Name: Rejestracja stanów przejściowych wapnia w mysim połączeniu nerwowo-mięśniowym z wysoką rozdzielczością czasową przy użyciu mikroskopii konfokalnej (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-12-01T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 12 s
Description: Poznaj metodę rejestracji szybkich stanów przejściowych wapnia w mysich zakończeniach nerwowo-mięśniowych z wysoką rozdzielczością czasową przy użyciu mikroskopii konfokalnej.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Badania fluorescencyjne tej pracy zostały przeprowadzone dzięki finansowemu wsparciu Grantu Rosyjskiej Fundacji Naukowej (nr projektu 19-15-00329). Metoda została opracowana w ramach finansowania z zadania rządowego dla FRC Kazańskie Centrum Naukowe RAS ААААА-А8-118022790083-9. Badania zostały opracowane z wykorzystaniem aparatury Federalnego Centrum Badawczego "Kazańskie Centrum Naukowe RAS". Autorzy pragną podziękować dr Wiktorowi I. Iljinowi za krytyczną lekturę tego manuskryptu.

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

W artykule przedstawiono metodę ładowania barwnika wrażliwego na Ca2+ do zakończeń nerwowych myszy przez kikut nerwowy i rejestrowania szybkiego stanu przejściowego wapnia za pomocą mikroskopu konfokalnego. W wyniku zastosowania tej metody obciążenia, większość synaps zlokalizowanych w pobliżu kikuta nerwowego miała wystarczający poziom fluorescencji, aby umożliwić rejestrację wejścia wapnia do zakończeń nerwowych w odpowiedzi na stymulację nerwu ruchowego o niskiej częstotliwości.
...

Problem pomiaru szybkich fal wapniowych w komórkach pobudliwych jest jednym z najważniejszych i najtrudniejszych aspektów badania transmisji sygnałów w ośrodkowym i obwodowym układzie nerwowym. Jony wapnia odgrywają ważną rolę w wyzwalaniu uwalniania neuroprzekaźników, plastyczności synaptycznej i modulacji aktywności różnych białek wewnątrzkomórkowych1,2,3,4,5. Badanie sygnalizacji wapniowej jest również ważne dla znalezienia sposobów leczenia chorób neurodegeneracyjnych6. Do pomiaru zmian poziomu wapnia powszechnie stosuje się fluorescencyjne barwniki wrażliwe na wapń, a zmiany ich poziomu fluorescencji są analizowane7,8,9.
Ładowanie barwników wapniowych do komórek można osiągnąć na różne sposoby. Głównie stosuje się barwniki przepuszczalne dla komórek10,11. Jednak w takim przypadku nie tylko trudno jest kontrolować stężenie barwnika wewnątrz komórki, ale także trudno jest wybrać komórki docelowe do obciążenia. Metoda ta nie ma zastosowania do badania zakończeń nerwów obwodowych, ponieważ barwnik dostaje się do komórek postsynaptycznych. Zamiast tego barwniki nieprzepuszczalne dla komórek są bardziej odpowiednie dla takich preparatów. W tym przypadku barwniki są dostarczane do komórek za pomocą mikroiniekcji lub pipety krostowej12,13,14. Istnieje również metoda ładowania przez kikut nerwu. Ta ostatnia metoda jest najbardziej odpowiednia dla preparatów połączeń nerwowo-mięśniowych15,16,17,18,19,20. Pozwala na wykonanie barwienia tylko dla interesujących komórek. Chociaż metoda ta nie zapewnia dokładnej oceny stężenia barwnika w komórce docelowej, stężenie można oszacować w przybliżeniu, porównując poziom fluorescencji komórek w spoczynku w roztworach o znanym stężeniu wapnia21. W pracy przedstawiono modyfikację tej metody zastosowanej do synaps ssaków.
Wprowadzanie wapnia podczas fazy depolaryzacji potencjału czynnościowego jest szybkim procesem, szczególnie w połączeniu nerwowo-mięśniowym; dlatego do jego rejestracji wymagany jest odpowiedni sprzęt<klasa SUP="xref">1. Niedawne badanie z użyciem wrażliwego na napięcie barwnika fluorescencyjnego wykazało, że czas trwania potencjału czynnościowego w synapsie obwodowej myszy wynosi około 300 μs22. Przemijający wapń, oceniany za pomocą barwników wrażliwych na wapń w synapsach obwodowych żaby, ma dłuższy czas trwania: czas narastania wynosi około 2-6 ms, a czas rozpadu około 30-90 ms, w zależności od użytego barwnika wapniowego23,24. Do pomiaru szybkich procesów za pomocą barwników fluorescencyjnych zwykle stosuje się kamery CCD lub CMOS z szybkimi i czułymi matrycami CCD. Kamery te mają jednak tę wadę, że mają niską rozdzielczość, ograniczoną rozmiarem wrażliwych elementów matrycy25,26,27,28. Najszybsze kamery o wystarczającej czułości do rejestrowania zarówno potencjałów czynnościowych, jak i stanów przejściowych wapnia w odpowiedzi na stymulację komórek niską częstotliwością mają częstotliwość skanowania 2 000 Hz i matrycę o wymiarze 80 x 8029. Aby uzyskać sygnały o wyższej rozdzielczości przestrzennej, stosuje się mikroskopię konfokalną, zwłaszcza jeśli konieczna jest ocena pewnych zmian objętościowych w sygnale30,31,32. Należy jednak pamiętać, że mikroskopia konfokalna ma dużą prędkość skanowania w trybie skanowania liniowego, ale nadal istnieją znaczne ograniczenia dotyczące szybkości zapisu szybkich procesów podczas budowania obrazu przestrzennego33. Istnieją mikroskopy konfokalne oparte na obrotowych dyskach Nipkowa (mikroskopia ze skaningiem szczelinowym) oraz skanery wielopunktowe, które charakteryzują się większą prędkością skanowania. Jednocześnie są gorsze od klasycznych mikroskopów konfokalnych pod względem konfokalnego filtrowania obrazu (przesłuchy otworkowe dla mikroskopów z dyskiem Nipkowa)32,34,35. Obrazowanie konfokalne ze skanowaniem rezonansowym może również zapewnić wysoką rozdzielczość czasoprzestrzenną wymaganą do pomiarów o wysokiej rozdzielczości czasowej36. Należy jednak wziąć pod uwagę, że rejestracja słabych odpowiedzi fluorescencyjnych przy dużej prędkości skanowania przy użyciu skanerów rezonansowych wymaga bardzo czułych detektorów, takich jak detektory hybrydowe36.
Ten artykuł przedstawia metodę zwiększania rozdzielczości czasowej sygnałów zarejestrowanych za pomocą Laserowej Skaningowej Mikroskopii Konfokalnej (LSCM) przy jednoczesnym zachowaniu rozdzielczości przestrzennej37. Obecna metoda jest dalszym rozwinięciem metod opisanych wcześniej i przeniesionych na platformę LSCM38,39,40. Podejście to nie wymaga zmian w sprzęcie mikroskopowym i opiera się na zastosowaniu algorytmu do rejestracji okresowo wywoływanych sygnałów fluorescencyjnych z przesunięciem w czasie względem momentu stymulacji.

<table><tbody><tr><td>Szkło kapilarne</td><td>Clark Instrumenty elektromedyczne, Wielka Brytania</td><td>GC150-10</td><td></td></tr><tr><td>System mikroskopu konfokalnego i wielofotonowego Leica TCS SP5 MP</td><td>Leica Microsystems , Heidelberg, Niemcy</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ściągacz do mikropipet płomieniowo-brązowych P 97</td><td>Sutter Instrument, USA</td><td>P-97</td><td></td></tr><tr><td>Regulator przepływu</td><td>KD Medical GmbH Produkty szpitalne, Niemcy</td><td>KD REG</td><td>Jednorazowy zestaw infuzyjny z regulatorem przepływu</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich, USA</td><td>H0887</td><td>100mL</td></tr><tr><td>System oświetlenia Leica CLS 150X</td><td>Leica Microsystems, Niemcy</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ImageJ</td><td>National Institutes of Health, USA</td><td></td><td>http://rsb.info.nih.gov/ij/download.html</td></tr><tr><td>Oprogramowanie Las AF</td><td>Leica Microsystems, Heidelberg, Niemcy</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Oprogramowanie Las X</td><td>Leica Microsystems, Heidelberg, Niemcy</td><td></td><td>https://www.leica-microsystems.com/products/microscope-software/p/leica-las-x-ls/</td></tr> <tr><td>Uchwyt magnetyczny z rurką ssącą</td><td>BIOSCIENCE TOOLS, USA</td><td>MTH-S</td><td></td></tr><tr><td>Microspin FV 2400</td><td>Biosan, Łotwa</td><td>BS-010201-AAA</td><td></td></tr><tr><td>Minutien Pins</td><td>Fine Science Tools, Kanada</td><td>26002-20</td><td></td></tr><tr><td>Multi-spin MSC 3000</td><td>Biosan, Łotwa</td><td>BS-010205-AAN</td><td></td></tr><tr><td>Oregon Green 488 BAPTA-1 sól pentapotasowa</td><td>Sondy molekularne, USA</td><td>O6806</td><td>500 &mu; g</td></tr><tr><td>Pipeta</td><td>Biohit, Rosja</td><td>720210</td><td>0,5-10 &mikro; L</td></tr><tr><td>Końcówka do pipet</td><td>Biohit, Rosja</td><td>781349</td><td>10 & mikro; L</td></tr><tr><td>Plastelina</td><td>lokalny producent</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Jednorazowe igły podskórne</td><td>Bbraun</td><td>100 Sterican</td><td>0,4 razy; Program</td></tr><tr><td>arkusza kalkulacyjnego</td><td>40 mm Microsoft, Stany Zjednoczone</td><td>Microsoft Office Excel</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop stereoskopowy, Leica M80</td><td>Leica Microsystems , Niemcy</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Elektroda ssąca</td><td>Kazakov A. PROSTA ELEKTRODA SSĄCA DO ELEKTRYCZNEJ STYMULACJI OBIEKTÓW BIOLOGICZNYCH / A. Kazakov, M. Alexandrov, N. V. Zhilyakov et al. // Międzynarodowy dziennik naukowy.&nbsp;- 2015. - Nr 9 (40) Część 3. - Str. 13-16.</td><td></td><td>http://research-journal.org/biology/prostoj-vsasyvayushhij-elektrod-dlya-elektricheskoj-stimulyacii-biologicheskix-obektov/</td></tr> <tr><td>Sylgard 184 elastomer</td><td>Dow Corning, USA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Strzykawka</td><td>lokalnego producenta</td><td></td><td>0,5 ml</td></tr><tr><td>Strzykawka</td><td>lokalnego producenta</td><td></td><td>60 ml</td></tr></tbody></table>

rejestracja stanów przejściowych wapnia w mysim połączeniu nerwowo-mięśniowym z wysoką rozdzielczością czasową przy użyciu mikroskopii konfokalnej

Registration of Calcium Transients in Mouse Neuromuscular Junction with High Temporal Resolution using Confocal Microscopy

Oszacowanie poziomu wapnia w presynaptycznych jest kluczowym zadaniem w badaniu transmisji synaptycznej, ponieważ wejście wapnia do komórki presynaptycznej uruchamia kaskadę zdarzeń prowadzących do uwolnienia neuroprzekaźnika. Co więcej, zmiany w presynaptycznym poziomie wapnia pośredniczą w aktywności wielu białek wewnątrzkomórkowych i odgrywają ważną rolę w plastyczności synaptycznej. Badanie sygnalizacji wapniowej jest również ważne dla znalezienia sposobów leczenia chorób neurodegeneracyjnych. Połączenie nerwowo-mięśniowe jest odpowiednim modelem do badania plastyczności synaptycznej, ponieważ ma tylko jeden typ neuroprzekaźnika. W tym artykule opisano metodę ładowania wrażliwego na wapń barwnika przez przecięty pęczek nerwowy do zakończeń nerwów ruchowych myszy. Metoda ta pozwala na oszacowanie wszystkich parametrów związanych z wewnątrzkomórkowymi zmianami wapnia, takich jak podstawowy poziom wapnia i stan przejściowy wapnia. Ponieważ napływ wapnia z zewnątrz komórki do zakończeń nerwowych i jego wiązanie/rozwiązywanie z barwnikiem wrażliwym na wapń zachodzi w ciągu kilku milisekund, do zarejestrowania tych zdarzeń potrzebny jest szybki system obrazowania. Rzeczywiście, kamery szybkoobrotowe są powszechnie stosowane do rejestracji szybkich zmian wapnia, ale mają niskie parametry rozdzielczości obrazu. Przedstawiony tutaj protokół rejestracji stanów przejściowych wapnia pozwala na wyjątkowo dobrą rozdzielczość przestrzenno-czasową zapewnianą przez mikroskopię konfokalną.

Po załadowaniu preparatu barwnikiem zgodnie z przedstawioną techniką, większość synaps znajdujących się blisko kikutu nerwu wykazała wystarczający poziom fluorescencji (patrz Rysunek 2). Po załadowaniu preparatu barwnikiem i zastosowaniu opisanego sposobu rejestracji oraz przetwarzania obrazu, uzyskano przejścia wapniowe o pożądanej rozdzielczości przestrzennej i czasowej (patrz Rysunek 4). Przejście wapniowe zostało odzyskaną za pomocą proponowanej metody (patr...

Protokół opisuje metodę ładowania fluorescencyjnego barwnika wapniowego przez przecięty nerw do zakończeń nerwu ruchowego myszy. Ponadto przedstawiono unikalną metodę rejestracji szybkich stanów przejściowych wapnia w zakończeniach nerwów obwodowych za pomocą mikroskopii konfokalnej.

Rejestracja stanów przejściowych wapnia w mysim połączeniu nerwowo-mięśniowym z wysoką rozdzielczością czasową przy użyciu mikroskopii konfokalnej

Estimation of the presynaptic calcium level is a key task in studying synaptic transmission since calcium entry into the presynaptic cell triggers a ...

Oszacowanie presynaptycznego poziomu wapnia jest kluczowym zadaniem w badaniu przekaźnictwa synaptycznego. Badanie sygnalizacji wapniowej jest również ważne dla znalezienia sposobów leczenia chorób neurodegeneracyjnych. Główną zaletą prezentowanej techniki ładowania jest to, że barwienie zostało wykonane tylko dla interesujących komórek.Nasza metoda rejestracji nieprzemijającości wapnia zapewnia wyjątkowo dobrą rozdzielczość przestrzenno-czasową. Przedstawiona metoda rejestracji może być pomocna dla neurofizjologów, którzy potrzebują rejestrować szybkie procesy okresowe za pomocą mikroskopu konfokalnego. Najtrudniejszym krokiem w technice ładowania jest utrzymanie nerwu wewnątrz pipety.Średnica pipety musi być idealnie dopasowana, więc zrób kilka innych. Znajomość wszystkich kroków w protokole jest skomplikowana, a pokazanie każdego z nich bardzo pomoże. Zacznij od utrwalenia tkanki mięśniowej dźwigacza długiego w lekko rozciągnięty sposób na pokrytej elastomerem szalce Petriego za pomocą drobnych szpilek ze stali nierdzewnej i dodaj roztwór Ringera do naczynia, aż mięsień zostanie całkowicie pokryty.Następnie za pomocą ściągacza do mikropipet przygotuj mikropipetę z cienką ostrą końcówką do nagrań wewnątrzkomórkowych. Używaj naczyń włosowatych bez wewnętrznych włókien. Po nacięciu stożka materiałem ściernym odłamać końcówkę mikropipety, pozostawiając otwartą końcówkę o średnicy około 100 mikrometrów.Następnie wypoleruj końcówkę, aż średnica wewnętrzna zmniejszy się z 80 mikrometrów do 12 mikrometrów. Po zakończeniu przymocuj silikonową rurkę po jednej stronie, a strzykawkę bez igły po drugiej stronie pipety napełniającej. Pod mikroskopem stereoskopowym znajdź miejsce, w którym pień nerwowy zamienia się w oddzielne gałęzie nerwowe.Umieść pipetę napełniającą na szalce Petriego za pomocą wosku, a następnie przesuń końcówkę pipety, aż znajdzie się nad nerwem. Przetnij nerw blisko włókna mięśniowego cienkimi nożyczkami, pozostawiając mały kawałek kikuta nerwu o długości około jednego milimetra. Następnie odessać kikut nerwowy odrobiną roztworu Ringera do końcówki pipety napełniającej, nie ściskając nerwu.Po zakończeniu wyjmij silikonową rurkę z pipety napełniającej. Później użyj strzykawki z długim filamentem, aby pobrać roztwór ładujący barwnik. Następnie włóż końcówkę filamentu z roztworem ładującym do pipety napełniającej i uwolnij mieszaninę na kikut nerwu, a następnie inkubuj preparat nerwowy w temperaturze pokojowej w ciemności przez 30 minut.Po inkubacji przepłukać preparat nerwowy świeżym roztworem Ringera, a następnie potraktować go 50 mililitrami roztworu Ringera w szklanej zlewce w temperaturze 25 stopni Celsjusza przez dwie godziny. W przypadku mikroskopii konfokalnej zamontuj preparat nerwowy w komorze doświadczalnej pokrytej elastomerem silikonowym i przymocuj go, lekko rozciągnięty, za pomocą zestawu stalowych mikroigieł. Następnie należy obficie spłukać preparat roztworem Ringera.Zamontuj elektrodę ssącą na komorze. Po zamontowaniu komory przygotowawczej na stoliku mikroskopu, należy umieścić złączki wlotowe i wylotowe w komorze. Włączyć system napędzany przepływem grawitacyjnym, aby usunąć nadmiar roztworu z preparatu.Po zakończeniu podłącz stymulującą elektrodę ssącą do stymulatora elektrycznego i upewnij się, że po bodźcach wystąpią skurcze mięśni. Następnie napełnij system perfuzyjny roztworem Ringera zawierającym 10 mikromolową d-tubokurarynę i włącz perfuzyjną pompę ssącą, aby rozpocząć perfuzję. W laserowym skaningowym mikroskopie konfokalnym lub oprogramowaniu LSCM wybierz tryb elektrofizjologii i akwizycji, aby ustawić parametry obrazowania.W ustawieniach menu zadania wybierz ustawienia wyzwalacza, aby wyzwolić stymulator za pomocą impulsu synchronizacji mikroskopu i ustaw wyjście wyzwalacza w polu klatki na kanał OUT 1. Przełącz tryb skanowania na XYT z częstotliwością skanowania 1 400 Hz. Współczynnik powiększenia powinien wynosić 6,1 przy całkowicie otwartym otworze.Upewnij się, że włączony jest sekwencyjny, transpassingowy, dwukierunkowy tryb X, a następnie ustaw minimalny czas tworzenia klatki na 52 milisekundy i zbieraj klatki w surowym wideo na 20 klatkach. Ustaw długość fali wzbudzenia lasera argonowego na 488 nanometrów z 8% mocy wyjściowej. Po ustawieniu parametrów naciśnij przycisk trybu na żywo, aby uzyskać podgląd na żywo zakończeń nerwowych załadowanych barwnikiem.W trybie na żywo wyszukaj obszar zainteresowania lub ROI, aby uzyskać najlepszą ostrość. Następnie przesuń opóźnienie na stymulatorze o dwie milisekundy mniej w stosunku do poprzedniej wartości i uruchom oprogramowanie do akwizycji danych, aby uzyskać 26 sekwencji, przesuwając każdą sekwencję o dwie milisekundy od poprzedniej. Aby przetworzyć przechwycone filmy, uruchom oprogramowanie Leica Application Suite X lub LAS X i otwórz utworzony projekt.Następnie kliknij Eksportuj i zapisz jako, aby zapisać ramki w formacie TIF w folderze docelowym. Następnie uruchom oprogramowanie ImageJ i kliknij plik, import i sekwencję obrazów. W oknie otwierania sekwencji obrazów wybierz folder docelowy i otwórz pierwszą klatkę.Z opcji sekwencji przejdź do pola obrazu początkowego i ustaw numer klatki na jeden dla pierwszej klatki. Następnie w polu inkrementacji ustaw wartość równą liczbie klatek w początkowym nagraniu sygnału przed kliknięciem OK. Aby zapisać wygenerowany plik ze zszytymi pierwszymi ramkami w osobnym folderze, kliknij kolejno zakładki plik, zapisz i folder.Powtórz procedury dla 19 klatek, ustawiając odpowiedni numer klatki w polu obrazu początkowego. Po uzyskaniu wszystkich obrazów kliknij plik, import i sekwencję obrazów, aby wybrać jeden z nich w polach obrazu początkowego i przyrostu. Można zobaczyć końcowy film ze wszystkimi klatkami zszytymi ze sobą w zwiększonej rozdzielczości czasowej.Następnie zapisz plik wideo w formacie TIF. Aby przeanalizować zszyte wideo, kliknij obraz, stosy, narzędzia i sortownik stosów. Następnie przejdź do analizy, narzędzi i menedżera ROI.Przeciągnij i upuść zapisany wcześniej plik TIF do okna ImageJ, a następnie powiększ obraz, aby uzyskać lepszy widok. Aby poprawić wizualizację obrazu, kliknij obraz, dostosuj, aby zmienić kontrast jasności na automatyczny. Ustaw tło blisko zakończenia nerwowego, rysując ROI i dodając wartość do menedżera ROI.Następnie oblicz tło, klikając więcej i wiele miar. Skopiuj wartości średnie, aby wkleić je do programu arkusza kalkulacyjnego. Następnie oblicz wartość średnią.Następnie odejmij obliczoną średnią wartość od stosów, klikając proces, główny i odejmij. Wprowadź uzyskaną wartość i narysuj ROI wokół zakończenia nerwowego za pomocą wielokąta przed dodaniem go do menedżera ROI. Zmierz przejściową intensywność zakończenia nerwowego, klikając zakładki więcej i wiele pomiarów.Następnie skopiuj średnie wartości intensywności i wklej je do programu arkusza kalkulacyjnego, aby obliczyć średnie przesunięcie sygnałów. Podziel wartości sygnału przez średnią wartość przesunięcia. Od uzyskanej wartości odejmij jeden, a następnie pomnóż przez 100%następnie wykreśl wykres stanów przejściowych wapnia, aby określić amplitudę.Po obciążeniu preparatu nerwowego barwnikiem, większość synapsy znajduje się blisko kikuta nerwowego, co wskazuje na wystarczający poziom fluorescencji. Po przetworzeniu obrazu uzyskano przejściowość wapnia o pożądanej rozdzielczości przestrzennej i czasowej. Jednym z najważniejszych kroków w tym protokole jest to, że kikut nerwu musi zostać umieszczony w roztworze zawierającym barwnik w ciągu pierwszych kilku minut po przecięciu nerwu.Ta metoda może być stosowana do ładowania różnych barwników i leków do neuronów ruchowych. Protokół rejestracji może być przydatny do oceny stężenia wapnia w dendrytach i kolcach w preparatach OUN. Nasza technika pozwala na rejestrację sygnału wapniowego z dobrą rozdzielczością przestrzenną i czasową.Badanie przejściowości wapnia jest potężnym narzędziem w badaniach nad regulacją uwalniania neuroprzekaźników i plastyczności synaptycznej.

registration-calcium-transients-mouse-neuromuscular-junction-with

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Szczegółowe metody obrazowania Ca2+ o wysokiej rozdzielczości w mięśniach gładkich w obrębie izolowanych organów, obejmujące: przygotowanie tkanki, akwizycję obrazu oraz analizę danych.

Wykrywanie ogniskowych przejściowych zmian stężenia Ca2+ w mięśniach gładkich

Źródło: Heredia, D. J., et. al. Obrazowanie ex vivo specyficznej dla komórki sygnalizacji wapniowej w trójdzielnej synapsie przepony myszy. J. Vis. Exp. (2018) Ten film przedstawia obrazowanie fluorescencyjne dynamiki wapnia w połączeniach nerwowo-mięśniowych (NMJ) u transgenicznej myszy wykazującej ekspresję genetycznie kodowanych wskaźników wapnia. NJM jest identyfikowany przez fluorescencyjnie znakowane receptory acetylocholiny w przeponie z nerwem przeponowym . Rozdzielacz obrazu służy do...

Obrazowanie fluorescencyjne dynamiki wapnia w połączeniach nerwowo-mięśniowych w przeponie transgenicznej myszy

Źródło: Fried, D. E., Gulbransen, B. D. In situ ca2+ Obrazowanie jelitowego układu nerwowego. J. Vis. Exp.Exp. (2015)Ten film pokazuje wapń obrazowanie w celu wizualizacji i analizy aktywności neuronów jelitowych i gleju w preparatach splotu mięśniowo-mięśniowego okrężnicy myszy.

Obrazowanie wapnia aktywności neuronów jelitowych i gleju w splocie mięśniowym okrężnicy myszy

Źródło: Bancroft, E. A., et al. Kwantyfikacja spontanicznych strumieni ca2+{ i ich dalsze efekty w pierwotnych neuronach śródmózgowia myszy. J. Vis. Exp. (2020) {{TAG_ 46}}Ten film pokazuje wizualizację w czasie rzeczywistym napływu wapnia do neuronów brzusznego śródmózgowia pochodzących z zarodków myszy. Wykorzystując wektor wirusowy do ekspresji wskaźnika wapnia, neurony są obrazowane pod mikroskopem konfokalnym w celu śledzenia zmian intensywności fluorescencji podczas spontanicznej i...

Wizualizacja napływu wapnia do neuronów brzusznego śródmózgowia pochodzących z zarodków myszy

Źródło: Kulkarni, M. et al. Obrazowanie ca2+ Dynamika w stożku fotoreceptorów zakończeń aksonów siatkówki myszy. J. Vis. Exp. (2015)Ten film demonstruje zastosowanie mikroskopii dwufotonowej do monitorowania dynamiki wapnia w fotoreceptorach czopków transgenicznej siatkówki myszy. Przedstawiono w nim etapy przygotowania wycinków siatkówki, obrazowania biosensorów wapnia opartych na FRET oraz analizy zmian fluorescencji w celu ilościowego określenia poziomu wapnia przy oświetleniu tła i...

Mikroskopia dwufotonowa do monitorowania dynamiki wapnia w fotoreceptorach czopków siatkówki myszy

Źródło: Zhilyakov, N. V. et al., Rejestracja stanów przejściowych wapnia w mysim połączeniu nerwowo-mięśniowym z wysoką rozdzielczością czasową przy użyciu mikroskopii konfokalnej. J. Vis. Exp. (2021)Ten film przedstawia technikę obrazowania polegającą na rejestrowaniu szybkich stanów przejściowych wapnia na zakończeniach nerwowych za pomocą mikroskopii konfokalnej. Stymulując nerw i wychwytując zmiany fluorescencji spowodowane barwnikami wiążącymi wapń, wizualizuje dynamiczny napływ i usuwanie...

Obrazowanie szybkich stanów przejściowych wapnia w zakończeniach nerwowych myszy za pomocą mikroskopii konfokalnej

Obecnie, większość dostępnych wskaźników wapnia jest używana do ilościowego określania cytoplazmatycznych stanów przejściowych wapnia jako pośrednich miar wapnia uwalnianego z retikulum sarkoplazmatycznego w hodowanych komórkach mięśni gładkich. Protokół ten opisuje użycie specyficznego wskaźnika opartego na FRET, który umożliwia bezpośredni pomiar sygnałów wapniowych w świetle retikulum sarkoplazmatycznego.

Pomiar wahań stężenia wapnia w siateczce sarkoplazmatycznej hodowanych komórek mięśni gładkich za pomocą obrazowania konfokalnego opartego na FRET

Tutaj opisujemy metodę ładowania barwnika wrażliwego na wapń przez pień nerwu żaby do zakończeń nerwowych. Przedstawiamy również protokół rejestracji i analizy szybkich stanów przejściowych wapnia w zakończeniach nerwów obwodowych.

Ładowanie barwnika wapniowego do zakończeń nerwowych żaby przez kikut nerwowy: przejściowa rejestracja wapnia w połączeniu nerwowo-mięśniowym żaby

Tutaj prezentujemy protokół obrazowania sygnalizacji wapniowej w populacjach poszczególnych typów komórek w mysim złączu nerwowo-mięśniowym.

Ex vivo Obrazowanie specyficznej dla komórki sygnalizacji wapniowej w trójdzielnej synapsie przepony myszy

Ta metoda umożliwia połączenie optogenetyki i genetycznie kodowanych czujników wapnia do obrazowania wyjściowego poziomu cytozolowego wapnia i zmian w wywołanych przejściowych stanach wapnia w mięśniach ściany ciała organizmu modelowego C. elegans.

Obrazowanie wapnia in vivo w mięśniach ściany ciała C. elegans

Ten protokół szczegółowo opisuje procedurę obrazowania reakcji wapnia w górnym wzgórku (SC) obudzonych myszy, w tym obrazowanie aktywności pojedynczego neuronu za pomocą mikroskopii dwufotonowej przy jednoczesnym pozostawieniu nienaruszonej kory mózgowej u myszy typu dzikiego, oraz obrazowanie całego SC za pomocą mikroskopii szerokiego pola u myszy z mutacją częściowej kory  mózgowej.

Obrazowanie wapnia u myszy Superior Colliculus

Poznaj metodę rejestracji szybkich stanów przejściowych wapnia w mysich zakończeniach nerwowo-mięśniowych z wysoką rozdzielczością czasową przy użyciu mikroskopii konfokalnej.

Rejestracja stanów przejściowych wapnia w mysim połączeniu nerwowo-mięśniowym z wysoką rozdzielczością czasową przy użyciu mikroskopii konfokalnej (Wideo) | JoVE Journal

Rejestracja stanów przejściowych wapnia w mysim połączeniu nerwowo-mięśniowym z wysoką rozdzielczością czasową przy użyciu mikroskopii konfokalnej

Przeglądaj więcej filmów