Specyficzna dla reszty wymiana proliny przez analogi proliny w białkach fluorescencyjnych: jak "chirurgia molekularna" kręgosłupa wpływa na fałdowanie i stabilność

W większości przypadków konwencjonalna mutageneza ukierunkowana na miejsce nie jest odpowiednia do badania funkcjonalnej roli prolin w białkach. W tym miejscu przedstawiamy metodę włączania analogów proliny jako aminokwasów niekanonicznych do białek syntetyzowanych rybosomalnie w celu zbadania roli reszt proliny w fałdowaniu i funkcji białek. Substytucja prolin przez standardowe aminokwasy jest ryzykownym podejściem.

Włączenie analogów proliny pozwala na rodzaj chirurgii molekularnej. Innymi słowy, wprowadza subtelne zmiany molekularne, aby racjonalnie wpływać na właściwości białek i manipulować nimi. Ponieważ reszty proliny odgrywają zasadniczą rolę w stabilności rusztowań białkowych, nasza technologia może być pomocna w zrozumieniu przyczyn deficytów fałdowania białek, które leżą u podstaw pewnych stanów patologicznych u ludzi.

Zmiany w białkach wywołane przez wymianę proliny mają implikacje dla inżynierii biotechnologicznej enzymów i dają możliwości poprawy translacji lub fałdowania białek rybosomalnych. Ta metoda nie wymaga specjalnego sprzętu i drogiego oprzyrządowania. Szczególną ostrożność należy zachować przy podejmowaniu kroków protokołu, w których natywna prolina jest zubożana z kultur E. coli przed dodaniem analogów proliny.

Aby rozpocząć produkcję białek fluorescencyjnych z natywną proliną, należy zaszczepić 200 mililitrów świeżej pożywki NMM w dwulitrowej kolbie Erlenmeyera z dwoma mililitrami kultury przez noc. Inkubuj komórki w temperaturze 37 stopni Celsjusza w wytrząsarce orbitalnej z prędkością 220 obr./min przez około 3,5 godziny. Podczas inkubacji należy co 30 minut mierzyć gęstość optyczną przy 600 nanometrach w spektrofotometrze.

Gdy gęstość optyczna osiągnie 0,7, odwiruj zawiesinę ogniw i delikatnie zdekantuj supernatant do odpadów. Następnie umyj komórki, ponownie zawieszając w 50 mililitrach lodowatego NMM bez żadnych aminokwasów lub NMM bez proliny. Ponownie odwiruj komórki i zdekantuj supernatant do odpadów.

Następnie ponownie zawiesić osad komórkowy przez delikatne pipetowanie w 200 mililitrach NMM bez proliny i uzupełniony ampicyliną w dwulitrowej kolbie Erlenmeyera i inkubować komórki w wytrząsarce orbitalnej przez 30 minut, aby umożliwić całkowite wyczerpanie proliny. Po inkubacji dodać odpowiednią objętość L-proliny lub analogów proliny z 50-milimolowych roztworów podstawowych, aby uzyskać jednomilimolowe stężenie końcowe w zawiesinie komórek. Następnie indukuj ekspresję białka docelowego, dodając 500-mikromolowy IPTG z jednomolowego roztworu podstawowego.

Ekspresję białka docelowego przez noc w temperaturze 37 stopni Celsjusza w wytrząsarce orbitalnej i zmierzenie gęstości optycznej następnego dnia. Zebrać komórki bakteryjne przez odwirowanie i zdekantować supernatant do odpadów. Następnie umyj komórki, ostrożnie pipetując 50 mililitrów buforu wiążącego zawierającego 10% glicerolu.

Ponownie zakręć komórki, zdekantuj supernatant i przechowuj osad komórek w 50-mililitrowej probówce w temperaturze minus 20 lub 80 stopni Celsjusza do dalszego użycia. Przed oceną emisji fluorescencji należy wykonać SDS-PAGE, aby upewnić się, że czystość próbki przekracza 95%Następnie dostosuj próbki każdego oczyszczonego wariantu białka do stężenia 0,3 mikromola, przyjmując jako odniesienie obliczoną wartość absorbancji przy odpowiedniej długości fali. Upewnij się, że przybliżona końcowa objętość próbki wynosi 200 mikrolitrów.

Pozostawić rozcieńczone próbki do zrównoważenia w temperaturze pokojowej. Po godzinie przenieś próbki do jednocentymetrowej kuwety kwarcowej i zmierz widmo emisji fluorescencji próbek za pomocą spektrometru fluorescencyjnego. Aby wywołać denaturację, rozcieńczyć próbki każdego wariantu białka dwudziestokrotnie, dodając dwa mikrolitry próbek o pojemności 300 mikromolów do 18 mikrolitrów buforu 1,11X PBS zawierającego 8,89-molowy mocznik i 5,56-milimolowy DTT.

Próbki należy inkubować w temperaturze 95 stopni Celsjusza przez pięć minut. Następnie rozcieńczyć próbki 100-krotnie, dodając 1 980 mikrolitrów PBS zawierających pięciomilimolowy DTT w celu wywołania renaturacji i natychmiast przenieść 200 mikrolitrów próbek do jednocentymetrowej kuwety kwarcowej. Włóż kuwetę kwarcową do odpowiedniego spektrometru fluorescencyjnego i monitoruj ponowne fałdowanie białek, uzyskując widmo fluorescencji co trzy sekundy przez 30 minut.

Przenieś ponownie składane próbki do 1,5-mililitrowych probówek mikrowirówek, a następnie zamknij pokrywę i przechowuj próbki w temperaturze pokojowej w ciemności, aby umożliwić całkowite ponowne złożenie wariantów EGFP. Po 24 godzinach zmierz emisję fluorescencji ponownie złożonych próbek białek przy użyciu tej samej długości fali wzbudzenia, co poprzednio, aby uchwycić czasowy punkt końcowy odzyskiwania fluorescencji. Osady z komórek wykazujących ekspresję białka natywnego i warianty zawierające S-fluoroprolinę i dehydroprolinę miały typowy jasny kolor ze względu na nienaruszony chromofor.

Natomiast warianty zawierające R-fluoroprolinę i difluoroprolinę pozostały bezbarwne, co wskazuje na nieprawidłowe fałdowanie i odkładanie się niesfałdowanego białka w ciałach inkluzyjnych. Analiza SDS-PAGE potwierdziła obecność nierozpuszczalnych białek zawierających R-fluoroprolinę. Natomiast we frakcjach rozpuszczalnych stwierdzono białka natywne oraz warianty zawierające S-fluoroprolinę i dehydroprolinę.

W analizie chromatografii cieczowej/spektrometrii mas każde zastąpienie proliny S-fluoroproliną powodowało dodatnie przesunięcie o 18 daltonów na resztę proliny, podczas gdy zastąpienie dehydroproliną powodowało ujemne przesunięcie o dwa daltony na resztę. W widmach absorpcji i emisji światła stwierdzono absorbancję chromoforu na poziomie 488 nanometrów dla EGFP i 493 nanometrów dla NowGFP. W KillerOrange obszar absorbancji chromoforu składał się z dwóch pasm odpowiadających dwóm możliwym stanom konfiguracyjnym i ładunkowym chromoforu złożonego.

Co więcej, widma fluorescencji zarejestrowane po wzbudzeniu przy odpowiednich maksymalnych długościach fal absorbancji sugerowały, że analogi nie zmieniły środowiska chemicznego chromoforów. W eksperymentach z ponownym fałdowaniem natywna fluorescencja chromoforu EGFP częściowo się poprawiła, chociaż fluorescencja specyficzna dla tryptofanu była większa po renaturacji. Podobne zachowanie zaobserwowano w przypadku wariantu zawierającego dehydroprolinę.

W przypadku S-fluoroproliny zawierającej EGFP podobny wynik zaobserwowano przy wzbudzeniu 295 nanometrów, podczas gdy fluorescencja powróciła w znacznie większym stopniu przy 488 nanometrach. Tylko warianty EGFP wykazywały szybką kinetykę fałdowania, przy czym odzyskiwanie emisji tryptofanu było dwukrotnie szybsze w porównaniu z emisją chromoforu. Należy użyć świeżych kultur bakteryjnych z odpowiednimi pożywkami wzrostowymi.

Sterylne techniki i regularne monitorowanie wzrostu kultur są również ważnymi warunkami wstępnymi powodzenia eksperymentu. Metoda ta ma zastosowanie w inżynierii białek, ponieważ pozwala badać rolę innych aminokwasów kanonicznych. W tym celu potrzebne są odpowiednie auksotroficzne szczepy E. coli i analogi aminokwasów.

Spektrometria mas całych białek jest wymagana jako dowód analityczny w celu potwierdzenia włączenia niekanonicznych analogów aminokwasów. Metoda SPI do włączania analogów proliny pozwala nam na bezpośrednie manipulowanie szkieletem białkowym i oferuje korzyści w zakresie racjonalnego projektowania i ułatwionej produkcji białek poprzez globalną stabilizację i poprawę translacji lub fałdowania rybosomów.