Wieloaspektowe badania neuropeptydów metodą spektrometrii mas u Callinectes sapidus

Analiza endogennych peptydów, które są mniejsze niż większość białek, ale większe niż wiele trawionych peptydów, jest niedostatecznie zbadaną dziedziną. Protokół ten rozwiązuje problem w przepływach pracy opartych na spektrometrii mas. Spektrometria mas jest bardzo czuła i może być stosowana do celowania w określone neuropeptydy będące przedmiotem zainteresowania lub może wychwytywać i wykrywać szereg neuropeptydów w próbce.

Kwantyfikacja i lokalizacja ekspresji neuropeptydu za pomocą spektrometrii mas może prowadzić do opracowania terapii peptydowych i odkrycia biomarkerów neuropeptydów dla różnych chorób. Aby rozpocząć ekstrakcję neuropeptydów, zbierz tkankę mózgową ze skorupiaka i za pomocą kleszczy natychmiast umieść po jednej tkance w 0,6 mililitrowej probówce zawierającej 20 mikrolitrów zakwaszonego metanolu. Dodać 150 mikrolitrów zakwaszonego metanolu do próbki.

Ustaw całkowity czas pacjenta Sonic na 24 sekundy, czas pulsu na osiem sekund. Zatrzymaj czas do 15 sekund, amplitudę do 50% na homogenizatorze ultradźwiękowym i homogenizuj próbki na lodzie. Odwirować próbkę w temperaturze czterech stopni Celsjusza w temperaturze 20 000 GS przez 20 minut.

Za pomocą pipety przenieś supernatant do probówki i wysusz go w koncentratorze próżniowym w temperaturze około 35 stopni Celsjusza. W celu odsalania rozpuść wyekstrahowaną próbkę tkanki w 20 mikrolitrach 0,1% kwasu mrówkowego. Zmieszać roztwór i poddać sonikacji w łaźni wodnej o temperaturze pokojowej przez jedną minutę.

Nałożyć 0,5 mikrolitra próbki na pasek pH, aby potwierdzić, że pH jest mniejsze niż cztery. Wirować w temperaturze czterech stopni Celsjusza i 20 000 GS przez 30 sekund. Przygotować zwilżające płukanie równowagowe w roztworach iluzji.

Zaopatrz się w końcówkę odsalającą o pojemności 10 mikrolitrów z żywicą C18. Umieść końcówkę odsalającą na pipecie o pojemności 20 mikrolitrów, która jest ustawiona na 15 mikrolitrów. Zassać końcówkę trzy razy roztworem zwilżającym i trzy razy roztworem do współpracy.

Odessać próbkę 10 razy, a następnie trzykrotnie przemyć roztworem do płukania, odrzucając każde przemycie. Elutę przez zasysanie 10 razy w każdym z roztworów iluzji w kolejności zwiększania acetonitrylu. Wysuszyć wymienione neuropeptydy w koncentratorze próżniowym.

Rozpuść wysuszone odsolone neuropeptydy w pięciu mikrolitrach 0,1% kwasu mrówkowego. Zmieszać roztwór i poddać go sonikacji w łaźni wodnej o temperaturze pokojowej przez jedną minutę. Krótko odwirować przy 2000 GS. W celu wykrycia neuropeptydów i tkanek skorupy ziemskiej należy odpipetować trzymikrolitrową kroplę próbki na folię hydrofobową.

Odpipetować trzy mikrolitry matrycy DHB bezpośrednio na kroplę próbki. Wymieszać roztwory, pipetując w górę i w dół. Odpipetować jeden mikrolitr mieszaniny próbki i matrycy do dołka płytki docelowej MALDI ze stali nierdzewnej i użyć końcówki pipety, aby rozprowadzić każdą mieszaninę do krawędzi dołka próbki.

Umieścić jeden mikrolitr mieszaniny kalibru jeden do jednego i matrycy w studzience w pobliżu próbki. Włożyć płytkę celowniczą zawierającą wysuszone plamki próbek do tandemowego przyrządu czasu przelotu MALDI. Z matrycą DHB ustaw moc lasera na 95%Wybierz automatyczne optymalne wzmocnienie detektora i inteligentny tryb ruchu nośnika próbki próbki.

Uzyskaj widma MS w zakresie od 200 do 3, 200 M przez Z i dodaj wiele widm z każdego miejsca razem, aby zwiększyć stosunek sygnału neuropeptydu do szumu. Napełnij pół kubka kriostatu żelatyną i pozwól mu zestalić się w temperaturze pokojowej. Utrzymuj resztki płynnej żelatyny w cieple w łaźni wodnej o temperaturze 37 stopni Celsjusza.

Zbierz pożądaną tkankę neuronalną od zwierzęcia i użyj kleszczy, aby natychmiast zanurzyć tkankę w 0,6 mililitrowej probówce zawierającej dejonizowaną wodę na jedną sekundę. Umieść tkankę na wierzchu stałej żelatyny i napełnij resztę kubka kriostatu płynną żelatyną. Użyj kleszczy, aby ustawić tkankę.

Umieść kubek kriostatu na płaskiej powierzchni i zamroź suchym lodem. W celu przygotowania do cięcia oddzielić próbkę zatopioną w żelatynie od formy kriostatu, odcinając formę. Zamontuj osadzoną tkankę na uchwycie kriostatowym, pipetując jednomililitrową kroplę dejonizowanej wody na uchwyt i natychmiast dociskając osadzoną tkankę do kropli.

Po zamrożeniu pipety więcej dejonizowanej wody wokół tkanki, aby jeszcze bardziej przymocować ją do uchwytu. Przekrój tkankę na przybliżoną grubość jednej komórki. Zamontuj kciukiem każdą sekcję na szkiełku pokrytym tlenkiem indu i cyny, umieszczając jedną stronę szkiełka w pobliżu sekcji i kładąc palec po drugiej stronie szkiełka, aby powoli ogrzać szkło i pozwolić, aby sekcja przykleiła się do szkiełka.

Eksport De Novo tylko peptydy. CSV ze szczytów ze średnim lokalnym współczynnikiem ufności większym lub równym 75. Przeszukaj listę peptydów pod kątem znanych motywów sekwencji wskazujących na neuropeptydy należące do określonych rodzin neuropeptydów.

Wybierz znaną sekwencję aminokwasów hormonu pre-pro, która Cię interesuje, i użyj TB blast N, aby wyszukać sekwencję hormonów pre-pro w bazie danych. Wybierz organizm docelowy i zmień parametry algorytmu progu oczekiwania na 1000, aby uwzględnić dopasowania do niskiego wyniku. Uruchom program blast, a następnie sprawdź wyniki pod kątem wysokich wyników homologii między sekwencjami zapytań i tematów, co daje znaczące wyrównania.

Zapisz plik FASTA zawierający sekwencję nukleotydów. Przetłumacz sekwencję nukleotydów hormonu pre-pro na sekwencje peptydów hormonalnych pre-pro za pomocą narzędzia do tłumaczenia Expasy. W przypadku callinectes sapidus wybierz mitochondria bezkręgowców do kodu genetycznego i uruchom narzędzie.

Sprawdź sekwencję peptydów sygnałowych i miejsca rozszczepienia prohormonów w sekwencjach peptydowych za pomocą sygnału P. Jest to widmo fragmentacji neuropeptydu zidentyfikowane ze 100% pokryciem sekwencji przy niskim błędzie masy fragmentu z maksymalnym limitem 0,02 daltona. Oto widmo neuropeptydu również zidentyfikowanego ze 100% pokryciem sekwencji, ale z niską liczbą jonów fragmentacyjnych, dlatego pewność identyfikacji jest niska. Są to wyekstrahowane chromatogramy jonowe dla pojedynczego neuropeptydu, który został zidentyfikowany w dwóch oddzielnych i następujących po sobie seriach.

Mimo że czas retencji różni się nieznacznie, nadal można go wykorzystać do oznaczania ilościowego bez etykiet, ponieważ przesunięcie w czasie jest mniejsze niż jedna minuta. Jest to przykład pełnego spektrum masowego skanowania zawierającego neuropeptyd, który został znakowany dimetylem, co spowodowało przesunięcie masy o 4,025 daltona między lekką i ciężką formą neuropeptydu. Widmo masowe jonów fragmentacyjnych peptydu zsekwencjonowanego De Novo wykazuje dobre pokrycie fragmentacji, w którym zaobserwowano jon fragmentu B i / lub Y dla każdego aminokwasu z niskim błędem masy wynoszącym 0,02 daltona.

Wskazuje to, że zaobserwowano endogenny peptyd należący do rodziny neuropeptydów RYMI skorupiaków. Przykłady dobrych miejsc, które stykają się ze wszystkimi krawędziami grawerunku studni, pokazano po lewej stronie. Przykłady złych miejsc są pokazane po prawej stronie.

Po obrazowaniu MALDI MS neuropeptydów z tkanek callinectes sapidus uzyskano obrazy rozkładu jonów o różnych wartościach M i Z odpowiadających różnym neuropeptydom. Optymalizacja rozpuszczalnika ekstrakcyjnego dla konkretnego rodzaju analizy ma kluczowe znaczenie. Upewnij się również, że następuje pełna homogenizacja i dostosuj metodę w razie potrzeby.

Nic nie zostanie wykryte dalej, jeśli nie zostanie wyodrębnione. Technika ta może dostarczyć fundamentalnej listy ważnych neuropeptydów, które mogą być dalej badane jako potencjalne biomarkery, a także dostarczyć informacji o nieukierunkowanej lokalizacji bez konieczności stosowania przeciwciał.