Podłużna mikroskopia przyżyciowa z wykorzystaniem okienka do obrazowania sutkowego z wymienną pokrywą

Gruczoł sutkowy jest bardzo dynamiczny i przechodzi wiele rund przebudowy w ciągu życia. Nasz protokół pozwala uchwycić dynamikę komórkową napędzającą rearanżacje tkanek w zdrowym i chorym gruczole sutkowym. Nasze okienko do obrazowania sutka z wymienną pokrywą umożliwia wykonywanie podłużnych obrazowań przyżyciowych gruczołu sutkowego przez długi okres czasu, do kilku tygodni.

Wymienna pokrywa okienka obrazowania sutka zapewnia optymalne warunki obrazowania przez cały czas i umożliwia manipulację tkankami lub podawanie leków między sesjami obrazowania. Nasza metoda nie tylko zapewnia wgląd w biologię zdrowego gruczołu sutkowego, ale także pozwala nam badać inicjację i progresję guza sutka na poziomie pojedynczej komórki. Zacznij od umieszczenia pokrywy okienka do obrazowania sutka na sterylnej powierzchni i nałożenia kleju klejowego z cyjanoakrylanu na całym obwodzie pokrywy obręczy.

Ostrożnie umieść 10-milimetrową okrągłą szklaną szkiełko nakrywkowe na pokrywie. Użyj sterylnego drewnianego patyczka, aby ustawić szklane szkiełko nakrywkowe i przyłóż pewną siłę, aby go docisnąć, aby zapewnić hermetyczne uszczelnienie między szkiełkiem nakrywkowym a ramą pokrywy. Upewnij się, że szkło nie zakrywa otworów w ramionach pokrywy.

Zdezynfekować powieki i okienko do obrazowania ssaka, zanurzając je w 80% etanolu na co najmniej 30 minut na zamkniętej szalce Petriego. Użyj bawełnianej końcówki nasączonej acetonem, aby usunąć nadmiar kleju cyjanoakrylowego z szkiełka nakrywkowego. Aby przygotować mysz do operacji, ogol obszar wokół czwartego gruczołu sutkowego za pomocą żyletki.

Użyj czwartego sutka jako punktu orientacyjnego i usuń luźne włoski za pomocą taśmy klejącej. Wykonaj test wycofania łapy, aby sprawdzić, czy zwierzę jest odpowiednio znieczulone. Delikatnie unieś skórę za pomocą cienkich kleszczyków Graefe i użyj małych nożyczek sprężynowych, aby wykonać 10-15-milimetrowe nacięcie po przekątnej skóry na czwartej poduszce tłuszczowej sutka Użyj czwartego sutka jako punktu orientacyjnego i upewnij się, że nie przecięłeś ani nie uszkodziłeś otrzewnej ani gruczołu sutkowego.

Oddziel skórę od poduszeczki tłuszczowej sutka i leżących pod nią warstw tkanki, wykonując rozwarstwienie o długości do pięciu do ośmiu milimetrów wokół linii nacięcia, aby utworzyć kieszeń pasującą do ramy okienka obrazowania sutka. Zdefiniuj obszar zainteresowania lub ROI na podstawie makroskopowych cech tkanki sutkowej, w tym lokalizacji węzła chłonnego lub zmiany nowotworowej. Staraj się, aby ROI był centralny w odniesieniu do nacięcia.

Podnieś okienko obrazowania sutka za pomocą sterylnych kleszczy i sprawdź, czy nacięcie jest wystarczająco duże, aby wprowadzić okienko. W razie potrzeby nieznacznie powiększ nacięcie, aż okienko obrazowania sutka będzie pasować. Usuń okienko i użyj jedwabnego szwu 5-0, aby umieścić szew sznurkowy w torebce w odległości od jednego do dwóch milimetrów od krawędzi nacięcia, zaczynając od końca ogonowego i od zewnątrz do wnętrza skóry.

Przesuń się około pięciu milimetrów w górę wzdłuż nacięcia i przełóż nić szwu przez skórę od wewnątrz na zewnątrz. Powtórz tę procedurę wzdłuż krawędzi nacięcia, tworząc w ten sposób okrągły szew składający się z pięciu do sześciu pętli. Końcowe wyjście nici do szwu powinno znajdować się w odległości około dwóch do pięciu milimetrów od pierwszego wejścia.

Dopasuj okienko do obrazowania sutka wewnątrz nacięcia i użyj kleszczyków Graefe, aby ostrożnie umieścić skórę w rowku okienka. Upewnij się, że pętle szwu zostały pozostawione na zewnątrz. Pociągnij za pętle szwu sznurkowego torebki i delikatnie pociągnij oba końce szwu, aby zacisnąć go w rowku okienka obrazowania sutka.

Zawiąż węzłami chirurgicznymi i odetnij nadmiar nici. Użyj wykałaczki, aby nałożyć wazelinę na wewnętrzną krawędź okna, omijając tkankę znajdującą się pod spodem. Delikatnie popchnij ramę okienną w dół za pomocą sterylnych kleszczyków i umieść pokrywę w ramie okiennej.

Pozwoli to uniknąć przepływu powietrza między tkanką gruczołu piersiowego a pokrywą okienka do obrazowania sutka. Umieść końcówki cienkich kleszczy przez otwory w ramionach pokrywki i dokręć pokrywkę, przekręcając ją zgodnie z ruchem wskazówek zegara. Jeśli po dokręceniu pokrywki pozostanie trochę powietrza, wprowadzić sterylną igłę insulinową przez skórę do jamy między tkanką sutkową a pokrywką i powoli wyciągnąć tłok, tworząc w ten sposób podciśnienie między tkanką gruczołu piersiowego a pokrywą okienka do obrazowania sutka.

Teraz po tej procedurze można łatwo zaobserwować węzeł chłonny. Sprawdź stan ramy okienka do obrazowania sutka i pokrywy, w tym stabilność szwów lub ewentualne uszkodzenia powieki. Umieść mysz na wkładce w taki sposób, aby okienko do obrazowania sutka wpadło w otwór we wkładce pudełka do obrazowania.

Nałóż półprzezroczystą i papierową taśmę na grzbiet myszy, aby ustabilizować mysz i zmniejszyć ruch tkanek spowodowany oddychaniem. W przypadku sesji obrazowania trwających dłużej niż trzy godziny umieść elastyczną igłę podskórnie w szyi myszy i zabezpiecz ją taśmą papierową. Podłącz 10-milimetrową strzykawkę z mieszanką składników odżywczych do elastycznej silikonowej rurki i wciskaj mieszankę składników odżywczych, aż dotrze do końca tubki.

Podłącz silikonową rurkę do elastycznej igły i wstrzykuj 50 mikrolitrów roztworu w infuzji co 30 minut. Umieść pokrywę nad pudełkiem do obrazowania, aby je zamknąć. Następnie zabezpiecz pudełko obrazowania w stoliku mikroskopu.

Sprawdź, czy mysz jest stabilnie osadzona w polu obrazowania. Zdefiniuj obszar zainteresowania za pomocą trybu epifluorescencji mikroskopu i zastosuj ustawienia mikroskopu. Użyj funkcji Spirala w trybie nawigatora oprogramowania do obrazowania, aby wygenerować duży skan kafelka przeglądowego i utworzyć mapę referencyjną tkanki.

Zdefiniuj obszar zainteresowania w przeglądzie krzywej przejściowej, a następnie zdefiniuj górną i dolną płaszczyznę Z, aby określić stos Z. Naciśnij Start, aby uzyskać szczegółowe trójwymiarowe lub czterowymiarowe stosy Z tkanki. Umieść końcówki cienkich kleszczyków przez otwory okienka obrazowania sutka w ramionach pokrywy i poluzuj pokrywkę, przekręcając ją w kierunku przeciwnym do ruchu wskazówek zegara.

Alternatywnie, tkanka może być manipulowana lub repozycjonowana za pomocą sterylnych kleszczy, aby zoptymalizować warunki obrazowania dla określonego obszaru zainteresowania. Nałóż wazelinę na wewnętrzną krawędź okienka obrazowania sutka, omijając tkankę znajdującą się pod spodem. Delikatnie popchnij ramę okienną w dół za pomocą sterylnych kleszczyków i umieść pokrywę w ramie okiennej.

Na koniec umieść końcówki cienkich kleszczyków w otworach w ramionach pokrywy i rozjaśnij pokrywkę, przekręcając ją zgodnie z ruchem wskazówek zegara. Dojrzewanie Rosa26 Cre / ERT2 Myszom GFP z błoną pomidorową Rosa26 wstrzyknięto niską dawkę tamoksyfenu, co doprowadziło do rekombinacji allelu GFP błony pomidorowej Rosa26 za pośrednictwem Cre. Myszy były obrazowane w pierwszym, trzecim i piątym dniu, aby śledzić dynamiczne zmiany w rozwijającym się gruczole sutkowym.

Reprezentatywne obrazy pokazują renderowanie 3D wydłużonego i rozgałęziającego się przewodu sutkowego przez wiele dni, zobrazowane przez okno obrazowania sutka. W tym miejscu pokazane są pojedyncze obrazy w płaszczyźnie Z rozgałęzionej końcówki i wydłużającej się gałęzi. Pojedyncze komórki w zrębie są wyróżnione białymi gwiazdkami.

Reprezentatywne obrazy pokazują pachwinowy węzeł chłonny myszy zobrazowany przez okienko obrazowania sutka. Druga generacja harmoniczna jest przedstawiona na zielono. Pokazano tutaj renderowane w 3D obrazy struktury przewodowej sutka dorosłej samicy myszy CFP z membraną E-kadheryny przez wiele kolejnych dni.

Wzór kolagenu I został użyty do odtworzenia tego samego ROI, a sygnał CFP membrany E-kadheryny został wykorzystany do oznaczenia komórek przewodowych. Zielono-czerwone myszy Kikume sfotografowano w dniu zero, przed i po ekspozycji na światło fioletowe. Sesje obrazowania powtarzano w drugim, szóstym i dziesiątym dniu po konwersji.

Ten sam obszar gruczołu sutkowego był obrazowany przez okienko obrazowania sutka przez 10 dni. Mniejsze obszary zostały poddane fotokonwersji w dniu zero i wykazały podobny stopień rozcieńczenia czerwonego sygnału Kikume w czasie, co wskazuje na równe tempo rotacji w całym nabłonku. Powiększone obrazy wskazanych regionów pokazują heterogeniczność proliferacyjną na poziomie komórkowym sześć i 10 dni po fotokonwersji.

Kwantyfikacja stosunku czerwieni do zieleni różnych komórek 10 dni po fotokonwersji ujawniła bardzo zmienne szybkości rozcieńczania niektórych komórek w tym samym mikrośrodowisku przewodowym. Kluczowym etapem tej procedury jest otwarcie pokrywy pomiędzy sesjami obrazowania. Ta unikalna cecha okienka poprawia warunki obrazowania i pozwala na obrazowanie podłużne tkanki.

Okienko do obrazowania sutka z wymienną pokrywą ułatwi zadawanie nowych pytań dotyczących in vivo, szybko działających testów leków i badań przesiewowych w dziedzinie inicjacji i progresji guza w mysim gruczole sutkowym.