Name: Wieloaspektowe badania neuropeptydów metodą spektrometrii mas u Callinectes sapidus (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-05-31T13:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 22 s
Description: Poznaj metody spektrometrii mas do analizy neuropeptydów u Callinectes sapidus. Odkryj techniki ekstrakcji, kwantyfikacji i lokalizacji, które wspierają badania nad biomarkerami i terapiami peptydowymi.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

To badanie było wspierane przez National Science Foundation (CHE-1710140 i CHE-2108223) oraz National Institutes of Health (NIH) poprzez granty R01DK071801. A.P. było częściowo wspierane przez NIH Chemistry-Biology Interface Training Grant (T32 GM008505). N.V.Q. było częściowo wspierane przez National Institutes of Health, w ramach nagrody Ruth L. Kirschstein National Research Service Award od National Heart Lung and Blood Institute dla University of Wisconsin-Madison Centrum Badań Sercowo-Naczyniowych (T32 HL007936). L.L. pragnie podziękować NIH przyznaje R56 MH110215, S10RR029531 i S10OD025084, a także wsparcie finansowe z profesury Vilas Distinguished Achievement Professorship i Charlesa Melbourne Johnsona z finansowaniem zapewnionym przez Wisconsin Alumni Research Foundation i University of Wisconsin-Madison School of Pharmacy.

<ol><li>Hökfelt, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuropeptides+-+an+overview%5BTitle%5D)+AND+%22Neuropharmacology%22%5BJournal%5D)">Neuropeptides - an overview.</a> Neuropharmacology. 39 (8), 1337-1356 (2000).</li>
<li>Radhakrishnan, V., Henry, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrophysiology+of+neuropeptides+in+the+sensory+spinal+cord%5BTitle%5D)+AND+%22Progress+in+Brain+Research%22%5BJournal%5D)">Electrophysiology of neuropeptides in the sensory spinal cord.</a> Progress in Brain Research. 104, 175-195 (1995).</li>
<li>Nässel, D. R., Ekström, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+neuropeptides+by+immunocytochemistry%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Detection of neuropeptides by immunocytochemistry.</a> Methods in Molecular Biology. 72, clifton, N.J. 71-101 (1997).</li>
<li>Martins, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+of+Neuropeptide+Y+Receptors+Modulates+Retinal+Ganglion+Cell+Physiology+and+Exerts+Neuroprotective+Actions+In+Vitro%5BTitle%5D)+AND+%22ASN+Neuro%22%5BJournal%5D)">Activation of Neuropeptide Y Receptors Modulates Retinal Ganglion Cell Physiology and Exerts Neuroprotective Actions In Vitro.</a> ASN Neuro. 7 (4), 1759091415598292(2015).</li>
<li>Racaityte, K., Lutz, E. S. M., Unger, K. K., Lubda, D., Boos, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+neuropeptide+Y+and+its+metabolites+by+high-performance+liquid+chromatography-electrospray+ionization+mass+spectrometry+and+integrated+sample+clean-up+with+a+novel+restricted-access+sulphonic+acid+cation+exchanger%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Chromatography.+A%22%5BJournal%5D)">Analysis of neuropeptide Y and its metabolites by high-performance liquid chromatography-electrospray ionization mass spectrometry and integrated sample clean-up with a novel restricted-access sulphonic acid cation exchanger.</a> Journal of Chromatography. A. 890 (1), 135-144 (2000).</li>
<li>Salisbury, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+rapid+MALDI-TOF+mass+spectrometry+workflow+for+Drosophila+melanogaster+differential+neuropeptidomics%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Brain%22%5BJournal%5D)">A rapid MALDI-TOF mass spectrometry workflow for Drosophila melanogaster differential neuropeptidomics.</a> Molecular Brain. 6, 60(2013).</li>
<li>Schmerberg, C. M., Li, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Function-driven+discovery+of+neuropeptides+with+mass+spectrometry-based+tools%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+and+Peptide+Letters%22%5BJournal%5D)">Function-driven discovery of neuropeptides with mass spectrometry-based tools.</a> Protein and Peptide Letters. 20 (6), 681-694 (2013).</li>
<li>Lee, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuropeptidomics%3A+Mass+Spectrometry-Based+Identification+and+Quantitation+of+Neuropeptides%5BTitle%5D)+AND+%22Genomics+%26+Informatics%22%5BJournal%5D)">Neuropeptidomics: Mass Spectrometry-Based Identification and Quantitation of Neuropeptides.</a> Genomics & Informatics. 14 (1), 12-19 (2016).</li>
<li>Sauer, C. S., Phetsanthad, A., Riusech, O. L., Li, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Developing+mass+spectrometry+for+the+quantitative+analysis+of+neuropeptides%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Review+of+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Developing mass spectrometry for the quantitative analysis of neuropeptides.</a> Expert Review of Proteomics. 18 (7), 607-621 (2021).</li>
<li>Pratavieira, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MALDI+Imaging+Analysis+of+Neuropeptides+in+Africanized+Honeybee+%28+Apis+mellifera%29+Brain%3A+Effect+of+Aggressiveness%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Proteome+Research%22%5BJournal%5D)">MALDI Imaging Analysis of Neuropeptides in Africanized Honeybee ( Apis mellifera) Brain: Effect of Aggressiveness.</a> Journal of Proteome Research. 17 (7), 2358-2369 (2018).</li>
<li>Buchberger, A. R., Vu, N. Q., Johnson, J., DeLaney, K., Li, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Simple+and+Effective+Sample+Preparation+Strategy+for+MALDI-MS+Imaging+of+Neuropeptide+Changes+in+the+Crustacean+Brain+Due+to+Hypoxia+and+Hypercapnia+Stress%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Society+for+Mass+Spectrometry%22%5BJournal%5D)">A Simple and Effective Sample Preparation Strategy for MALDI-MS Imaging of Neuropeptide Changes in the Crustacean Brain Due to Hypoxia and Hypercapnia Stress.</a> Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 31 (5), 1058-1065 (2020).</li>
<li>Vu, N. Q., DeLaney, K., Li, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuropeptidomics%3A+Improvements+in+Mass+Spectrometry+Imaging+Analysis+and+Recent+Advancements%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protein+%26+Peptide+Science%22%5BJournal%5D)">Neuropeptidomics: Improvements in Mass Spectrometry Imaging Analysis and Recent Advancements.</a> Current Protein & Peptide Science. 22 (2), 158-169 (2021).</li>
<li>Li, L., Sweedler, J. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peptides+in+the+brain%3A+mass+spectrometry-based+measurement+approaches+and+challenges%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Analytical+Chemistry+%28Palo+Alto%2C+Calif%29%22%5BJournal%5D)">Peptides in the brain: mass spectrometry-based measurement approaches and challenges.</a> Annual Review of Analytical Chemistry (Palo Alto, Calif). 1, 451-483 (2008).</li>
<li>Li, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sequential+Precipitation+and+Delipidation+Enables+Efficient+Enrichment+of+Low-Molecular+Weight+Proteins+and+Peptides+from+Human+Plasma%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Proteome+Research%22%5BJournal%5D)">Sequential Precipitation and Delipidation Enables Efficient Enrichment of Low-Molecular Weight Proteins and Peptides from Human Plasma.</a> Journal of Proteome Research. 19 (8), 3340-3351 (2020).</li>
<li>Zhang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PEAKS+DB%3A+de+novo+sequencing+assisted+database+search+for+sensitive+and+accurate+peptide+identification%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+%26+Cellular+Proteomics+%3A+MCP%22%5BJournal%5D)">PEAKS DB: de novo sequencing assisted database search for sensitive and accurate peptide identification.</a> Molecular & Cellular Proteomics : MCP. 11 (4), (2012).</li>
<li>Sturm, R. M., Greer, T., Woodards, N., Gemperline, E., Li, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mass+spectrometric+evaluation+of+neuropeptidomic+profiles+upon+heat+stabilization+treatment+of+neuroendocrine+tissues+in+crustaceans%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Proteome+Research%22%5BJournal%5D)">Mass spectrometric evaluation of neuropeptidomic profiles upon heat stabilization treatment of neuroendocrine tissues in crustaceans.</a> Journal of Proteome Research. 12 (2), 743-752 (2013).</li>
<li>Gutierrez, G. J., Grashow, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer+borealis+stomatogastric+nervous+system+dissection%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Cancer borealis stomatogastric nervous system dissection.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (25), e1207(2009).</li>
<li>Sample Preparation for Mass Spectrometry. Merck. , Available from: 
 <a target="_blank" href="http://www.millipore.com/catalogue/module/c5737">http://www.millipore.com/catalogue/module/c5737</a> (2021).</li>
<li>DeLaney, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PRESnovo%3A+Prescreening+Prior+to+de+novo+Sequencing+to+Improve+Accuracy+and+Sensitivity+of+Neuropeptide+Identification%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Society+for+Mass+Spectrometry%22%5BJournal%5D)">PRESnovo: Prescreening Prior to de novo Sequencing to Improve Accuracy and Sensitivity of Neuropeptide Identification.</a> Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 31 (7), 1358-1371 (2020).</li>
<li>Oleisky, E. R., Stanhope, M. E., Hull, J. J., Christie, A. E., Dickinson, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+neuropeptide+modulation+of+premotor+and+motor+neurons+in+the+lobster+cardiac+ganglion%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurophysiology%22%5BJournal%5D)">Differential neuropeptide modulation of premotor and motor neurons in the lobster cardiac ganglion.</a> Journal of Neurophysiology. 124 (4), 1241-1256 (2020).</li>
<li>Ma, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combining+in+silico+transcriptome+mining+and+biological+mass+spectrometry+for+neuropeptide+discovery+in+the+Pacific+white+shrimp+Litopenaeus+vannamei%5BTitle%5D)+AND+%22Peptides%22%5BJournal%5D)">Combining in silico transcriptome mining and biological mass spectrometry for neuropeptide discovery in the Pacific white shrimp Litopenaeus vannamei.</a> Peptides. 31 (1), 27-43 (2010).</li>
<li>Christie, A. E., Stemmler, E. A., Dickinson, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crustacean+neuropeptides%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+and+Molecular+Life+Sciences+%3A+CMLS%22%5BJournal%5D)">Crustacean neuropeptides.</a> Cellular and Molecular Life Sciences : CMLS. 67 (24), 4135-4169 (2010).</li>
<li>DeLaney, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+techniques%2C+applications+and+perspectives+in+neuropeptide+research%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Experimental+Biology%22%5BJournal%5D)">New techniques, applications and perspectives in neuropeptide research.</a> The Journal of Experimental Biology. 221, Pt 3 (2018).</li>
<li>Habenstein, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptomic%2C+peptidomic%2C+and+mass+spectrometry+imaging+analysis+of+the+brain+in+the+ant+Cataglyphis+nodus%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurochemistry%22%5BJournal%5D)">Transcriptomic, peptidomic, and mass spectrometry imaging analysis of the brain in the ant Cataglyphis nodus.</a> Journal of Neurochemistry. 158 (2), 391-412 (2021).</li>
<li>Maes, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+sensitivity+of+the+nano+ultra-high+performance+liquid+chromatography-tandem+mass+spectrometric+analysis+of+low-concentrated+neuropeptides+by+reducing+aspecific+adsorption+and+optimizing+the+injection+solvent%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Chromatography.+A%22%5BJournal%5D)">Improved sensitivity of the nano ultra-high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometric analysis of low-concentrated neuropeptides by reducing aspecific adsorption and optimizing the injection solvent.</a> Journal of Chromatography. A. 1360, 217-228 (2014).</li>
<li>Li, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanosecond+photochemically+promoted+click+chemistry+for+enhanced+neuropeptide+visualization+and+rapid+protein+labeling%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Nanosecond photochemically promoted click chemistry for enhanced neuropeptide visualization and rapid protein labeling.</a> Nature Communications. 10 (1), 4697(2019).</li>
<li>Corbière, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Strategies+for+the+Identification+of+Bioactive+Neuropeptides+in+Vertebrates%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Strategies for the Identification of Bioactive Neuropeptides in Vertebrates.</a> Frontiers in Neuroscience. 13, 948(2019).</li>
<li>Chen, R., Ma, M., Hui, L., Zhang, J., Li, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurement+of+neuropeptides+in+crustacean+hemolymph+via+MALDI+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+American+Society+for+Mass+Spectrometry%22%5BJournal%5D)">Measurement of neuropeptides in crustacean hemolymph via MALDI mass spectrometry.</a> Journal of American Society for Mass Spectrometry. 20 (4), 708-718 (2009).</li>
<li>Fridjonsdottir, E., Nilsson, A., Wadensten, H., Andrén, P. E. Brain Tissue Sample Stabilization and Extraction Strategies for Neuropeptidomics. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aFridjonsdottir%2C+E+%22Peptidomics%3A+Methods+and+Strategies%22">Peptidomics: Methods and Strategies</a>. , Springer Protocols. New York,NY. 41-49 (2018).</li>
<li>Buchberger, A. R., DeLaney, K., Johnson, J., Li, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mass+Spectrometry+Imaging%3A+A+Review+of+Emerging+Advancements+and+Future+Insights%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Mass Spectrometry Imaging: A Review of Emerging Advancements and Future Insights.</a> Analytical Chemistry. 90 (1), 240-265 (2018).</li>
<li>Phetsanthad, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+advances+in+mass+spectrometry+analysis+of+neuropeptides%5BTitle%5D)+AND+%22Mass+Spectrometry+Reviews%22%5BJournal%5D)">Recent advances in mass spectrometry analysis of neuropeptides.</a> Mass Spectrometry Reviews. , 21734(2021).</li>
<li>Pérez-Cova, M., Bedia, C., Stoll, D. R., Tauler, R., Jaumot, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MSroi%3A+A+pre-processing+tool+for+mass+spectrometry-based+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Chemometrics+and+Intelligent+Laboratory+Systems%22%5BJournal%5D)">MSroi: A pre-processing tool for mass spectrometry-based studies.</a> Chemometrics and Intelligent Laboratory Systems. 215, 104333(2021).</li>
<li>Christie, A. E., Chi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prediction+of+the+neuropeptidomes+of+members+of+the+Astacidea+%28Crustacea%2C+Decapoda%29+using+publicly+accessible+transcriptome+shotgun+assembly+%28TSA%29+sequence+data%5BTitle%5D)+AND+%22General+and+Comparative+Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Prediction of the neuropeptidomes of members of the Astacidea (Crustacea, Decapoda) using publicly accessible transcriptome shotgun assembly (TSA) sequence data.</a> General and Comparative Endocrinology. 224, 38-60 (2015).</li>
<li>Livnat, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+d-Amino+Acid-Containing+Neuropeptide+Discovery+Funnel%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">A d-Amino Acid-Containing Neuropeptide Discovery Funnel.</a> Analytical Chemistry. 88 (23), 11868-11876 (2016).</li>
<li>Lehrer, R. I., Ganz, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Defensins%3A+endogenous+antibiotic+peptides+from+human+leukocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Ciba+Foundation+Symposium%22%5BJournal%5D)">Defensins: endogenous antibiotic peptides from human leukocytes.</a> Ciba Foundation Symposium. 171, 276-290 (1992).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Dokładna identyfikacja, kwantyfikacja i lokalizacja neuropeptydów i endogennych peptydów znajdujących się w układzie nerwowym ma kluczowe znaczenie dla zrozumienia ich funkcji23,24. Spektrometria mas to potężna technika, która może pozwolić na osiągnięcie tego wszystkiego, nawet w organizmach bez w pełni zsekwencjonowanego genomu. Wykazano zdolność tego protokołu do wykrywania, ilościowego i lokalizowania neuropeptydów z tkanki pobranej z C. sapidus popr...

Układ nerwowy jest złożony i wymaga sieci neuronów do przekazywania sygnałów w całym organizmie. Układ nerwowy koordynuje informacje sensoryczne i reakcję biologiczną. Skomplikowane i zawiłe interakcje związane z transmisją sygnału wymagają wielu różnych cząsteczek sygnałowych, takich jak neuroprzekaźniki, steroidy i neuropeptydy. Ponieważ neuropeptydy są najbardziej zróżnicowanymi i najsilniejszymi cząsteczkami sygnałowymi, które odgrywają kluczową rolę w aktywacji reakcji fizjologicznych na stres i inne bodźce, interesujące jest określenie ich specyficznej roli w tych procesach fizjologicznych. Funkcja neuropeptydów jest związana z ich strukturą aminokwasową, która determinuje ruchliwość, interakcję z receptorem i powinowactwo1. Techniki takie jak histochemia, która jest ważna, ponieważ neuropeptydy mogą być syntetyzowane, przechowywane i uwalniane w różnych regionach tkanki, oraz elektrofizjologia zostały wykorzystane do zbadania struktury i funkcji neuropeptydu2,3,4, ale te metody są ograniczone przepustowością i swoistością, aby rozwiązać ogromną różnorodność sekwencji neuropeptydów.
Spektrometria mas (MS) umożliwia wysokoprzepustową analizę struktury i obfitości neuropeptydów. Można to przeprowadzić za pomocą różnych technik MS, najczęściej chromatografii cieczowej z jonizacją elektrorozpylającą MS (LC-ESI-MS)5 i matrycowo wspomaganej desorpcji/jonizacji laserowej MS (MALDI-MS)6. Wykorzystując wysoką dokładność pomiarów masy i fragmentację MS, MS zapewnia możliwość przypisywania sekwencji aminokwasów i statusu modyfikacji potranslacyjnej (PTM) neuropeptydom ze złożonych mieszanin bez wiedzy a priori, aby pomóc w ustaleniu ich funkcji7,8. Oprócz informacji jakościowych, MS umożliwia ilościowe informacje o neuropeptydach za pomocą bezznacznikowej kwantyfikacji (LFQ) lub metod opartych na znacznikach, takich jak znakowanie izotopowe lub izobaryczne9. Główne zalety LFQ to jego prostota, niski koszt analizy i zmniejszone etapy przygotowania próbki, co może zminimalizować straty próbki. Do wad LFQ należy jednak zwiększenie kosztów czasu pracy urządzenia, ponieważ wymaga on wielu powtórzeń technicznych w celu wyeliminowania błędu ilościowego wynikającego ze zmienności między seriami. Prowadzi to również do zmniejszenia zdolności do dokładnego ilościowego określania małych zmian. Metody oparte na znakach podlegają mniej systematycznym zmianom, ponieważ wiele próbek może być znakowanych różnicowo przy użyciu różnych stabilnych izotopów, łączonych w jedną próbkę i jednocześnie analizowanych za pomocą spektrometrii mas. Zwiększa to również przepustowość, chociaż synteza lub zakup etykiet izotopowych może być czasochłonny i kosztowny. Złożoność spektralna widm masowych pełnego skanowania (MS1) również wzrasta wraz ze wzrostem multipleksowania, co zmniejsza liczbę unikalnych neuropeptydów, które można fragmentować, a tym samym identyfikować. I odwrotnie, znakowanie izobaryczne nie zwiększa złożoności spektralnej na poziomie MS1, chociaż wprowadza wyzwania dla analitów o niskiej obfitości, takich jak neuropeptydy. Ponieważ ilościowe oznaczanie izobaryczne przeprowadza się na poziomie widm masowych jonów fragmentacyjnych (MS2), neuropeptydy o niskiej liczebności mogą nie być możliwe do ilościowego określenia, ponieważ do fragmentacji można wybrać bardziej obfite składniki matrycy, a te wybrane mogą nie mieć wystarczająco wysokiej obfitości, aby można je było określić ilościowo. Dzięki znakowaniu izotopowemu można przeprowadzić ocenę ilościową każdego zidentyfikowanego peptydu.
Oprócz identyfikacji i kwantyfikacji, informacje o lokalizacji mogą być uzyskane przez MS za pomocą obrazowania MALDI-MS (MALDI-MSI)10. Poprzez rasterowanie laserem na powierzchni próbki, widma MS można skompilować w obraz mapy cieplnej dla każdej wartości m/z. Mapowanie intensywności sygnału przejściowego neuropeptydu w różnych regionach w różnych warunkach może dostarczyć cennych informacji do określenia funkcji11. Lokalizacja neuropeptydów jest szczególnie ważna, ponieważ funkcja neuropeptydu może się różnić w zależności od lokalizacji12.
Neuropeptydy występują w mniejszej obfitości in vivo niż inne cząsteczki sygnałowe, takie jak neuroprzekaźniki, i dlatego wymagają czułych metod wykrywania13. Można to osiągnąć poprzez usunięcie składników macierzy o wyższej obfitości, takich jak lipids11,14. W porównaniu z powszechnymi procesami pracy w proteomice należy wziąć pod uwagę dodatkowe względy dotyczące analizy neuropeptydów, głównie dlatego, że większość analiz neuropeptydomicznych pomija trawienie enzymatyczne. Ogranicza to możliwości oprogramowania do analizy danych neuropeptydowych, ponieważ większość z nich została zbudowana przy użyciu algorytmów opartych na danych proteomicznych i dopasowaniach białek opartych na wykrywaniu peptydów. Jednak wiele programów, takich jak PEAKS15, jest bardziej odpowiednich do analizy neuropeptydów ze względu na ich możliwości sekwencjonowania de novo. Przy analizie neuropeptydów należy wziąć pod uwagę kilka czynników, począwszy od metody ekstrakcji, a skończywszy na analizie danych MS.
Opisane tutaj protokoły obejmują metody przygotowania próbek i znakowania izotopów dimetylu, pozyskiwania danych i analizy danych neuropeptydów przez LC-ESI-MS, MALDI-MS i MALDI-MSI. Dzięki reprezentatywnym wynikom kilku eksperymentów wykazano użyteczność i zdolność tych metod do identyfikacji, kwantyfikacji i lokalizacji neuropeptydów z niebieskich krabów, Callinectes sapidus. Aby lepiej zrozumieć układ nerwowy, powszechnie stosuje się systemy modelowe. Wiele organizmów nie ma dostępnego w pełni zsekwencjonowanego genomu, co uniemożliwia kompleksowe odkrycie neuropeptydów na poziomie peptydów. Aby złagodzić to wyzwanie, dołączono protokół identyfikacji nowych neuropeptydów i eksploracji transkryptomu w celu wygenerowania baz danych dla organizmów bez pełnych informacji o genomie. Wszystkie przedstawione tutaj protokoły mogą być zoptymalizowane pod kątem próbek neuropeptydów od dowolnego gatunku, a także stosowane do analizy dowolnych endogennych peptydów.

<table><tbody><tr><td>Chemikalia, odczynniki i materiały eksploatacyjne</td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>matryca kwasu 2,5-dihydroksybenzoesowego (DHB)</td><td>Supelco</td><td>39319</td><td></td></tr><tr><td>Kwas octowy</td><td>Fisher Chemical</td><td>A38S-500</td><td></td></tr><tr><td>Acetonitryl Optima LC/MS klasy</td><td>Fisher Chemical</td><td>A955-500</td><td></td></tr><tr><td>Wodorowęglan amonu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>9830</td><td></td></tr><tr><td>Boran pirydyna</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>179752</td><td></td></tr><tr><td>Bruker peptyd mieszanka kalibracyjna</td><td>Bruker Daltonics</td><td>NC9846988</td><td></td></tr><tr><td>Kapilarna</td><td>Polymicro 1068150019</td><td></td><td>do wykonania kolumny nanoprzepływowej (75 &mikro; m średnica wewnętrzna x 360 &mikro; m średnica zewnętrzna)</td></tr> <tr><td>Kubek kriostatu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E6032</td><td>każdy kubek lub forma powinna działać</td></tr><tr><td>&nbsp; Probówki do mikrowirówek</td><td>Eppendorf</td><td>30108434</td><td></td></tr><tr><td>Formaldehyd</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>252549</td><td></td></tr><tr><td>Formaldehyd - D2</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>492620</td><td></td></tr><tr><td>Kwas mrówkowy Optima LC/MS grade</td><td>Fisher Chemical</td><td>A117-50</td><td></td></tr><tr><td>Żelatyna</td><td>Difco</td><td>214340</td><td>miejsce w 37 &deg; C kąpiel wodna do stopienia</td></tr><tr><td>Hydrofobowy długopis</td><td>barierowy Vector Labs</td><td>15553953</td><td></td></tr><tr><td>Szkiełka szklane powlekane tlenkiem indu i cyny (ITO)</td><td>Delta Technologies</td><td>CB-90IN-S107</td><td>25 mm x 75 mm x 0,8 mm (szerokość x długość x grubość)</td></tr><tr><td>Fiolki LC-MS</td><td>Thermo</td><td>TFMSCERT5000-30LVW</td><td></td></tr><tr><td>Metanol Optima LC/MS Grade</td><td>Fisher Chemical</td><td>A456-500</td><td></td></tr><tr><td>Parafilm</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P7793</td><td>Folia hydrofobowa</td></tr><tr><td>Paski wskaźnikowe pH</td><td>Supelco</td><td>109450</td><td></td></tr><tr><td>Klastry czerwonego fosforu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>343242</td><td></td></tr><tr><td>Materiał C18 z odwróconą fazą</td><td>Wody</td><td>186002350</td><td>ręcznie pakowane w kolumnę nanoflow</td></tr><tr><td>Długopis Witeout</td><td>BIC</td><td>150810</td><td></td></tr><tr><td>ZipTip</td><td>Millipore</td><td>Z720070</td><td></td></tr><tr><td>Przyrządy i narzędzia</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Automatyczny system opryskiwania matrycowego- Wirówka M5</td><td>HTX Technologies, LLC</td><td></td><td></td></tr><tr><td>- 5424 R</td><td>Eppendorf</td><td>05-401-205</td><td></td></tr><tr><td>Kriostat- HM 550</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>956564A</td><td></td></tr><tr><td>Środek osuszający</td><td></td><td>2088701</td><td></td></tr><tr><td>Kleszcze</td><td>WPI</td><td>501764</td><td></td></tr><tr><td>Tarcza celownicza ze stali nierdzewnej MALDI</td><td>Bruker Daltonics</td><td>8280781</td><td></td></tr><tr><td>Pipet-Lite XLS</td><td>Rainin</td><td>17014391</td><td>200 &micro; L</td></tr><tr><td>Q Exactive Plus Hybrid Quadrupole-Orbitrap</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>IQLAAEGAAPFALGMBDK</td><td></td></tr><tr><td>RapifleX MALDI-TOF/TOF</td><td>Bruker Daltonics</td><td></td><td></td></tr><tr><td>SpeedVac - SVC100</td><td>Savant</td><td>SVC-100D</td><td></td></tr><tr><td>Myjka ultradźwiękowa</td><td>Bransonic</td><td>2510R-MTH</td><td>do sonikacji</td></tr><tr><td>Homogenizator ultradźwiękowy</td><td>Fisher Scientific</td><td>FB120110</td><td>FB120 Dysmembrator soniczny z sondą CL-18</td></tr><tr><td>Pompa próżniowa - Alcatel 2008</td><td>Idealne produkty próżniowe</td><td>P10976</td><td>ciśnienie końcowe = 1 x 10-4 Mikser Torr</td></tr><tr><td>Vortex</td><td>Corning</td><td>6775</td><td></td></tr><tr><td>Łaźnia wodna (37C) - Isotemp 110</td><td>Fisher Scientific</td><td>15-460-10</td><td></td></tr><tr><td>Oprogramowanie do analizy danych</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Expasy</td><td>https://web.expasy.org/translate/</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>FlexAnalysis</td><td>Bruker Daltonics</td><td></td><td></td></tr><tr><td>FlexControl</td><td>Bruker Daltonics</td><td></td><td></td></tr><tr><td>FlexImaging</td><td>Bruker Daltonics</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PEAKS Studio</td><td>Bioinformatics Solutions, Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>SCiLS Lab</td><td>https://scils.de/</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>SignalP 5.0</td><td>https://services.healthtech.dtu.dk/service.php?SignalP-5.0</td><td></td><td></td></tr><tr><td>tBLASTn</td><td>http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi?PROGRAM=tblastn&BLAST_ PROGRAMY=tblastn& PAGE_ TYPE=BlastSearch& SHOW_ DEFAULTS=włączone i LINK_LOC =blasthome</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

wieloaspektowe badania neuropeptydów metodą spektrometrii mas u callinectes sapidus

Multi-Faceted Mass Spectrometric Investigation of Neuropeptides in Callinectes sapidus

Neuropeptydy to cząsteczki sygnałowe, które regulują prawie wszystkie procesy fizjologiczne i behawioralne, takie jak rozwój, rozmnażanie, przyjmowanie pokarmu i reagowanie na zewnętrzne czynniki stresogenne. Jednak mechanizmy biochemiczne i pełny zestaw neuropeptydów oraz ich funkcjonalne role pozostają słabo poznane. Charakterystyka tych endogennych peptydów jest utrudniona przez ogromną różnorodność w tej klasie cząsteczek sygnałowych. Dodatkowo neuropeptydy są bioaktywne w stężeniach 100x - 1000x niższych niż neuroprzekaźniki i są podatne na degradację enzymatyczną po uwolnieniu synaptycznym. Spektrometria mas (MS) to bardzo czułe narzędzie analityczne, które może identyfikować, określać ilościowo i lokalizować anality bez kompleksowej wiedzy a priori. Doskonale nadaje się do globalnego profilowania neuropeptydów i pomocy w odkrywaniu nowych peptydów. Ze względu na niską liczebność i dużą różnorodność chemiczną tej klasy peptydów, kilka metod przygotowania próbek, parametrów akwizycji MS i strategii analizy danych zostało zaadaptowanych z technik proteomicznych, aby umożliwić optymalną charakterystykę neuropeptydów. W tym miejscu opisano metody izolowania neuropeptydów ze złożonych tkanek biologicznych w celu charakterystyki sekwencji, oceny ilościowej i lokalizacji przy użyciu chromatografii cieczowej (LC)-MS i desorpcji/jonizacji laserowej wspomaganej matrycą (MALDI)-MS. Dołączono protokół przygotowania bazy danych neuropeptydów z kraba błękitnego, Callinectes sapidus, organizmu bez wyczerpujących informacji genomicznych. Te przepływy pracy można dostosować do badania innych klas endogennych peptydów u różnych gatunków przy użyciu różnych instrumentów.

Przebieg przygotowania próbek i analizy MS przedstawiono na Rysunku 1. Po wycięciu tkanki neuronalnej przeprowadzane są homogenizacja, ekstrakcja i odsalanie w celu oczyszczenia próbek neuropeptydów. Jeśli wymagana jest kwantyfikacja oparta na znakowaniu izotopowym, próbki są następnie znakowane i ponownie odsalane. Otrzymaną próbkę analizuje się za pomocą LC-MS/MS w celu identyfikacji i kwantyfikacji neuropeptydów.
Neuropeptydy zidentyfikowane za pomocą oprogramo...

Charakterystyka spektrometryczna mas neuropeptydów dostarcza informacji o sekwencji, kwantyfikacji i lokalizacji. Ten zoptymalizowany przepływ pracy jest przydatny nie tylko w badaniach neuropeptydów, ale także innych endogennych peptydów. Przedstawione tutaj protokoły opisują przygotowanie próbki, akwizycję MS, analizę MS i generowanie bazy danych neuropeptydów za pomocą LC-ESI-MS, MALDI-MS spotting i obrazowania MALDI-MS.

Wieloaspektowe badania neuropeptydów metodą spektrometrii mas u Callinectes sapidus

Neuropeptides are signaling molecules that regulate almost all physiological and behavioral processes, such as development, reproduction, food intake, and ...

Analiza endogennych peptydów, które są mniejsze niż większość białek, ale większe niż wiele trawionych peptydów, jest niedostatecznie zbadaną dziedziną. Protokół ten rozwiązuje problem w przepływach pracy opartych na spektrometrii mas. Spektrometria mas jest bardzo czuła i może być stosowana do celowania w określone neuropeptydy będące przedmiotem zainteresowania lub może wychwytywać i wykrywać szereg neuropeptydów w próbce.Kwantyfikacja i lokalizacja ekspresji neuropeptydu za pomocą spektrometrii mas może prowadzić do opracowania terapii peptydowych i odkrycia biomarkerów neuropeptydów dla różnych chorób. Aby rozpocząć ekstrakcję neuropeptydów, zbierz tkankę mózgową ze skorupiaka i za pomocą kleszczy natychmiast umieść po jednej tkance w 0,6 mililitrowej probówce zawierającej 20 mikrolitrów zakwaszonego metanolu. Dodać 150 mikrolitrów zakwaszonego metanolu do próbki.Ustaw całkowity czas pacjenta Sonic na 24 sekundy, czas pulsu na osiem sekund. Zatrzymaj czas do 15 sekund, amplitudę do 50% na homogenizatorze ultradźwiękowym i homogenizuj próbki na lodzie. Odwirować próbkę w temperaturze czterech stopni Celsjusza w temperaturze 20 000 GS przez 20 minut.Za pomocą pipety przenieś supernatant do probówki i wysusz go w koncentratorze próżniowym w temperaturze około 35 stopni Celsjusza. W celu odsalania rozpuść wyekstrahowaną próbkę tkanki w 20 mikrolitrach 0,1% kwasu mrówkowego. Zmieszać roztwór i poddać sonikacji w łaźni wodnej o temperaturze pokojowej przez jedną minutę.Nałożyć 0,5 mikrolitra próbki na pasek pH, aby potwierdzić, że pH jest mniejsze niż cztery. Wirować w temperaturze czterech stopni Celsjusza i 20 000 GS przez 30 sekund. Przygotować zwilżające płukanie równowagowe w roztworach iluzji.Zaopatrz się w końcówkę odsalającą o pojemności 10 mikrolitrów z żywicą C18. Umieść końcówkę odsalającą na pipecie o pojemności 20 mikrolitrów, która jest ustawiona na 15 mikrolitrów. Zassać końcówkę trzy razy roztworem zwilżającym i trzy razy roztworem do współpracy.Odessać próbkę 10 razy, a następnie trzykrotnie przemyć roztworem do płukania, odrzucając każde przemycie. Elutę przez zasysanie 10 razy w każdym z roztworów iluzji w kolejności zwiększania acetonitrylu. Wysuszyć wymienione neuropeptydy w koncentratorze próżniowym.Rozpuść wysuszone odsolone neuropeptydy w pięciu mikrolitrach 0,1% kwasu mrówkowego. Zmieszać roztwór i poddać go sonikacji w łaźni wodnej o temperaturze pokojowej przez jedną minutę. Krótko odwirować przy 2000 GS. W celu wykrycia neuropeptydów i tkanek skorupy ziemskiej należy odpipetować trzymikrolitrową kroplę próbki na folię hydrofobową.Odpipetować trzy mikrolitry matrycy DHB bezpośrednio na kroplę próbki. Wymieszać roztwory, pipetując w górę i w dół. Odpipetować jeden mikrolitr mieszaniny próbki i matrycy do dołka płytki docelowej MALDI ze stali nierdzewnej i użyć końcówki pipety, aby rozprowadzić każdą mieszaninę do krawędzi dołka próbki.Umieścić jeden mikrolitr mieszaniny kalibru jeden do jednego i matrycy w studzience w pobliżu próbki. Włożyć płytkę celowniczą zawierającą wysuszone plamki próbek do tandemowego przyrządu czasu przelotu MALDI. Z matrycą DHB ustaw moc lasera na 95%Wybierz automatyczne optymalne wzmocnienie detektora i inteligentny tryb ruchu nośnika próbki próbki.Uzyskaj widma MS w zakresie od 200 do 3, 200 M przez Z i dodaj wiele widm z każdego miejsca razem, aby zwiększyć stosunek sygnału neuropeptydu do szumu. Napełnij pół kubka kriostatu żelatyną i pozwól mu zestalić się w temperaturze pokojowej. Utrzymuj resztki płynnej żelatyny w cieple w łaźni wodnej o temperaturze 37 stopni Celsjusza.Zbierz pożądaną tkankę neuronalną od zwierzęcia i użyj kleszczy, aby natychmiast zanurzyć tkankę w 0,6 mililitrowej probówce zawierającej dejonizowaną wodę na jedną sekundę. Umieść tkankę na wierzchu stałej żelatyny i napełnij resztę kubka kriostatu płynną żelatyną. Użyj kleszczy, aby ustawić tkankę.Umieść kubek kriostatu na płaskiej powierzchni i zamroź suchym lodem. W celu przygotowania do cięcia oddzielić próbkę zatopioną w żelatynie od formy kriostatu, odcinając formę. Zamontuj osadzoną tkankę na uchwycie kriostatowym, pipetując jednomililitrową kroplę dejonizowanej wody na uchwyt i natychmiast dociskając osadzoną tkankę do kropli.Po zamrożeniu pipety więcej dejonizowanej wody wokół tkanki, aby jeszcze bardziej przymocować ją do uchwytu. Przekrój tkankę na przybliżoną grubość jednej komórki. Zamontuj kciukiem każdą sekcję na szkiełku pokrytym tlenkiem indu i cyny, umieszczając jedną stronę szkiełka w pobliżu sekcji i kładąc palec po drugiej stronie szkiełka, aby powoli ogrzać szkło i pozwolić, aby sekcja przykleiła się do szkiełka.Eksport De Novo tylko peptydy. CSV ze szczytów ze średnim lokalnym współczynnikiem ufności większym lub równym 75. Przeszukaj listę peptydów pod kątem znanych motywów sekwencji wskazujących na neuropeptydy należące do określonych rodzin neuropeptydów.Wybierz znaną sekwencję aminokwasów hormonu pre-pro, która Cię interesuje, i użyj TB blast N, aby wyszukać sekwencję hormonów pre-pro w bazie danych. Wybierz organizm docelowy i zmień parametry algorytmu progu oczekiwania na 1000, aby uwzględnić dopasowania do niskiego wyniku. Uruchom program blast, a następnie sprawdź wyniki pod kątem wysokich wyników homologii między sekwencjami zapytań i tematów, co daje znaczące wyrównania.Zapisz plik FASTA zawierający sekwencję nukleotydów. Przetłumacz sekwencję nukleotydów hormonu pre-pro na sekwencje peptydów hormonalnych pre-pro za pomocą narzędzia do tłumaczenia Expasy. W przypadku callinectes sapidus wybierz mitochondria bezkręgowców do kodu genetycznego i uruchom narzędzie.Sprawdź sekwencję peptydów sygnałowych i miejsca rozszczepienia prohormonów w sekwencjach peptydowych za pomocą sygnału P. Jest to widmo fragmentacji neuropeptydu zidentyfikowane ze 100% pokryciem sekwencji przy niskim błędzie masy fragmentu z maksymalnym limitem 0,02 daltona. Oto widmo neuropeptydu również zidentyfikowanego ze 100% pokryciem sekwencji, ale z niską liczbą jonów fragmentacyjnych, dlatego pewność identyfikacji jest niska. Są to wyekstrahowane chromatogramy jonowe dla pojedynczego neuropeptydu, który został zidentyfikowany w dwóch oddzielnych i następujących po sobie seriach.Mimo że czas retencji różni się nieznacznie, nadal można go wykorzystać do oznaczania ilościowego bez etykiet, ponieważ przesunięcie w czasie jest mniejsze niż jedna minuta. Jest to przykład pełnego spektrum masowego skanowania zawierającego neuropeptyd, który został znakowany dimetylem, co spowodowało przesunięcie masy o 4,025 daltona między lekką i ciężką formą neuropeptydu. Widmo masowe jonów fragmentacyjnych peptydu zsekwencjonowanego De Novo wykazuje dobre pokrycie fragmentacji, w którym zaobserwowano jon fragmentu B i / lub Y dla każdego aminokwasu z niskim błędem masy wynoszącym 0,02 daltona.Wskazuje to, że zaobserwowano endogenny peptyd należący do rodziny neuropeptydów RYMI skorupiaków. Przykłady dobrych miejsc, które stykają się ze wszystkimi krawędziami grawerunku studni, pokazano po lewej stronie. Przykłady złych miejsc są pokazane po prawej stronie.Po obrazowaniu MALDI MS neuropeptydów z tkanek callinectes sapidus uzyskano obrazy rozkładu jonów o różnych wartościach M i Z odpowiadających różnym neuropeptydom. Optymalizacja rozpuszczalnika ekstrakcyjnego dla konkretnego rodzaju analizy ma kluczowe znaczenie. Upewnij się również, że następuje pełna homogenizacja i dostosuj metodę w razie potrzeby.Nic nie zostanie wykryte dalej, jeśli nie zostanie wyodrębnione. Technika ta może dostarczyć fundamentalnej listy ważnych neuropeptydów, które mogą być dalej badane jako potencjalne biomarkery, a także dostarczyć informacji o nieukierunkowanej lokalizacji bez konieczności stosowania przeciwciał.

multi-faceted-mass-spectrometric-investigation-neuropeptides

Research

JoVE Journal

Chemistry

Chemia

Związki wychwytujące (Capture Compounds) to trifunkcyjne małe cząsteczki służące do redukcji złożoności proteomu poprzez funkcjonalną, odwracalną oddziaływanie małej cząsteczki z białkiem, a następnie fotousieciowanie i oczyszczanie. W niniejszej procedurze wykorzystujemy związek wychwytujący z funkcją selektywności wiązania S-adenozylo-L-homocysteiny w celu wyizolowaniay metylotransferaz z lizatu całych komórek Escherichia coli oraz ich identyfikacji metodą MS.

Profilowanie metylotransferaz i innych białek wiążących S-adenozylo- L-homocysteinę za pomocą spektrometrii mas z wykorzystaniem związków wychwytujących (CCMS)

Farmakoterapia polegająca na zastępowaniu dopaminy za pomocą L-DOPA jest najczęściej stosowanym leczeniem objawowym choroby Parkinsona, jednak wiąże się z efektami ubocznymi, w tym z mimowolnymi, nieprawidłowymi ruchami, określanymi mianem dyskinezy 1. W niniejszym materiale przedstawiono protokół obrazowania metodą spektrometrii mas MALDI, który pozwala wykryć zmiany w poziomach neuropeptydów w mózgu szczura związane z dyskinezą.

Obrazowanie spektrometrią mas MALDI neuropeptydów w chorobie Parkinsona

Źródło: Wulf, M., et.al.  Protokół oparty na mikrodysekcji laserowej do analizy LC-MS/MS profilu proteomicznego granulek neuromelaniny. J. Vis. Exp. (2021). Ten film przedstawia analizę próbek peptydów z granulek neuromelaniny (NMG) wyizolowanych z ludzkiej pośmiertnej tkanki mózgowej. Peptydy są najpierw rozdzielane za pomocą wysokosprawnej chromatografii cieczowej (HPLC), a następnie analizowane za pomocą spektrometrii mas w celu określenia ich stosunku masy do ładunku (m / z). Docelowe...

Analiza LC-MS/MS profilu proteomicznego granulek neuromelaniny wyizolowanych z ludzkiej tkanki mózgowej

Bakteryjna ściana komórkowa składa się z peptydoglikanu, makromolekularnej sieci nici cukrowych połączonych peptydami. Ultrasprawna chromatografia cieczowa zapewnia wysoką rozdzielczość i przepustowość dla nowatorskich odkryć składu peptydoglikanu. Przedstawiamy procedurę izolacji ścian komórkowych (woreczków) i ich późniejszego przygotowania do analizy za pomocą UPLC.

Izolacja i przygotowanie ścian komórkowych bakterii do analizy składu metodą ultra sprawnej chromatografii cieczowej

Obrazowanie metodą spektrometrii mas (MSI) to potężne narzędzie, które może być używane do odkrywania i identyfikowania różnych związków chemicznych w nienaruszonych tkankach, zachowując związki w ich naturalnym środowisku, co może dostarczyć nowych informacji na temat procesów biologicznych. W niniejszym artykule opisano metodę MSI opracowaną do analizy małych cząsteczek.

Obrazowanie metodą spektrometrii mas MALDI, do badania metabolitów w guzkach korzeniowych Medicago truncatula

Przedstawiono metodę analizy spektrometrycznej endogennych peptydów w ludzkim płynie mózgowo-rdzeniowym (CSF). Dzięki zastosowaniu filtracji odcięcia masy cząsteczkowej, wstępnego frakcjonowania chromatograficznego, analizy spektrometrii mas i późniejszej kombinacji strategii identyfikacji peptydów, możliwe było prawie dziesięciokrotne rozszerzenie znanego peptydomu płynu mózgowo-rdzeniowego w porównaniu z poprzednimi badaniami.

Przygotowanie próbki do analizy endopeptydomicznej w ludzkim płynie mózgowo-rdzeniowym

Spektrometria mas w sprayu z liści to technika bezpośredniej analizy chemicznej, która minimalizuje przygotowanie próbki i eliminuje chromatografię, pozwalając na szybkie wykrywanie małych cząsteczek z tkanek roślinnych.

Spektrometria mas oprysków liściowych: technika szybkiej jonizacji otoczenia do bezpośredniej oceny metabolitów z tkanek roślinnych

Ten protokół obejmuje szczegółową analizę składu peptydoglikanu za pomocą chromatografii cieczowej, spektrometrii mas w połączeniu z zaawansowanym oprogramowaniem do ekstrakcji cech i analizy bioinformatycznej.

Półilościowa analiza peptydoglikanu za pomocą chromatografii cieczowej, spektrometrii mas i bioinformatyki

Tutaj opisujemy opartą na spektrometrii mas proteomiczną charakterystykę linii komórkowych ze znanymi losami tkanek u zarodka kręgowca Xenopus laevis.

Proteomika spektrometrii mas sterowana linią komórkową w rozwijającym się zarodku (żaby)

Modyfikacje potranslacyjne (PTM) zmieniają struktury i funkcje białek. Metody jednoczesnego wzbogacania wielu typów PTM mogą maksymalizować pokrycie w analizach. Przedstawiamy protokół wykorzystujący dwufunkcyjną chromatografię powinowactwa do metali immobilizowaną Ti(IV), a następnie spektrometrię mas do jednoczesnego wzbogacania i analizy N-glikozylacji i fosforylacji białek w tkankach trzustki.

Strategia wzbogacania spin-tip do jednoczesnej analizy N-glikopeptydów i fosfopeptydów z ludzkich tkanek trzustki

Poznaj metody spektrometrii mas do analizy neuropeptydów u Callinectes sapidus. Odkryj techniki ekstrakcji, kwantyfikacji i lokalizacji, które wspierają badania nad biomarkerami i terapiami peptydowymi.

Wieloaspektowe badania neuropeptydów metodą spektrometrii mas u Callinectes sapidus

Przeglądaj więcej filmów