Name: Izolacja i profilowanie ludzkich pierwotnych komórek śródbłonka tętnic krezkowych na poziomie transkryptomu (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-03-14T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 45 s
Description: Poznaj izolację i profilowanie transkryptomowe ludzkich komórek śródbłonka z tętnic krezkowych. Ta metoda umożliwia analizę interakcji komórkowych w kontekście tkankowym oraz badanie zmian w cukrzycy i otyłości.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez granty NIH R01HL108735, R01HL145170, R01HL106089 (dla Z.B.C.); DP1DK126138 i DP1HD087990 (do S.Z.); stypendium Fundacji Elli Fitzgerald oraz Wanek Family Project (dla Z.B.C.); oraz grant sieci nasion Human Cell Atlas (dla Z.B.C. i S.Z.). Badania opisane w tej publikacji obejmowały prace wykonane w Integrative Genomics Core w City of Hope wspieranym przez National Cancer Institute of the National Institutes of Health w ramach nagrody numer P30CA033572. Autorzy chcieliby podziękować dr Ismailowi Al-Abdullahowi i dr Meirigeng Qi z zespołu transplantacji wysp trzustkowych w City of Hope za izolację tkanek ludzkich, dr Dongqiang Yuan z City of Hope za pomoc w analizie scRNA-seq oraz dr Marc Halushka z Division of Cardiovascular Pathology, Johns Hopkins University School of Medicine za jego nieocenione spostrzeżenia na temat histologii naczyniowej.

Badania tkanek ludzkich zostały przeprowadzone na niezidentyfikowanych próbkach uzyskanych z Southern California Islet Cell Resource Center w City of Hope. Zgody na przeprowadzenie badań nad wykorzystaniem pośmiertnych tkanek ludzkich uzyskano od najbliższej rodziny dawców, a zgoda etyczna na to badanie została udzielona przez Institutional Review Board of City of Hope (IRB nr 01046).
1. Fizyczna dysocjacja (szacowany czas: 1-2 h)
<ol>
	<li>Umieść świeżą tętnicę na 10-centymetrowym naczyniu i przemyj sterylnym roztworem soli fizjologicznej buforowanym fosforanami (D-PBS) firmy Dulbecco.</li>
	<li>Za pomocą sterylnych kleszczy i nożyczek preparacyjnych usuń tłuszcz i zewnętrzną tkankę łączną, aż naczynie będzie czyste. Zmierz długość naczynia za pomocą linijki umieszczonej na zewnątrz naczynia i zrób zdjęcia do rekordów (<silna klasa="xfig">Rysunek 1A).</li>
	<li>Wstępnie podgrzej odpowiedni bufor do trawienia do 37 °C: dla sekwencji scRNA użyj enzymu dysocjacji komórek; do testów hodowli komórkowych użyj 1-6 mg/ml kolagenazy D, 3 mg/ml proteazy pochodzenia bakteryjnego, 100 mM HEPES, 120 mM NaCl, 50 mM KCl, 5 mM glukozy, z 1 mM CaCl26,38 (pH 7,0, nie wymaga regulacji) dodano 5 minut przed użyciem.</li>
	<li>Weź tętnicę krezkową (zwykle o średnicy 6-8 mm) i przetnij wzdłuż nożyczkami, aby otworzyć światło naczynia w pionie.</li>
	<li>Za pomocą igieł przymocuj naczynie do czarnego wosku we wszystkich czterech rogach, pozostawiając odsłoniętą błonę wewnętrzną (<silna klasa = "xfig">Rysunek 1B).</li>
	<li>Dodaj 1 ml wstępnie podgrzanego buforu wytrawiającego do błony wewnętrznej. Weź sterylny skalpel i delikatnie zeskrob światło naczynia dwukrotnie. 
	UWAGA: Celem tej procedury jest dysocjacja warstwy wewnętrznej, która może wymagać praktyki. Należy przyłożyć wystarczającą siłę, aby usunąć śródbłonek, ale nie na tyle, aby usunąć również głębsze warstwy tkanki, co zmniejszy reprezentację EC.</li>
	<li>Przenieść bufor wytrawiający do probówki o pojemności 5 ml. Dodać 1 ml buforu wytrawiającego do błony wewnętrznej i ostrożnie pipetować w górę i w dół, aby zebrać pozostałe komórki i dodać do probówki o pojemności 5 ml. Inkubować komórki w temperaturze 37 °C, obracając się z prędkością 150 obr./min przez 5 min.</li>
	<li>Dodaj 2 ml pożywki M199 (lub D-PBS, jeśli postępujesz z sekwencją scRNA) do zawiesiny komórkowej, aby wygasić reakcję enzymatyczną. Delikatnie wymieszać i odwirować w temperaturze 4 °C, 600 x g przez 5 min.</li>
	<li>Usunąć supernatant i przechowywać go oddzielnie do hodowli jako kontrolę w celu obserwacji, czy wszystkie komórki zostały wychwycone w osadzie w kroku 1.8. Ponownie zawiesić osad komórkowy w 1 ml pożywki M199 (lub D-PBS, jeśli kontynuujesz sekwencję scRNA).</li>
	<li>Ocenić żywotność komórek, mieszając 10 μl błękitu trypanowego z 10 μl zapasu komórkowego. Obserwuj morfologię komórek i policz komórki za pomocą hemocytometru. 
	UWAGA: W tym momencie komórki mogą być używane do kwantyfikacji białek lub RNA lub hodowane in vitro przy użyciu pożywek hodowlanych EC zgodnie ze standardowymi protokołami39. Alternatywnie można je przygotować do sekwencjonowania zgodnie z opisem w następnej sekcji.</li>
	<li>W celu hodowli pokryj dwie studzienki na płytce 6-dołkowej, pipetując 500 μl odczynnika przyłączającego do studzienek przez 30 minut w temperaturze pokojowej. Po usunięciu odczynnika przyłączającego i umyciu sterylnym D-PBS, należy dozować cały zapas komórek do jednego dołka, a supernatant przechowywany jako kontrolę do drugiego dołka.</li>
</ol>
2. Przygotowanie do badań scRNA-seq (szacowany czas: 3-4 h)
<ol>
	<li>Odwirować materiał komórkowy z kroku 1.11 w temperaturze 4 °C, 600 x g przez 5 minut. Usunąć supernatant i delikatnie zawiesić osad za pomocą pipety P1000 i końcówki o szerokim otworze w 1 ml 0,04% albuminy surowicy bydlęcej (BSA) w D-PBS. Dobrze wymieszaj, aby uzyskać zawiesinę jednokomórkową.</li>
	<li>Przepuść roztwór przez sitko o wielkości 40 μm, aby usunąć resztki komórek. Jeśli pozostaną zanieczyszczenia, przepuść przez drugie sitko do 4 ml 0,04% BSA w D-PBS.</li>
	<li>Wirować w temperaturze 4 °C, 600 x g przez 5 min. Usunąć supernatant i ponownie zawiesić osad w 500 μl 0,04% BSA w D-PBS za pomocą pipety P1000 z końcówką do pipety o szerokim otworze. Dobrze wymieszaj, aby uzyskać zawiesinę jednokomórkową.</li>
	<li>Ocenić żywotność komórek, mieszając 10 μl materiału komórkowego z 10 μl błękitu trypanowego. Za pomocą hemocytometru obserwuj morfologię, określ, czy występuje zawiesina pojedynczej komórki bez klastrów, sprawdź, czy nie ma resztek tkanek i oblicz liczbę żywych i martwych komórek.</li>
	<li>Jeśli komórki są skupione lub pozostały zanieczyszczenia, powtórzyć mycie 0,04% BSA w D-PBS lub ponownie przepuścić przez sitko 40 μm. 
	UWAGA: Chociaż zmniejszy to wydajność, ważne jest, aby komórki znajdowały się w czystej zawiesinie jednokomórkowej dla optymalnego sekwencjonowania.</li>
	<li>Zawiesina jednokomórkowa może być używana do sekwencjonowania scRNA.</li>
</ol>
3. Przestrzenne profilowanie transkryptomu (szacowany czas: 3-4 h)
<ol>
	<li>Dodaj izopentan (2-metylobutan) do metalowego kanistra i schładzaj w ciekłym azocie (LN2) lub suchym lodzie (preferowany jest LN2, ponieważ obniży temperaturę niż suchy lód). Wlej związek o optymalnej temperaturze cięcia (OCT) do studzienek oznaczonych plastikowych krioform, uważając, aby nie tworzyć pęcherzyków i usuwać te, które się pojawiają. Pozostaw kriomold na suchym lodzie do ostygnięcia.</li>
	<li>Wyciąć co najmniej dwa odcinki koronalne o długości 1 cm od naczynia. Za pomocą długich (12") kleszczy zanurz tkankę w izopentanie do momentu zamrożenia. Szybko zanurz tkankę w OCT w orientacji z widocznym światłem pośrodku. Zadbaj o to, aby usunąć wszelkie pęcherzyki, zwłaszcza te znajdujące się przy chusteczce.</li>
	<li>Za pomocą długich (12") kleszczy chwyć krioformy i przytrzymaj je w metalowym kanistrze. Podczas gdy podstawa form powinna znajdować się w cieczy, nie powinna być zbyt głęboka, aby izopentan mógł spływać po tkance. Obserwuj zamarzanie, OCT stanie się stopniowo biały od zewnątrz w ciągu 1-2 minut.</li>
	<li>Skrawki te należy przechowywać w szczelnie zamkniętym pojemniku w temperaturze -80 °C przez okres do 6 miesięcy. 
	UWAGA: Próbki należy zawsze utrzymywać na suchym lodzie i nie dopuszczać do więcej niż jednego cyklu zamrażania i rozmrażania. Tkanka ta może być wykorzystana do analizy histologicznej, fluorescencji RNA/DNA hybrydyzacji in situ (FISH) lub transkryptomiki przestrzennej, która zostanie teraz opisana.</li>
	<li>Ustawić temperaturę kriostatu na -20 °C dla komory i -10 °C dla głowicy próbki. Równowagi osadzone w OCT sekcje naczyń, noże, szczotki i szkiełka do -20 °C w kriostacie przez około 30 minut. Podczas wyrównywania wyczyść maszynę i wszystkie urządzenia, które mogą stykać się z sekcjami, w tym ostrze, 70% etanolem, a następnie roztworem do odkażania RNazy.</li>
	<li>Dołączyć próbkę, dozując niewielką ilość OCT na okrągły blok kriostatu i umieszczając próbkę na wierzchu przed jej zamrożeniem. Umieść klocek na środku łba próbki i przykręć go za pomocą wysokiego czarnego uchwytu po lewej stronie. Odciąć nadmiar OCT otaczającego naczynie.</li>
	<li>Ustawiając grubość cięcia na 10 μm na kriostacie, wytnij około 60 sekcji i umieść je we wstępnie schłodzonej probówce o pojemności 1,5 ml. Sekcje te zostaną wykorzystane do oceny jakości RNA. Po wyjęciu z kriostatu natychmiast dodaj 1 ml odczynnika do ekstrakcji RNA i wiruj, aż skrawki całkowicie się rozpuszczą.</li>
	<li>Dodaj 200 μl chloroformu i mieszaj, aż roztwór będzie przypominał truskawkowy koktajl mleczny. Wirować przy 11 200 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Zbierz fazę wodną (klarowna faza na wierzchu białych i różowych warstw) i dodaj do niej 500 μl izopropanolu. Wymieszać, odwracając probówki ponad 10 razy i umieścić w temperaturze -80 °C na co najmniej 20 minut.</li>
	<li>Wirować przy 11 200 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C. Rozpuścić oczyszczony osad RNA w 5 μl wody wolnej od RNaz. Sprawdź numer integralności RNA (RIN). 
	UWAGA: Preferowane są próbki o RIN ≥ 7, ale dopuszczalne jest RIN ≥ 6. Liczba skrawków tkanki i objętość roztworu do rozpuszczania RNA może wymagać optymalizacji w zależności od zastosowanego systemu, aby zapewnić, że końcowe stężenie RNA mieści się w zakresie funkcji RIN, aby umożliwić dokładną ocenę RIN.</li>
	<li>Przećwicz prawidłowe cięcie i umieszczanie skrawków w ramach odniesienia za pomocą zwykłych szkiełek przed przystąpieniem do dostępnej na rynku optymalizacji tkanek lub preparatów do ekspresji genów. Można to osiągnąć, rysując kwadraty o wymiarach 6,5 mm x 6,5 mm na zwykłym szkiełku podstawowym, schładzając do -20 °C w kriostacie i umieszczając sekcje w tym obszarze wychwytywania.</li>
	<li>Wytnij odcinki 10 μm z założoną płytką zabezpieczającą, odwróć i ostrożnie spłaszcz, delikatnie dotykając sekcji przez otaczający OCT.</li>
	<li>Używając szczotek do kriostatu bez RNaz, umieść wycinek tkanki w kwadracie, używając tylko otaczającego OCT. Natychmiast umieść jeden palec (w rękawiczkach) z tyłu obszaru przechwytywania, aby stopić sekcję do szkiełka.</li>
	<li>Po przyklejeniu się sekcji umieść szkiełko na kriobarze, aby umożliwić zamrożenie sekcji. Należy zachować ostrożność, aby uniknąć fałdowania tkanek i pokrywania się tkanek poza wyznaczonymi krawędziami ramy odniesienia. W razie potrzeby pokrój tkankę na połówki lub ćwiartki wzdłuż światła za pomocą ostrza, aby upewnić się, że sekcja naczynia mieści się w ramie o wymiarach 6,5 mm x 6,5 mm.</li>
	<li>Wyciąć 10 μm skrawki tkanki zgodnie z 3.12-3.14 na szkiełkach do optymalizacji tkanek lub ekspresji genów. Przenieś szkiełko do szkiełka umieszczonego na suchym lodzie. Przechowuj slajdy w temperaturze -80 °C przez okres do 4 tygodni przed przystąpieniem do publikowania protokołów przestrzennych33,34.</li>
</ol>
4. Analiza danych sekwencjonowania (szacowany czas: do 1 tygodnia w zależności od znajomości oprogramowania)
UWAGA: Tylko dla przestrzennej analizy transkryptomicznej, przejdź do kroku 4.8. Dane sekwencyjne scRNA są przetwarzane przy użyciu ustandaryzowanego potoku dostosowanego do ludzkiego transkryptomu referencyjnego hg38. Pakiet R Seurat (v3.2.2) służy do analizowania danych sekwencyjnych scRNA zgodnie z opublikowanymi wytycznymi40.
<ol>
	<li>Filtruj przy użyciu dobrze znanych wskaźników kontroli jakości: rzadkie komórki z bardzo dużą liczbą genów (potencjalnie wielokrotności) i komórki z wysokim procentem mitochondriów (komórki niskiej jakości lub umierające często wykazują zanieczyszczenie mitochondrialne) są usuwane.</li>
	<li>Normalizuj dane przy użyciu "sctransform", metody poprawiającej integrację próbki w porównaniu z normalizacją logarytmu. Te znormalizowane dane są używane do redukcji wymiarowości i grupowania, podczas gdy znormalizowane logarytmicznie poziomy ekspresji są używane do analizy na podstawie poziomów ekspresji genów, takich jak klasyfikacja typów komórek41.</li>
	<li>Wybierz geny markerowe dla każdego typu komórki, na przykład cząsteczkę adhezji komórek śródbłonka płytek krwi-1 (PECAM1) i czynnik von Willebranda (VWF) dla EC, lumikan (LUM) i prokolagen C-Endopeptidas Enhancer (PCOLCE) dla fibroblastów, gen translokacji komórek B 1 (BTG1) i CD52 dla makrofagów, C1QA i C1QB dla monocytów oraz łańcuch ciężki miozyny 11 (MYH11) i transgelina (TAGLN) dla komórek mięśni gładkich naczyń krwionośnych36.</li>
	<li>Oblicza średni poziom wyrażenia w pojedynczych komórkach między każdą parą markerów, aby mieć pojedynczy znacznik o średnim poziomie wyrażenia skojarzonym z każdą komórką type42.</li>
	<li>Zastosuj model mieszaniny Gaussa (GMM) z dwoma składnikami do danych ekspresji każdego markera w pojedynczych komórkach, aby rozdzielić komórki na dwa zestawy, a mianowicie o wysokiej ekspresji markera i niskiej ekspresji markera. W ten sposób dla każdego znacznika każda pojedyncza komórka jest przypisana do jednego z dwóch komponentów42.</li>
	<li>Użyj wzbogacenia statystycznego dla zestawu genów markerowych, dokładnego testu Fishera, aby przypisać typ komórki do każdego klastra. W ten sposób uzyskuje się zestaw wartości p dla każdego klastra, z których każda odpowiada typowi komórki. Typ komórki o najniższej wartości p jest przypisany do tego klastra.</li>
	<li>Przetwarzanie przestrzennych danych transkryptomicznych przy użyciu potoków Space Ranger, co skutkuje przestrzennym odkodowaniem kreskowym i generowaniem wskaźników kontroli jakości (QC), w tym całkowitych wyrównanych odczytów do ludzkiego transkryptomu hg38, mediany liczby unikalnego identyfikatora molekularnego (UMI) lub genów na spot35. 
	UWAGA: Pakiet R Seurat (v3.2.2) jest używany do analizowania danych przetwarzanych przez Space Ranger zgodnie z opublikowanymi wytycznymi40.</li>
	<li>Normalizuj dane za pomocą "sctransform", metody, która, jak wykazano, poprawia dalszą analizę w porównaniu z normalizacją logarytmiczną, biorąc pod uwagę niejednorodność tkanki i bardzo wysoką wariancję zliczeń w plamach.</li>
</ol>

S.Z. jest założycielem i członkiem zarządu Genemo, Inc.

Prezentowany przepływ pracy szczegółowo opisuje zestaw technik profilowania EC z pojedynczego fragmentu ludzkiej tętnicy z rozdzielczością jednokomórkową i przestrzenną. W protokole znajduje się kilka krytycznych kroków i czynników ograniczających. Jednym z kluczy do profilowania transkryptomu jest świeżość tkanki i integralność RNA. Ważne jest, aby przed przetwarzaniem utrzymać tkanki na lodzie w jak największym stopniu, aby zminimalizować degradację RNA. Zazwyczaj tkanki pośmiertne są przetwarzane w okresie od 8 do 14 ...

Komórki śródbłonka (EC) wyściełające światło naczyń krwionośnych są kluczowymi regulatorami napięcia naczyniowego i perfuzji tkanek. EC są niezwykłe pod względem zdolności do reagowania na środowisko zewnątrzkomórkowe i przystosowywania się do zmian w dynamice i składzie przepływu krwi. Te dynamiczne odpowiedzi są pośredniczone przez sieć wewnątrzkomórkowych zdarzeń sygnalizacyjnych, w tym modulacje transkrypcyjne i potranskrypcyjne z rozdzielczością czasoprzestrzenną. Rozregulowanie tych odpowiedzi jest związane z wieloma patologiami, w tym między innymi z chorobami układu krążenia, cukrzycą i rakiem1,2.
Duża część badań wykorzystuje linie komórkowe lub modele zwierzęce do badania transkryptomu EC. To pierwsze jest przydatnym narzędziem, biorąc pod uwagę względną łatwość użycia i niedrogość. Jednak hodowla seryjna może wprowadzić zmiany fenotypowe do EC, takie jak cechy fibroblastyczne i brak polaryzacji, odłączając je od stanu in vivo3. Komórki pierwotne, np. ludzka żyła pępowinowa EC (HUVEC) są popularnym wyborem od lat 80. XX wieku, ale pochodzą z rozwojowego łożyska naczyniowego, które nie istnieje u dorosłych, a zatem jest mało prawdopodobne, aby w pełni reprezentowały dojrzałe EC. Zwierzęta, zwłaszcza modele mysie, lepiej reprezentują fizjologiczne lub patofizjologiczne środowisko EC i umożliwiają badanie transkryptomów w wyniku zaburzeń genetycznych. Mysie EC można izolować z różnych tkanek, w tym z aorty, płuc i tkanki tłuszczowej za pomocą procedur opartych na enzymach4,5,6,7. Jednak izolowane komórki nie mogą być używane do wielu przejść, chyba że zostaną przekształcone6 i często mają ograniczoną liczbę, co wymaga łączenia wielu zwierząt5,8,9.
Pojawienie się nowych technologii badających architekturę naczyń na poziomie transkryptomicznym, szczególnie w przypadku rozdzielczości pojedynczej komórki, umożliwiło nową erę biologii śródbłonka, ujawniając nowe funkcje i właściwości ECs5, 10,11,12,13,14. Bogaty zasób stworzony przez badaczy Tabula Muris zebrał profile transkryptomiczne pojedynczych komórek 100 000 komórek, w tym EC, w 20 różnych narządach myszy15, które ujawniły zarówno wspólne geny markerów EC, jak i unikalne sygnatury transkryptomiczne z różnicami między i wewnątrz tkanek5,13. Niemniej jednak istnieją wyraźne różnice między myszą a człowiekiem w genomie, epigenomie i transkryptomie, zwłaszcza w regionach niekodujących16,17,18. Te wyżej wymienione wady podkreślają znaczenie analizy EC przy użyciu próbek ludzkich w celu uzyskania wiernego profilu EC w ich naturalnym stanie pod względem zdrowia i choroby.
Większość metod izolacji EC opiera się na fizycznej dysocjacji poprzez homogenizację, drobne cięcie i mielenie tkanki przed inkubacją z enzymami proteolitycznymi przez różne czasy. Enzymy i warunki różnią się również znacznie w zależności od typu tkanki, od trypsyny po kolagenazę, stosowane samodzielnie lub w połączeniu19,20,21. Często stosuje się dalsze wzbogacanie lub oczyszczanie oparte na przeciwciałach w celu zwiększenia czystości EC. Zazwyczaj przeciwciała przeciwko markerom błonowym EC, np. CD144 i CD31 są sprzężone z kulkami magnetycznymi i dodawane do zawiesiny komórkowej22,23. Taka strategia może być ogólnie zaadaptowana do izolacji EC z wielu tkanek ludzkich i mysich, w tym technik wprowadzonych w tym protokole.
W swoim stanie naturalnym, EC oddziałują z wieloma typami komórek i mogą istnieć w niszach naczyniowych, gdzie bliskość komórek jest kluczowa dla ich funkcjonowania. Podczas gdy badania nad sekwencjonowaniem RNA pojedynczej komórki i pojedynczego jądra (scRNA i snRNA-seq) miały kluczowe znaczenie dla ostatnich przełomów w opisie heterogeniczności EC, proces dysocjacji zaburza kontekst tkankowy i kontakt komórka-komórka, które są również ważne dla zrozumienia biologii EC. Opracowane w 2012 roku i nazwane Metodą Roku 202024, przestrzenne profilowanie transkryptomu zostało wykorzystane do profilowania globalnej ekspresji genów przy zachowaniu cech przestrzennych w różnych tkankach, w tym brain25, tumor26 i tkanka tłuszczowa27. Technologie te mogą być ukierunkowane przy użyciu specjalistycznych sond specyficznych dla określonych sekwencji RNA przyłączonych do odczynników powinowactwa lub znaczników fluorescencyjnych, wykrywając w ten sposób wybrane geny w rozdzielczości subkomórkowej28,29,30,31. Mogą być również nieukierunkowane32,33, zazwyczaj wykorzystując przestrzennie kodowane oligonukleotydy do wychwytywania RNA, które razem przekształcają się w cDNA w celu późniejszego przygotowania biblioteki sekwencyjnej, a zatem mają tę zaletę, że dedukują ekspresję genów w całej tkance w bezstronny sposób. Jednak rozdzielczość przestrzenna nie jest obecnie osiągana na poziomie pojedynczej komórki przy użyciu dostępnych na rynku technologii. Można to do pewnego stopnia przezwyciężyć dzięki integracji danych z danymi scRNA-seq, co ostatecznie pozwala na mapowanie transkryptomu pojedynczej komórki w złożonym kontekście tkankowym, zachowując jednocześnie oryginalną informację przestrzenną34.
Tutaj, opisano przepływ pracy do profilowania transkryptomu EC za pomocą ludzkiej tętnicy krezkowej górnej, tętnicy obwodowej, która została wykorzystana do badania rozszerzenia naczyń krwionośnych, przebudowy naczyń krwionośnych, stresu oksydacyjnego i stanu zapalnego35,36,37. Opisano dwie techniki: 1) izolowanie i wzbogacanie EC z błony wewnętrznej naczyń krwionośnych, łącząc dysocjację mechaniczną i trawienie enzymatyczne, odpowiednie do sekwencjonowania transkryptomu pojedynczej komórki lub późniejszej hodowli in vitro; 2) przygotowanie odcinków tętniczych do przestrzennego profilowania transkryptomu (<silna klasa="xfig">Ryc. 1). Te dwie techniki mogą być wykonywane niezależnie lub komplementarnie w celu profilowania EC i otaczających je komórek. Co więcej, ten przepływ pracy można dostosować do zastosowania na dowolnej średniej lub dużej tętnicy.

<table><tbody><tr><td>Mikroprobówka wirówkowa 1,5 ml</td><td>USA Scientific</td><td>1615-5500</td><td></td></tr><tr><td>10 cm naczynie</td><td>Genesee Scientific</td><td>25-202</td><td></td></tr><tr><td>23G igły</td><td>BD</td><td>305145</td><td></td></tr><tr><td>2-metylobutan</td><td>Thermo Fisher</td><td>AC327270010</td><td></td></tr><tr><td>40 &micro; m Filtr siatkowy</td><td>Fisher</td><td>14100150</td><td></td></tr><tr><td>4200 System TapeStation</td><td>Agilent Technologies</td><td>G2991BA</td><td></td></tr><tr><td>Probówka 5 ml</td><td>Thermo Fisher</td><td>14282300</td><td></td></tr><tr><td>6-dołkowa płytka</td><td>Greiner Bio-One</td><td>07-000-208</td><td></td></tr><tr><td>Współczynnik przyłączenia</td><td>Zastosowania komórek</td><td>123-500</td><td>Odczynnik przyłączeniowy w protokole</td></tr><tr><td>wosk</td><td></td><td></td><td>Można użyć dowolnego komercyjnego czarnego wosku</td></tr><tr><td>Surowica bydlęca Albumina poddana szokowi cieplnemu</td><td>Fisher</td><td>BP1600-100</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Fisher</td><td>BP510</td><td></td></tr><tr><td>Wirówka</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Chloroform</td><td>Fisher</td><td>C607</td><td></td></tr><tr><td>Kolagenaza D</td><td>Roche</td><td>11088866001</td><td></td></tr><tr><td>Kriostat</td><td>Szczotki</td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td>Leica Cryostat</td></tr><tr><td>D-Glucose</td><td>Fisher</td><td>D16-1</td><td></td></tr><tr><td>Dimetylosulfotlenek</td><td>Fisher</td><td>MT25950CQC</td><td></td></tr><tr><td>Dispase II</td><td>Roche</td><td>4942078001</td><td>Proteaza pochodzenia bakteryjnego w protokole</td></tr><tr><td>Jednorazowe bezpieczne skalpele</td><td>Myco Instrumentation</td><td>6008TR-10</td><td></td></tr><tr><td>D-PBS</td><td>Thermo Fisher</td><td>14080055</td><td></td></tr><tr><td>Etanol</td><td>Fisher</td><td>BP2818-4</td><td></td></tr><tr><td>Surowica bydlęca płodu</td><td></td> Hemocytometr <td>Fisher 10437028</td><td></td></tr><tr><td>Fisher</td><td></td><td>267110</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma Aldrich</td><td>H3375-100g</td><td></td></tr><tr><td>Bufor do próbek D1000 o wysokiej czułości</td><td>Agilent Technologies</td><td>5067-5603</td><td></td></tr><tr><td>Taśma sitowa D1000 o wysokiej czułości</td><td>Inkubator</td><td></td> Agilent Technologies 5067-5584 <td></td></tr><tr><td></td> Utrzymywany w temperaturze 37 stopni;<td></td><td></td><td> C 5% CO2</td></tr><tr><td>Isopropanol</td><td>Fisher</td><td>BP26324</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Fisher</td><td>P217-3</td><td></td></tr><tr><td>Ciekły azot</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Medium 199</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M2520-10X</td><td></td></tr><tr><td>Kanister</td><td></td><td></td><td></td>metalowy</tr><tr><td>Mikroskop</td><td>Leica</td><td></td><td>Do oceny morfologii komórki</td></tr><tr><td>Pożywka do hodowli śródbłonka mikronaczyniowego</td><td>Zastosowania komórkowe</td><td>111-500</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Fisher</td><td>S271-1</td><td></td></tr><tr><td>New Brunswick Innova 44/44R Wytrząsarka orbitalna</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Optymalna temperatura cięcia związek</td><td>Fisher</td><td>4585</td><td></td></tr><tr><td>Krioformy plastikowe</td><td>Fisher</td><td>22363553</td><td></td></tr><tr><td>Taśma</td> <td>sitowa RNAAgilent Technologies</td><td>5067-5576</td><td></td></tr><tr><td>Ekran RNA Bufor próbki taśmy</td><td>Agilent Technologies</td><td>5067-5577</td><td></td></tr><tr><td>RNase ZAP</td><td>Thermo Fisher</td><td>AM9780</td><td></td></tr><tr><td>Woda wolna od RNaz</td><td>Takara</td><td>RR036B</td><td>Woda wolna od RNaz (2) w zestawie</td></tr><tr><td>Sterylne kleszcze długie 12"</td><td>FST</td><td>91100-16</td><td></td></tr><tr><td>Sterylne kleszcze drobne</td><td>FST</td><td>11050-10</td><td></td></tr><tr><td>Sterylne cienkie nożyczki</td><td>FST</td><td>14061-11</td><td></td></tr><tr><td>Superfrost PLUS Gold Slides</td><td>Odczynnik Fisher</td><td>1518848</td><td></td></tr><tr><td>TRIzol</td><td>Fisher</td><td>15596018</td><td></td></tr><tr><td>Trypan Blue</td><td>Corning</td><td>MT25900CI</td><td></td></tr><tr><td>TrypLE Express Enzyme (1X) czerwień fenolowa</td><td>Thermo Fisher</td><td>12605010</td><td>Enzym dysocjacji komórek w protokół</td></tr><tr><td>Zestaw akcesoriów Visium</td><td>10X Genomics</td><td>PN-1000215</td><td></td></tr><tr><td>Pakiet bramki Visium, 2rxns</td><td>10X Genomics</td><td>PN-1000316</td><td></td></tr><tr><td>Slajd do przestrzennej ekspresji genów Visium i Zestaw odczynników, 4 rxns</td><td>10X Genomics</td><td>PN-1000184</td><td></td></tr></tbody></table>

izolacja i profilowanie ludzkich pierwotnych komórek śródbłonka tętnic krezkowych na poziomie transkryptomu

Isolation and Profiling of Human Primary Mesenteric Arterial Endothelial Cells at the Transcriptome Level

Komórki śródbłonka (EC) są kluczowe dla funkcjonowania naczyń krwionośnych i całego ciała poprzez ich dynamiczną reakcję na sygnały środowiskowe. Wyjaśnienie transkryptomu i epigenomu EC ma zasadnicze znaczenie dla zrozumienia ich roli w rozwoju, zdrowiu i chorobie, ale jest ograniczone pod względem dostępności izolowanych komórek pierwotnych. Najnowsze technologie umożliwiły wysokoprzepustowe profilowanie transkryptomu i epigenomu EC, co doprowadziło do identyfikacji nieznanych wcześniej subpopulacji komórek EC i trajektorii rozwojowych. Podczas gdy kultury EC są użytecznym narzędziem w badaniu funkcji i dysfunkcji EC, warunki hodowli i wielokrotne pasaże mogą wprowadzać zmienne zewnętrzne, które zmieniają właściwości natywnego EC, w tym morfologię, stan epigenetyczny i program ekspresji genów. Aby przezwyciężyć to ograniczenie, w niniejszej pracy przedstawiono metodę izolowania ludzkich pierwotnych EC od tętnic krezkowych dawcy w celu uchwycenia ich rodzimego stanu. EC w warstwie wewnętrznej są dysocjowane mechanicznie i biochemicznie za pomocą określonych enzymów. Powstałe w ten sposób komórki można bezpośrednio wykorzystać do sekwencjonowania masowego RNA lub jednokomórkowego RNA lub posiać je do hodowli. Ponadto opisano przebieg pracy w celu przygotowania ludzkiej tkanki tętniczej do transkryptomiki przestrzennej, w szczególności dla dostępnej na rynku platformy, chociaż metoda ta nadaje się również do innych technik profilowania transkryptomu przestrzennego. Metodologia ta może być stosowana do różnych naczyń pobranych od różnych dawców w stanie zdrowia lub choroby, aby uzyskać wgląd w regulację transkrypcyjną i epigenetyczną EC, co jest kluczowym aspektem biologii komórek śródbłonka.

Przedstawiono tutaj analizę ECs z tętnicy krezkowej z wykorzystaniem kombinacji dysocjacji mechanicznej i enzymatycznej lub kriokonserwacji do zastosowania w różnych badaniach w dalszym etapie (Rycina 1). Profilowanie ECs w tętnicach krezkowych można przeprowadzić w następujący sposób: A) dysocjacja mechaniczna z błony wewnętrznej połączona z trawieniem kolagenazą w celu hodowli komórek; B) przygotowanie zawiesiny pojedynczych komórek do scRNA-seq; lub C) przetoki tętnicy mogą zostać zatopio...

Protokół opisuje izolację, hodowlę i profilowanie komórek śródbłonka z ludzkiej tętnicy krezkowej. Dodatkowo opracowano metodę przygotowania tętnicy człowieka do transkryptomiki przestrzennej. Proteomika, transkryptomika i testy funkcjonalne mogą być wykonywane na izolowanych komórkach. Protokół ten można zastosować do każdej tętnicy średniej lub dużej wielkości.

Izolacja i profilowanie ludzkich pierwotnych komórek śródbłonka tętnic krezkowych na poziomie transkryptomu

Endothelial cells (ECs) are crucial for vascular and whole-body function through their dynamic response to environmental cues. Elucidating the ...

Scharakteryzowanie ekspresji genów na poziomie transkryptomicznym jest kluczem do zrozumienia funkcji komórek w zdrowiu i chorobie. Nasza metoda koncentruje się na wychwytywaniu komórek śródbłonka, kluczowej warstwy ściany naczyniowej, z tętnic menestrowych ludzkich dawców w celu profilowania transkryptomicznego z rozdzielczością jednokomórkową i przestrzenną. Istnieje wzbogacona populacja komórek śródbłonka z naczynia bez etapu sortowania, co może powodować utratę komórek.Ponadto istnieją inne typy komórek, które pozwalają na badanie interakcji komórka-komórka w kontekście tkankowym. Wykorzystaliśmy tę technikę do zbadania zmian tętniczych w cukrzycy i otyłości. W zależności od dostępności naczynia, techniki te mogą być również wykorzystane do badania biologii w innych naczyniach krwionośnych i innych chorobach.Jeśli jest to pierwszy raz, dwa kluczowe kroki wymagają najwięcej praktyki. Po pierwsze, skrobanie, chociaż należy wywierać odpowiednią siłę, aby usunąć integralne komórki bez odrywania głębszych warstw. A po drugie, cięcie kriostatu.Upewnij się, że sekcje są zimne, płaskie i mieszczą się w granicach specjalistycznej zjeżdżalni. Procedurę zademonstrują Yingjun Luo i Xiaofang Tang, dwaj doktoranci z mojego laboratorium. Aby rozpocząć, umyj chusteczkę za pomocą DPBS.Za pomocą sterylnych kleszczy i nożyczek preparacyjnych usuń tłuszcz i zewnętrzną tkankę łączną, aż naczynie będzie czyste. Zmierz długość naczynia linijką umieszczoną na zewnątrz naczynia i zrób dokumentację fotograficzną. Przeciąć tętnicę krezkową wzdłuż nożyczkami, aby otworzyć światło naczynia w pionie.Za pomocą igieł przymocuj naczynie do czarnego wosku we wszystkich czterech rogach, odsłaniając błonę wewnętrzną. Dodaj jeden mililitr wstępnie podgrzanego buforu wytrawiającego do błony wewnętrznej. Za pomocą sterylnego skalpela delikatnie zeskrob dwukrotnie światło naczynia.Przenieść bufor wytrawiający do probówki. Dodać jeden mililitr buforu wytrawiającego do błony wewnętrznej i ostrożnie pipetować w górę iw dół, aby zebrać pozostałe komórki i przenieść zawiesinę komórkową do probówki. Inkubuj komórki w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez pięć minut w inkubatorze lub na kołysce.Dodaj pożywkę M199 do zawiesiny komórkowej, aby wygasić reakcję enzymatyczną i delikatnie wymieszać. Odwirować zawiesinę przez pięć minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza i 600 razy G.At końcem wirowania, wyjąć i przechowywać supernatant oddzielnie jako kulturę kontrolną w celu obserwacji, czy wszystkie komórki zostały wychwycone w osadzie. Następnie ponownie zawiesić osad komórkowy w jednym mililitrze pożywki M199.Oceń żywotność komórek, mieszając 10 mikrolitrów błękitu trypanowego z 10 mikrolitrami zapasu komórkowego. Obserwuj morfologię komórek i policz komórki za pomocą hemocytometru. Pokryj dwie studzienki na płytce sześciodołkowej, pipetując 500 mikrolitrów odczynnika przyłączającego do studzienek przez 30 minut w temperaturze pokojowej.Po umyciu studzienek sterylnym DPBS, należy dozować cały zapas komórek do jednej studzienki, a supernatant jest przechowywany jako kontrola w drugiej studzience. Odwirować wcześniej przygotowany wywar komórkowy w temperaturze czterech stopni Celsjusza i 600 razy G przez pięć minut. Usunąć supernatant i delikatnie zawiesić osad za pomocą pipety P-1000 w 0,04% BSA w DPBS.Dobrze wymieszaj, aby uzyskać zawiesinę jednokomórkową. Przepuść roztwór przez sitko o średnicy 40 mikrometrów, aby usunąć resztki komórek. Następnie odwirować zawiesinę i usunąć supernatant, jak pokazano.Ponownie zawiesić osad w 500 mikrolitrach 0,04% BSA w DPBS za pomocą pipety P-1000 i dobrze wymieszać, aby uzyskać zawiesinę jednokomórkową. Jak wykazano wcześniej, oceń żywotność komórek za pomocą błękitu trypanowego. Za pomocą hemocytometru lub automatycznego licznika komórek obserwuj morfologię zawiesiny pojedynczej komórki, sprawdź, czy nie ma resztek tkanek i oblicz liczbę żywych i martwych komórek.Po dodaniu izopentanu do metalowego kanistra schłodzić w ciekłym azocie lub suchym lodzie. Wlej związek OCT do studzienek z oznakowanej plastikowej formy kriogenicznej, zapobiegając tworzeniu się pęcherzyków. Pozostaw formę kriogeniczną na suchym lodzie do ostygnięcia.Wytnij co najmniej dwa odcinki czołowe o długości jednego centymetra na długości naczynia. Za pomocą 12-calowych kleszczy zanurz tkankę w izopentanie, aż zostanie zamrożona. Szybko zanurz tkankę w OCT w orientacji z widocznym światłem pośrodku.Chwyć i umieść formy kriogeniczne na suchym lodzie i obserwuj zamarzanie. OCT stanie się stopniowo biały od zewnątrz w ciągu jednej do dwóch minut. Przechowuj te sekcje w zabezpieczonym pojemniku w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza do sześciu miesięcy.Ustaw żądaną temperaturę kriostatu dla komory i głowicy próbki. Zrównoważyć sekcje naczyń osadzone w OCT, noże, szczotki i szkiełka do minus 20 stopni Celsjusza w kriostacie przez około 30 minut. Podczas wyrównywania wyczyść maszynę i wszystkie urządzenia, które mogą stykać się z sekcjami, w tym ostrze, 70% etanolem, a następnie roztworem do odkażania RNazy.Dołączyć próbkę, dozując niewielką ilość OCT na okrągły blok kriostatu i umieszczając próbkę na wierzchu przed jej zamrożeniem. Po umieszczeniu klocka w środku główki próbki, przykręć klocek na miejscu za pomocą wysokiego czarnego uchwytu po lewej stronie. Odciąć nadmiar OCT otaczającego naczynie.Ustawiając grubość cięcia na 10 mikrometrów na kriostacie, wytnij około 60 odcinków i umieść je we wstępnie schłodzonej 1,5-mililitrowej probówce zawierającej odczynnik do ekstrakcji RNA. Wiruj, aż skrawki całkowicie się rozpuszczą. Wyekstrahuj RNA zgodnie z opisem w manuskrypcie tekstowym i rozpuść oczyszczoną osadkę RNA w pięciu mikrolitrach wody wolnej od RNaz.Wytnij odcinki o grubości 10 mikrometrów z założoną płytką zabezpieczającą. Odwróć i ostrożnie spłaszcz, delikatnie dotykając sekcji przez otaczający OCT. Wytrzyj szkiełko etanolem i wstępnie rozgrzej palcem tylną część obszaru przechwytywania.Używając szczotek do kriostatu bez RNaz lub bezpośrednio szkiełka, umieść wycinek tkanki w kwadracie, używając tylko otaczającego OCT. Natychmiast umieść jeden palec z tyłu obszaru przechwytywania, aby stopić sekcję ze szkiełkiem. Gdy sekcja przylgnie, umieść szkiełko na listwie kriogenicznej, aby umożliwić zamrożenie sekcji.Wytnij skrawki tkanki o grubości 10 mikrometrów, jak pokazano wcześniej, na szkiełkach do optymalizacji tkanek lub ekspresji genów. Przenieś szkiełko do szkiełka umieszczonego na suchym lodzie. Rysunek przedstawia izolowane EC hodowane przy użyciu opisanego protokołu, wykazujące wyraźną morfologię przypominającą bruk z minimalną ilością komórek zanieczyszczających.Ekspresję markera EC kadheryny śródbłonka naczyniowego potwierdzono za pomocą immunofluorescencji wizualizującej połączenia międzykomórkowe. Około 80% komórek było CD31-dodatnich, co wskazuje, że ludzkie EC tętnicze krezkowe stanowiły większość świeżo wyizolowanej populacji komórek. Nieudane izolacje skutkują powstaniem komórek o zaburzonej morfologii, potencjalnie wykazujących ekspresję markerów mezenchymalnych lub wydłużających się przypominających stan fibroblastyczny.Rysunek przedstawia reprezentatywną jednorodną aproksymację i projekcję rozmaitości izolowanej dla tętnicy krezkowej przy użyciu obecnego protokołu sekwencjonowania jednokomórkowego RNA na izolowanym ludzkim ECS tętniczym krezkowym, z 34% komórkami zgrupowanymi jako EC przy użyciu PECAM1 i VWF jako markerów. RNA wysokiej jakości powinno wykazywać liczbę integralności RNA nie mniejszą niż sześć, a stosunek prążków rybosomalnego RNA 28S do 18S jest jak najbardziej zbliżony do dwóch. Słabe lub brak tych sygnałów rybosomalnego RNA można zaobserwować, gdy RNA są degradowane.Barwienie hematoksyliną i eozyną uwidoczniło morfologię naczynia, co pozwoliło na identyfikację obszarów zainteresowania. Ekspresję genów zwizualizowano za pomocą przestrzennego zakotwiczenia na naczyniu barwionym hematoksyliną i eozyną. Z tkankami i komórkami należy obchodzić się ostrożnie, aby utrzymać jakość RNA, szczególnie w przypadku przestrzennego profilowania transkryptomu.Upewnij się, że tkanka jest umieszczona na suchym lodzie, aby zmniejszyć degradację RNA. Z skrawkami i tkankami należy również obchodzić się za pomocą wstępnie schłodzonych narzędzi. Udało nam się zbadać zmiany ekspresji genów EC, w tym LncRNA w kontekście cukrzycy i ich interakcji z innymi typami komórek.Możemy wywnioskować lokalizację tych zmian transkryptomicznych za pomocą technik przestrzennego profilowania transkryptomu.

isolation-profiling-human-primary-mesenteric-arterial-endothelial

Research

JoVE Journal

Medicine

Medycyna

Prezentujemy preparat do wizualizacji i manipulowania sygnalizacją wapniową w natywnym, nienaruszonym śródbłonku mikronaczyniowym. Śródbłonek świeżo wyizolowany z tętnic oporowych myszy zaopatrujących mięśnie szkieletowe zachowują morfologię in vivo i dynamiczną sygnalizację w sąsiednich komórkach i między nimi. Rurki śródbłonka można przygotować z mikronaczyń innych tkanek i narządów.

Izolacja śródbłonka mikronaczyniowego z tętnic oporowych myszy

Komórki śródbłonka naczyniowego odgrywają znaczącą rolę w wielu ważnych zaburzeniach sercowo-naczyniowych. W tym artykule opisano prostą metodę izolowania i rozszerzania komórek śródbłonka z aorty myszy bez użycia specjalnego sprzętu. Nasz protokół zapewnia skuteczny sposób identyfikacji mechanizmów w fizjopatologii komórek śródbłonka.

Izolacja i pierwotna hodowla komórek śródbłonka aorty myszy

Ten protokół jest przygotowany, aby podzielić się naszą metodą izolowania komórek śródbłonka naczyń wieńcowych myszy w celu obrazowania lub przeprowadzania eksperymentów z biologii molekularnej.

Izolacja mysich komórek śródbłonka naczyń wieńcowych

Komórki śródbłonka guza są ważnymi determinantami mikrośrodowiska guza i przebiegu choroby. W tym miejscu opisano protokół izolacji czystych i żywotnych komórek śródbłonka z ludzkiego raka jelita grubego i normalnej okrężnicy, który ma być stosowany w testach narkotykowych i badaniach nad patogenezą.

Izolacja ludzkich komórek śródbłonka z normalnego raka jelita grubego i raka jelita grubego - ulepszony protokół

Odróżnienie białych i beżowych adipocytów od komórek progenitorowych naczyń tkanki tłuszczowej niesie ze sobą potencjał do metabolicznej poprawy otyłości. Opisujemy protokoły izolacji komórek śródbłonka CD34 + CD31 + z ludzkiego tłuszczu oraz późniejszej ekspansji i różnicowania in vitro do białych i beżowych adipocytów. Omówiono kilka dalszych zastosowań.

Izolacja, ekspansja i indukcja adipogenna komórek śródbłonka CD34+CD31+ z ludzkiej tkanki tłuszczowej i podskórnej

Mikronaczyniowe komórki śródbłonka mięśni szkieletowych (MMEC) kształtują wewnętrzną ścianę naczyń włosowatych mięśni i regulują zarówno wymianę płynów/molekuł, jak i migrację komórek (immunologicznych) między tkanką mięśniową a krwią. Opisana tutaj izolacja pierwotnego mysiego MMEC umożliwia kompleksowe badania in vitro "jednostki mięśniowo-naczyniowej".

Izolacja pierwotnych mysich komórek śródbłonka mikronaczyniowego mięśni szkieletowych

Przedstawiamy prosty protokół izolacji komórek jednojądrzastych krwi obwodowej z krwi pełnej uzyskanej od pacjentów, u których zdiagnozowano zespół Sézary'ego, a następnie selekcję limfocytów T CD4+, ich stymulację octanem forbolu12-mirystynian13 i jonoforem A23187 oraz przygotowanie RNA do profilowania transkryptomicznego.

Izolowanie ludzkich komórek jednojądrzastych krwi obwodowej i limfocytów T CD4+ od pacjentów z zespołem Sézary'ego w celu profilowania transkryptomicznego

Przedstawiamy metodę izolowania komórek i jąder śródbłonka od światła tętnic szyjnych myszy wystawionych na stabilne lub zaburzone warunki przepływu w celu przeprowadzenia eksperymentów omicznych na pojedynczych komórkach.

Izolacja komórek śródbłonka ze światła tętnic szyjnych myszy do eksperymentów multiomicznych na pojedynczych komórkach

Ten protokół opisuje metodę izolacji mysich komórek śródbłonka siatkówki po urodzeniu, zoptymalizowanych pod kątem wydajności, czystości i żywotności komórek. Komórki te nadają się do sekwencjonowania nowej generacji.

Izolacja mysich komórek śródbłonka siatkówki do sekwencjonowania nowej generacji

Ten protokół szczegółowo opisuje metodę preparacji mysich magazynów tłuszczu oraz izolacji i trawienia odpowiednich tętnic w celu uwolnienia, a następnie zidentyfikowania populacji komórek śródbłonka. Świeżo wyizolowane komórki wykorzystywane w dalszych zastosowaniach przyczynią się do lepszego zrozumienia biologii komórek naczyniowych i mechanizmów dysfunkcji naczyń krwionośnych.

Izolacja i identyfikacja komórek śródbłonka naczyń krwionośnych z różnych magazynów tłuszczu do dalszych zastosowań

Ten protokół opisuje izolację komórek śródbłonka myszy z całej trzustki.

Izolacja komórek śródbłonka trzustki myszy

Poznaj izolację i profilowanie transkryptomowe ludzkich komórek śródbłonka z tętnic krezkowych. Ta metoda umożliwia analizę interakcji komórkowych w kontekście tkankowym oraz badanie zmian w cukrzycy i otyłości.

Izolacja i profilowanie ludzkich pierwotnych komórek śródbłonka tętnic krezkowych na poziomie transkryptomu

Przeglądaj więcej filmów