnego RNA 28S do 18S jest jak najbardziej zbliżony do dwóch. Słabe lub brak tych sygnałów rybosomalnego RNA można zaobserwować, gdy RNA są degradowane.
Barwienie hematoksyliną i eozyną uwidoczniło morfologię naczynia, co pozwoliło na identyfikację obszarów zainteresowania. Ekspresję genów zwizualizowano za pomocą przestrzennego zakotwiczenia na naczyniu barwionym hematoksyliną i eozyną. Z tkankami i komórkami należy obchodzić się ostrożnie, aby utrzymać jakość RNA, szczególnie w przypadku przestrzennego profilowania transkryptomu.
Upewnij się, że tkanka jest umieszczona na suchym lodzie, aby zmniejszyć degradację RNA. Z skrawkami i tkankami należy również obchodzić się za pomocą wstępnie schłodzonych narzędzi. Udało nam się zbadać zmiany ekspresji genów EC, w tym LncRNA w kontekście cukrzycy i ich interakcji z innymi typami komórek.
Możemy wywnioskować lokalizację tych zmian transkryptomicznych za pomocą technik przestrzennego profilowania transkryptomu.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Przegląd
Ten protokół opisuje izolację i hodowlę komórek śródbłonka z ludzkich tętnic okrężnicy, umożliwiając profilowanie transkryptomowe. Zawiera również metodę przygotowania ludzkich tętnic do transkryptomik przestrzennej, ułatwiającą badania interakcji komórkowych w różnych kontekstach naczyniowych.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neuronauki
- Biologia komórki
- Biologia naczyń
Tło
- Komórki śródbłonka są niezbędne dla funkcjonowania i zdrowia naczyń krwionośnych.
- Zrozumienie ekspresji genów w tych komórkach jest kluczowe dla badań nad chorobami takimi jak cukrzyca i otyłość.
- Pozbawianie komórek śródbłonka bez sortowania minimalizuje utratę komórek.
- Ta metoda może być dostosowana do innych badań naczyniowych.
Cel badania
- Izolacja i profilowanie komórek śródbłonka z ludzkich tętnic okrężnicy.
- Umożliwienie przestrzennej analizy transkryptomu tkanek naczyniowych.
- Badanie interakcji komórkowych i zmian w kontekście chorobowym.
Stosowane metody
- Izolacja komórek śródbłonka z ludzkich tętnic okrężnicy.
- Hodowla izolowanych komórek na potrzeby badań funkcjonalnych.
- Przygotowanie tętnic do transkryptomik przestrzennej.
- Analiza ekspresji genów na poziomie pojedynczej komórki.
Główne wyniki
- Udana izolacja wzbogaconej populacji komórek śródbłonka.
- Możliwość badania interakcji komórka-komórka w kontekście tkankowym.
- Zastosowanie metody do badania zmian tętniczych w cukrzycy i otyłości.
- Możliwość adaptacji technik do innych badań naczyniowych.
Wnioski
- Ten protokół zapewnia efektywną metodę profilowania komórek śródbłonka.
- Ułatwia badanie biologii naczyń w kontekście zdrowia i choroby.
- Przyszłe badania mogą wykorzystywać to podejście do szerszych zastosowań.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
Direct isolation and transcriptomic profiling of human primary mesenteric arterial endothelial cells (ECs) addresses a critical need for native-state vascular cell models in early discovery and translational research. This workflow enables high-fidelity interrogation of EC gene expression and spatial context, supporting mechanistic de-risking and predictive confidence in vascular biology portfolios. The approach is adaptable to diverse disease states and vessel types, enhancing enterprise R&D impact across cardiovascular and metabolic indications.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables interrogation of EC transcriptional programs in native tissue for functional target validation.
- Supports mechanistic de-risking by preserving in vivo-like gene expression and epigenetic states.
- Facilitates identification of disease-relevant EC subpopulations and pathways for hypothesis-driven research.
Screening & Assay Development
- Provides validated primary ECs for downstream transcriptomic and spatial profiling workflows.
- Improves assay reproducibility by minimizing culture-induced artifacts and external variables.
- Enables quantitative assessment of EC marker expression and cell viability for screening readiness.
Translational & Preclinical Research
- Aligns transcriptomic outputs with disease models, supporting translational biomarker discovery.
- Maintains continuity from human tissue to preclinical validation by preserving spatial and cellular context.
- Enables risk-adjusted advancement decisions based on high-quality, disease-relevant molecular data.
Pipeline & Workflow Integration
This method integrates into the discovery-to-preclinical continuum by supplying native-state ECs and spatial transcriptomic data for target validation, lead identification, and translational research.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification through direct transcriptomic analysis of primary ECs.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative outputs for EC marker validation and cell viability assessment.
- Analytics: Provides high-quality RNA and spatial gene expression data for robust comparative analyses.
- Translational Research: Enables alignment of molecular findings with disease context and tissue architecture.
- Enterprise Reuse: Adaptable protocol for multiple vessel types and disease states, supporting broad R&D utility.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in vascular target validation.
- Operational Value: Standardizes EC isolation and profiling, enhancing reproducibility and scalability.
- Strategic Value: Informs go/no-go decisions with high-fidelity molecular data, improving capital efficiency.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization and advancement of vascular and metabolic programs.
Implementation Considerations
- Requires expertise in tissue dissection, cryosectioning, and RNA handling to maintain sample integrity.
- Demands access to specialized instrumentation for spatial transcriptomics and single-cell RNA sequencing.
- Necessitates cross-team standardization of tissue processing and analytical workflows.
- Adaptable to various vessel types and donor conditions, but tissue quality and handling are critical.
- RNA degradation risk mandates stringent cold-chain and RNase-free practices throughout the workflow.
