Izolacja i profilowanie ludzkich pierwotnych komórek śródbłonka tętnic krezkowych na poziomie transkryptomu
14 marca 2022
Protokół opisuje izolację, hodowlę i profilowanie komórek śródbłonka z ludzkiej tętnicy krezkowej. Dodatkowo opracowano metodę przygotowania tętnicy człowieka do transkryptomiki przestrzennej. Proteomika, transkryptomika i testy funkcjonalne mogą być wykonywane na izolowanych komórkach. Protokół ten można zastosować do każdej tętnicy średniej lub dużej wielkości.
Scharakteryzowanie ekspresji genów na poziomie transkryptomicznym jest kluczem do zrozumienia funkcji komórek w zdrowiu i chorobie. Nasza metoda koncentruje się na wychwytywaniu komórek śródbłonka, kluczowej warstwy ściany naczyniowej, z tętnic menestrowych ludzkich dawców w celu profilowania transkryptomicznego z rozdzielczością jednokomórkową i przestrzenną. Istnieje wzbogacona populacja komórek śródbłonka z naczynia bez etapu sortowania, co może powodować utratę komórek.
Ponadto istnieją inne typy komórek, które pozwalają na badanie interakcji komórka-komórka w kontekście tkankowym. Wykorzystaliśmy tę technikę do zbadania zmian tętniczych w cukrzycy i otyłości. W zależności od dostępności naczynia, techniki te mogą być również wykorzystane do badania biologii w innych naczyniach krwionośnych i innych chorobach.
Jeśli jest to pierwszy raz, dwa kluczowe kroki wymagają najwięcej praktyki. Po pierwsze, skrobanie, chociaż należy wywierać odpowiednią siłę, aby usunąć integralne komórki bez odrywania głębszych warstw. A po drugie, cięcie kriostatu.
Upewnij się, że sekcje są zimne, płaskie i mieszczą się w granicach specjalistycznej zjeżdżalni. Procedurę zademonstrują Yingjun Luo i Xiaofang Tang, dwaj doktoranci z mojego laboratorium. Aby rozpocząć, umyj chusteczkę za pomocą DPBS.
Za pomocą sterylnych kleszczy i nożyczek preparacyjnych usuń tłuszcz i zewnętrzną tkankę łączną, aż naczynie będzie czyste. Zmierz długość naczynia linijką umieszczoną na zewnątrz naczynia i zrób dokumentację fotograficzną. Przeciąć tętnicę krezkową wzdłuż nożyczkami, aby otworzyć światło naczynia w pionie.
Za pomocą igieł przymocuj naczynie do czarnego wosku we wszystkich czterech rogach, odsłaniając błonę wewnętrzną. Dodaj jeden mililitr wstępnie podgrzanego buforu wytrawiającego do błony wewnętrznej. Za pomocą sterylnego skalpela delikatnie zeskrob dwukrotnie światło naczynia.
Przenieść bufor wytrawiający do probówki. Dodać jeden mililitr buforu wytrawiającego do błony wewnętrznej i ostrożnie pipetować w górę iw dół, aby zebrać pozostałe komórki i przenieść zawiesinę komórkową do probówki. Inkubuj komórki w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez pięć minut w inkubatorze lub na kołysce.
Dodaj pożywkę M199 do zawiesiny komórkowej, aby wygasić reakcję enzymatyczną i delikatnie wymieszać. Odwirować zawiesinę przez pięć minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza i 600 razy G.At końcem wirowania, wyjąć i przechowywać supernatant oddzielnie jako kulturę kontrolną w celu obserwacji, czy wszystkie komórki zostały wychwycone w osadzie. Następnie ponownie zawiesić osad komórkowy w jednym mililitrze pożywki M199.
Oceń żywotność komórek, mieszając 10 mikrolitrów błękitu trypanowego z 10 mikrolitrami zapasu komórkowego. Obserwuj morfologię komórek i policz komórki za pomocą hemocytometru. Pokryj dwie studzienki na płytce sześciodołkowej, pipetując 500 mikrolitrów odczynnika przyłączającego do studzienek przez 30 minut w temperaturze pokojowej.
Po umyciu studzienek sterylnym DPBS, należy dozować cały zapas komórek do jednej studzienki, a supernatant jest przechowywany jako kontrola w drugiej studzience. Odwirować wcześniej przygotowany wywar komórkowy w temperaturze czterech stopni Celsjusza i 600 razy G przez pięć minut. Usunąć supernatant i delikatnie zawiesić osad za pomocą pipety P-1000 w 0,04% BSA w DPBS.
Dobrze wymieszaj, aby uzyskać zawiesinę jednokomórkową. Przepuść roztwór przez sitko o średnicy 40 mikrometrów, aby usunąć resztki komórek. Następnie odwirować zawiesinę i usunąć supernatant, jak pokazano.
Ponownie zawiesić osad w 500 mikrolitrach 0,04% BSA w DPBS za pomocą pipety P-1000 i dobrze wymieszać, aby uzyskać zawiesinę jednokomórkową. Jak wykazano wcześniej, oceń żywotność komórek za pomocą błękitu trypanowego. Za pomocą hemocytometru lub automatycznego licznika komórek obserwuj morfologię zawiesiny pojedynczej komórki, sprawdź, czy nie ma resztek tkanek i oblicz liczbę żywych i martwych komórek.
Po dodaniu izopentanu do metalowego kanistra schłodzić w ciekłym azocie lub suchym lodzie. Wlej związek OCT do studzienek z oznakowanej plastikowej formy kriogenicznej, zapobiegając tworzeniu się pęcherzyków. Pozostaw formę kriogeniczną na suchym lodzie do ostygnięcia.
Wytnij co najmniej dwa odcinki czołowe o długości jednego centymetra na długości naczynia. Za pomocą 12-calowych kleszczy zanurz tkankę w izopentanie, aż zostanie zamrożona. Szybko zanurz tkankę w OCT w orientacji z widocznym światłem pośrodku.
Chwyć i umieść formy kriogeniczne na suchym lodzie i obserwuj zamarzanie. OCT stanie się stopniowo biały od zewnątrz w ciągu jednej do dwóch minut. Przechowuj te sekcje w zabezpieczonym pojemniku w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza do sześciu miesięcy.
Ustaw żądaną temperaturę kriostatu dla komory i głowicy próbki. Zrównoważyć sekcje naczyń osadzone w OCT, noże, szczotki i szkiełka do minus 20 stopni Celsjusza w kriostacie przez około 30 minut. Podczas wyrównywania wyczyść maszynę i wszystkie urządzenia, które mogą stykać się z sekcjami, w tym ostrze, 70% etanolem, a następnie roztworem do odkażania RNazy.
Dołączyć próbkę, dozując niewielką ilość OCT na okrągły blok kriostatu i umieszczając próbkę na wierzchu przed jej zamrożeniem. Po umieszczeniu klocka w środku główki próbki, przykręć klocek na miejscu za pomocą wysokiego czarnego uchwytu po lewej stronie. Odciąć nadmiar OCT otaczającego naczynie.
Ustawiając grubość cięcia na 10 mikrometrów na kriostacie, wytnij około 60 odcinków i umieść je we wstępnie schłodzonej 1,5-mililitrowej probówce zawierającej odczynnik do ekstrakcji RNA. Wiruj, aż skrawki całkowicie się rozpuszczą. Wyekstrahuj RNA zgodnie z opisem w manuskrypcie tekstowym i rozpuść oczyszczoną osadkę RNA w pięciu mikrolitrach wody wolnej od RNaz.
Wytnij odcinki o grubości 10 mikrometrów z założoną płytką zabezpieczającą. Odwróć i ostrożnie spłaszcz, delikatnie dotykając sekcji przez otaczający OCT. Wytrzyj szkiełko etanolem i wstępnie rozgrzej palcem tylną część obszaru przechwytywania.
Używając szczotek do kriostatu bez RNaz lub bezpośrednio szkiełka, umieść wycinek tkanki w kwadracie, używając tylko otaczającego OCT. Natychmiast umieść jeden palec z tyłu obszaru przechwytywania, aby stopić sekcję ze szkiełkiem. Gdy sekcja przylgnie, umieść szkiełko na listwie kriogenicznej, aby umożliwić zamrożenie sekcji.
Wytnij skrawki tkanki o grubości 10 mikrometrów, jak pokazano wcześniej, na szkiełkach do optymalizacji tkanek lub ekspresji genów. Przenieś szkiełko do szkiełka umieszczonego na suchym lodzie. Rysunek przedstawia izolowane EC hodowane przy użyciu opisanego protokołu, wykazujące wyraźną morfologię przypominającą bruk z minimalną ilością komórek zanieczyszczających.
Ekspresję markera EC kadheryny śródbłonka naczyniowego potwierdzono za pomocą immunofluorescencji wizualizującej połączenia międzykomórkowe. Około 80% komórek było CD31-dodatnich, co wskazuje, że ludzkie EC tętnicze krezkowe stanowiły większość świeżo wyizolowanej populacji komórek. Nieudane izolacje skutkują powstaniem komórek o zaburzonej morfologii, potencjalnie wykazujących ekspresję markerów mezenchymalnych lub wydłużających się przypominających stan fibroblastyczny.
Rysunek przedstawia reprezentatywną jednorodną aproksymację i projekcję rozmaitości izolowanej dla tętnicy krezkowej przy użyciu obecnego protokołu sekwencjonowania jednokomórkowego RNA na izolowanym ludzkim ECS tętniczym krezkowym, z 34% komórkami zgrupowanymi jako EC przy użyciu PECAM1 i VWF jako markerów. RNA wysokiej jakości powinno wykazywać liczbę integralności RNA nie mniejszą niż sześć, a stosunek prążków rybosomalnego RNA 28S do 18S jest jak najbardziej zbliżony do dwóch. Słabe lub brak tych sygnałów rybosomalnego RNA można zaobserwować, gdy RNA są degradowane.
Barwienie hematoksyliną i eozyną uwidoczniło morfologię naczynia, co pozwoliło na identyfikację obszarów zainteresowania. Ekspresję genów zwizualizowano za pomocą przestrzennego zakotwiczenia na naczyniu barwionym hematoksyliną i eozyną. Z tkankami i komórkami należy obchodzić się ostrożnie, aby utrzymać jakość RNA, szczególnie w przypadku przestrzennego profilowania transkryptomu.
Upewnij się, że tkanka jest umieszczona na suchym lodzie, aby zmniejszyć degradację RNA. Z skrawkami i tkankami należy również obchodzić się za pomocą wstępnie schłodzonych narzędzi. Udało nam się zbadać zmiany ekspresji genów EC, w tym LncRNA w kontekście cukrzycy i ich interakcji z innymi typami komórek.
Możemy wywnioskować lokalizację tych zmian transkryptomicznych za pomocą technik przestrzennego profilowania transkryptomu.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejszy protokół opisuje izolację i hodowlę komórek śródbłonka z ludzkich tętnic krezkowych, co umożliwia profilowanie transkrypcyjne. Zawiera on również metodę przygotowania ludzkich tętnic do przestrzennej transkryptomiki, co ułatwia badanie oddziaływań międzykomórkowych w różnych kontekstach naczyniowych.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- neuronauka
- biologia komórki
- biologia naczyń
Wstęp
- Komórki śródbłonka są kluczowe dla funkcji i zdrowia naczyń krwionośnych.
- Zrozumienie ekspresji genów w tych komórkach jest niezbędne do badania chorób takich jak cukrzyca i otyłość.
- Pozyskiwanie komórek śródbłonka bez sortowania minimalizuje stratę komórek.
- Metoda ta może zostać dostosowana do innych badań naczyniowych.
Cel badania
- Izolacja i profilowanie komórek śródbłonka z ludzkich tętnic krezkowych.
- Umożliwienie analizy transkrypcyjnej tkanki naczyniowej w wymiarze przestrzennym.
- Badanie interakcji komórkowych oraz zmian zachodzących w kontekście chorobowym.
Zastosowane metody
- Izolacja komórek śródbłonka z ludzkich tętnic krezkowych.
- Hodowla wyizolowanych komórek do testów funkcjonalnych.
- Przygotowanie tętnic do transkryptomiki przestrzennej.
- Analiza ekspresji genów na poziomie pojedynczych komórek.
Główne wyniki
- Skuteczna izolacja wzbogaconej populacji komórek śródbłonka.
- Możliwość badania oddziaływań międzykomórkowych w kontekście tkankowym.
- Zastosowanie metody do badania zmian tętniczych w cukrzycy i otyłości.
- Potencjał do adaptacji technik w innych badaniach naczyniowych.
Wnioski
- Niniejszy protokół przedstawia niezawodną metodę profilowania komórek śródbłonka.
- Umożliwia on badanie biologii naczyń w stanach zdrowia i choroby.
- W przyszłych badaniach podejście to można wykorzystać w szerszym zakresie zastosowań.
Najczęściej Zadawane Pytania
Znaczenie dla przemysłu
Bezpośrednia izolacja i profilowanie transkryptomiczne pierwotnych ludzkich komórek śródbłonka tętnic krezkowych (ECs) odpowiada na krytyczną potrzebę uzyskania modeli komórek naczyniowych w stanie natywnym do wczesnych odkryć i badań translacyjnych. Przedstawiony schemat pracy umożliwia wysokowierną analizę ekspresji genów EC oraz ich kontekstu przestrzennego, co wspiera mechanistyczną redukcję ryzyka i zwiększa pewność prognostyczną w ramach portfeli badań nad biologią naczyń. Podejście to można dostosować do różnych stanów chorobowych i typów naczyń, co zwiększa wpływ działalności badawczo-rozwojowej przedsiębiorstw w zakresie wskazań sercowo-naczyniowych i metabolicznych.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Umożliwia badanie programów transkrypcyjnych EC w tkance natywnej w celu funkcjonalnej walidacji celów.
- Wspiera ograniczanie ryzyka mechanistycznego poprzez zachowanie ekspresji genów i stanów epigenetycznych zbliżonych do warunków in vivo.
- Ułatwia identyfikację subpopulacji EC i szlaków istotnych dla choroby w badaniach opartych na hipotezach.
Przesiewy i rozwój testów
- Zapewnia zwalidowane pierwotne komórki śródbłonka (EC) do dalszych analiz transkryptomicznych oraz profilowania przestrzennego.
- Poprawia powtarzalność analizy poprzez minimalizację artefaktów indukowanych hodowlą i zmiennych zewnętrznych.
- Umożliwia ilościową ocenę ekspresji markerów EC oraz żywotności komórek w celu weryfikacji gotowości do screeningu.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Koreluje wyniki transkrypcyjne z modelami chorób, wspierając odkrywanie translacyjnych biomarkerów.
- Zapewnia ciągłość od tkanki ludzkiej do walidacji przedklinicznej poprzez zachowanie kontekstu przestrzennego i komórkowego.
- Umożliwia podejmowanie decyzji o dalszym rozwoju projektu w oparciu o ocenę ryzyka i wysokiej jakości dane molekularne istotne dla danej choroby.
Integracja potoków i przepływów pracy
Metoda ta integruje się z kontinuum od etapu odkrywania do badań przedklinicznych, dostarczając komórek śródbłonków (EC) w stanie natywnym oraz danych z transkryptomiki przestrzennej w celu walidacji celów, identyfikacji związków wiodących oraz prowadzenia badań translacyjnych.
- Biologia odkrywcza: Wspiera testowanie hipotez i wyjaśnianie szlaków sygnałowych poprzez bezpośrednią analizę transkryptomiczną pierwotnych EC.
- Przesiewanie: Zapewnia powtarzalne, ilościowe wyniki w celu walidacji markerów EC oraz oceny żywotności komórek.
- Analityka: Dostarcza wysokiej jakości RNA oraz danych o przestrzennej ekspresji genów do rzetelnych analiz porównawczych.
- Badania translacyjne: Umożliwia powiązanie odkryć molekularnych z kontekstem choroby i architekturą tkanki.
- Zastosowania w przedsiębiorstwach: Adaptowalny protokół dla wielu typów naczyń i stanów chorobowych, wspierający szerokie zastosowanie w obszarze B&R.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorczy
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność prognostyczną i zmniejsza niejednoznaczność mechanistyczną w walidacji celów naczyniowych.
- Wartość operacyjna: Standaryzuje izolację i profilowanie EC, zwiększając powtarzalność i skalowalność.
- Wartość strategiczna: Wspiera decyzje typu go/no-go dzięki wysokiej jakości danym molekularnym, poprawiając efektywność kapitałową.
- Wpływ na portfolio: Umożliwia priorytetyzację dostosowaną do ryzyka oraz rozwój programów naczyniowych i metabolicznych.
Uwagi dotyczące wdrożenia
- Wymaga doświadczenia w preparatyce tkanek, kriotomii oraz postępowaniu z RNA w celu zachowania integralności próbek.
- Wymaga dostępu do specjalistycznej aparatury do transcriptomiki przestrzennej i sekwencjonowania RNA z pojedynczych komórek.
- Konieczna jest standaryzacja procesowania tkanek i przepływów analitycznych pomiędzy zespołami.
- Metoda jest możliwa do zastosowania dla różnych typów naczyń i stanów dawców, jednak jakość tkanki i sposób jej obchodzenia są kluczowe.
- Ryzyko degradacji RNA nakłada obowiązek stosowania rygorystycznych procedur łańcucha chłodniczego oraz zasad pracy w warunkach wolnych od RNaz w całym procesie.
