Name: Solidne różnicowanie ludzkich iPSC w czystą populację adipocytów w celu zbadania zaburzeń związanych z adipocytami (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-02-09T14:45:00.000+00:00
Duration: 10 min 31 s
Description: Poznaj protokół różnicowania ludzkich iPSC w czystą populację adipocytów przy użyciu kwasu retinowego i barwienia Nile red. Ta metoda umożliwia badanie zaburzeń metabolicznych z wysoką czystością próbek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca została sfinansowana z grantu z Qatar National Research Fund (QNRF) (Grant No. NPRP10-1221-160041). Maryam Aghadi była wspierana przez stypendium GSRA z Qatar National Research Fund (QNRF).

Badanie zostało zatwierdzone przez odpowiednią instytucjonalną komisję etyki badań i przeprowadzone zgodnie ze standardami etycznymi określonymi w Deklaracji Helsińskiej z 1964 roku i jej późniejszymi poprawkami lub porównywalnymi standardami etycznymi. Protokół został zatwierdzony przez Instytucjonalną Komisję Rewizyjną (IRB) HMC (nr 16260/16) i QBRI (nr 2016-003). Ta praca jest również zoptymalizowana pod kątem hESC, takich jak H1 i H9. Próbki krwi pobrano od osób zdrowych za pełną świadomą zgodą. iPSC są generowane z komórek jednojądrzastych krwi obwodowej (PBMC) zdrowych osób.
1. Hodowla i utrzymanie iPSC
<ol>
	<li>Przygotować płyty pokryte membraną podstawną, odtwarzając matrycę powłoki w knockout-DMEM w stosunku 1:80 i przechowywać w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Przygotować pożywkę hodowlaną iPSC, dodając 50 ml 10 pożywek uzupełniających komórki macierzyste do 500 ml pożywki bazowej komórek macierzystych wraz z 5 ml 100 pożywki penicyliny-streptomycyny (P/S) i przechowywać w temperaturze 4 °C przez krótki czas lub w temperaturze -20 °C przez długi czas.</li>
	<li>Wyłożyć płytki matrycą powlekającą-1 ml dla płytki 6-dołkowej, 500 μl dla płytki 12-dołkowej, 250 μl dla płytki 24-dołkowej i inkubować płytkę w temperaturze 37 °C przez 1-2 godziny.</li>
	<li>Przed użyciem usunąć podwielokrotność pożywki hodowlanej iPSC i wstępnie ogrzać ją w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Rozmrozić fiolkę z iPSC (ESC lub iPSC) w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C i przenieść do stożkowej probówki o pojemności 15 ml zawierającej 2-3 ml pożywki hodowlanej.</li>
	<li>Odwirować probówkę o sile 120 x g przez 4 minuty w temperaturze pokojowej (RT-23 °C).</li>
	<li>Usunąć supernatant i dodać 2 ml świeżej pożywki hodowlanej uzupełnionej 10 μM inhibitorem ROCK (Y-27632). Umieścić komórki w jednym dołku na pokrytej matrycą płytce 6-dołkowej i umieścić płytkę w temperaturze 37 °C.</li>
	<li>Po 24 godzinach wyjmij pożywkę i zastąp ją świeżą pożywką hodowlaną.</li>
	<li>Zmieniaj pożywkę codziennie, aż komórki osiągną zbieżność 80%-90%.</li>
	<li>Po osiągnięciu konfluencji przejdź komórki, wykonując czynności opisane poniżej.
	<ol>
		<li>Usuń pożywkę i umyj komórki solą fizjologiczną buforowaną fosforanami (DPBS) firmy Dulbecco.</li>
		<li>Dodać odczynnik dysocjacyjny iPSC (patrz tabela materiałów) – 500 μl dla dołka na płytce 6-dołkowej, 250 μl dla dołka na płytce 24-dołkowej – i inkubować przez 1 minutę w temperaturze 37 °C.</li>
		<li>Usunąć odczynnik dysocjacyjny i inkubować komórki na sucho przez 1 minutę w temperaturze 37 °C.</li>
		<li>Zebrać komórki za pomocą pożywki hodowlanej - 1 ml dla dołka na płytce 6-dołkowej i 250 μl dla dołka na płytce 24-dołkowej - w stożkowej probówce o pojemności 15 ml i odwirować przy 120 x g przez 4 min.</li>
		<li>Ponownie zawiesić komórki w pożywce hodowlanej-2 ml dla dołka na płytce 6-dołkowej i 500 μl dla dołka z 24-dołkową płytką uzupełnioną 10 μM inhibitorem ROCK i umieścić je na świeżych płytkach pokrytych matrycą przy 40% zbiegu.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Różnicowanie iPSC na MSC
<ol>
	<li>Przygotować pożywkę różnicującą MSC, dodając 15% płodowej surowicy bydlęcej (FBS) i 1% P/S do DMEM + pirogronianu o niskiej stężeniu glukozy i przechowywać w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Po osiągnięciu 80% konfluencji użyj iPSC do tworzenia ciała zarodka (EB), postępując zgodnie z instrukcjami opisanymi poniżej.
	<ol>
		<li>Przemyć komórki DPBS i inkubować je z pożywką dysocjacyjną/EDTA-500 μl dla dołka na płytce 6-dołkowej, 250 μl dla dołka na płytce 24-dołkowej.</li>
		<li>Inkubować w temperaturze 37 °C przez 1 minutę, odessać odczynnik dysocjacyjny i utrzymywać komórki w temperaturze 37 °C przez dodatkowy 1 minutę. Aby rozpocząć różnicowanie MSC, wymagane jest ~10-12 x 106 komórek.</li>
		<li>Zebrać komórki w stożkowej probówce o pojemności 15 ml za pomocą pożywki hodowlanej. Upewnij się, że jesteś bardzo delikatny podczas zbierania, aby zapobiec pojedynczemu tworzeniu się komórek i umożliwić tworzenie się EB. Odwirować komórki przy 120 x g przez 4 min.</li>
		<li>Zawiesić komórki w 3 ml pożywki różnicującej MSC zawierającej 10 μM inhibitora ROCK.</li>
		<li>Wymieszaj i rozprowadź 0,5 ml/dołek w 24-dołkowej płytce o bardzo niskim mocowaniu. 
		UWAGA: Użycie bardzo niskiej płytki mocującej zachęciłoby do agregacji komórek w EB, a nie do ich przyczepienia na powierzchni.</li>
		<li>Umieścić płytkę w inkubatorze w temperaturze 37 °C.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Po 24 godzinach wywołaj uzyskane EB za pomocą leczenia wysokim kwasem retinowym (RZS), postępując zgodnie z instrukcjami opisanymi poniżej.
	<ol>
		<li>Dodać 10 μM RA do 3 ml pożywki różnicującej MSC. Zbierz EB do probówki o pojemności 15 ml i pozwól im osiąść przez 15 minut.</li>
		<li>Usunąć supernatant z EB i dodać pożywkę różnicującą MSC uzupełnioną 10 μM RA.</li>
		<li>Delikatnie zawiesić i rozprowadzić 0,5 ml / dołek w tej samej 24-dołkowej płytce o bardzo niskim nasadce.</li>
		<li>Umieścić płytkę w inkubatorze w temperaturze 37 °C. Nie przeszkadzaj EBs przez następne 48 godzin.</li>
		<li>Po 48 godzinach zbierz EB do probówki o pojemności 15 ml i pozwól im osiąść przez 15 minut.</li>
		<li>Usunąć supernatant z EB i dodać pożywkę różnicującą MSC uzupełnioną 0,1 μM RA.</li>
		<li>Delikatnie zawiesić i rozprowadzić 0,5 ml / dołek w tej samej 24-dołkowej płytce o bardzo niskim nasadce.</li>
		<li>Umieścić płytkę w inkubatorze w temperaturze 37 °C. Nie przeszkadzaj EBs przez następne 48 godzin.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Usuń RA dodany do komórek, wykonując czynności opisane poniżej.
	<ol>
		<li>Po 48 godzinach od ostatniego zabiegu RZS należy pobrać EB i pozostawić je na 15 minut.</li>
		<li>Usunąć supernatant i dodać pożywkę DMEM o niskiej zawartości glukozy bez cytokin.</li>
		<li>Delikatnie zawiesić i rozprowadzić 0,5 ml/dołek w 24-dołkowej płytce o bardzo niskim nasadce. Umieścić płytkę w inkubatorze w temperaturze 37 °C.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Na płytce należy umieścić EB pochodzące z iPSC, wykonując czynności opisane poniżej.
	<ol>
		<li>Po upływie 48 godzin od poprzedniego kroku (krok 2.4) zebrać EB do probówki o pojemności 15 ml i pozostawić na 15 minut.</li>
		<li>Usunąć supernatant i ponownie zawiesić w 2 ml świeżej pożywki różnicującej MSC.</li>
		<li>Przenieść do dwóch dołków 6-dołkowej płytki pokrytej membraną podstawną, pokrytej matrycą.</li>
		<li>Zmieniaj nośnik co drugi dzień przez dodatkowe 5 dni.</li>
		<li>Po 5 dniach usuń zużytą pożywkę i zastąp ją świeżą pożywką różnicującą MSC zawierającą 2,5 ng/ml podstawowego czynnika wzrostu fibroblastów (bFGF).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przejdź przez platerowane EB, gdy osiągną zbieżność 80%-90%, wykonując czynności opisane poniżej.
	<ol>
		<li>Przemyć komórki DPBS, dodać trypsynę-EDTA-500 μl do dołka z 6-dołkową płytką i inkubować komórki w temperaturze 37 °C przez 3 minuty.</li>
		<li>Zebrać komórki za pomocą pożywki różnicującej MSC w stożkowej probówce o pojemności 15 ml i wirować w temperaturze 750 x g przez 4 minuty.</li>
		<li>Zawiesić w pożywce różnicującej MSC z 2,5 ng/ml bFGF i ułożyć komórki na płytkach pokrytych matrycą błony podstawnej w stosunku 1:3.</li>
		<li>Powtórz przejście, gdy komórki osiągną zbieg 70%-80%. Oczekuje się, że zyska 3-6 milionów komórek przez 2-3 przejścia.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Analiza metodą cytometrii przepływowej MSC pochodzących z iPSC
UWAGA: Po przejściu 2-3 przejść, komórki powinny być dostępne dla efektywności różnicowania MSC. Różnicowanie zostanie uznane za udane, jeśli komórki wyrażają markery różnicowania MSC-CD44, CD73, CD90 i CD105 z ponad 90% wydajnością i nie wyrażają wysokich poziomów markerów krwiotwórczych - CD14, CD19, CD34 i CD45. Dostęp do wydajności tych markerów można uzyskać, wykonując poniższe czynności.
<ol>
	<li>Przejść przez komórki, wykonując czynności opisane powyżej (krok 2.6) i uzyskać 1 x 105 komórek w jednym dołku 96-dołkowej płytki z dnem w kształcie litery V.</li>
	<li>Odwirować płytkę o sile 375 x g przez 4 minuty w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Zawiesić 1 x 105 komórek w 100 μl zimnego DPBS z 1 μl sprzężonego przeciwciała (Ab) (patrz tabela materiałów) i inkubować w temperaturze 4 °C przez 30-40 minut, zapobiegając ekspozycji na światło.</li>
	<li>Zawiesić kolejne 1 x 105 komórek w 100 μl zimnego DPBS z odpowiednią kontrolą izotypową sprzężonego Ab w stężeniu 1:100 ) i inkubować w temperaturze 4 °C przez 30-40 minut, zapobiegając ekspozycji na światło.</li>
	<li>Po inkubacji odwirować płytkę o masie 375 x g przez 4 minuty w temperaturze 4 °C. Odrzucić supernatant przez potrząśnięcie płytką nad zlewem.</li>
	<li>Ponownie zawiesić komórki w 100 μl zimnego DPBS.</li>
	<li>Odwirować komórki w temperaturze 375 x g przez 4 minuty w temperaturze 4 °C. Odrzucić supernatant.</li>
	<li>Ponownie zawiesić komórki w 200 μl zimnego DPBS i zebrać w ciemnych, zimnych probówkach wirówkowych o pojemności 1,5 ml i trzymać je na lodzie do czasu analizy przez sortowanie komórek aktywowane fluorescencją (FACS).</li>
	<li>W przypadku analizy FACS rozmieść ogniwa przy użyciu rozpraszania bocznego (SSC-A) i rozpraszania do przodu (FSC-A), aby wykluczyć zanieczyszczenia. Ponadto rozmieść bramkowane komórki, używając wysokości rozproszenia do przodu (FSC-H) w porównaniu z obszarem rozproszonym do przodu (FSC-A), aby odróżnić pojedyncze punkty od dubletów z populacji żywych komórek. 
	UWAGA: Komórki bramkowano względem przesunięcia kontroli izotypu dla każdego markera, a do analizy wykorzystano co najmniej 10 000 zdarzeń bramkowanych z każdej barwionej próbki.</li>
</ol>
4. Różnicowanie MSCs w adipocyty
<ol>
	<li>Przygotować podstawowe podłoże do różnicowania adipocytów, dodając 10% zamiennik surowicy nokautującej (KOSR), 1% glutaminy, 1% P/S, 4,5 ng/μL glukozy do minimalnej niezbędnej pożywki (MEM)-alfa i przechowywać w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Pozwól MSCs osiągnąć konfluencję powyżej 90%. Kontynuuj ich hodowlę przez kolejne 48 godzin, aby umożliwić im przejście okresu zatrzymania wzrostu.</li>
	<li>Przygotować kompletną pożywkę do różnicowania adipocytów, dodając 100 μg/ml 3-izobutylo-1-metyloksantyny (IBMX), 1 μM deksametazonu, 0,2 U/ml insuliny, 100 μM indometacyny i 10 μM rozyglitazonu do podłoża podstawowego.</li>
	<li>Usunąć pożywkę różnicującą MSC i umyć komórki za pomocą DPBS.</li>
	<li>Dodać pełną pożywkę do różnicowania adipocytów - 2 ml dla dołka na płytce 6-dołkowej i 1 ml dla dołka na płytce 12-dołkowej - i inkubować komórki w temperaturze 37 °C. Zmieniaj pożywkę do całkowitego różnicowania co drugi dzień przez 14 dni.</li>
</ol>
5. Ocena efektywności różnicowania adipocytów
<ol>
	<li>W 14 dniu różnicowania sprawdź skuteczność różnicowania poprzez barwienie komórek pod kątem markerów dojrzewania adipocytów, FABP4 i adiponektyny.</li>
	<li>Usuń pożywkę i umyj komórki DPBS.</li>
	<li>Utrwalić komórki za pomocą 4% paraformaldehydu (PFA) - 200 μl w dołku na 24-dołkowej płytce - i inkubować w temperaturze pokojowej przez 15 minut.</li>
	<li>Wyrzuć PFA i przemyj solą fizjologiczną z 0,5% teen (TBST) i umieść na shakerze w temperaturze pokojowej na 15 minut. Powtórz proces dwukrotnie.</li>
	<li>Utrwalone komórki przepuścić roztworem soli fizjologicznej buforowanym fosforanami z 0,5% Triton X-100 (PBST) i umieścić na wytrząsarce w temperaturze pokojowej na 15-20 minut.</li>
	<li>Odrzucić PBST i dodać bufor blokujący (5%-6% albuminy surowicy bydlęcej (BSA) w PBST) - 500 μl dla studzienki na płytce 6-dołkowej i 250 μl dla studzienki z płytką 12-dołkową - i inkubować w temperaturze pokojowej na wytrząsarce przez 40-60 minut.</li>
	<li>Rozcieńczyć pierwszorzędowe przeciwciała przeciwko FABP4, adiponektynie w 2%-3% BSA, w stężeniu 1:500 (patrz tabela materiałów). Dodać te przeciwciała do siebie tylko wtedy, gdy są hodowane u różnych zwierząt i umieścić płytkę na wytrząsarce w temperaturze 4 °C przez noc.</li>
	<li>Usuń przeciwciała pierwszorzędowe i umyj komórki trzykrotnie TBST (po 15 minut) i umieść je na shakerze w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Przygotuj przeciwciała drugorzędowe Alexa Fluor w PBST (1:500). Inkubować komórki w drugorzędowych kombinacjach przeciwciał (zgodnie z gatunkami, w których hoduje się przeciwciało pierwszorzędowe) przez 60 minut w temperaturze pokojowej i przykryć płytkę folią aluminiową, aby chronić ją przed światłem.</li>
	<li>Wyrzucić przeciwciała drugorzędowe, przemyć trzykrotnie TBST i umieścić płytkę na shakerze.</li>
	<li>Aby wybarwić jądra, dodać 1 μg/ml Hoechst 33342-200 μl do dołka z 24-dołkową płytką rozcieńczoną w PBS i inkubować przez 5 minut w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Odrzucić roztwór Hoechsta i dodać PBS-500 μl do dołka z 24-dołkową płytką do komórek. Utrzymuj płytki przykryte przed światłem do czasu wizualizacji za pomocą odwróconego mikroskopu fluorescencyjnego.</li>
</ol>
6. Sortowanie adipocytów za pomocą czerwieni nilowej
<ol>
	<li>Przygotować roztwór roboczy czerwieni nilowej, dodając 1 mg/ml roztworu podstawowego czerwieni nilowej w DMSO i przechowywać w temperaturze -20 °C. Bezpośrednio przed użyciem rozmrozić czerwony wywar Nilowy i rozpuścić go w DPBS do uzyskania stężenia roztworu roboczego 300 nM.</li>
	<li>W 14 dniu różnicowania adipocytów lub po nim wyrzuć pożywkę z komórek i przemyj za pomocą DPBS.</li>
	<li>Dodać czerwony roztwór roboczy Nilu -1 ml do studzienki z 6-dołkową płytką i inkubować w temperaturze 37 °C przez 15 minut.</li>
	<li>Usunąć roztwór czerwieni nilowej i dodać trypsynę-EDTA -500 μl do studzienki z 6-dołkową płytką i inkubować w temperaturze 37 °C przez 4 minuty.</li>
	<li>Zebrać komórki za pomocą DMEM zawierającego 5% FBS w stożkowej probówce o pojemności 15 ml. Wirować przy 750 x g przez 4 min.</li>
	<li>Usunąć supernatant i ponownie zawiesić w DPBS-1 ml dla 1 x 106 komórek. Wirować przy 750 x g przez 4 min.</li>
	<li>Usunąć supernatant i ponownie zawiesić w DPBS-1 ml dla 1 x 106 komórek. Użyj sortera FACS, aby wyizolować czerwone komórki Nilu za pomocą kanału FL1.</li>
	<li>Ponownie hoduj posortowane komórki w pożywkach różnicujących adipocyty lub zbierz posortowane komórki w celu izolacji RNA i białka.</li>
	<li>Wyekstrahuj RNA z posortowanych komórek i przeprowadź względną analizę ilościową markerów różnicowania adipocytów, w tym FABP4, PPARG i C/EBPA. Komórki czerwono-dodatnie Nilu wykazują znaczną regulację ekspresji genów co najmniej dwukrotnego wzrostu w porównaniu z komórkami niesortowanymi.</li>
</ol>

<ol><li>Hass, R., Kasper, C., Bohm, S., Jacobs, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Different+populations+and+sources+of+human+mesenchymal+stem+cells+%28MSC%29%3A+A+comparison+of+adult+and+neonatal+tissue-derived+MSC%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Communication+and+Signaling%3A+CCS%22%5BJournal%5D)">Different populations and sources of human mesenchymal stem cells (MSC): A comparison of adult and neonatal tissue-derived MSC.</a> Cell Communication and Signaling: CCS. 9, 12(2011).</li>
<li>Wagner, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aging+and+replicative+senescence+have+related+effects+on+human+stem+and+progenitor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Aging and replicative senescence have related effects on human stem and progenitor cells.</a> PLoS One. 4 (6), 5846(2009).</li>
<li>Brown, P. T., Squire, M. W., Li, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+and+evaluation+of+mesenchymal+stem+cells+derived+from+human+embryonic+stem+cells+and+bone+marrow%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+and+Tissue+Research%22%5BJournal%5D)">Characterization and evaluation of mesenchymal stem cells derived from human embryonic stem cells and bone marrow.</a> Cell and Tissue Research. 358 (1), 149-164 (2014).</li>
<li>Trivedi, P., Hematti, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Derivation+and+immunological+characterization+of+mesenchymal+stromal+cells+from+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Hematology%22%5BJournal%5D)">Derivation and immunological characterization of mesenchymal stromal cells from human embryonic stem cells.</a> Experimental Hematology. 36 (3), 350-359 (2008).</li>
<li>Barberi, T., Willis, L. M., Socci, N. D., Studer, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Derivation+of+multipotent+mesenchymal+precursors+from+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Medicine%22%5BJournal%5D)">Derivation of multipotent mesenchymal precursors from human embryonic stem cells.</a> PLoS Medicine. 2 (6), 161(2005).</li>
<li>Xiong, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Derivation+of+adipocytes+from+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+and+Development%22%5BJournal%5D)">Derivation of adipocytes from human embryonic stem cells.</a> Stem Cells and Development. 14 (6), 671-675 (2005).</li>
<li>Cuaranta-Monroy, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+efficient+differentiation+of+embryonic+stem+cells+into+adipocytes+by+ascorbic+acid%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Research%22%5BJournal%5D)">Highly efficient differentiation of embryonic stem cells into adipocytes by ascorbic acid.</a> Stem Cell Research. 13 (1), 88-97 (2014).</li>
<li>van Harmelen, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+lipolytic+regulation+in+human+embryonic+stem+cell-derived+adipocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Obesity+%28Silver+Spring%29%22%5BJournal%5D)">Differential lipolytic regulation in human embryonic stem cell-derived adipocytes.</a> Obesity (Silver Spring). 15 (4), 846-852 (2007).</li>
<li>Noguchi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+characterization+and+engraftment+of+adipocytes+derived+from+human+induced+pluripotent+stem+cells+and+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+and+Development%22%5BJournal%5D)">In vitro characterization and engraftment of adipocytes derived from human induced pluripotent stem cells and embryonic stem cells.</a> Stem Cells and Development. 22 (21), 2895-2905 (2013).</li>
<li>Ahfeldt, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Programming+human+pluripotent+stem+cells+into+white+and+brown+adipocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Programming human pluripotent stem cells into white and brown adipocytes.</a> Nature Cell Biology. 14 (2), 209-219 (2012).</li>
<li>Lee, Y. K., Cowan, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differentiation+of+white+and+brown+adipocytes+from+human+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">Differentiation of white and brown adipocytes from human pluripotent stem cells.</a> Methods in Enzymology. 538, 35-47 (2014).</li>
<li>Abdelalim, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modeling+different+types+of+diabetes+using+human+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+and+Molecular+Life+Sciences%3A+CMLS%22%5BJournal%5D)">Modeling different types of diabetes using human pluripotent stem cells.</a> Cellular and Molecular Life Sciences: CMLS. 78 (6), 2459-2483 (2021).</li>
<li>Abdelalim, E. M., Bonnefond, A., Bennaceur-Griscelli, A., Froguel, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pluripotent+stem+cells+as+a+potential+tool+for+disease+modelling+and+cell+therapy+in+diabetes%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Reviews+and+Reports%22%5BJournal%5D)">Pluripotent stem cells as a potential tool for disease modelling and cell therapy in diabetes.</a> Stem Cell Reviews and Reports. 10 (3), 327-337 (2014).</li>
<li>Karam, M., Younis, I., Elareer, N. R., Nasser, S., Abdelalim, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Scalable+Generation+of+mesenchymal+stem+cells+and+adipocytes+from+human+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cells%22%5BJournal%5D)">Scalable Generation of mesenchymal stem cells and adipocytes from human pluripotent stem cells.</a> Cells. 9 (3), (2020).</li>
<li>Karam, M., Abdelalim, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Robust+and+highly+efficient+protocol+for+differentiation+of+human+pluripotent+stem+cells+into+mesenchymal+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Robust and highly efficient protocol for differentiation of human pluripotent stem cells into mesenchymal stem cells.</a> Methods in Molecular Biology. , Clifton, N.J. (2020).</li>
<li>Li, L., Bennett, S. A., Wang, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+E-cadherin+and+other+cell+adhesion+molecules+in+survival+and+differentiation+of+human+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Adhesion+%26+Migration%22%5BJournal%5D)">Role of E-cadherin and other cell adhesion molecules in survival and differentiation of human pluripotent stem cells.</a> Cell Adhesion & Migration. 6 (1), 59-70 (2012).</li>
<li>Lai, L., Bohnsack, B. L., Niederreither, K., Hirschi, K. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retinoic+acid+regulates+endothelial+cell+proliferation+during+vasculogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Retinoic acid regulates endothelial cell proliferation during vasculogenesis.</a> Development. 130 (26), 6465-6474 (2003).</li>
<li>Chanchevalap, S., Nandan, M. O., Merlin, D., Yang, V. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((All-trans+retinoic+acid+inhibits+proliferation+of+intestinal+epithelial+cells+by+inhibiting+expression+of+the+gene+encoding+Kruppel-like+factor+5%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Letters%22%5BJournal%5D)">All-trans retinoic acid inhibits proliferation of intestinal epithelial cells by inhibiting expression of the gene encoding Kruppel-like factor 5.</a> FEBS Letters. 578 (1-2), 99-105 (2004).</li>
<li>di Masi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retinoic+acid+receptors%3A+from+molecular+mechanisms+to+cancer+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Aspects+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Retinoic acid receptors: from molecular mechanisms to cancer therapy.</a> Molecular Aspects of Medicine. 41, 1(2015).</li>
<li>Simandi, Z., Balint, B. L., Poliska, S., Ruhl, R., Nagy, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+of+retinoic+acid+receptor+signaling+coordinates+lineage+commitment+of+spontaneously+differentiating+mouse+embryonic+stem+cells+in+embryoid+bodies%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Letters%22%5BJournal%5D)">Activation of retinoic acid receptor signaling coordinates lineage commitment of spontaneously differentiating mouse embryonic stem cells in embryoid bodies.</a> FEBS Letters. 584 (14), 3123-3130 (2010).</li>
<li>De Angelis, M. T., Parrotta, E. I., Santamaria, G., Cuda, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Short-term+retinoic+acid+treatment+sustains+pluripotency+and+suppresses+differentiation+of+human+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+%26+Disease%22%5BJournal%5D)">Short-term retinoic acid treatment sustains pluripotency and suppresses differentiation of human induced pluripotent stem cells.</a> Cell Death & Disease. 9 (1), 6(2018).</li>
<li>Li, L., Dong, L., Wang, Y., Zhang, X., Yan, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lats1%2F2-mediated+alteration+of+hippo+signaling+pathway+regulates+the+fate+of+bone+marrow-derived+mesenchymal+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22BioMed+Research+International%22%5BJournal%5D)">Lats1/2-mediated alteration of hippo signaling pathway regulates the fate of bone marrow-derived mesenchymal stem cells.</a> BioMed Research International. 2018, 4387932(2018).</li>
<li>Moldes, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peroxisome-proliferator-activated+receptor+gamma+suppresses+Wnt%2Fbeta-catenin+signalling+during+adipogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22The+Biochemical+Journal%22%5BJournal%5D)">Peroxisome-proliferator-activated receptor gamma suppresses Wnt/beta-catenin signalling during adipogenesis.</a> The Biochemical Journal. 376, Pt 3 607-613 (2003).</li>
<li>Ross, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+adipogenesis+by+Wnt+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Inhibition of adipogenesis by Wnt signaling.</a> Science. 289 (5481), 950-953 (2000).</li>
<li>Wang, Y. K., Chen, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+adhesion+and+mechanical+stimulation+in+the+regulation+of+mesenchymal+stem+cell+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cellular+and+Molecular+Medicine%22%5BJournal%5D)">Cell adhesion and mechanical stimulation in the regulation of mesenchymal stem cell differentiation.</a> Journal of Cellular and Molecular Medicine. 17 (7), 823-832 (2013).</li>
<li>Mohsen-Kanson, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differentiation+of+human+induced+pluripotent+stem+cells+into+brown+and+white+adipocytes%3A+role+of+Pax3%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Differentiation of human induced pluripotent stem cells into brown and white adipocytes: role of Pax3.</a> Stem Cells. 32 (6), 1459-1467 (2014).</li>
<li>Billon, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+generation+of+adipocytes+by+the+neural+crest%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">The generation of adipocytes by the neural crest.</a> Development. 134 (12), 2283-2292 (2007).</li>
<li>Li, N., Kelsh, R. N., Croucher, P., Roehl, H. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+neural+crest+cell+fate+by+the+retinoic+acid+and+Pparg+signalling+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Regulation of neural crest cell fate by the retinoic acid and Pparg signalling pathways.</a> Development. 137 (3), 389-394 (2010).</li>
<li>Ussar, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ASC-1%2C+PAT2%2C+and+P2RX5+are+cell+surface+markers+for+white%2C+beige%2C+and+brown+adipocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Translational+Medicine%22%5BJournal%5D)">ASC-1, PAT2, and P2RX5 are cell surface markers for white, beige, and brown adipocytes.</a> Science Translational Medicine. 6 (247), (2014).</li>
<li>Festy, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Surface+protein+expression+between+human+adipose+tissue-derived+stromal+cells+and+mature+adipocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Histochemistry+and+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Surface protein expression between human adipose tissue-derived stromal cells and mature adipocytes.</a> Histochemistry and Cell Biology. 124 (2), 113-121 (2005).</li>
<li>Cai, L., Wang, Z., Ji, A., Meyer, J. M., vander Westhuyzen, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Scavenger+receptor+CD36+expression+contributes+to+adipose+tissue+inflammation+and+cell+death+in+diet-induced+obesity%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Scavenger receptor CD36 expression contributes to adipose tissue inflammation and cell death in diet-induced obesity.</a> PLoS One. 7 (5), 36785(2012).</li>
<li>Mesuret, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+neuronal+role+of+the+Alanine-Serine-Cysteine-1+transporter+%28SLC7A10%2C+Asc-1%29+for+glycine+inhibitory+transmission+and+respiratory+pattern%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">A neuronal role of the Alanine-Serine-Cysteine-1 transporter (SLC7A10, Asc-1) for glycine inhibitory transmission and respiratory pattern.</a> Scientific Reports. 8 (1), 8536(2018).</li>
<li>Silverstein, R. L., Febbraio, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD36%2C+a+scavenger+receptor+involved+in+immunity%2C+metabolism%2C+angiogenesis%2C+and+behavior%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Signaling%22%5BJournal%5D)">CD36, a scavenger receptor involved in immunity, metabolism, angiogenesis, and behavior.</a> Science Signaling. 2 (72), (2009).</li>
<li>Brooimans, R. A., van Wieringen, P. A., van Es, L. A., Daha, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Relative+roles+of+decay-accelerating+factor%2C+membrane+cofactor+protein%2C+and+CD59+in+the+protection+of+human+endothelial+cells+against+complement-mediated+lysis%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Relative roles of decay-accelerating factor, membrane cofactor protein, and CD59 in the protection of human endothelial cells against complement-mediated lysis.</a> European Journal of Immunology. 22 (12), 3135-3140 (1992).</li>
<li>Davies, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD59%2C+an+LY-6-like+protein+expressed+in+human+lymphoid+cells%2C+regulates+the+action+of+the+complement+membrane+attack+complex+on+homologous+cells%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Experimental+Medicine%22%5BJournal%5D)">CD59, an LY-6-like protein expressed in human lymphoid cells, regulates the action of the complement membrane attack complex on homologous cells.</a> The Journal of Experimental Medicine. 170 (3), 637-654 (1989).</li>
<li>Lapid, K., Graff, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Form%28ul%29ation+of+adipocytes+by+lipids%5BTitle%5D)+AND+%22Adipocyte%22%5BJournal%5D)">Form(ul)ation of adipocytes by lipids.</a> Adipocyte. 6 (3), 176-186 (2017).</li>
<li>Aldridge, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assay+validation+for+the+assessment+of+adipogenesis+of+multipotential+stromal+cells--a+direct+comparison+of+four+different+methods%5BTitle%5D)+AND+%22Cytotherapy%22%5BJournal%5D)">Assay validation for the assessment of adipogenesis of multipotential stromal cells--a direct comparison of four different methods.</a> Cytotherapy. 15 (1), 89-101 (2013).</li>
<li>Schaedlich, K., Knelangen, J. M., Navarrete Santos, A., Fischer, B., Navarrete Santos, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+method+to+sort+ESC-derived+adipocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+A%22%5BJournal%5D)">A simple method to sort ESC-derived adipocytes.</a> Cytometry A. 77 (10), 990-995 (2010).</li>
<li>Costa, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+heterogeneity+of+mesenchymal+stem+cells+from+natural+niches+to+culture+conditions%3A+implications+for+further+clinical+uses%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+and+Molecular+Life+Sciences%3A+CMLS%22%5BJournal%5D)">Functional heterogeneity of mesenchymal stem cells from natural niches to culture conditions: implications for further clinical uses.</a> Cellular and Molecular Life Sciences: CMLS. 78 (2), 447-467 (2021).</li>
</ol>

Autorzy oświadczają, że nie mają sprzecznych interesów.

Protokół ten ma ogromne znaczenie ze względu na jego zdolność do dostarczania MSCs o wysokiej wydajności i wydajności. Ta masowa produkcja MSCs była możliwa dzięki przejściowej inkubacji EB pochodzących z iPSC z 10 μM RA14,15. Przejściowe leczenie 10 μM RZS zwiększyło wydajność MSC od 11,2 do 1542 razy14,15, przy czym protokół ten ma zastosowanie zarówno do iPSC, jak i hPSC. Przy tej dawce i czasie trwani...

Mezenchymalne komórki macierzyste (MSC) działają jako efektywny zasób przejściowy do produkcji komórek pochodzenia mezodermalnego, takich jak adipocyty, osteocyty i chondrocyty, które mogą być dalej wykorzystywane do modelowania ich odpowiednich zaburzeń genetycznych. Jednak poprzednie podejścia opierały się na pozyskiwaniu tych MSCs z dorosłych tkanek 1, co wiązało się z wyzwaniem uzyskania ich w dużej liczbie od dawców oraz ograniczeniem utrzymania ich funkcjonalnej żywotności w nieoptymalnych warunkach hodowli in vitro1,2. Przeszkody te spowodowały duże zapotrzebowanie na posiadanie protokołu do wytwarzania MSC in vitro. Ludzkie indukowane pluripotencjalne komórki macierzyste (iPSC) mogą być wykorzystywane jako cenne źródło MSCs, wykazując cechy MSC3,4,5. MSCs pochodzące z iPSC mogą być stosowane jako opcja terapeutyczna w wielu chorobach. Ponadto zdolność MSC pochodzących z iPSC do generowania adipocytów sprawia, że są one cennym modelem ludzkim in vitro do badania ludzkiej adipogenezy, otyłości i zaburzeń związanych z adipocytami.
Obecne protokoły różnicowania adipocytów można podzielić na dwie grupy, z których jedna obejmuje różnicowanie adipocytów za pomocą chemicznych lub białkowych koktajli, co daje wynikową wydajność 30%-60%6,7,8,9, podczas gdy drugi obejmuje manipulację genetyczną w celu solidnej indukcji kluczowych czynników transkrypcyjnych regulujących rozwój adipocytów, aby uzyskać wydajność 80%-90%10,11. Jednak manipulacja genetyczna nie podsumowuje naturalnego procesu różnicowania adipocytów i często maskuje subtelne paradygmaty pojawiające się podczas adipogenezy, co czyni ją nieskuteczną dla celów modelowania chorób12,13. Dlatego przedstawiamy sposób na sortowanie dojrzałych adipocytów pochodzenia chemicznego od niedojrzałych poprzez fluorescencyjne znakowanie adipocytów zawierających lipidy za pomocą czerwieni nilowej.
Tutaj prezentujemy protokół polegający na przejściowej inkubacji ciał embrionalnych pochodzących z iPSC (EBs) z kwasem all-trans retinowym w celu wytworzenia dużej liczby szybko proliferujących MSCs, które mogą być dalej wykorzystywane do generowania adipocytów14. Przedstawiamy również sposób sortowania dojrzałych adipocytów pochodzenia chemicznego z puli różnicowania heterogenicznego poprzez fluorescencyjne znakowanie ich kropelek lipidów za pomocą barwnika lipofilowego; Nil czerwony. Pozwoliłoby to na wygenerowanie czystej populacji dojrzałych adipocytów o zwiększonej funkcjonalności w celu dokładnego modelowania zaburzeń metabolicznych związanych z adipocytami.

<table><tbody><tr><td>Adiponektyna</td><td>Abcam</td><td>ab22554</td><td>Marker dojrzewania adipocytów</td></tr><tr><td>anty-CD105</td><td>BD Pharmingen</td><td>560839</td><td>Marker różnicowania MSC</td></tr><tr><td>anty-CD14</td><td>Pharmingen</td><td>561712</td><td>Marker różnicowania MSC</td></tr><tr><td>anty-CD19</td><td>Pharmingen</td><td>555415</td><td>Marker różnicowania MSC</td></tr><tr><td>anty-CD34</td><td>BD Pharmingen</td><td>555824</td><td>Marker różnicujący</td></tr><tr><td>MSC anty-CD44</td><td>abcam</td><td>ab93758</td><td>Marker różnicujący MSC</td></tr><tr><td>anty-CD45</td><td>BD Pharmingen</td><td> 560975</td><td>Marker różnicowania MSC</td></tr><tr><td>anty-CD73</td><td>BD Pharmingen</td><td>550256</td><td>Marker różnicowania MSC</td></tr><tr><td>anty-CD90</td><td>BD Pharmingen</td><td>555596</td><td>Marker różnicowania MSC</td></tr><tr><td>bFGF</td><td>R& D</td><td>233-FP</td><td>Suplement do pożywek hodowlanych MSC</td></tr><tr><td>C/EBPA</td><td>Abcam</td><td>ab40761</td><td>Marker dojrzewania adipocytów</td></tr><tr><td>Dexamethasone</td><td>Torics</td><td>1126</td><td>Suplement pożywki różnicującej adipocyty</td></tr><tr><td>FABP4</td><td>Abcam</td><td>ab93945</td><td>Marker dojrzewania adipocytów</td></tr><tr><td>Surowica bydlęca płodu</td><td>ThermoFisher</td><td>10082147</td><td>Suplement pożywki hodowlanej MSC</td></tr><tr><td>Glutamax</td><td>ThermoFisher</td><td>35050-061</td><td>Suplement pożywki hodowlanej MSC</td></tr><tr><td>IBMX</td><td>Sigma Aldrich</td><td>I5879</td><td>Suplement pożywek różnicujących adipocyty</td></tr><tr><td>Indometacyna</td><td>Sigma Aldrich</td><td>I7378</td><td>Suplement pożywki różnicującej adipocyty</td></tr><tr><td></td><td>Insulina Sigma Aldrich</td><td>91077C</td><td>Suplement pożywki różnicującej adipocyty</td></tr><tr><td>Nokaut DMEM</td><td>ThermoFisher</td><td>12660012</td><td>Pożywka bazowa do przygotowania matrigelu</td></tr><tr><td>DMEM o niskiej zawartości glukozy</td><td>Pożywka</td>hodowlana <td>ThermoFisher</td><td>11885084</td> MSC</tr><tr><td>Matrigel</td><td>Corning</td><td>354230</td><td>Matryca powlekająca</td></tr><tr><td>MEM-alfa</td><td>ThermoFisher</td><td>12561056</td><td>Pożywki różnicujące adipocyty</td></tr><tr><td>Nilered</td><td>Sigma Aldrich</td><td>19123</td><td>Marker sortujący dla adipocytów</td></tr><tr><td>Penicylina</td><td>ThermoFisher</td><td>15140122</td><td>Suplement pożywki MSC/Adipocyte</td></tr><tr><td>Sól fizjologiczna buforowana fosforanami</td><td>Bufor</td> do <td>płukania</td><td>14190144</td></tr><tr><td>ThermoFisher Pierce&trade; 20X TBS Bufor</td><td>do płukania</td><td>Thermo Fisher</td><td>28358</td></tr><tr><td>PPARG</td><td>Cell Signaling Technology</td><td>2443</td><td>Marker dojrzewania adipocytów</td></tr><tr><td>ReLeSR</td><td>Stem Cell Technologie</td><td>5872</td><td>Odczynnik dysocjacyjny</td></tr><tr><td>Kwas retinowy</td><td>Sigma Aldrich</td><td>R2625</td><td>MSC Suplement pożywek różnicujących</td></tr><tr><td>Inhibitor skał</td><td>Tocris</td><td>1254/10</td><td>hPSC suplement do pożywek</td></tr><tr><td>hodowlanych Roziglitazon</td><td>Sigma Aldrich</td><td>R2408</td><td>Suplement do różnicowania adipocytów</td></tr><tr><td>StemFlex</td><td>ThermoFisher</td><td>A334901</td><td>hPSC pożywka hodowlana</td></tr><tr><td>Triton</td><td>Thermo Fisher</td><td>28314</td><td>Odczynnik do permebealizacji</td></tr><tr><td>Trypsyna</td><td>ThermoFisher</td><td>25200072</td><td>Odczynnik dysocjacyjny</td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P7942</td><td>Bufor do płukania</td></tr></tbody></table>

solidne różnicowanie ludzkich ipsc w czystą populację adipocytów w celu zbadania zaburzeń związanych z adipocytami

Robust Differentiation of Human iPSCs into a Pure Population of Adipocytes to Study Adipocyte-Associated Disorders

Ostatnie osiągnięcia w technologii indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (iPSC) pozwoliły na generowanie różnych typów komórek, w tym adipocytów. Jednak obecne metody różnicowania mają niską skuteczność i nie wytwarzają jednorodnej populacji adipocytów. Tutaj obchodzimy ten problem, stosując metodę opartą w całości na retinoe trans do produkcji mezenchymalnych komórek macierzystych (MSC) z wysoką wydajnością. Regulując szlaki rządzące proliferacją, przeżyciem i adhezją komórek, nasza strategia różnicowania umożliwia wydajne generowanie ciał embrionalnych (EB), które różnicują się w czystą populację multipotencjalnych MSCs. Duża liczba MSCs generowanych tą metodą stanowi idealne źródło do generowania adipocytów. Wyzwaniem pozostaje jednak niejednorodność próbki wynikająca z różnicowania adipocytów. Dlatego zastosowaliśmy metodę opartą na czerwieni nilowej do oczyszczania dojrzałych adipocytów zawierających lipidy za pomocą FACS. Ta strategia sortowania pozwoliła nam ustalić niezawodny sposób modelowania zaburzeń metabolicznych związanych z adipocytami przy użyciu puli adipocytów o zmniejszonej niejednorodności próbki i zwiększonej funkcjonalności komórek.

Schemat i morfologia komórek podczas różnicowania mezenchymalnego: Różnicowanie iPSC w MSC obejmuje różne etapy rozwoju, obejmujące formowanie EB, różnicowanie w MSC oraz ekspansję MSC (Rycina 1). Podczas tych etapów rozwoju komórki przyjmują różną morfologię ze względu na różne substancje stymulujące, którym są poddawane. Po zainicjowaniu różnicowania komórki są wysiewane w zawiesinie i powinny być okrągłe, z wyraźnymi granicami komórkowymi, o średnicy od małej do średniej (<strong class="x...

Protokół pozwala na generowanie czystej populacji adipocytów z indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (iPSC). Kwas retinowy służy do różnicowania iPSC w mezenchymalne komórki macierzyste (MSC), które są wykorzystywane do produkcji adipocytów. Następnie stosuje się podejście sortowania oparte na barwieniu czerwienią nilową w celu uzyskania czystych adipocytów.

Solidne różnicowanie ludzkich iPSC w czystą populację adipocytów w celu zbadania zaburzeń związanych z adipocytami

Recent advances in induced pluripotent stem cell (iPSC) technology have allowed the generation of different cell types, including adipocytes. However, the ...

Poprzednie podejścia opierały się na wysoce inwazyjnych metodach pozyskiwania mezenchymalnych komórek macierzystych in vitro, ale te mezenchymalne komórki macierzyste miały ograniczenie do wytwarzania heterogenicznej puli 30% z wydajnością od 30 do 60%Tutaj przedstawiamy protokół wytwarzania dużej liczby szybko proliferujących mezenchymalnych komórek macierzystych, które mogą wytworzyć czystą populację dojrzałych adipocytów poprzez sortowanie przy użyciu czerwieni nilowej. Gdy iPSC osiągną 80% konfluencji, umyj komórki DPBS i dodaj pożywkę dysocjacyjną zawierającą EDTA. Inkubuj komórki w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez jedną minutę.Po jednej minucie odessać odczynnik dysocjacyjny i umieścić komórki w temperaturze 37 stopni Celsjusza na dodatkową minutę. Następnie wyjmij płytkę z inkubatora. Dodaj jeden mililitr pożywki StemFlex na studzienkę i ostrożnie zbierz komórki w 15-mililitrowej stożkowej probówce.Odwirować komórki. Usunąć supernatant i delikatnie zawiesić go ponownie w trzech mililitrach pożywki różnicującej MSC zawierającej 10 mikromoli inhibitora skały. Wymieszaj zawiesinę komórek i rozprowadź 500 mikrolitrów na studzienkę w 24-dołkowej płytce o bardzo niskim mocowaniu.Następnie umieść płytkę w inkubatorze w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Po 24 godzinach, aby indukować uzyskane ciała embrionalne, zbierz je do 15-mililitrowej probówki i pozwól im się uspokoić. Po 15 minutach usunąć supernatant i dodać pożywkę różnicującą MSC uzupełnioną 10 mikromolowym kwasem retinowym.Delikatnie zawiesić ciała embrionalne i rozprowadzić 500 mikrolitrów na studzienkę w tej samej 24-dołkowej płytce mocującej o bardzo niskim poziomie. Następnie umieść płytkę w inkubatorze. Po 48 godzinach zbierz ciała zarodkowe do 15-mililitrowej probówki i pozwól im osiąść przez 15 minut.Następnie usunąć supernatant i dodać pożywkę do różnicowania MSC uzupełnioną 0,1 mikromolowym kwasem retinowym. Po ponownym wywieszeniu ciał zarodkowych rozprowadzić 500 mikrolitrów na studzienkę na tej samej płytce 24-dołkowej i umieścić płytkę w inkubatorze. Czterdzieści osiem godzin po ostatnim leczeniu kwasem retinowym zbierz ciała zarodkowe, usuń supernatant i dodaj pożywkę DMEM o niskiej zawartości glukozy bez cytokin.Delikatnie zawiesić ponownie i rozprowadzić 500 mikrolitrów zawiesiny komórek na studzienkę w tej samej 24-dołkowej płytce o bardzo niskim mocowaniu, a następnie inkubować płytkę w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Po 48 godzinach, aby pokryć ciała embrionalne pochodzące z iPSC, zbierz ciała embrionalne do 15-mililitrowej probówki, pozwól im się osadzić, a następnie usuń supernatant i ponownie zawieś w dwóch mililitrach świeżej pożywki różnicującej MSC. Następnie przenieś zawiesinę do dwóch studzienek sześciodołkowej płytki pokrytej membraną podstawną i inkubuj komórki w temperaturze 37 stopni Celsjusza.Po pięciu dniach zastąp zużyte pożywki świeżą pożywką różnicującą MSC zawierającą 2,5 nanograma na mililitr podstawowego czynnika wzrostu fibroblastów i kontynuuj różnicowanie MCS przez okres do 11 i 15 dni. Gdy posiane ciała embrionalne osiągną 80 do 90% konfluencji, należy je przepuścić, myjąc DPBS, dodając trypsynę-EDTA i inkubując w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez jedną minutę. Usuń trypsynę-EDTA z płytki i ponownie inkubuj w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez jedną minutę.Następnie dodaj jeden mililitr pożywki na studzienkę. Po trzech minutach zebrać komórki za pomocą pożywki różnicującej MSC w stożkowej probówce o pojemności 15 mililitrów i odwirować komórki. Następnie ponownie zawieś komórki w pożywce różnicującej MSC zawierającej podstawowy czynnik wzrostu fibroblastów i umieść komórki na płytkach pokrytych macierzą błony podstawnej w stosunku od jednego do trzech.Po tym, jak MSCs osiągną 90% konfluencji, kontynuuj ich hodowlę przez kolejne 48 godzin, aby umożliwić im przejście przez okres zahamowania wzrostu. Następnie usuń pożywkę i umyj komórki DBPS. Po umyciu dodaj do płytki kompletną pożywkę do różnicowania adipocytów i inkubuj komórki w temperaturze 37 stopni Celsjusza.Zmieniaj podłoże co drugi dzień przez 14 dni. Różnicowanie MSC pochodzących z iPSC na adipocyty. Aby posortować adipocyty za pomocą czerwieni nilowej, należy przygotować roztwór roboczy czerwieni nilowej w DMSO, jak opisano w manuskrypcie tekstowym.Przed użyciem należy rozmrozić roztwór podstawowy i rozpuścić go w DPBS do uzyskania stężenia roztworu roboczego 300 nanomolowych. W 14 dniu różnicowania adipocytów lub po nim należy wyrzucić pożywkę z komórek i przemyć za pomocą DPBS. Następnie dodaj czerwony roztwór roboczy Nilu.Przykryj płytkę i inkubuj komórki w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Po 15 minutach zastąp roztwór czerwieni nilowej trypsyną-EDTA i inkubuj komórki w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez cztery minuty. Następnie zbierz komórki za pomocą DMEM zawierającego 5% FBS w 15-mililitrowej stożkowej probówce i odwiruj komórki.Usunąć supernatant i ponownie zawiesić komórki w DPBS o gęstości 1 miliona komórek na mililitr. Następnie za pomocą sortera FACS wyizoluj czerwono-dodatnie komórki Nilu za pomocą kanału FL-1. Zebrać posortowane komórki i ponownie wyhodować je w pożywce różnicującej adipocyty lub przystąpić do ekstrakcji RNA, a następnie przeprowadzić analizę ilościową markerów różnicowania adipocytów.Po zainicjowaniu różnicowania komórki posiane w zawiesinie są okrągłe z określonymi granicami komórek i mają małą lub średnią średnicę. Żywotność ciał embrionalnych obserwuje się na podstawie szybkiej proliferacji, która prowadzi do powstania większej liczby MSCs. To szybkie zachowanie proliferacji, wraz z ich osobliwą i wydłużoną morfologią, jest zachowane nawet po przejściu MSCs na świeże płytki pokryte matrycą.Dobre różnicowanie daje wiarygodne MSCs o ponad 90% skuteczności ekspresji mezenchymalnych markerów powierzchniowych CD73, CD44 i CD90. Ponadto ocena komórek pod kątem braku markerów powierzchniowych obrazujących fenotyp hematopoetyczny CD14, CD34 i CD19 wykazała mniej niż 1% skuteczność ekspresji, wysoka ekspresja w dystrybucji cytoplazmatycznej FABP4, markera terminalnie zróżnicowanych adipocytów, wskazuje na ich dojrzałość rozwojową. Dodatkowo wysoka ekspresja adiponektyny, innego markera dojrzałości adipocytów, wskazuje, że adipocyty są wystarczająco funkcjonalne, aby ulegać magazynowaniu lipidów i adipogenezie w odpowiedzi na sygnalizację glukozy.Po barwieniu czerwień nilowa wiąże się wyłącznie z dojrzałymi adipocytami zawierającymi lipidy, co czyni ją skutecznym narzędziem do sortowania dojrzałych adipocytów za pomocą fluorescencyjnej cytometrii przepływowej. Komórki czerwono-dodatnie Nilu wykazują znaczną regulację markerów dojrzewania co najmniej dwukrotnie w porównaniu z komórkami niesortowanymi. Musisz być bardzo delikatny podczas pobierania komórek podczas tworzenia ciała embrionalnego i dysocjacji komórek mezenchymalnych, ponieważ miałoby to duży wpływ na przeżywalność po dysocjacji mezenchymalnych komórek macierzystych.Czysta populacja adipocytów uzyskana od pacjentów będących nosicielami mutacji może być poddana funkcjonalnemu i całemu sekwencjonowaniu transkryptomu w celu określenia szlaków regulacyjnych i sygnałowych dotkniętych daną mutacją bez wpływu na dane dotyczące niejednorodności próbki. Technika ta pozwoli na skalowalne wytwarzanie mezenchymalnych komórek macierzystych in vitro, eliminując potrzebę pobierania ich od ludzkich dawców w celu łatwego różnicowania ich do adipocytów, chondrocytów i osteocytów w celu zrozumienia patogenezy chorób związanych z tkankami.

robust-differentiation-human-ipscs-into-pure-population-adipocytes-to

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia rozwojowa

Dojrzałe adipocyty mogą stanowić obfite źródło komórek macierzystych poprzez dedyferencjację, co prowadzi do jednorodnej populacji komórek podobnych do fibroblastów. Trawienie kolagenazą służy do izolowania dojrzałych adipocytów z ludzkiego tłuszczu. Celem naszego protokołu jest uzyskanie multipotencjalnych, odróżnicowanych komórek tłuszczowych z ludzkich dojrzałych adipocytów.

Wytwarzanie ludzkich komórek macierzystych tkanki tłuszczowej poprzez dedyferencjację dojrzałych adipocytów w hodowlach sufitowych

Ten protokół opisuje izolację komórek macierzystych pochodzących z tkanki tłuszczowej świni (pADSC) z podskórnych tkanek tłuszczowych z badaniem multipotencji. Multipotencjalne pADSC są wykorzystywane do wyznaczania procesów różnicowania adipocytów i badania transdyferencjacji do wielu linii komórkowych mezenchymy mezodermalnej lub dalszych linii ektodermy i endodermy do badań regeneracyjnych.

Izolacja i różnicowanie komórek macierzystych pochodzących z tkanki tłuszczowej z podskórnych tkanek tłuszczowych świń

Ten protokół opisuje techniczne podejście do izolowania subpopulacji komórek zrębu adipogennych i włóknisto-zapalnych z mysich magazynów białej tkanki tłuszczowej (WAT) w jamie brzusznej poprzez sortowanie komórek aktywowane fluorescencją lub separację kulek immunomagnetycznych.

Izolacja adipogennych i włóknisto-zapalnych subpopulacji komórek zrębu z mysich wewnątrzbrzusznych magazynów tłuszczu

Prezentujemy prostą metodę izolowania wysoce żywotnych komórek progenitorowych tkanki tłuszczowej z najądrzy myszy za pomocą sortowania komórek aktywowanego fluorescencją.

Preparat komórek progenitorowych tkanki tłuszczowej tkanki tłuszczowej najądrza myszy

Ten raport opisuje protokół jednoczesnej izolacji pierwotnych brązowych i białych preadipocytów od nowonarodzonych myszy. Wyizolowane komórki można hodować w hodowli i indukować do różnicowania się w pełni dojrzałe białe i brązowe adipocyty. Metoda umożliwia genetyczną, molekularną i funkcjonalną charakterystykę pierwotnych komórek tłuszczowych w hodowli.

Izolacja i różnicowanie pierwotnych białych i brązowych preadipocytów od nowonarodzonych myszy

Ten protokół opisuje izolację preadipocytów myszy z podskórnego tłuszczu, ich różnicowanie na dojrzałe adipocyty oraz indukcję insulinooporności. Działanie insuliny ocenia się na podstawie fosforylacji/aktywacji członków szlaku sygnałowego insuliny przez western blot. Metoda ta pozwala na bezpośrednie określenie insulinooporności/wrażliwości w adipocytach pierwotnych.

Zróżnicowane adipocyty myszy w hodowli pierwotnej: model insulinooporności

Preadipocyty są izolowane z frakcji naczyniowej zrębu międzyłopatkowej brązowej tkanki tłuszczowej od nowonarodzonych myszy i różnicowane w komórki, które gromadzą kropelki lipidów, wyrażają markery molekularne i pokazują morfologię mitochondriów dojrzałych brązowych adipocytów. Komórki te są dalej analizowane za pomocą immunofluorescencji i transmisyjnej mikroskopii elektronowej.

Różnicowanie i obrazowanie brązowych adipocytów z frakcji zrębowej naczyniowej tkanki tłuszczowej śródłopatkowej od nowonarodzonych myszy

Ten protokół opisuje półautomatyczną izolację frakcji zrębu naczyniowego (SVF) z mysiej tkanki tłuszczowej w celu uzyskania preadipocytów i osiągnięcia różnicowania adipocytów in vitro. Użycie dysocjatora tkankowego do trawienia kolagenazy zmniejsza zmienność eksperymentalną i zwiększa odtwarzalność.

Półautomatyczna izolacja zrębu frakcji naczyniowej z mysiej białej tkanki tłuszczowej za pomocą dysocjatora tkankowego

Rozmiar i kruchość dojrzałych adipocytów ograniczyły dostępne techniki i narzędzia do ich badania i izolacji. W tym miejscu opisano protokół izolacji dojrzałych mysich adipocytów, który można łatwo dostosować do różnych magazynów tłuszczowych i diety myszy.

Izolacja i hodowla pierwotnych mysich adipocytów od myszy chudych i otyłych

Przedstawiamy tutaj standardową metodę efektywnej izolacji komórek macierzystych pochodzących z tłuszczu i adipocytów, charakteryzującą się skróceniem czasu przetwarzania o &gt;90%, wysoką żywotnością komórek oraz szeroką kompatybilnością.

Efektywna izolacja komórek macierzystych i adipocytów pochodzących z tłuszczu z tkanki tłuszczowej wieprzi

Poznaj protokół różnicowania ludzkich iPSC w czystą populację adipocytów przy użyciu kwasu retinowego i barwienia Nile red. Ta metoda umożliwia badanie zaburzeń metabolicznych z wysoką czystością próbek.

Solidne różnicowanie ludzkich iPSC w czystą populację adipocytów w celu zbadania zaburzeń związanych z adipocytami

Przeglądaj więcej filmów