Analiza mysiego modelu choroby Parkinsona indukowanego przez wektory wirusowe związane z adenowirusem kodujące ludzką α-synukleinę

Ogólnym celem tej procedury jest odtworzenie większości istotnych aspektów choroby Parkinsona w modelu zwierzęcym. Stereotaktyczne dostarczanie wektorów wirusowych związanych z adeno, kodujących ludzką synukleinę w istocie czarnej. Choroba Parkinsona jest zaburzeniem neurodegeneracyjnym, które polega na śmierci neuronu dopaminergicznego w szlaku nigrostriatalnym, a w konsekwencji na postępie utraty kontroli nad dobrowolnymi ruchami.

Temu procesowi neurodegeneracyjnemu towarzyszy odkładanie się agregatów białkowych w mózgu, które są głównie tworzone przez synukleinę. Pojawiające się dowody wskazują, że agregaty synukleiny mogą stymulować receptory toll-podobne do receptorów na mikrogleju, wywołując w ten sposób zapalenie neuronów w istocie czarnej. Ponadto dowody wskazują, że agregaty synukleiny mogą być wychwytywane i prezentowane przez komórki prezentujące antygen limfocytom T, indukując adaptacyjną odpowiedź immunologiczną specyficzną dla synukleiny.

Wykazano, że stereotaktyczne dostarczanie wektorów wirusowych związanych z adeno, kodujących ludzką synukleinę w istocie czarnej, odtwarza wiele istotnych aspektów choroby, w tym patologię synukleiny, aktywację mikrogleju, aktywację komórek T, neurodegenerację i upośledzenie motoryczne. W pracy przedstawiono analizę, w jaki sposób wektor wirusowy i czas po dostarczeniu wektora wirusowego wpływają na zakres ekspresji ludzkiej synukleiny, neurodegeneracji i zapalenia nerwów w szlaku nigrostriatalnym, a także stopień upośledzenia motorycznego w mysim modelu jednostronnego stereotaktycznego dostarczania ludzkiej synukleiny w istocie czarnej. Aby utrzymać aseptyczne środowisko, podczas całego zabiegu należy nosić odpowiednią odzież chirurgiczną, w tym ochraniacze na buty, maskę chirurgiczną, barierę sanitarną, rękawice i czepek chirurgiczny.

Rozpyl etanol na mysz i cały materiał chirurgiczny, aby utrzymać aseptyczne środowisko. Aby wywołać analgezję, należy wstrzykiwać karprofen podskórnie co 12 godzin, zaczynając godzinę przed zabiegiem i kontynuując do trzech dni po operacji. Aby znieczulić mysz, umieść zwierzę w komorze indukcyjnej.

Otwórz przepływ izofluranu z szybkością 0,5%, a następnie powoli zwiększaj go do 5% przez około pięć minut, aż mysz straci odruch prostowania. Wyjmij zwierzę z komory indukcyjnej. Natychmiast przenieś zwierzę do obwodu bez ponownego oddychania z stożkiem nosowym o odpowiedniej wielkości.

Utrzymuj znieczulenie myszy, z izofluranem 1% przez cały czas trwania operacji. Upewnij się, że mysz jest całkowicie znieczulona, szczypiąc jej ogony i łapy. Kiedy mysz nie reaguje na szczypanie ogona i łap, oznacza to, że mysz jest całkowicie znieczulona.

Ogol głowę myszy za pomocą nożyczek. Oczyść skórę myszy za pomocą bawełnianego wacika z chlorheksydyną 2% i usuń wszystkie włosy. Zamocuj głowicę myszy w ramce stereotaktycznej.

Umieść środek ochronny rogówki w obu oczach myszy za pomocą bawełnianego wacika. Aby zapobiec indukcji stresu u innych gryzoni, unikaj obecności innych myszy na sali operacyjnej. Oczyść głowę myszy trzema rundami chlorheksydyny 2%, a następnie etanolem 70%Odsłoń czaszkę za pomocą materiału chirurgicznego i wykonaj cienki otwór wiertłem na współrzędnych przednio-tylnych 2,8 mm i przyśrodkowo-bocznych 1,4 mm w stosunku do linii przyśrodkowej.

Umieść igłę strzykawki o pojemności 10 mikrolitrów w otworze i powoli przesuwaj igłę wewnątrz mózgu, aż dojdziesz do 7,2 mm grzbietowo-brzusznej, w stosunku do opony twardej. Pozostaw igłę w końcowej pozycji na dwie minuty, aby tkanka nieco się uspokoiła, a następnie wstrzyknij jeden mikrolitr wektorów wirusowych do prawej istoty czarnej, w tempie 0,2 mikrolitra co 30 sekund. Pozostaw igłę w tej samej pozycji na pięć minut po dostarczeniu wektorów wirusowych, a następnie powoli ją wycofaj.

Zamknij ranę za pomocą sterylnego jedwabnego szwu. Umieść mysz w domowej klatce, wstępnie ogrzanej, umieszczając ją na ciepłym materacu elektrycznym. 12 tygodni po operacji stereotaktycznej oceń sprawność motoryczną, korzystając z uproszczonej wersji testu wiązki, opisanego wcześniej.

W tym celu użyj belki poziomej o długości 25 cm i szerokości 3 cm. Powierzchnia belki musi być pokryta metalową siatką z kwadratami o wielkości jednego centymetra i uniesiona o jeden centymetr ponad belkę. Nagraj film, na którym mysz przechodzi przez belkę powierzchni siatki, od jednego końca do przeciwległego końca belki, gdzie znajduje się klatka domowa.

Trenuj mysz przez dwa dni, przed określeniem wydajności silnika. Pierwszego dnia wytrenuj mysz, aby pięciokrotnie przechodziła przez belkę, bez siatki. Drugiego dnia wytrenuj mysz, aby przechodziła przez belkę pięć razy w obecności siatki.

Trzeciego dnia oceń wydajność motoryczną. Aby to zrobić, określ ilościowo liczbę popełnionych błędów, osobno przez lewe łapy lub prawe łapy, oglądając filmy w trybie zwolnionego tempa. Aby znieczulić mysz, wstrzyknij dootrzewnowo mieszaninę ketaminy i ksylazyny.

Gdy mysz zostanie całkowicie znieczulona, otwórz klatkę piersiową materiałem chirurgicznym i odsłoń serce. Następnie włóż igłę z płaską końcówką do lewej komory serca. Łącząc igłę z rurą, przelej 50 mililitrów soli fizjologicznej buforu fosforanowego z szybkością 9,5 mililitra na minutę za pomocą pompy perystaltycznej.

Usuń mózg za pomocą nożyczek i pęsety, a następnie utrwal go przez zanurzenie w pięciu mililitrach 4% paraformaldehydu w roztworze soli fizjologicznej z buforem fosforanowym. Następnie umieść nieruchomy mózg w 15 mililitrach 30% sacharozy na 48 godzin. Następnie umieść mózg w czterech mililitrach roztworu krioprotekcji i zachowaj mózg w temperaturze 80 stopni lub użyj go natychmiast w następnym kroku.

Aby uzyskać plasterki prążkowia, pokrój mózg na odcinki o grubości 40 mikrometrów, zaczynając od 1,34 mm, a kończąc na 0,26 mm. Zbierz każdy plasterek w krioprobówce o pojemności dwóch mililitrów, zgodnie z kolejnością przednio-tylną. Aby przeprowadzić analizę immunohistochemiczną i immunofluorescencyjną w prążkowiu, należy wybrać pięć koronalnych odcinków prążkowia pobranych w jednakowych odstępach czasu, które obejmują cały zasięg rostrocaudalny jądra.

Aby potwierdzić prawidłowe dostarczanie wektorów wirusowych do neuronów dopaminergicznych szlaku nigrostriatalnego, wstrzyknięto wektory kodujące GFP w istocie czarnej, a 12 tygodni później fluorescencję GFP i immunoreaktywność hydroksylazy tyrozynowej analizowano w istocie czarnej i prążkowiu za pomocą immunofluorescencji. Fluorescencja związana z GFP była zlokalizowana wyłącznie w miejscu ipsilateralnym, a znaczącą kolokalizację z immunoreaktywnością hydroksylazy tyrozynowej zaobserwowano zarówno w istocie czarnej, jak i prążkowiu, co wskazuje na prawidłowe dostarczanie wektorów wirusowych w neuronach dopaminergicznych szlaku nigrostriatal. Aby przetestować dawkę wektorów, kodujących synukleinę wymaganą, w celu wywołania znacznej nadekspresji ludzkiej synukleiny, która sprzyja neurodegeneracji neuronów dopaminergicznych nigralnych, wstrzyknięto różne dawki wektorów.

A 12 tygodni później zbadano immunoreaktywność ludzkiej synukleiny i zakres immunoreaktywności hydroksylazy tyrozyny w szlaku nigrostriatalnym. Immunoreaktywność ludzkiej synukleiny była oczywista, a wszystkie dawki testowano w istocie czarnej. Jednak tylko myszy, które otrzymały od 10 do 10 genomów wirusa na mysz, wykazywały wyraźną immunoreaktywność ludzkiej synukleiny w prążkowiu.

Myszy otrzymujące od 10 do 10 genomów wirusowych na mysz wektorów kodujących ludzką synukleinę, wykazywały znaczną utratę neuronów dopaminergicznych w istocie czarnej. Chociaż myszy otrzymujące tę samą dawkę wektorów kodujących GFP wykazywały niski stopień utraty neuronów, myszy te wykazywały znacznie niższy stopień neurodegeneracji w porównaniu z myszami otrzymującymi wektory kodujące ludzką synukleinę. Za pomocą testu wiązki wykryto znaczne zmniejszenie sprawności motorycznej wyłącznie u tych myszy, które otrzymały od 10 do 10 genomów wirusowych na mysz wektorów kodujących ludzką synukleinę, porównując liczbę błędów popełnionych przez prawą i lewą łapę lub porównując całkowitą liczbę błędów myszy otrzymujących wektory kodujące ludzką synukleinę, z tymi myszami, które otrzymują wektor kontrolny.

Aby określić początek ekspresji ludzkiej synukleiny, myszom podawano od 10 do 10 genomów wirusa na mysz, wektorów kodujących ludzką synukleinę lub operację pozorowaną, a zakres ekspresji ludzkiej synukleiny analizowano w istocie czarnej, raz w tygodniu, w tygodniach od dwóch do pięciu po operacji stereotaktycznej. Wyniki pokazują, że ekspresja ludzkiej synukleiny zaczęła być widoczna w piątym tygodniu po operacji stereotaktycznej. Aby określić szczyt aktywacji mikrogleju, określono ilościowo zakres komórek wyrażających wysoki poziom Iba1 w prążkowiu myszy w ciągu 2-15 tygodni po operacji.

Wyniki wskazują na znaczny wzrost aktywacji mikrogleju po stronie ipsilateralnej, w porównaniu z przeciwległą stroną myszy, 15 tygodni po inokulacji wirusa. Liczba regulatorowych limfocytów T infiltrowanych do znacznej czerni była analizowana w różnych punktach czasowych, po operacji stereotaktycznej za pomocą immunofluorescencji, a następnie obserwacji pod mikroskopią konfokalną. Szczyt naciekania regulatorowych limfocytów T do istoty czarnej zaobserwowano w 11. tygodniu po operacji.

Analizowany tutaj mysi model neurodegeneracji stanowi użyteczny model do badania liczby kluczowych aspektów zaangażowania w patofizjologię choroby Parkinsona. Mechanizmy zaangażowania w patologię synukleiny, aktywację mikrogleju, udział obwodowego układu odpornościowego, w zapalenie nerwów i mechanizmy neurodegeneracji Właściwa dawka wektora wirusowego związanego z adenowirusem, podtyp piąty kodującego ludzką synukleinę w celu wywołania neurodegeneracji, zapalenia nerwów, nacieku limfocytów T i upośledzenia motorycznego, wynosi od 10 do 10 genomów wirusa na mysz. Badanie to pokazuje, że pięć tygodni po operacji stereotaktycznej stanowi kluczowy punkt czasowy, w którym ekspresja synukleiny u ludzi była już widoczna, ale przy braku upośledzenia motorycznego w tym modelu zwierzęcym.

W związku z tym ten punkt czasowy stanowi interesujący punkt czasowy, w którym należy rozpocząć podawanie eksperymentalnych terapii dostosowanych do zatrzymania postępu zapalenia nerwów i neurodegeneracji. Najbardziej odpowiednim punktem czasowym do analizy zapalenia układu nerwowego w tym modelu zwierzęcym jest 15 tydzień po operacji stereotaktycznej. Podczas gdy właściwy punkt czasowy do analizy infiltracji limfocytów T do ośrodkowego układu nerwowego.

wydaje się, że jest w 11 tygodniu po zaszczepieniu wektora wirusowego.