Solidne różnicowanie ludzkich iPSC w czystą populację adipocytów w celu zbadania zaburzeń związanych z adipocytami

Poprzednie podejścia opierały się na wysoce inwazyjnych metodach pozyskiwania mezenchymalnych komórek macierzystych in vitro, ale te mezenchymalne komórki macierzyste miały ograniczenie do wytwarzania heterogenicznej puli 30% z wydajnością od 30 do 60%Tutaj przedstawiamy protokół wytwarzania dużej liczby szybko proliferujących mezenchymalnych komórek macierzystych, które mogą wytworzyć czystą populację dojrzałych adipocytów poprzez sortowanie przy użyciu czerwieni nilowej. Gdy iPSC osiągną 80% konfluencji, umyj komórki DPBS i dodaj pożywkę dysocjacyjną zawierającą EDTA. Inkubuj komórki w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez jedną minutę.

Po jednej minucie odessać odczynnik dysocjacyjny i umieścić komórki w temperaturze 37 stopni Celsjusza na dodatkową minutę. Następnie wyjmij płytkę z inkubatora. Dodaj jeden mililitr pożywki StemFlex na studzienkę i ostrożnie zbierz komórki w 15-mililitrowej stożkowej probówce.

Odwirować komórki. Usunąć supernatant i delikatnie zawiesić go ponownie w trzech mililitrach pożywki różnicującej MSC zawierającej 10 mikromoli inhibitora skały. Wymieszaj zawiesinę komórek i rozprowadź 500 mikrolitrów na studzienkę w 24-dołkowej płytce o bardzo niskim mocowaniu.

Następnie umieść płytkę w inkubatorze w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Po 24 godzinach, aby indukować uzyskane ciała embrionalne, zbierz je do 15-mililitrowej probówki i pozwól im się uspokoić. Po 15 minutach usunąć supernatant i dodać pożywkę różnicującą MSC uzupełnioną 10 mikromolowym kwasem retinowym.

Delikatnie zawiesić ciała embrionalne i rozprowadzić 500 mikrolitrów na studzienkę w tej samej 24-dołkowej płytce mocującej o bardzo niskim poziomie. Następnie umieść płytkę w inkubatorze. Po 48 godzinach zbierz ciała zarodkowe do 15-mililitrowej probówki i pozwól im osiąść przez 15 minut.

Następnie usunąć supernatant i dodać pożywkę do różnicowania MSC uzupełnioną 0,1 mikromolowym kwasem retinowym. Po ponownym wywieszeniu ciał zarodkowych rozprowadzić 500 mikrolitrów na studzienkę na tej samej płytce 24-dołkowej i umieścić płytkę w inkubatorze. Czterdzieści osiem godzin po ostatnim leczeniu kwasem retinowym zbierz ciała zarodkowe, usuń supernatant i dodaj pożywkę DMEM o niskiej zawartości glukozy bez cytokin.

Delikatnie zawiesić ponownie i rozprowadzić 500 mikrolitrów zawiesiny komórek na studzienkę w tej samej 24-dołkowej płytce o bardzo niskim mocowaniu, a następnie inkubować płytkę w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Po 48 godzinach, aby pokryć ciała embrionalne pochodzące z iPSC, zbierz ciała embrionalne do 15-mililitrowej probówki, pozwól im się osadzić, a następnie usuń supernatant i ponownie zawieś w dwóch mililitrach świeżej pożywki różnicującej MSC. Następnie przenieś zawiesinę do dwóch studzienek sześciodołkowej płytki pokrytej membraną podstawną i inkubuj komórki w temperaturze 37 stopni Celsjusza.

Po pięciu dniach zastąp zużyte pożywki świeżą pożywką różnicującą MSC zawierającą 2,5 nanograma na mililitr podstawowego czynnika wzrostu fibroblastów i kontynuuj różnicowanie MCS przez okres do 11 i 15 dni. Gdy posiane ciała embrionalne osiągną 80 do 90% konfluencji, należy je przepuścić, myjąc DPBS, dodając trypsynę-EDTA i inkubując w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez jedną minutę. Usuń trypsynę-EDTA z płytki i ponownie inkubuj w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez jedną minutę.

Następnie dodaj jeden mililitr pożywki na studzienkę. Po trzech minutach zebrać komórki za pomocą pożywki różnicującej MSC w stożkowej probówce o pojemności 15 mililitrów i odwirować komórki. Następnie ponownie zawieś komórki w pożywce różnicującej MSC zawierającej podstawowy czynnik wzrostu fibroblastów i umieść komórki na płytkach pokrytych macierzą błony podstawnej w stosunku od jednego do trzech.

Po tym, jak MSCs osiągną 90% konfluencji, kontynuuj ich hodowlę przez kolejne 48 godzin, aby umożliwić im przejście przez okres zahamowania wzrostu. Następnie usuń pożywkę i umyj komórki DBPS. Po umyciu dodaj do płytki kompletną pożywkę do różnicowania adipocytów i inkubuj komórki w temperaturze 37 stopni Celsjusza.

Zmieniaj podłoże co drugi dzień przez 14 dni. Różnicowanie MSC pochodzących z iPSC na adipocyty. Aby posortować adipocyty za pomocą czerwieni nilowej, należy przygotować roztwór roboczy czerwieni nilowej w DMSO, jak opisano w manuskrypcie tekstowym.

Przed użyciem należy rozmrozić roztwór podstawowy i rozpuścić go w DPBS do uzyskania stężenia roztworu roboczego 300 nanomolowych. W 14 dniu różnicowania adipocytów lub po nim należy wyrzucić pożywkę z komórek i przemyć za pomocą DPBS. Następnie dodaj czerwony roztwór roboczy Nilu.

Przykryj płytkę i inkubuj komórki w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Po 15 minutach zastąp roztwór czerwieni nilowej trypsyną-EDTA i inkubuj komórki w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez cztery minuty. Następnie zbierz komórki za pomocą DMEM zawierającego 5% FBS w 15-mililitrowej stożkowej probówce i odwiruj komórki.

Usunąć supernatant i ponownie zawiesić komórki w DPBS o gęstości 1 miliona komórek na mililitr. Następnie za pomocą sortera FACS wyizoluj czerwono-dodatnie komórki Nilu za pomocą kanału FL-1. Zebrać posortowane komórki i ponownie wyhodować je w pożywce różnicującej adipocyty lub przystąpić do ekstrakcji RNA, a następnie przeprowadzić analizę ilościową markerów różnicowania adipocytów.

Po zainicjowaniu różnicowania komórki posiane w zawiesinie są okrągłe z określonymi granicami komórek i mają małą lub średnią średnicę. Żywotność ciał embrionalnych obserwuje się na podstawie szybkiej proliferacji, która prowadzi do powstania większej liczby MSCs. To szybkie zachowanie proliferacji, wraz z ich osobliwą i wydłużoną morfologią, jest zachowane nawet po przejściu MSCs na świeże płytki pokryte matrycą.

Dobre różnicowanie daje wiarygodne MSCs o ponad 90% skuteczności ekspresji mezenchymalnych markerów powierzchniowych CD73, CD44 i CD90. Ponadto ocena komórek pod kątem braku markerów powierzchniowych obrazujących fenotyp hematopoetyczny CD14, CD34 i CD19 wykazała mniej niż 1% skuteczność ekspresji, wysoka ekspresja w dystrybucji cytoplazmatycznej FABP4, markera terminalnie zróżnicowanych adipocytów, wskazuje na ich dojrzałość rozwojową. Dodatkowo wysoka ekspresja adiponektyny, innego markera dojrzałości adipocytów, wskazuje, że adipocyty są wystarczająco funkcjonalne, aby ulegać magazynowaniu lipidów i adipogenezie w odpowiedzi na sygnalizację glukozy.

Po barwieniu czerwień nilowa wiąże się wyłącznie z dojrzałymi adipocytami zawierającymi lipidy, co czyni ją skutecznym narzędziem do sortowania dojrzałych adipocytów za pomocą fluorescencyjnej cytometrii przepływowej. Komórki czerwono-dodatnie Nilu wykazują znaczną regulację markerów dojrzewania co najmniej dwukrotnie w porównaniu z komórkami niesortowanymi. Musisz być bardzo delikatny podczas pobierania komórek podczas tworzenia ciała embrionalnego i dysocjacji komórek mezenchymalnych, ponieważ miałoby to duży wpływ na przeżywalność po dysocjacji mezenchymalnych komórek macierzystych.

Czysta populacja adipocytów uzyskana od pacjentów będących nosicielami mutacji może być poddana funkcjonalnemu i całemu sekwencjonowaniu transkryptomu w celu określenia szlaków regulacyjnych i sygnałowych dotkniętych daną mutacją bez wpływu na dane dotyczące niejednorodności próbki. Technika ta pozwoli na skalowalne wytwarzanie mezenchymalnych komórek macierzystych in vitro, eliminując potrzebę pobierania ich od ludzkich dawców w celu łatwego różnicowania ich do adipocytów, chondrocytów i osteocytów w celu zrozumienia patogenezy chorób związanych z tkankami.