Name: Analiza mysiego modelu choroby Parkinsona indukowanego przez wektory wirusowe związane z adenowirusem kodujące ludzką α-synukleinę (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-07-29T13:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 45 s
Description: Poznaj metodę stereotaksycznego podawania wektorów wirusowych kodujących ludzką α-synukleinę w czarną substancję myszy, aby badać neurozapalenie i neurodegenerację w modelu choroby Parkinsona.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy Dr. Sebastiánowi Valenzueli i Dr. Micaeli Ricca za ich cenną pomoc weterynaryjną w naszym ośrodku dla zwierząt. Prace te były wspierane przez "Financiamiento Basal para Centros Científicos y Tecnológicos de Excelencia de ANID" Centro Ciencia & Vida, FB210008 (Fundación Ciencia & Vida) oraz Geroscience Center for Brain Health and Metabolism, FONDAP-15150012. Praca ta została również sfinansowana z grantów FONDECYT-1210013 (dla R.P.) i FONDECYT-1150766 (dla F.C.) z "Agencia Nacional de Investigación y Desarrollo de Chile (ANID)" oraz MJFF-10332.01 (dla R.P.) i MJFF-17303 (dla F.C.) z Fundacji Michaela J. Foxa na rzecz Badań nad Chorobą Parkinsona.

Autorzy deklarują, że badanie zostało przeprowadzone przy braku jakichkolwiek konkurencyjnych interesów finansowych lub niefinansowych.

Analizowany tutaj mysi model neurodegeneracji może pomóc w badaniu wielu kluczowych aspektów patofizjologii choroby Parkinsona, w tym mechanizmów związanych z patologią αSyn i aktywacją mikrogleju, roli obwodowego układu odpornościowego w regulacji neurostanu zapalnego oraz mechanizmów neurodegeneracji. Do mechanizmów związanych z patologią αSyn należą mechanizmy subkomórkowe związane z dysfunkcją mitochondriów, lizosomów lub proteasomów w obecności nadmiernego obciążenia αSyn w neuronach dopaminergicznych SN2. Należy wziąć pod uwagę, że oprócz ekspresji hαSyn indukowanej transdukcją za pośrednictwem AAV, do całkowitego poziomu ekspresji αSyn przyczynia się również endogenna mysia αSyn. Myszy transgeniczne z nadekspresją mysiej αSyn wykazują podobną patologię synukleiny, neuropatologię i zaburzenia motoryczne, co modele mysie oparte na nadekspresji hαSyn32. W odniesieniu do aktywacji mikrogleju, niniejszy model mysi może być wykorzystany do badania, w jaki sposób różne czynniki molekularne i komórkowe, takie jak cytokiny, neuroprzekaźniki, astrocyty, neurony, bariera krew-mózg i limfocyty T, mogą regulować nabywanie prozapalnych lub przeciwzapalnych fenotypów funkcjonalnych8,10,11. Model ten stanowi również ważne narzędzie do badania roli obwodowego układu odpornościowego, obejmującego nie tylko limfocyty T, ale także makrofagi, monocyty i neutrofile, w procesach neurostanu zapalnego i neurodegeneracji neuronów istotą czarna11,33,34. Wreszcie, ten model mysi stanowi cenny system do badania komórkowych i molekularnych mechanizmów neurodegeneracji in vivo, w tym tych indukowanych przez wewnętrzne procesy komórkowe, takie jak stres oksydacyjny, deficyty energetyczne i uszkodzone organelle 2, lub tych wywieranych przez czynniki zewnętrzne, takie jak czynniki neurotoksyczne produkowane przez komórki mikrogleju, astrocyty i cytotoksyczne limfocyty T8,28,29,35. 
Ograniczeniem tego modelu mysiego jest brak możliwości zbadania, w jaki sposób patologiczna agregacja αSyn w lokalizacjach pozamózgowych może stanowić początkowe etapy rozwoju choroby Parkinsona36. W związku z tym narasta liczba dowodów wskazujących na to, że przed neurodegeneracją neuronów istoty czarnej i wystąpieniem zaburzeń ruchowych, patologia αSyn rozpoczyna się w błonie śluzowej jelit oraz w nabłonku węchowym36, a prawdopodobnie również specyficzna odpowiedź limfocytów T na αSyn12. Następnie agregaty αSyn miałyby migrować przez nerw błędny do pnia mózgu, wywołując neurostan zapalny i neurodegenerację neuronów dopaminergicznych12. Chociaż model AAV-hαSyn odtwarza większość aspektów choroby Parkinsona, w modelu tym nie występuje wyraźne zaangażowanie patologicznej agregacji αSyn w lokalizacjach pozamózgowych. Alternatywnym modelem obejmującym patologię hαSyn, odpowiednim do badania tych aspektów choroby Parkinsona, mogą być myszy transgeniczne z nadekspresją hαSyn pod kontrolą promotora Thy1, czyli model Thy1-SNCA 37, w którym rozwój choroby zależy od mikrobioty jelitowej i wiąże się z wyraźnymi zaburzeniami żлізуjelitowymi38. 
Choć model ten jest pomocny w badaniu różnorodnych procesów związanych z patofizjologią choroby Parkinsona, obecny model mysi obejmuje krytyczne etapy, które należy skrupulatnie sprawdzać, w tym: prawidłowe dostarczenie wektorów wirusowych do odpowiednich współrzędnych przestrzennych, selektywną ekspresję hαSyn w neuronach (która zależy od serotypu AAV i konstrukcji wektora) oraz właściwą dawkę AAV i czas przed analizą fenotypu parkinsonowskiego. Konieczna jest analiza prawidłowego dostarczenia wektorów wirusowych do SN, ponieważ zastosowanie odpowiednich współrzędnych przestrzennych SN może okazać się niewystarczające, gdy igła nie jest całkowicie prosta, co czasem jest niezauważalne dla ludzkiego oka. Ponadto dyfuzja wektorów AAV zależy od serotypu AAV39. Z tych powodów niezbędne jest przeprowadzanie okresowych kontroli jakości w celu sprawdzenia prawidłowego dostarczenia i dyfuzji wstrzykniętych wektorów AAV-GFP poprzez obserwację GFP w przekrojach mózgu zawierających obszar SN.
W odniesieniu do selektywnej ekspresji hαSyn w neuronach, w zasadzie ekspresję hαSyn można by zaprogramować tak, aby była ona kontrolowana przez promotor selektywny dla neuronów lub, jeszcze precyzyjniej, selektywny dla neuronów dopaminergicznych, na przykład poprzez zastosowanie promotora TH w wektorach AAV w celu indukcji selektywnej ekspresji genów w neuronach dopaminergicznych40. Jednak strategia ta nie sprawdza się w sytuacjach, gdy pożądaną cechą jest nadekspresja badanego genu. Z tego powodu w niniejszym modelu niezbędne jest zastosowanie silnego promotora (promotora indukującego wysoką ekspresję genu znajdującego się w dalszej części sekwencji) oraz serotypów AAV o tropizmie neuronalnym. W niniejszej badaniu jako silny promotor indukujący nadekspresję hαSyn zastosowano promotor CBA, a jako wektor wirusowy serotyp AAV5. Serotyp ten był wcześniej wykorzystywany do transdukcji neuronów myszy i szczura41,42. W tym przypadku wyniki wykazały, że 12 tygodni po podaniu AAV5-GFP do SN myszy, fluorescencja zielona występowała selektywnie po stronie ipsilateralnej zarówno w SN, jak i w prążkowiu (Rysunek 1), co wskazuje na efektywną transdukcję neuronów drogi nigrostriatalnej.
Kolejnym krytycznym aspektem tego modelu mysiego choroby Parkinsona jest punkt czasowy wymagany do analizy konkretnego procesu po zabiegu chirurgicznym. W związku z tym niniejsza praca przedstawia badanie kinetyczne różnych procesów zaangażowanych w patologię. Ponieważ kluczowe punkty czasowe zmieniają się w zależności od dawki genomów wirusowych podanej myszy, zastosowanego serotypu AAV, a nawet partii AAV, w pierwszej kolejności przeprowadzono analizę zależności dawka-odpowiedź w celu ustalenia ilości AAV-αSyn wymaganej do wywołania istotnej utraty neuronów TH+ i upośledzenia funkcji motorycznych. Wcześniejsze badania wykazały znaczące upośledzenie motoryczne oraz utratę neuronów TH+ drogi nigrostriatalnej po 12 tygodniach od wstrzyknięć AAV-αSyn u myszy w dawkach od 6 x 108–3 x 1010 genomów wirusowych na mysz16,17,30,31. Odpowiednio, dawka AAV-hαSyn zastosowana w celu indukcji ekspresji hαSyn w drodze nigrostriatalnej, utraty neuronów TH+ i upośledzenia funkcji motorycznych u myszy mieściła się w zakresie 1 x 108–1 x 1010 genomów wirusowych na mysz. Ponadto, aby sprawdzić, czy utrata neuronów TH+ i upośledzenie motoryczne były wywołane nadekspresją hαSyn w SN, a nie infekcją AAV neuronów SN, włączono grupy kontrolne, w których jednostronnie do SN myszy podano AAV kodujący gen reporterowy (AAV-eGFP), a następnie określono stopień neurodegeneracji i upośledzenia funkcji motorycznych. Wyniki wykazały, że 12 tygodni po zabiegu stereotaktycznym dawka 1 x 1010 genomów wirusowych na mysz była odpowiednią dawką AAV5-hαSyn, ponieważ myszy otrzymujące tę dawkę wirusa wykazały znaczną obecność hαSyn w drodze nigrostriatalnej (Rycina 2 i Rycina 3), utratę neuronów TH+ (Rycina 4) oraz upośledzenie funkcji motorycznych (Rycina 5). W przeciwieństwie do tego, niższe dawki AAV5-hαSyn (1 x 108 genomów wirusowych na mysz i 1 x 109 genomów wirusowych na mysz) nie były wystarczająco silne, aby doprowadzić do istotnych zmian we wszystkich tych parametrach jednocześnie (Ryciny 2–4). Należy zauważyć, że podanie AAV-GFP w dawce 1 x 1010 genomów wirusowych na mysz wywołało niewielki (~20%), ale istotny stopień utraty neuronów TH+ wśród dopaminergicznych neuronów prążkowia (Rycina 4A,B). Wynik ten jest zgodny z wcześniejszymi obserwacjami z zastosowaniem tego modelu41 i prawdopodobnie jest konsekwencją niskiego poziomu neurostanu zapalnego wywołanego podaniem wektorów AAV do SN. Niemniej jednak zakres utraty neuronów TH+ był znacząco większy u myszy otrzymujących AAV5-hαSyn w porównaniu do tych otrzymujących tę samą dawkę AAV-GFP (Rycina 4C). Warto zaznaczyć, że kinetyka ekspresji hαSyn zależy nie tylko od wydajności transdukcji, ale także od zakresu dyfuzji AAV39. Ponieważ dyfuzja AAV zależy od serotypu AAV, precyzyjne kluczowe punkty czasowe w tym modelu zwierzęcym mogą się różnić przy zastosowaniu innego serotypu AAV niż AAV5.
Następnie przeprowadzono analizę kinetyczną z użyciem 1 x 1010 ilość genomów wirusowych na mysz w celu określenia kluczowych punktów czasowych w tym modelu mysim. Ponieważ obecne dowody wykazały występowanie niektórych wczesnych objawów pojawiających się przed upośledzeniem funkcji motorycznych, co umożliwiłoby wczesną diagnostykę choroby Parkinsona43,44te eksperymenty miały na celu wyznaczenie punktu czasowego, w którym ekspresja hαSyn była już widoczna, lecz przy jednoczesnym braku zaburzeń ruchowych. Wyniki wskazują, że początek ekspresji hαSyn w SN nastąpił w 5. tygodniu po stereotaktycznym podaniu AAV-hαSyn (Rycina 6). Ten punkt czasowy stanowi interesujący moment rozpoczęcia podawania terapii ukierunkowanych na zatrzymanie procesów neurozapalnych i neurodegeneracyjnych. Innymi kluczowymi punktami czasowymi określonymi w niniejszej pracy były momenty szczytowe dla dwóch krytycznych zdarzeń związanych z procesem neurozapalenia: czas, w którym mikroglej osiąga maksymalny stopień aktywacji, oraz czas maksymalnej infiltracji limfocytów T do SN. Wyniki wykazały krzywą z tendencją do występowania dwóch fal maksymalnej aktywacji mikrogleju – pierwszej w 10. tygodniu po operacji i drugiej w 15. tygodniu po operacji (Rysunek 7). Analiza kinetyczna infiltracji limfocytów T wykazała, że szczytowy czas infiltracji limfocytów Treg do SN nastąpił w 11. tygodniu po zabiegu stereotaksyjnym (Rysunek 8). Co zaskakujące, nie stwierdzono obecności efektorowych limfocytów T (CD4+ Foxp3-) wykryto wnikające do SN w analizowanym przedziale czasowym (tygodnie 8–13 po operacji). Łącznie wyniki te sugerują odpowiedni przedział czasowy na rozpoczęcie podawania terapii ukierunkowanych na zatrzymanie procesu neurozapalenia i osłabienie infiltracji limfocytów T do SN z wykorzystaniem tego modelu przedklinicznego, który obejmuje okres od 5. tygodnia po operacji (początek nadekspresji hαSyn) do 10. tygodnia po operacji (pierwsza fala neurozapalenia i infiltracji limfocytów T) (Rysunek 9).
<img alt="Harmonogram podawania AAV-hαSyn z fazami aktywacji mikrogleju i leczenia przeciwzapalnego." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63313/63313fig09.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rysunek 9"> 
Rysunek 9: Podsumowanie kluczowych punktów czasowych ustalonych dla tego modelu zwierzęcego. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63313/63313fig09large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>

Po chorobie Alzheimera, choroba Parkinsona jest drugą najbardziej rozpowszechnioną chorobą neurodegeneracyjną na świecie. Pierwotne neurony dotknięte chorobą Parkinsona to neurony szlaku nigrostriatalnego, które wytwarzają dopaminę i kontrolują dobrowolne ruchy. W konsekwencji najbardziej charakterystycznym objawem związanym z tym zaburzeniem jest upośledzenie ruchowe. Ta patologia obejmuje również odkładanie się agregatów białkowych w mózgu, które składają się głównie z α-synukleiny (αSyn)1, cytozolowego białka związanego z zakończeniami presynaptycznymi. Dowody wykazały, że generowanie patogennych inkluzji αSyn jest wywoływane przez nieprawidłowe fałdowanie lub pewne modyfikacje potranslacyjne tego białka2.
Warto zauważyć, że ustalono ścisły związek między patologią αSyn a utratą neuronów dopaminergicznych szlaku nigrostriatal w ludzkiej chorobie Parkinsona i modelach zwierzęcych3,4. Zrozumienie, w jaki sposób generowane są agregaty αSyn i w jaki sposób indukują śmierć neuronów, stanowi poważne wyzwanie w tej dziedzinie. Rosnąca grupa badań wykazała, że dysfunkcja mitochondriów, poprzez wzrost stresu oksydacyjnego, jest jedną z głównych przyczyn powstawania agregów αSyn2. Rzeczywiście, kilka genów związanych z ryzykiem choroby Parkinsona koduje białka zaangażowane w funkcję, morfologię i dynamikę mitochondriów5,6. Ponadto dysfunkcja lizosomów, która skutkuje akumulacją dysfunkcyjnych mitochondriów i nieprawidłowo sfałdowanym αSyn, stanowi kolejne ważne zdarzenie promujące generowanie agregatów αSyn 7.
Pojawiające się dowody wskazują, że po zdeponowaniu agregatów αSyn w mózgu, te patogenne białka stymulują receptory toll-podobne (TLR) na mikrogleju, wywołując w ten sposób aktywację mikrogleju i początkowe środowisko zapalne w istocie czarnej (SN)8,9. Co więcej, dowody wskazują, że agregaty αSyn są wychwytywane i prezentowane przez komórki prezentujące antygen limfocytom T, indukując adaptacyjną odpowiedź immunologiczną specyficzną dla αSyn10,11. Te limfocyty T specyficzne dla αSyn następnie infiltrują mózg i są remumulowane przez aktywowany mikroglej, promując w ten sposób wydzielanie czynników neurotoksycznych, które wywołują śmierć neuronów9,10. Co ciekawe, kilka linii dowodowych sugeruje, że agregaty αSyn są generowane najpierw w jelitowym układzie nerwowym, a następnie transportowane przez nerw błędny do pnia mózgu12.
Kilka zwierzęcych modeli choroby Parkinsona było używanych przez wiele lat, w tym te wywołane przez podawanie substancji neurotoksycznych (tj. 6-hydroksydopaminy, parakwat, rotenon, 1-metylo-4-fenylo-1,2,3,6-tetrahydropirydyna) oraz te związane z chorobami genetycznymi (np. zmutowana α-synukleina, zmutowana anaza powtórzeniowa bogata w leucynę 2)<klasa SUP="xref">13. Pomimo tego, że modele obejmujące neurodegenerację wywołaną neurotoksynami replikują niektóre aspekty choroby Parkinsona, żaden z nich nie podsumowuje wszystkich istotnych aspektów choroby lub nie jest postępujący13. Z drugiej strony, chociaż genetyczne modele myszy obejmujące ekspresję zmutowanych wersji bogatej w leucynę kinazy powtórzeniowej 2, zmutowanych wersji α-synukleiny lub nadekspresję ludzkiej α-synukleiny typu dzikiego powodują upośledzenie motoryczne, a w niektórych przypadkach także rozwój synukleinopatii, nie odtwarzają one wyraźnej neurodegeneracji neuronów dopaminergicznych nigralnych, co jest istotnym aspektem choroby Parkinsona13,14. Trzeci rodzaj zwierzęcego modelu neurodegeneracji zdołał spełnić większość istotnych aspektów choroby Parkinsona, stereotaktyczne dostarczanie wektorów wirusowych związanych z adenowirusem (AAV) kodujących ludzką α-synukleinę (AAV-hαSyn)14,15. Co ważne, AAV pozwalają na transdukcję neuronów z wysoką skutecznością, a w dłuższej perspektywie w mózgu dorosłych ssaków. Ponadto wykazano, że stereotaktyczne dostarczanie AAV-hαSyn w SN odtwarza wiele istotnych aspektów choroby, w tym patologię αSyn, aktywację mikrogleju, neurodegenerację i upośledzenie motoryczne16,17,18,19,20. W pracy przedstawiono analizę, w jaki sposób dawka wektora wirusowego i czas po dostarczeniu wektora wirusowego wpływają na zakres ekspresji hαSyn, neurodegenerację i zapalenie nerwów w szlaku nigrostriatalnym, a także stopień upośledzenia motorycznego w mysim modelu jednostronnego stereotaktycznego dostarczania hαSyn w SN.

<table><tbody><tr><td>ANIMALS AND ANIMAL FOOD</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Foxp3-GFP C57BL/6 myszy</td><td>The Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME)</td><td>Nr katalogowy:&nbsp; 023800</td><td></td></tr><tr><td>Laboratoryjna dieta dla gryzoni</td><td>LabDiet</td> dla <td>gryzoni 5001</td><td>Standardowa dieta dla gryzoni</td></tr><tr><td>Myszy C57BL/6 typu dzikiego</td><td>Laboratorium Jacksona (Bar Harbor, ME)</td><td>Nr katalogowy: 000664</td><td></td></tr><tr><td><silny>WEKTORY WIRUSOWE</silny></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>AAV5-CBA-&alfa; Syn</td><td>University of Iowa Viral Vector Core Facility</td><td>N/A</td><td>Stężenie zapasów przy 10E13 vg/mL</td></tr><tr><td>AAV5-CBA-eGFP</td><td>University of Iowa Viral Vector Core Facility</td><td>N/A</td><td>Koncentracja zapasów przy 9,5 x 10E12 vg/mL</td></tr><tr><td><silne>znieczulające i przeciwbólowe</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Isoflurane</td><td>Baxter</td><td>218082</td><td>1% do chirurgii stereotaktycznej</td></tr><tr><td>Ketamina</td><td>Drag Pharma</td><td>CHE30</td><td>70 mg/kg&nbsp; do chirurgii stereotaktycznej</td></tr><tr><td>Sevoflurane</td><td>Baxter</td><td>VE2L9117</td><td>Do perfuzji przed perfuzją przezsercową</td></tr><tr><td>Tramadol</td><td>Drag Pharma</td><td>DPH134</td><td>30 mg/kg co 24 h</td></tr><tr><td>Xylazine</td><td>Centrovet</td><td>EHL40</td><td>9 mg/kg do chirurgii stereotaktycznej</td></tr><tr><td>EQUIPMENT</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Test belki</td><td>Domowa</td> nie <td>dotyczy</td><td>belki poziomej o długości 25 cm i szerokości 3 cm. Powierzchnię belki pokryto metalową siatką (1 cm2).</td></tr><tr><td>Aparat cyfrowy Cryostate</td><td>Leica</td><td>CM1520</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Nikon</td><td>S2800 Coolpix</td><td>Do rejestrowania wydajności testu wiązki</td></tr><tr><td>Mikroskop</td><td>Olympus</td><td>BX51</td><td>Używany do analizy IHC (sekcja 4.4)</td></tr><tr><td>Mikroskop</td><td>Olympus</td><td>IX71</td><td>Używany do analizy IF (sekcja 5.3)</td></tr><tr><td>Mikroskop</td><td>Leica</td><td>DMI8</td><td>Używany do analizy IF (sekcja 5.7)</td></tr><tr><td>Nowy standard stereotaktyczny, mysz</td><td>Stoelting, Wood Dale, IL, USA</td><td>51500</td><td>rama stereotaktyczna do chirurgii</td></tr><tr><td>Pompa perystaltyczna</td><td>Masterflex</td><td>C-flex L/S16</td><td></td></tr><tr><td>Zasilacz</td><td>Olympus</td><td>U-RFL-T</td><td>Używany do analizy IF (sekcja 5.3)</td></tr><tr><td>Szew chirurgiczny</td><td>Sylkam&reg;, B Strzykawka C0760171</td><td></td><td></td>Braun</tr><tr><td>100 U</td><td>BD</td><td>324918</td><td>Do znieczulenia przed perfuzją przezsercową, strzykawka igłowa 29G</td></tr><tr><td>RN 5uL SYR BEZ IGŁY</td><td>Hamilton</td><td>HA-7641-01</td><td>Do inokulacji wektorów wirusowych</td></tr> <tr><td>< silnych > I ODCZYNNIKÓW</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Aviden, koniugat peroksydazy</td><td>Merck, Darmstadt, Niemcy</td><td>189728</td><td></td></tr><tr><td>Albumina surowicy bydlęcej</td><td>Merck, Darmstadt, Niemcy</td><td>9048-46-8</td><td></td></tr><tr><td>Bufor kriotrotekcyjny</td><td>Domowa</td><td>N/A</td><td>20% gliceryny i 2% DMSO w PBS</td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Abcam</td><td>ab228549</td><td></td></tr><tr><td>Diaminoferydyna</td><td>Merck, Darmstadt, Niemcy</td><td>D8001</td><td></td></tr><tr><td>Fluoromount -G T</td><td>Mikroskopia elektronowa Science</td><td>17984-25</td><td></td></tr><tr><td>Żelatyna</td><td>Merck, Darmstadt, Niemcy</td><td>104078</td><td></td></tr><tr><td>Normalna surowica kozia</td><td>Jackson ImmunoResearch Laboratory</td><td>5000121</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyd</td><td>Merck, Darmstadt, Niemcy</td><td>104005</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Domowa</td><td>produkcja N/A</td><td>0,125 M, pH 7,4</td></tr><tr><td>Bufor inaktywujący peroksydazę</td><td>Domowa</td><td>produkcja N/A</td><td>0,03% H2O2 w metanolu</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>9036-19-5</td><td></td></tr><tr><td>Trizma Chlorowodorek Merck</td><td>, Darmstadt, Niemcy</td><td>1185-53-1</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>822184</td><td></td></tr><tr><td>PRZECIWCIAŁA</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Biotin-SP (long spacer) AffiniPure Goat Anti-Rabbit IgG (H+L)</td><td>Jackson ImmunoResearch Laboratory</td><td>111065003</td><td></td></tr><tr><td>Kozia anty-królicza IgG (H+L)&nbsp; Alexa Fluor 546</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>A11010</td><td></td></tr><tr><td>Kozia IgG Anty-Królicza (H+L)&nbsp; Alexa Fluor 647</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>A21244</td><td></td></tr><tr><td>Kozia IgG Anty-Szczura (H+L)&nbsp; Alexa Fluor 546</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>A11081</td><td></td></tr><tr><td>Królik monoklonalny anty-alfa-synukleina</td><td>Abcam</td><td>ab138501</td><td></td></tr><tr><td>Królik monoklonalny anty-Iba-1</td><td>Abcam</td><td>EPR16588</td><td></td></tr><tr><td>Królik poliklonalny anty-tyrozynowy hydroksylaza</td><td>Millipore</td><td>AB152</td><td></td></tr><tr><td>Szczur monoklonalny anty-CD4</td><td>Biolegend</td><td>100402</td><td></td></tr><tr><td>SOFTWARES</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>GraphPad</td><td>Prism</td><td>6.0</td><td>Analiza statystyk Fos</td></tr><tr><td>ImageJ</td><td>National Institute of Health</td><td>N/A</td><td>Do analizy obrazu</td></tr><tr><td>LAS X</td><td>Leica</td><td>N/A</td><td>Do przechwytywania obrazów za pomocą mikroskopu Leica</td></tr><tr><td>ProgRes Capture Pro</td><td>Jenoptik</td><td>N/A</td><td>Do rejestrowania obrazów za pomocą mikroskopu</td></tr> <tr>Olympus<td>Odtwarzacz multimedialny VLC</td><td>Organizacja VideoLAN N</td><td>/A</td><td>Do analizy testów behawioralnych</td></tr></tbody></table>

analiza mysiego modelu choroby parkinsona indukowanego przez wektory wirusowe związane z adenowirusem kodujące ludzką α-synukleinę

Analyzing the Parkinson's Disease Mouse Model Induced by Adeno-associated Viral Vectors Encoding Human &#945;-Synuclein

Choroba Parkinsona jest zaburzeniem neurodegeneracyjnym, które polega na obumieraniu neuronów dopaminergicznych szlaku nigrostriatalnym, a w konsekwencji na postępującej utracie kontroli nad ruchami dobrowolnymi. Ten proces neurodegeneracyjny jest wywoływany przez odkładanie się agregatów białkowych w mózgu, które składają się głównie z α-synukleiny. Kilka badań wykazało, że zapalenie nerwów jest wymagane do rozwoju neurodegeneracji związanej z chorobą Parkinsona. Warto zauważyć, że proces neurozapalny obejmuje aktywację mikrogleju, a także infiltrację obwodowych limfocytów T do istoty czarnej (SN). W niniejszej pracy przeanalizowano mysi model choroby Parkinsona, który podsumowuje aktywację mikrogleju, infiltrację komórek T do SN, neurodegenerację neuronów dopaminergicznych nigralnych i upośledzenie motoryczne. Ten mysi model choroby Parkinsona jest indukowany przez stereotaktyczne dostarczanie wektorów wirusowych związanych z adeno, kodujących ludzką α-synukleinę typu dzikiego (AAV-hαSyn) do SN. Prawidłowe dostarczanie wektorów wirusowych do SN potwierdzono za pomocą wektorów kontrolnych kodujących białko zielonej fluorescencji (GFP). Następnie oceniono, w jaki sposób dawka AAV-hαSyn podawana w SN wpłynęła na zakres ekspresji hαSyn, utratę neuronów dopaminergicznych nigralnych i upośledzenie motoryczne. Ponadto określono dynamikę ekspresji hαSyn, aktywacji mikrogleju i infiltracji limfocytów T w całym przebiegu rozwoju choroby. Tak więc badanie to zapewnia krytyczne punkty czasowe, które mogą być przydatne w celowaniu w patologię synukleiny i zapalenie nerwów w tym przedklinicznym modelu choroby Parkinsona.

Walidacja prawidłowego dostarczenia wektorów AAV do neuronów dopaminergicznych szlaku nigrostriatalnego 
W celu zbadania procesów neuroinflamacji, neurodegeneracji i zaburzeń ruchowych wywołanych patologią synukleiny, zastosowano model mysi choroby Parkinsona indukowany jednostronnym stereotaksycznym wprowadzeniem do SN wektora AAV kodującego hαSyn16,17,30,31 (patrz schemat doświadczalny na Rysunku uzupełniającym 1). Aby potwierdzić prawidłowe dostarczenie wektorów AAV do neuronów dopaminergicznych szlaku nigrostriatalnego, do SN wstrzyknięto AAV kodujący GFP (AAV-GFP), a po 12 tygodniach przeanalizowano fluorescencję GFP oraz immunoreaktywność tyrozynowej hydroksylazy (TH) w SN i prążkowiu za pomocą immunofluorescencji. Fluorescencja związana z GFP była obserwowana wyłącznie po stronie ipsilateralnej i stwierdzono znaczną kolokalizację z immunoreaktywnością TH zarówno w SN, jak i w prążkowiu, co wskazuje na prawidłowe dostarczenie wektorów AAV do neuronów dopaminergicznych szlaku nigrostriatalnego (Rysunek 1).
<img alt="Schemat mikroskopii fluorescencyjnej; analiza barwień TH, GFP i DAPI w istocie czarnej oraz prążkowiu." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63313/63313fig01.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1: Analiza dostarczenia AAV-GFP do szlaku nigrostriatalnego. Myszy otrzymały AAV-GFP (1 x 1010 vg/mysz), a po 12 tygodniach zostały uśpione, po czym wykonano immunostaining TH w (A) istocie czarnej (paski skali: 118 µm) oraz (B) prążkowiu (paski skali: 100 µm). Fluorescencję związaną z TH i GFP analizowano za pomocą mikroskopii epifluorescencyjnej. Jądra komórkowe barwiono DAPI. Przedstawiono reprezentatywne obrazy barwień pojedynczych lub nałożonych TH (czerwony), GFP (zielony) i DAPI (niebieski). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63313/63313fig01large.jpg" target="_blank">Prosimy kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
Ustalenie dawki wektora wirusowego podawanego w celu wywołania neurodegeneracji i zaburzeń motorycznych w mysim modelu choroby Parkinsona indukowanej AAV-hαSyn 
Aby przetestować dawkę AAV-hαSyn niezbędną do wywołania istotnej nadekspresji hαSyn promującej neurodegenerację dopaminergicznych neuronów istoty czarnej, wstrzyknięto różne dawki AAV-hαSyn (1 x 108 genomów wirusowych [vg]/mysz, 1 x 109 vg/mysz lub 1 x 1010 vg/mysz), a po 12 tygodniach oceniono immunoreaktywność hαSyn oraz zakres immunoreaktywności TH w drodze nigrostriatalnej. Chociaż immunoreaktywność hαSyn była widoczna w SN przy wszystkich testowanych dawkach (Rycina 2), tylko myszy otrzymujące 1 x 1010 vg/mysz wykazały wyraźną immunoreaktywność hαSyn w prążkowiu (Rycina 3). Co więcej, myszy otrzymujące 1 x 1010 vg/mysz AAV-hαSyn wykazały znaczną utratę neuronów dopaminergicznych w SN (Rycina 4A,B). Podczas gdy myszy otrzymujące 1 x 1010 vg/mysz AAV-GFP wykazały niski stopień utraty neuronów (~20%) (Rycina 4A,B), myszy otrzymujące taką samą dawkę AAV-hαSyn zaprezentowały znacznie wyższy stopień neurodegeneracji dopaminergicznych neuronów istoty czarnej (Rycina 4C). W związku z tym dalsze eksperymenty przeprowadzono z użyciem dawki 1 x 1010 vg/mysz AAV-hαSyn. Dodatkowo, zakres zaburzeń motorycznych u myszy otrzymujących różne dawki AAV-hαSyn określono za pomocą testu belkowania (Rycina 5A), zgodnie z wcześniejszym opisem25. Znaczną redukcję sprawności motorycznej w teście belkowania wykryto wyłącznie przy dawce 1 x 1010 vg/mysz AAV-hαSyn, zarówno przy porównywaniu liczby błędów popełnionych prawą i lewą łapą (Rycina 5B), jak i przy porównywaniu całkowitej liczby błędów myszy otrzymujących AAV-hαSyn w stosunku do myszy otrzymujących wektor kontrolny AAV-GFP (Rycina 5C). W konsekwencji dalsze eksperymenty przeprowadzono z użyciem 1 x 1010 vg/mysz AAV-hαSyn.
<img alt="Immunofluorescencja, ekspresja białka, hαSyn, DAPI, obraz z nałożeniem, analiza eksperymentalna, mikroskopia." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63313/63313fig02.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rysunek 2"> 
Rysunek 2: Analiza ekspresji ludzkiej α-synukleiny w SN myszy traktowanych różnymi dawkami AAV-hαSyn. Myszy otrzymały AAV-hαSyn w dawkach (A) 1 x 1010 vg/mouse, (B) 1 x 109 vg/mouse lub (C) 1 x 108 vg/mouse i zostały uśpione po 12 tygodniach, a ekspresję hαSyn przeanalizowano za pomocą immunofluorescencji w SN przy użyciu mikroskopii epifluorescencyjnej. Jądra komórkowe barwiono DAPI. Przedstawiono reprezentatywne obrazy z nałożeniem lub pojedynczym barwieniem hαSyn (czerwony) lub DAPI (niebieski). Paski skali wynoszą 118 µm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63313/63313fig02large.jpg" target="_blank">Aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku, kliknij tutaj.</a>
<img alt="immunofluorescencja hαSyn, barwienie DAPI, przekroje tkanki mózgowej, ocena dystrybucji wektora wirusowego." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63313/63313fig03.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rycina 3"> 
Rycina 3: Analiza ekspresji ludzkiej α-synukleiny w prążkowiu myszy traktowanych różnymi dawkami AAV-hαSyn. Myszy otrzymały AAV-hαSyn w dawkach (A) 1 x 1010 vg/mouse, (B) 1 x 109 vg/mouse lub (C) 1 x 108 vg/mouse), a po 12 tygodniach zostały uśpione, po czym przeanalizowano ekspresję hαSyn w prążkowiu metodą immunofluorescencji przy użyciu mikroskopii epifluorescencyjnej. Jądra komórkowe zabarwiono DAPI. Przedstawiono reprezentatywne obrazy barwień łączonych lub pojedynczych dla hαSyn (czerwony) lub DAPI (niebieski). Paski skali odpowiadają 100 µm. Wstawka w prawym górnym rogu obrazów łączonych przedstawia obszar zainteresowania w większym powiększeniu. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63313/63313fig03large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Analiza ekspresji genów, wykresy słupkowe; wpływ wektora AAV na gęstość neuronów, wyniki mikroskopowe." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63313/63313fig04.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rycina 4"> 
Rycina 4: Utrata neuronów dopaminergicznych SN u myszy leczonych różnymi dawkami AAV-hαSyn lub wektorem kontrolnym. Myszy otrzymały AAV-hαSyn (1 x 1010 vg/mouse, 1 x 109 vg/mouse lub 1 x 108 vg/mouse) lub AAV-GFP (1 x 1010 vg/mouse), a po 12 tygodniach zostały uśpione i przeanalizowano obecność TH w SNpc za pomocą immunohistochemii. (A) Obrazy reprezentatywne. Paski skali, 100 µm. (B,C) Gęstość neuronów określono jako liczbę neuronów TH+/mm2. Dane przedstawiają średnią ± SEM. n = 3–8 myszy na grupę. (B) Porównanie stron ipsilateralnej i kontralateralnej przeprowadzono za pomocą dwustronnego sparowanego testu t Student’a. (C) Przeprowadzono porównanie stron ipsilateralnych u myszy otrzymujących 1 x 1010 vg/mouse AAV-hαSyn lub AAV-GFP. (B,C) Białe słupki wskazują ilościowe oznaczenie neuronów TH+ po stronie ipsilateralnej u myszy otrzymujących AAV-hαSyn, natomiast zielone słupki wskazują ilościowe oznaczenie neuronów TH+ po stronie ipsilateralnej u myszy otrzymujących AAV-GFP. Szare słupki wskazują ilościowe oznaczenie neuronów TH+ po stronie kontralateralnej w odpowiedniej grupie. Porównania wykonano za pomocą dwustronnego niesparowanego testu t Student’a. *p < 0,05; **p < 0,01. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63313/63313fig04large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Próba przejścia po belce; motoryka myszy; wykres słupkowy; błędy przeciwstronne vs ipsilateralne; analiza leczenia AAV." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63313/63313fig05.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rysunek 5"> 
Rysunek 5: Analiza sprawności motorycznej u myszy traktowanych różnymi dawkami AAV-hαSyn. Myszy otrzymały różne dawki (1 x 1010 vg/mysz, 1 x 109 vg/mysz lub 1 x 108 vg/mysz) AAV-hαSyn lub AAV-GFP, a 12 tygodni później oceniono sprawność motoryczną za pomocą próby przejścia po belce. (A) Zdjęcie myszy idącej po belce. (B) Ilość błędów popełnionych przez kończyny lewe (przeciwstronne) w porównaniu do kończyn prawych (ipsilateralnych) została ilościowo określona w grupach myszy otrzymujących AAV-hαSyn. (C) Całkowita liczba błędów została porównana pomiędzy różnymi grupami eksperymentalnymi otrzymującymi tę samą dawkę AAV-hαSyn lub AAV-GFP. Dane przedstawiają średnią ± SEM. n = 3–5 myszy na grupę. Porównania wykonano za pomocą (B) sparowanego dwustronnego testu t Studenta lub (C) niesparowanego dwustronnego testu t Studenta. *p &lt; 0,05; **p &lt; 0,01. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63313/63313fig05large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
Ustalenie kinetyki modelu choroby Parkinsona indukowanego AAV-αSyn 
Po określeniu odpowiedniej dawki AAV-hαSyn niezbędnej do wywołania znaczącego poziomu neurodegeneracji i zaburzeń motorycznych, przeprowadzono eksperymenty w celu zdefiniowania czasu rozpoczęcia nadekspresji hαSyn. W tym celu myszy poddano leczeniu dawką 1 x 1010 vg/mysz AAV-hαSyn lub wykonano operację pozorowaną. Stopień ekspresji hαSyn analizowano w SN raz w tygodniu w tygodniach 2–5 po zabiegu stereotaktycznym (patrz: projekt eksperymentalny na Ryc. uzupełniającej 2). Wyniki pokazują, że mimo wykrycia niskich poziomów ekspresji hαSyn już w 2. tygodniu po operacji, agregaty hαSyn pojawiły się w 5. tygodniu po zabiegu stereotaktycznym (Ryc. 6).
<img alt="Immunofluorescencja, ekspresja hαSyn, przekroje mózgu, przebieg czasowy, barwienie DAPI, obrazy nałożone." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63313/63313fig06.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rycina 6"> 
Rysunek 6Analiza przebiegu czasowego ekspresji ludzkiej α-synukleiny w istocie czarnej myszy traktowanych AAV-hαSyn. Myszy otrzymały AAV-hαSyn (1 x 1010 vg/mysz) lub tylko pozorną operację stereotaktyczną, a następnie przeanalizowano ekspresję hαSyn w SN (A) 2 tygodnie, (B) 3 tygodnie, (C) 4 tygodnie, lub (D) 5 tygodni później za pomocą immunofluorescencji z wykorzystaniem mikroskopii epifluorescencyjnej. Jądra komórkowe barwiono DAPI. Przedstawiono reprezentatywne obrazy z nałożonymi lub pojedynczymi barwieniami hαSyn (czerwony) lub DAPI (niebieski). Paski skali, 100 µmWstawka w prawym górnym rogu złączonych obrazów przedstawia obszar zainteresowania w większym powiększeniu. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63313/63313fig06large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
Następnie przeprowadzono eksperymenty w celu wyznaczenia odpowiednich punktów czasowych do analizy neurostanu zapalnego i infiltracji limfocytów T w ośrodkowym układzie nerwowym (OUN) po stereotaktycznym podaniu AAV-hαSyn. Aby określić szczyt aktywacji mikrogleju po podaniu myszom AAV-hαSyn, raz w tygodniu w okresie od 2. do 15. tygodnia po zabiegu stereotaktycznym oceniano liczbę komórek wykazujących wysoką ekspresję Iba1 w prążkowiu. Wyniki wskazują na istotny wzrost aktywacji mikrogleju po stronie ipsilateralnej w porównaniu ze stroną kontralateralną u myszy 15 tygodni po podaniu AAV-hαSyn (Rysunek 7). Za pomocą immunofluorescencji i następującej po niej obserwacji mikroskopowej konfokalnej oceniano również liczbę komórek Treg (CD4+ Foxp3+) infiltrujących SNpc w różnych punktach czasowych po stereotaktycznym podaniu AAV-hαSyn. Wyniki pokazują, że szczyt infiltracji komórek Treg do SNpc wystąpił w 11. tygodniu po zabiegu, natomiast stopień infiltracji komórek Treg do tego obszaru mózgu był niższy w 8. i 13. tygodniu po zabiegu (Rysunek 8). Nie stwierdzono infiltracji limfocytów T CD4+ do prążkowia (dane nie przedstawiono). Podsumowując, wyniki te wskazują, że przy zastosowaniu dawki 1 x 1010 vg/mysz AAV-hαSyn, najodpowiedniejszym momentem do analizy stanu zapalnego w układzie nerwowym jest 15. tydzień po zabiegu stereotaktycznym, natomiast właściwym momentem do analizy infiltracji limfocytów T do OUN wydaje się być 11. tydzień po podaniu AAV-hαSyn.
<img alt="Obrazy histologiczne i wykres słupkowy aktywacji mikrogleju w czasie; analiza przeciwległa i ipsylateralna." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63313/63313fig07.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rysunek 7"> 
Rysunek 7: Analiza przebiegu czasowego aktywacji mikrogleju u myszy inokulowanych AAV-hαSyn. Myszy otrzymały AAV-hαSyn (1 x 1010 vg/mysz), a aktywację mikrogleju oceniono poprzez analizę immunohistochemiczną Iba1 w prążkowiu w różnych punktach czasowych po operacji. (A) Przedstawiono reprezentatywne obrazy przekrojowe analizy immunohistochemicznej Iba1 z myszy uśpionych 5, 10 lub 15 tygodni po inokulacji AAV-hαSyn. Paski skali, 110 µm. (B) Gęstość aktywowanego mikrogleju określono jako liczbę komórek wykazujących wysoki poziom Iba1 i kształt ameboidalny na jednostkę powierzchni. Dane przedstawiono jako średnia ± SEM. n = 3 myszy na grupę. Do wyznaczenia różnic statystycznych między poziomem Iba1 po stronie ipsylateralnej i przeciwległej w każdej grupie zastosowano dwustronny sparowany test t Student’a. *p &lt; 0.05. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63313/63313fig07large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Mikroskopia gęstości komórek CD4 Foxp3 w immunofluorescencji, barwienie TH, wykres tygodni po operacji dla limfocytów T." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63313/63313fig08.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rysunek 8"> 
Rysunek 8: Analiza przebiegu czasowego infiltracji limfocytów T CD4+ do SN u myszy inokulowanych AAV-hαSyn. Myszy reporterowe Foxp3gfp otrzymały AAV-hαSyn (1 x 1010 vg/mysz). Obecność limfocytów T CD4+ wykazujących ekspresję Foxp3 oraz obecność neuronów TH+ analizowano w różnych punktach czasowych (tydzień 8, tydzień 11 i tydzień 13 po operacji) w SN przy użyciu immunofluorescencji. (A) Przedstawiono reprezentatywne obrazy dla pojedynczego barwienia immunologicznego lub obrazów połączonych. Paski skali: 100 µm. (B) Ilościowo określono liczbę limfocytów T CD4+ Foxp3+ na obszar w SN. Dane przedstawiają średnią ± SEM dla 3 myszy na grupę. *p&lt;0.05, limfocyty T CD4+ Foxp3+ po stronie ipsilateralnej w porównaniu do strony contralateralnej, test t Studenta dla dwóch stron. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63313/63313fig08large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
Rycina uzupełniająca 1: Projekt eksperymentalny służący do oceny wpływu różnych dawek wektorów AAV na patologię synukleiny, neurodegenerację i zaburzenia motoryczne. Samce myszy C57BL/6 typu dzikiego zostały poddane znieczuleniu i stereotaktycznemu wstrzyknięciu różnych dawek (1 x 1010 vg/mysz, 1 x 109 vg/mysz lub 1 x 108 vg/mysz) AAV kodującego ludzką α-synukleinę (AAV-hαSyn) lub eGFP (AAV-GFP) pod kontrolą promotora CBA do prawej istoty czarnej (SN). Po 12 tygodniach oceniono ekspresję GFP i hαSyn w SN i prążkowiu (Str) za pomocą immunofluorescencji (IF), określono liczbę komórek wykazujących obecność tyrozynowej hydroksylazy (TH+) metodą immunohistochemii (IHC) w SN, a sprawność motoryczną oceniono za pomocą testu przejścia po belce. Liczba myszy w każdej grupie eksperymentalnej jest podana w nawiasach. * oznacza grupy, w których jedna mysz padła przed przeprowadzeniem analiz. Przy każdej analizie w nawiasie podano numer ryciny z treści artykułu, na której przedstawiono odpowiadające jej wyniki. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63313/Supplementary%20Figure%201.zip" target="_blank">Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.</a>
Rycina uzupełniająca 2: Projekt eksperymentalny w celu określenia kinetyki infiltracji limfocytów T, neurostanu zapalnego oraz ekspresji hαSyn. Myszy reporterowe Foxp3gfp poddano znieczuleniu i wykonano stereotaktyczną inokulację AAV (1 x 1010 vg/mysz) kodującego ludzką α-synukleinę (AAV-hαSyn) pod kontrolą promotora CBA do prawej istoty czarnej (SN) lub wykonano zabieg pozorowany (PBS). Myszy uśmiercono w różnych punktach czasowych; ekspresję hαSyn w SN i prążkowiu oceniono za pomocą immunofluorescencji (IF), natomiast liczbę komórek GFP (Foxp3), CD4 oraz komórek wykazujących obecność hydroksylazy tyrozynowej (TH+) określono za pomocą IF w SN, a ekspresję Iba1 przeanalizowano metodą immunohistochemii (IHC) w prążkowiu (Str). Podano liczbę myszy w każdej grupie eksperymentalnej. Wskazano zakres punktów czasowych objętych każdą analizą. Przy każdej analizie w nawiasie podano numer ryciny z treści artykułu, w której przedstawiono odpowiadające im wyniki. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63313/Supplementary%20Figure%202.zip" target="_blank">Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.</a>

Ta praca analizuje dawkę wektora i czas ekspozycji wymagane do wywołania zapalenia nerwów, neurodegeneracji i upośledzenia motorycznego w tym przedklinicznym modelu choroby Parkinsona. Te wektory kodujące ludzką α-synukleinę są dostarczane do istoty czarnej w celu podsumowania patologii synukleiny związanej z chorobą Parkinsona.

Analiza mysiego modelu choroby Parkinsona indukowanego przez wektory wirusowe związane z adenowirusem kodujące ludzką α-synukleinę

Parkinson&#39;s disease is a neurodegenerative disorder that involves the death of the dopaminergic neurons of the nigrostriatal pathway and, ...

Ogólnym celem tej procedury jest odtworzenie większości istotnych aspektów choroby Parkinsona w modelu zwierzęcym. Stereotaktyczne dostarczanie wektorów wirusowych związanych z adeno, kodujących ludzką synukleinę w istocie czarnej. Choroba Parkinsona jest zaburzeniem neurodegeneracyjnym, które polega na śmierci neuronu dopaminergicznego w szlaku nigrostriatalnym, a w konsekwencji na postępie utraty kontroli nad dobrowolnymi ruchami.Temu procesowi neurodegeneracyjnemu towarzyszy odkładanie się agregatów białkowych w mózgu, które są głównie tworzone przez synukleinę. Pojawiające się dowody wskazują, że agregaty synukleiny mogą stymulować receptory toll-podobne do receptorów na mikrogleju, wywołując w ten sposób zapalenie neuronów w istocie czarnej. Ponadto dowody wskazują, że agregaty synukleiny mogą być wychwytywane i prezentowane przez komórki prezentujące antygen limfocytom T, indukując adaptacyjną odpowiedź immunologiczną specyficzną dla synukleiny.Wykazano, że stereotaktyczne dostarczanie wektorów wirusowych związanych z adeno, kodujących ludzką synukleinę w istocie czarnej, odtwarza wiele istotnych aspektów choroby, w tym patologię synukleiny, aktywację mikrogleju, aktywację komórek T, neurodegenerację i upośledzenie motoryczne. W pracy przedstawiono analizę, w jaki sposób wektor wirusowy i czas po dostarczeniu wektora wirusowego wpływają na zakres ekspresji ludzkiej synukleiny, neurodegeneracji i zapalenia nerwów w szlaku nigrostriatalnym, a także stopień upośledzenia motorycznego w mysim modelu jednostronnego stereotaktycznego dostarczania ludzkiej synukleiny w istocie czarnej. Aby utrzymać aseptyczne środowisko, podczas całego zabiegu należy nosić odpowiednią odzież chirurgiczną, w tym ochraniacze na buty, maskę chirurgiczną, barierę sanitarną, rękawice i czepek chirurgiczny.Rozpyl etanol na mysz i cały materiał chirurgiczny, aby utrzymać aseptyczne środowisko. Aby wywołać analgezję, należy wstrzykiwać karprofen podskórnie co 12 godzin, zaczynając godzinę przed zabiegiem i kontynuując do trzech dni po operacji. Aby znieczulić mysz, umieść zwierzę w komorze indukcyjnej.Otwórz przepływ izofluranu z szybkością 0,5%, a następnie powoli zwiększaj go do 5% przez około pięć minut, aż mysz straci odruch prostowania. Wyjmij zwierzę z komory indukcyjnej. Natychmiast przenieś zwierzę do obwodu bez ponownego oddychania z stożkiem nosowym o odpowiedniej wielkości.Utrzymuj znieczulenie myszy, z izofluranem 1% przez cały czas trwania operacji. Upewnij się, że mysz jest całkowicie znieczulona, szczypiąc jej ogony i łapy. Kiedy mysz nie reaguje na szczypanie ogona i łap, oznacza to, że mysz jest całkowicie znieczulona.Ogol głowę myszy za pomocą nożyczek. Oczyść skórę myszy za pomocą bawełnianego wacika z chlorheksydyną 2% i usuń wszystkie włosy. Zamocuj głowicę myszy w ramce stereotaktycznej.Umieść środek ochronny rogówki w obu oczach myszy za pomocą bawełnianego wacika. Aby zapobiec indukcji stresu u innych gryzoni, unikaj obecności innych myszy na sali operacyjnej. Oczyść głowę myszy trzema rundami chlorheksydyny 2%, a następnie etanolem 70%Odsłoń czaszkę za pomocą materiału chirurgicznego i wykonaj cienki otwór wiertłem na współrzędnych przednio-tylnych 2,8 mm i przyśrodkowo-bocznych 1,4 mm w stosunku do linii przyśrodkowej.Umieść igłę strzykawki o pojemności 10 mikrolitrów w otworze i powoli przesuwaj igłę wewnątrz mózgu, aż dojdziesz do 7,2 mm grzbietowo-brzusznej, w stosunku do opony twardej. Pozostaw igłę w końcowej pozycji na dwie minuty, aby tkanka nieco się uspokoiła, a następnie wstrzyknij jeden mikrolitr wektorów wirusowych do prawej istoty czarnej, w tempie 0,2 mikrolitra co 30 sekund. Pozostaw igłę w tej samej pozycji na pięć minut po dostarczeniu wektorów wirusowych, a następnie powoli ją wycofaj.Zamknij ranę za pomocą sterylnego jedwabnego szwu. Umieść mysz w domowej klatce, wstępnie ogrzanej, umieszczając ją na ciepłym materacu elektrycznym. 12 tygodni po operacji stereotaktycznej oceń sprawność motoryczną, korzystając z uproszczonej wersji testu wiązki, opisanego wcześniej.W tym celu użyj belki poziomej o długości 25 cm i szerokości 3 cm. Powierzchnia belki musi być pokryta metalową siatką z kwadratami o wielkości jednego centymetra i uniesiona o jeden centymetr ponad belkę. Nagraj film, na którym mysz przechodzi przez belkę powierzchni siatki, od jednego końca do przeciwległego końca belki, gdzie znajduje się klatka domowa.Trenuj mysz przez dwa dni, przed określeniem wydajności silnika. Pierwszego dnia wytrenuj mysz, aby pięciokrotnie przechodziła przez belkę, bez siatki. Drugiego dnia wytrenuj mysz, aby przechodziła przez belkę pięć razy w obecności siatki.Trzeciego dnia oceń wydajność motoryczną. Aby to zrobić, określ ilościowo liczbę popełnionych błędów, osobno przez lewe łapy lub prawe łapy, oglądając filmy w trybie zwolnionego tempa. Aby znieczulić mysz, wstrzyknij dootrzewnowo mieszaninę ketaminy i ksylazyny.Gdy mysz zostanie całkowicie znieczulona, otwórz klatkę piersiową materiałem chirurgicznym i odsłoń serce. Następnie włóż igłę z płaską końcówką do lewej komory serca. Łącząc igłę z rurą, przelej 50 mililitrów soli fizjologicznej buforu fosforanowego z szybkością 9,5 mililitra na minutę za pomocą pompy perystaltycznej.Usuń mózg za pomocą nożyczek i pęsety, a następnie utrwal go przez zanurzenie w pięciu mililitrach 4% paraformaldehydu w roztworze soli fizjologicznej z buforem fosforanowym. Następnie umieść nieruchomy mózg w 15 mililitrach 30% sacharozy na 48 godzin. Następnie umieść mózg w czterech mililitrach roztworu krioprotekcji i zachowaj mózg w temperaturze 80 stopni lub użyj go natychmiast w następnym kroku.Aby uzyskać plasterki prążkowia, pokrój mózg na odcinki o grubości 40 mikrometrów, zaczynając od 1,34 mm, a kończąc na 0,26 mm. Zbierz każdy plasterek w krioprobówce o pojemności dwóch mililitrów, zgodnie z kolejnością przednio-tylną. Aby przeprowadzić analizę immunohistochemiczną i immunofluorescencyjną w prążkowiu, należy wybrać pięć koronalnych odcinków prążkowia pobranych w jednakowych odstępach czasu, które obejmują cały zasięg rostrocaudalny jądra.Aby potwierdzić prawidłowe dostarczanie wektorów wirusowych do neuronów dopaminergicznych szlaku nigrostriatalnego, wstrzyknięto wektory kodujące GFP w istocie czarnej, a 12 tygodni później fluorescencję GFP i immunoreaktywność hydroksylazy tyrozynowej analizowano w istocie czarnej i prążkowiu za pomocą immunofluorescencji. Fluorescencja związana z GFP była zlokalizowana wyłącznie w miejscu ipsilateralnym, a znaczącą kolokalizację z immunoreaktywnością hydroksylazy tyrozynowej zaobserwowano zarówno w istocie czarnej, jak i prążkowiu, co wskazuje na prawidłowe dostarczanie wektorów wirusowych w neuronach dopaminergicznych szlaku nigrostriatal. Aby przetestować dawkę wektorów, kodujących synukleinę wymaganą, w celu wywołania znacznej nadekspresji ludzkiej synukleiny, która sprzyja neurodegeneracji neuronów dopaminergicznych nigralnych, wstrzyknięto różne dawki wektorów.A 12 tygodni później zbadano immunoreaktywność ludzkiej synukleiny i zakres immunoreaktywności hydroksylazy tyrozyny w szlaku nigrostriatalnym. Immunoreaktywność ludzkiej synukleiny była oczywista, a wszystkie dawki testowano w istocie czarnej. Jednak tylko myszy, które otrzymały od 10 do 10 genomów wirusa na mysz, wykazywały wyraźną immunoreaktywność ludzkiej synukleiny w prążkowiu.Myszy otrzymujące od 10 do 10 genomów wirusowych na mysz wektorów kodujących ludzką synukleinę, wykazywały znaczną utratę neuronów dopaminergicznych w istocie czarnej. Chociaż myszy otrzymujące tę samą dawkę wektorów kodujących GFP wykazywały niski stopień utraty neuronów, myszy te wykazywały znacznie niższy stopień neurodegeneracji w porównaniu z myszami otrzymującymi wektory kodujące ludzką synukleinę. Za pomocą testu wiązki wykryto znaczne zmniejszenie sprawności motorycznej wyłącznie u tych myszy, które otrzymały od 10 do 10 genomów wirusowych na mysz wektorów kodujących ludzką synukleinę, porównując liczbę błędów popełnionych przez prawą i lewą łapę lub porównując całkowitą liczbę błędów myszy otrzymujących wektory kodujące ludzką synukleinę, z tymi myszami, które otrzymują wektor kontrolny.Aby określić początek ekspresji ludzkiej synukleiny, myszom podawano od 10 do 10 genomów wirusa na mysz, wektorów kodujących ludzką synukleinę lub operację pozorowaną, a zakres ekspresji ludzkiej synukleiny analizowano w istocie czarnej, raz w tygodniu, w tygodniach od dwóch do pięciu po operacji stereotaktycznej. Wyniki pokazują, że ekspresja ludzkiej synukleiny zaczęła być widoczna w piątym tygodniu po operacji stereotaktycznej. Aby określić szczyt aktywacji mikrogleju, określono ilościowo zakres komórek wyrażających wysoki poziom Iba1 w prążkowiu myszy w ciągu 2-15 tygodni po operacji.Wyniki wskazują na znaczny wzrost aktywacji mikrogleju po stronie ipsilateralnej, w porównaniu z przeciwległą stroną myszy, 15 tygodni po inokulacji wirusa. Liczba regulatorowych limfocytów T infiltrowanych do znacznej czerni była analizowana w różnych punktach czasowych, po operacji stereotaktycznej za pomocą immunofluorescencji, a następnie obserwacji pod mikroskopią konfokalną. Szczyt naciekania regulatorowych limfocytów T do istoty czarnej zaobserwowano w 11. tygodniu po operacji.Analizowany tutaj mysi model neurodegeneracji stanowi użyteczny model do badania liczby kluczowych aspektów zaangażowania w patofizjologię choroby Parkinsona. Mechanizmy zaangażowania w patologię synukleiny, aktywację mikrogleju, udział obwodowego układu odpornościowego, w zapalenie nerwów i mechanizmy neurodegeneracji Właściwa dawka wektora wirusowego związanego z adenowirusem, podtyp piąty kodującego ludzką synukleinę w celu wywołania neurodegeneracji, zapalenia nerwów, nacieku limfocytów T i upośledzenia motorycznego, wynosi od 10 do 10 genomów wirusa na mysz. Badanie to pokazuje, że pięć tygodni po operacji stereotaktycznej stanowi kluczowy punkt czasowy, w którym ekspresja synukleiny u ludzi była już widoczna, ale przy braku upośledzenia motorycznego w tym modelu zwierzęcym.W związku z tym ten punkt czasowy stanowi interesujący punkt czasowy, w którym należy rozpocząć podawanie eksperymentalnych terapii dostosowanych do zatrzymania postępu zapalenia nerwów i neurodegeneracji. Najbardziej odpowiednim punktem czasowym do analizy zapalenia układu nerwowego w tym modelu zwierzęcym jest 15 tydzień po operacji stereotaktycznej. Podczas gdy właściwy punkt czasowy do analizy infiltracji limfocytów T do ośrodkowego układu nerwowego.wydaje się, że jest w 11 tygodniu po zaszczepieniu wektora wirusowego.

analyzing-parkinson-s-disease-mouse-model-induced-adeno-associated

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Choroba Parkinsona jest spowodowana utratą unerwienia dopaminergicznego prążkowia, którą można wywołać eksperymentalnie za pomocą 6-OH-dopaminy. Opisujemy sposób wykonania stereotaktycznej lekcji oraz monitorowania zachowania rotacyjnego indukowanego apomorfiną u myszy. Model ten jest użyteczny i wiarygodny w testowaniu nowych terapii choroby Parkinsona.

Model mysi choroby Parkinsona: od uszkodzenia dopaminergicznego 6-OHDA do testów behawioralnych

Ten film pokazuje proces wstrzykiwania wektora wirusowego do istoty czarnej szczura w celu modelowania choroby Parkinsona. Przedstawiono w nim etapy przygotowania szczura, mikrowstrzyknięcia wektora wirusowego do istoty czarnej oraz procedury odzyskiwania.

Wstrzyknięcie wektora wirusowego do istoty czarnej szczura w celu modelowania chorób neurodegeneracyjnych

W chorobie Parkinsona i ogólnie w zaburzeniach ruchowych, czułe i wiarygodne testy behawioralne są niezbędne do testowania nowych potencjalnych terapii. W tym miejscu opisujemy łatwą do opanowania baterię testów sensomotorycznych dla myszy, które są wrażliwe na różne stopnie uszkodzenia układu nigrostriatal i przydatne w badaniach przedklinicznych.

Ocena funkcji sensomotorycznych w mysich modelach choroby Parkinsona

Opisano zostało ELISA oferujące nowatorskie podejście ilościowe. Specyficznie wykrywa związane z chorobą α-synukleina (αSD) w transgennym modelu myszym (M83) synucleinopatii za pomocą kilku przeciwciał skierowanych albo przeciw fosforylowanej w Ser129 formie αS, albo przeciwko C-końcowej części białka.

Wykrywanie białka α-synucleiny związanego z chorobą za pomocą ulepszonego testu ELISA w mózgu transgenicznych myszy nadmiernie ekspresujących ludzkie α-synucleinę z mutacją A53T

Ten manuskrypt opisuje, w jaki sposób lokalne dostarczanie genów za pośrednictwem wektorów wirusowych zapewnia atrakcyjny sposób ekspresji transgenów w ośrodkowym układzie nerwowym.  Protokół określa wszystkie kluczowe kroki w celu wykonania wstrzyknięcia wektora wirusowego w istotę czarną szczura w celu opracowania opartego na wektorze wirusowym modelu zwierzęcego dla choroby Parkinsona.

Opracowanie szczurzego modelu choroby Parkinsona opartego na alfa-synukleinie poprzez stereotaktyczne wstrzyknięcie rekombinowanego wektora wirusowego związanego z adenowirusem

Celem tego protokołu jest dostarczenie systemu opartego na komórkach, który replikuje tworzenie agregatów alfa-synukleiny in vivo. Wewnątrzkomórkowe inkluzje alfa-synukleiny są wysiewane w pierwotnych neuronach przez internalizację i propagację egzogennych, podawanych natywnych agregatów alfa-synukleiny związanych z mikrosomami wyizolowanych z chorych myszy transgenicznych alfa-synukleiny.

Egzogenne podawanie agregatów alfa-synukleiny związanych z mikrosomami do neuronów pierwotnych jako potężny model komórkowy tworzenia włókienek

Celem tego artykułu jest nakreślenie kroków wymaganych do wytworzenia włókienek z monomerycznej alfa-synukleiny, późniejszej kontroli jakości i użycia wstępnie uformowanych włókienek in vivo.

Wytwarzanie włókienek preformowanych alfa-synukleiną z monomerów i stosowanie in vivo

Tutaj prezentujemy zautomatyzowaną metodę półilościowego określania liczby neuronów dopaminergicznych u szczurzej istoty czarnej pars compacta.

Półilościowe oznaczanie gęstości neuronów dopaminergicznych w istocie czarnej modeli gryzoni przy użyciu automatycznej analizy obrazu

Prezentowana jest wygodna metoda perfuzji grawitacyjnej do analizy histologicznej ośrodkowego układu nerwowego myszy. Immunofluorescencyjne wykrywanie fosforylowanej α-synukleiny wykazano w mysim modelu choroby Parkinsona. Praca ta kompleksowo opisuje również etapy perfuzji przezsercowej, rozwarstwienia, zamrażania/osadzania tkanek i zamrażania sekcji.

Grawitacyjna metoda perfuzji przezsercowej do analizy histologicznej ośrodkowego układu nerwowego myszy

W niniejszym materiale przedstawiamy metodę wewnątrzczaszkowej iniekcji wektorów AAV w celu fluorescencyjnego znakowania neuronów i gleju w korze wzrokowej.

Wewnątrzczaszkowe wstrzykiwanie wektorów wirusowych opartych na wirusach adeno-zależnych

Poznaj metodę stereotaksycznego podawania wektorów wirusowych kodujących ludzką α-synukleinę w czarną substancję myszy, aby badać neurozapalenie i neurodegenerację w modelu choroby Parkinsona.

Analiza mysiego modelu choroby Parkinsona indukowanego przez wektory wirusowe związane z adenowirusem kodujące ludzką α-synukleinę (Wideo) | JoVE Journal

Analiza mysiego modelu choroby Parkinsona indukowanego przez wektory wirusowe związane z adenowirusem kodujące ludzką α-synukleinę

Przeglądaj więcej filmów