Rejestracja stanów przejściowych wapnia w mysim połączeniu nerwowo-mięśniowym z wysoką rozdzielczością czasową przy użyciu mikroskopii konfokalnej
1 grudnia 2021
Protokół opisuje metodę ładowania fluorescencyjnego barwnika wapniowego przez przecięty nerw do zakończeń nerwu ruchowego myszy. Ponadto przedstawiono unikalną metodę rejestracji szybkich stanów przejściowych wapnia w zakończeniach nerwów obwodowych za pomocą mikroskopii konfokalnej.
Oszacowanie presynaptycznego poziomu wapnia jest kluczowym zadaniem w badaniu przekaźnictwa synaptycznego. Badanie sygnalizacji wapniowej jest również ważne dla znalezienia sposobów leczenia chorób neurodegeneracyjnych. Główną zaletą prezentowanej techniki ładowania jest to, że barwienie zostało wykonane tylko dla interesujących komórek.
Nasza metoda rejestracji nieprzemijającości wapnia zapewnia wyjątkowo dobrą rozdzielczość przestrzenno-czasową. Przedstawiona metoda rejestracji może być pomocna dla neurofizjologów, którzy potrzebują rejestrować szybkie procesy okresowe za pomocą mikroskopu konfokalnego. Najtrudniejszym krokiem w technice ładowania jest utrzymanie nerwu wewnątrz pipety.
Średnica pipety musi być idealnie dopasowana, więc zrób kilka innych. Znajomość wszystkich kroków w protokole jest skomplikowana, a pokazanie każdego z nich bardzo pomoże. Zacznij od utrwalenia tkanki mięśniowej dźwigacza długiego w lekko rozciągnięty sposób na pokrytej elastomerem szalce Petriego za pomocą drobnych szpilek ze stali nierdzewnej i dodaj roztwór Ringera do naczynia, aż mięsień zostanie całkowicie pokryty.
Następnie za pomocą ściągacza do mikropipet przygotuj mikropipetę z cienką ostrą końcówką do nagrań wewnątrzkomórkowych. Używaj naczyń włosowatych bez wewnętrznych włókien. Po nacięciu stożka materiałem ściernym odłamać końcówkę mikropipety, pozostawiając otwartą końcówkę o średnicy około 100 mikrometrów.
Następnie wypoleruj końcówkę, aż średnica wewnętrzna zmniejszy się z 80 mikrometrów do 12 mikrometrów. Po zakończeniu przymocuj silikonową rurkę po jednej stronie, a strzykawkę bez igły po drugiej stronie pipety napełniającej. Pod mikroskopem stereoskopowym znajdź miejsce, w którym pień nerwowy zamienia się w oddzielne gałęzie nerwowe.
Umieść pipetę napełniającą na szalce Petriego za pomocą wosku, a następnie przesuń końcówkę pipety, aż znajdzie się nad nerwem. Przetnij nerw blisko włókna mięśniowego cienkimi nożyczkami, pozostawiając mały kawałek kikuta nerwu o długości około jednego milimetra. Następnie odessać kikut nerwowy odrobiną roztworu Ringera do końcówki pipety napełniającej, nie ściskając nerwu.
Po zakończeniu wyjmij silikonową rurkę z pipety napełniającej. Później użyj strzykawki z długim filamentem, aby pobrać roztwór ładujący barwnik. Następnie włóż końcówkę filamentu z roztworem ładującym do pipety napełniającej i uwolnij mieszaninę na kikut nerwu, a następnie inkubuj preparat nerwowy w temperaturze pokojowej w ciemności przez 30 minut.
Po inkubacji przepłukać preparat nerwowy świeżym roztworem Ringera, a następnie potraktować go 50 mililitrami roztworu Ringera w szklanej zlewce w temperaturze 25 stopni Celsjusza przez dwie godziny. W przypadku mikroskopii konfokalnej zamontuj preparat nerwowy w komorze doświadczalnej pokrytej elastomerem silikonowym i przymocuj go, lekko rozciągnięty, za pomocą zestawu stalowych mikroigieł. Następnie należy obficie spłukać preparat roztworem Ringera.
Zamontuj elektrodę ssącą na komorze. Po zamontowaniu komory przygotowawczej na stoliku mikroskopu, należy umieścić złączki wlotowe i wylotowe w komorze. Włączyć system napędzany przepływem grawitacyjnym, aby usunąć nadmiar roztworu z preparatu.
Po zakończeniu podłącz stymulującą elektrodę ssącą do stymulatora elektrycznego i upewnij się, że po bodźcach wystąpią skurcze mięśni. Następnie napełnij system perfuzyjny roztworem Ringera zawierającym 10 mikromolową d-tubokurarynę i włącz perfuzyjną pompę ssącą, aby rozpocząć perfuzję. W laserowym skaningowym mikroskopie konfokalnym lub oprogramowaniu LSCM wybierz tryb elektrofizjologii i akwizycji, aby ustawić parametry obrazowania.
W ustawieniach menu zadania wybierz ustawienia wyzwalacza, aby wyzwolić stymulator za pomocą impulsu synchronizacji mikroskopu i ustaw wyjście wyzwalacza w polu klatki na kanał OUT 1. Przełącz tryb skanowania na XYT z częstotliwością skanowania 1 400 Hz. Współczynnik powiększenia powinien wynosić 6,1 przy całkowicie otwartym otworze.
Upewnij się, że włączony jest sekwencyjny, transpassingowy, dwukierunkowy tryb X, a następnie ustaw minimalny czas tworzenia klatki na 52 milisekundy i zbieraj klatki w surowym wideo na 20 klatkach. Ustaw długość fali wzbudzenia lasera argonowego na 488 nanometrów z 8% mocy wyjściowej. Po ustawieniu parametrów naciśnij przycisk trybu na żywo, aby uzyskać podgląd na żywo zakończeń nerwowych załadowanych barwnikiem.
W trybie na żywo wyszukaj obszar zainteresowania lub ROI, aby uzyskać najlepszą ostrość. Następnie przesuń opóźnienie na stymulatorze o dwie milisekundy mniej w stosunku do poprzedniej wartości i uruchom oprogramowanie do akwizycji danych, aby uzyskać 26 sekwencji, przesuwając każdą sekwencję o dwie milisekundy od poprzedniej. Aby przetworzyć przechwycone filmy, uruchom oprogramowanie Leica Application Suite X lub LAS X i otwórz utworzony projekt.
Następnie kliknij Eksportuj i zapisz jako, aby zapisać ramki w formacie TIF w folderze docelowym. Następnie uruchom oprogramowanie ImageJ i kliknij plik, import i sekwencję obrazów. W oknie otwierania sekwencji obrazów wybierz folder docelowy i otwórz pierwszą klatkę.
Z opcji sekwencji przejdź do pola obrazu początkowego i ustaw numer klatki na jeden dla pierwszej klatki. Następnie w polu inkrementacji ustaw wartość równą liczbie klatek w początkowym nagraniu sygnału przed kliknięciem OK. Aby zapisać wygenerowany plik ze zszytymi pierwszymi ramkami w osobnym folderze, kliknij kolejno zakładki plik, zapisz i folder.
Powtórz procedury dla 19 klatek, ustawiając odpowiedni numer klatki w polu obrazu początkowego. Po uzyskaniu wszystkich obrazów kliknij plik, import i sekwencję obrazów, aby wybrać jeden z nich w polach obrazu początkowego i przyrostu. Można zobaczyć końcowy film ze wszystkimi klatkami zszytymi ze sobą w zwiększonej rozdzielczości czasowej.
Następnie zapisz plik wideo w formacie TIF. Aby przeanalizować zszyte wideo, kliknij obraz, stosy, narzędzia i sortownik stosów. Następnie przejdź do analizy, narzędzi i menedżera ROI.
Przeciągnij i upuść zapisany wcześniej plik TIF do okna ImageJ, a następnie powiększ obraz, aby uzyskać lepszy widok. Aby poprawić wizualizację obrazu, kliknij obraz, dostosuj, aby zmienić kontrast jasności na automatyczny. Ustaw tło blisko zakończenia nerwowego, rysując ROI i dodając wartość do menedżera ROI.
Następnie oblicz tło, klikając więcej i wiele miar. Skopiuj wartości średnie, aby wkleić je do programu arkusza kalkulacyjnego. Następnie oblicz wartość średnią.
Następnie odejmij obliczoną średnią wartość od stosów, klikając proces, główny i odejmij. Wprowadź uzyskaną wartość i narysuj ROI wokół zakończenia nerwowego za pomocą wielokąta przed dodaniem go do menedżera ROI. Zmierz przejściową intensywność zakończenia nerwowego, klikając zakładki więcej i wiele pomiarów.
Następnie skopiuj średnie wartości intensywności i wklej je do programu arkusza kalkulacyjnego, aby obliczyć średnie przesunięcie sygnałów. Podziel wartości sygnału przez średnią wartość przesunięcia. Od uzyskanej wartości odejmij jeden, a następnie pomnóż przez 100%następnie wykreśl wykres stanów przejściowych wapnia, aby określić amplitudę.
Po obciążeniu preparatu nerwowego barwnikiem, większość synapsy znajduje się blisko kikuta nerwowego, co wskazuje na wystarczający poziom fluorescencji. Po przetworzeniu obrazu uzyskano przejściowość wapnia o pożądanej rozdzielczości przestrzennej i czasowej. Jednym z najważniejszych kroków w tym protokole jest to, że kikut nerwu musi zostać umieszczony w roztworze zawierającym barwnik w ciągu pierwszych kilku minut po przecięciu nerwu.
Ta metoda może być stosowana do ładowania różnych barwników i leków do neuronów ruchowych. Protokół rejestracji może być przydatny do oceny stężenia wapnia w dendrytach i kolcach w preparatach OUN. Nasza technika pozwala na rejestrację sygnału wapniowego z dobrą rozdzielczością przestrzenną i czasową.
Badanie przejściowości wapnia jest potężnym narzędziem w badaniach nad regulacją uwalniania neuroprzekaźników i plastyczności synaptycznej.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejszy artykuł przedstawia metodę wprowadzania fluorescencyjnego barwnika wapnia do zakończeń nerwów ruchowych myszy oraz unikalną technikę rejestracji szybkich przejściowych zmian stężenia wapnia w zakończeniach nerwów obwodowych z wykorzystaniem mikroskopii konfokalnej. Badanie koncentruje się na szacowaniu presynaptycznych poziomów wapnia w celu lepszego zrozumienia przekazywania synaptycznego, co ma kluczowe znaczenie dla opracowania terapii chorób neurodegeneracyjnych.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neurofizjologia
- Sygnalizacja wapniowa
- Przekaźnictwo synaptyczne
Wstęp
- Konieczność szacowania poziomu wapnia presynaptycznego w badaniach nad przekaźnictwem synaptycznym.
- Rola sygnalizacji wapniowej w leczeniu chorób neurodegeneracyjnych.
- Wyzwania związane z precyzyjnym wykonywaniem rejestracji wewnątrzkomórkowych z zakończeń nerwów ruchowych myszy.
Cel badania
- Wykazanie skutecznej metody wewnątrzkomórkowego wprowadzania barwnika wapniowego do zakończeń nerwowych.
- Przedstawienie techniki rejestrowania przejściowych zmian stężenia wapnia z wysoką rozdzielczością czasowo-przestrzenną.
Zastosowane metody
- Główną platformą wykorzystywaną do rejestracji danych obrazowych jest mikroskopia konfokalna.
- Model biologiczny koncentruje się na zakończeniach nerwów ruchowych myszy.
- Kluczowymi etapami są techniki mikropipetowe, obejmujące precyzyjne wykonanie pipet i manewrowanie wokół nerwu.
- Przygotowanie nerwu obejmuje specyficzne procedury postępowania, w tym podawanie roztworu Ringera oraz inkubację.
Główne wyniki
- Zastosowana technika ładowania umożliwia efektywne barwienie wyłącznie w komórkach będących przedmiotem zainteresowania.
- W rejestracji przejściowych zmian stężenia wapnia w zakończeniach nerwowych osiągnięto wysoką rozdzielczość czasowo-przestrzenną.
- Metoda ta wykazuje potencjał w rejestrowaniu szybkich procesów okresowych istotnych dla neurofizjologii.
Wnioski
- Niniejsze badanie przedstawia cenny protokół służący do zrozumienia dynamiki wapnia w terminalach presynaptycznych.
- Wyniki mają istotne znaczenie dla mechanizmów neuronalnych, oferując nowe wglądy w procesy przekaźnictwa synaptycznego.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Wysokorozdzielcza rejestracja przesyłowych przejściowych zmian stężenia wapnia w zakończeniach presynaptycznych złącza nerwowo-mięśniowego umożliwia precyzyjne badanie mechanizmów przekaźnictwa synaptycznego, co wspiera wczesną walidację celów w neurobiologii. Możliwość ta zwiększa pewność predykcyjną w analizie szlaków sygnałowych i dostarcza informacji niezbędnych do podejmowania decyzji skorygowanych o ryzyko w portfelach badań nad chorobami neurodegeneracyjnymi. Wierność czasowo-przestrzenna tej metody sprawia, że stanowi ona wielokrotnego użytku zasób w procesie ograniczania ryzyka mechanistycznego oraz zachowania ciągłości translacyjnej.
Zastosowania strategiczne w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Umożliwia ilościową ocenę presynaptycznej dynamiki wapnia, co jest kluczowe dla walidacji celów neurotransmisji.
- Wspiera mechanistyczną redukcję ryzyka poprzez wyjaśnienie sekwencji czasowej zależnych od wapnia zdarzeń synaptycznych.
- Ułatwia funkcjonalną walidację celu poprzez bezpośredni pomiar wywołanego bodźcem napływu wapnia.
Przesiewanie i opracowywanie testów
- Zapewnia zwalidowany system do obrazowania o wysokiej rozdzielczości przejściowych zmian stężenia wapnia w określonych populacjach neuronów.
- Umożliwia powtarzalną kwantyfikację odpowiedzi wapniowych, co wspiera standaryzację testów i dalsze procesy przesiewowe.
- Dostarcza wyników ilościowych odpowiednich do analizy porównawczej zaburzeń farmakologicznych lub genetycznych.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Jest zgodne z modelami istotnymi dla przebiegu chorób, umożliwiając ocenę mechanizmów plastyczności synaptycznej uwikłanych w procesy neurodegeneracji.
- Wspiera rozwój biomarkerów translacyjnych poprzez bezpośredni pomiar funkcjonalnych punktów końcowych synaps.
- Ułatwia zachowanie ciągłości od etapu odkryć do walidacji przedklinicznej, dostarczając wiarygodnych, ilościowych odczytów.
Integracja potoków i przepływów pracy
Ta metoda obrazowania wapnia oparta na mikroskopii konfokalnej wpisuje się w kontinuum od odkrycia do badań przedklinicznych, łącząc studia mechanistyczne z badaniami translacyjnymi w neurobiologii.
- Biologia odkrywcza: Wspiera testowanie hipotez dotyczących regulacji wapnia w terminalach presynaptycznych oraz mechanizmów uwalniania neuroprzekaźników.
- Przesiewanie: Zapewnia gotowe do analizy, powtarzalne obrazowanie stanów przejściowych wapnia do przesiewania związków chemicznych lub genetycznego.
- Analityka: Umożliwia ilościowe wyznaczenie amplitudy, kinetyki i poziomu wapnia bazowego w celu przeprowadzenia rzetelnego porównania statystycznego.
- Badania translacyjne: Łączy ustalenia mechanistyczne z modelami dysfunkcji synaptycznych istotnymi dla przebiegu chorób.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwach: Oferuje zestandaryzowany schemat postępowania, który można dostosować do różnych preparatów neuronalnych i pytań badawczych.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorstwowy
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność predykcyjną w walidacji celów synaptycznych i badaniach mechanistycznych.
- Wartość operacyjna: Zapewnia standaryzowane, powtarzalne i skalowalne przepływy pracy w obrazowaniu, umożliwiając ich wdrożenie w różnych zespołach.
- Wartość strategiczna: Poprawia jakość decyzji go/no-go i redukuje ryzyko biologiczne na późnych etapach w portfolio badań nad neurodegeneracją.
- Wpływ na portfolio: Umożliwia priorytetyzację celów i szlaków synaptycznych do dalszego rozwoju w oparciu o analizę ryzyka.
Wskazówki dotyczące wdrożenia
- Wymaga doświadczenia w zakresie mikroskopii konfokalnej oraz precyzyjnych technik manipulacji nerwami.
- Wymaga dostępu do platform do obrazowania wysokiej szybkości oraz zaawansowanego oprogramowania do analizy obrazu.
- Konieczna jest rygorystyczna standaryzacja parametrów obrazowania i ładowania barwnika pomiędzy zespołami.
- Metoda jest adaptowalna do innych układów neuronalnych po optymalizacji protokołu pod kątem zgodności barwnika z tkanką.
- Wynik zależy od utrzymania żywotności nerwu oraz precyzyjnego przestrzegania czasu aplikacji barwnika i obrazowania.
Najczęściej zadawane pytania dotyczące biofarmacji
Chapters in this video
0:05
Introduction
1:12
Dye Loading Procedure
3:28
Video Capture with Confocal Microscopy
6:14
Video Processing
7:56
Video Analysis
9:55
Results: Mouse Nerve Terminals Loaded with the Ca2+ Indicator and Representative Trace of Calcium Signal
10:18
Conclusion
