Name: Podłużna mikroskopia przyżyciowa z wykorzystaniem okienka do obrazowania sutkowego z wymienną pokrywą (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-01-20T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 53 s
Description: Poznaj metodę podłużnej mikroskopii przyżyciowej gruczołu sutkowego z wymienną pokrywą okienka obrazującego. Technika umożliwia obserwację dynamiki komórkowej i przebudowy tkanek na poziomie pojedynczych komórek u myszy.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez Fundację Badawczą Flandrii (grant doktorski na badania podstawowe 11L7222N dla M.C.), Fundację Boehringer Ingelheim (stypendium doktoranckie dla C.L.G.J.S.), stypendium podoktorskie EMBO (grant ALTF 1035-2020 dla C.L.G.J.S.) oraz Nagrodę Doktora Josefa Steinera (dla J.v.R.).

<ol><li>Watson, C. J., Khaled, W. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mammary+development+in+the+embryo+and+adult%3A+new+insights+into+the+journey+of+morphogenesis+and+commitment%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Mammary development in the embryo and adult: new insights into the journey of morphogenesis and commitment.</a> Development. 147 (22), Cambridge, England. (2020).</li>
<li>Messal, H. A., van Rheenen, J., Scheele, C. L. G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+Intravital+Microscopy+Toolbox+to+Study+Mammary+Gland+Dynamics+from+Cellular+Level+to+Organ+Scale%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Mammary+Gland+Biology+and+Neoplasia%22%5BJournal%5D)">An Intravital Microscopy Toolbox to Study Mammary Gland Dynamics from Cellular Level to Organ Scale.</a> Journal of Mammary Gland Biology and Neoplasia. 26 (1), 9-27 (2021).</li>
<li>Kedrin, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intravital+imaging+of+metastatic+behavior+through+a+mammary+imaging+window%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Intravital imaging of metastatic behavior through a mammary imaging window.</a> Nature Methods. 5 (12), 1019-1021 (2008).</li>
<li>Dawson, C. A., Mueller, S. N., Lindeman, G. J., Rios, A. C., Visvader, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intravital+microscopy+of+dynamic+single-cell+behavior+in+mouse+mammary+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Intravital microscopy of dynamic single-cell behavior in mouse mammary tissue.</a> Nature Protocols. 16 (4), 1907-1935 (2021).</li>
<li>Scheele, C. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identity+and+dynamics+of+mammary+stem+cells+during+branching+morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Identity and dynamics of mammary stem cells during branching morphogenesis.</a> Nature. 542 (7641), 313-317 (2017).</li>
<li>Kotsuma, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nondestructive%2C+serial+in+vivo+imaging+of+a+tissue-flap+using+a+tissue+adhesion+barrier%5BTitle%5D)+AND+%22IntraVital%22%5BJournal%5D)">Nondestructive, serial in vivo imaging of a tissue-flap using a tissue adhesion barrier.</a> IntraVital. 1 (1), 69-76 (2012).</li>
<li>Ingman, W. V., Wyckoff, J., Gouon-Evans, V., Condeelis, J., Pollard, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macrophages+promote+collagen+fibrillogenesis+around+terminal+end+buds+of+the+developing+mammary+gland%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Dynamics%3A+an+official+publication+of+the+American+Association+of+Anatomists%22%5BJournal%5D)">Macrophages promote collagen fibrillogenesis around terminal end buds of the developing mammary gland.</a> Developmental Dynamics: an official publication of the American Association of Anatomists. 235 (12), 3222-3229 (2006).</li>
<li>Entenberg, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((large-volume%2C+high-resolution+intravital+imaging+for+tissue-wide+analysis+of+single+cell+dynamics%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+%28San+Diego%2C+Calif%29%22%5BJournal%5D)">large-volume, high-resolution intravital imaging for tissue-wide analysis of single cell dynamics.</a> Methods (San Diego, Calif). 128, 65-77 (2017).</li>
<li>Masedunskas, A., Weigert, R., Mather, I. H. Intravital Imaging of the Lactating Mammary Gland in Transgenic Mice Expressing Fluorescent Proteins. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aMasedunskas%2C+A+%22Advances+in+Intravital+Microscopy%22">Advances in Intravital Microscopy</a>. , Springer. Netherlands. 187-204 (2014).</li>
<li>Masedunskas, A., Chen, Y., Stussman, R., Weigert, R., Mather, I. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kinetics+of+milk+lipid+droplet+transport%2C+growth%2C+and+secretion+revealed+by+intravital+imaging%3A+lipid+droplet+release+is+intermittently+stimulated+by+oxytocin%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Biology+of+the+Cell%22%5BJournal%5D)">Kinetics of milk lipid droplet transport, growth, and secretion revealed by intravital imaging: lipid droplet release is intermittently stimulated by oxytocin.</a> Molecular Biology of the Cell. 28 (7), 935-946 (2017).</li>
<li>Mather, I. H., Masedunskas, A., Chen, Y., Weigert, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Symposium+review%3A+Intravital+imaging+of+the+lactating+mammary+gland+in+live+mice+reveals+novel+aspects+of+milk-lipid+secretion%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Dairy+Science%22%5BJournal%5D)">Symposium review: Intravital imaging of the lactating mammary gland in live mice reveals novel aspects of milk-lipid secretion.</a> Journal of Dairy Science. 102 (3), 2760-2782 (2019).</li>
<li>Stevenson, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiscale+imaging+of+basal+cell+dynamics+in+the+functionally+mature+mammary+gland%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Multiscale imaging of basal cell dynamics in the functionally mature mammary gland.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 117 (43), 26822-26832 (2020).</li>
<li>Ewald, A. J., Werb, Z., Egeblad, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+Mice+for+Long-Term+Intravital+Imaging+of+the+Mammary+Gland%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Protocols%22%5BJournal%5D)">Preparation of Mice for Long-Term Intravital Imaging of the Mammary Gland.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2011 (2), 5562(2011).</li>
<li>Ewald, A. J., Werb, Z., Egeblad, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monitoring+of+Vital+Signs+for+Long-Term+Survival+of+Mice+under+Anesthesia%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Protocols%22%5BJournal%5D)">Monitoring of Vital Signs for Long-Term Survival of Mice under Anesthesia.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2011 (2), 5563(2011).</li>
<li>Harney, A. S., Wang, Y., Condeelis, J. S., Entenberg, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extended+Time-lapse+Intravital+Imaging+of+Real-time+Multicellular+Dynamics+in+the+Tumor+Microenvironment%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Extended Time-lapse Intravital Imaging of Real-time Multicellular Dynamics in the Tumor Microenvironment.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (112), e54042(2016).</li>
<li>Harper, K. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanism+of+early+dissemination+and+metastasis+in+Her2%2B+mammary+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Mechanism of early dissemination and metastasis in Her2+ mammary cancer.</a> Nature. 540 (7634), 588-592 (2016).</li>
<li>Sobolik, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+novel+murine+mammary+imaging+windows+to+examine+wound+healing+effects+on+leukocyte+trafficking+in+mammary+tumors+with+intravital+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22IntraVital%22%5BJournal%5D)">Development of novel murine mammary imaging windows to examine wound healing effects on leukocyte trafficking in mammary tumors with intravital imaging.</a> IntraVital. 5 (1), 1125562(2016).</li>
<li>Shan, S., Sorg, B., Dewhirst, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+rodent+mammary+window+of+orthotopic+breast+cancer+for+intravital+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Microvascular+Research%22%5BJournal%5D)">A novel rodent mammary window of orthotopic breast cancer for intravital microscopy.</a> Microvascular Research. 65 (2), 109-117 (2003).</li>
<li>Zomer, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intravital+imaging+of+cancer+stem+cell+plasticity+in+mammary+tumors%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Intravital imaging of cancer stem cell plasticity in mammary tumors.</a> Stem Cells. 31 (3), 602-606 (2013).</li>
<li>Jacquemin, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Longitudinal+high-resolution+imaging+through+a+flexible+intravital+imaging+window%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Advances%22%5BJournal%5D)">Longitudinal high-resolution imaging through a flexible intravital imaging window.</a> Science Advances. 7 (25), (2021).</li>
<li>Niinomi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+research+and+development+in+titanium+alloys+for+biomedical+applications+and+healthcare+goods%5BTitle%5D)+AND+%22Science+and+Technology+of+Advanced+Materials%22%5BJournal%5D)">Recent research and development in titanium alloys for biomedical applications and healthcare goods.</a> Science and Technology of Advanced Materials. 4 (5), 445-454 (2003).</li>
<li>Ritsma, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Surgical+implantation+of+an+abdominal+imaging+window+for+intravital+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Surgical implantation of an abdominal imaging window for intravital microscopy.</a> Nature Protocols. 8 (3), 583-594 (2013).</li>
<li>Muzumdar, M. D., Tasic, B., Miyamichi, K., Li, N., Luo, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+global+double-fluorescent+cre+reporter+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Genesis%22%5BJournal%5D)">A global double-fluorescent cre reporter mouse.</a> Genesis. 45 (9), New York, N.Y. 593-605 (2007).</li>
<li>Snippert, H. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intestinal+Crypt+Homeostasis+Results+from+Neutral+Competition+between+Symmetrically+Dividing+Lgr5+Stem+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Intestinal Crypt Homeostasis Results from Neutral Competition between Symmetrically Dividing Lgr5 Stem Cells.</a> Cell. 143 (1), 134-144 (2010).</li>
<li>Nowotschin, S., Hadjantonakis, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+KikGR+a+photoconvertible+green-to-red+fluorescent+protein+for+cell+labeling+and+lineage+analysis+in+ES+cells+and+mouse+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Use of KikGR a photoconvertible green-to-red fluorescent protein for cell labeling and lineage analysis in ES cells and mouse embryos.</a> BMC Developmental Biology. 9, 49(2009).</li>
<li>Kurotaki, Y., Hatta, K., Nakao, K., Nabeshima, Y. I., Fujimori, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blastocyst+Axis+Is+Specified+Independently+of+Early+Cell+Lineage+But+Aligns+with+the+ZP+Shape%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Blastocyst Axis Is Specified Independently of Early Cell Lineage But Aligns with the ZP Shape.</a> Science. 316 (5825), New York, N.Y. 719-723 (2007).</li>
<li>Heo, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+soft%2C+transparent%2C+freely+accessible+cranial+window+for+chronic+imaging+and+electrophysiology%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">A soft, transparent, freely accessible cranial window for chronic imaging and electrophysiology.</a> Scientific Reports. 6, 27818(2016).</li>
<li>Warren, S. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Removing+physiological+motion+from+Intravital+and+clinical+functional+imaging+data%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Removing physiological motion from Intravital and clinical functional imaging data.</a> eLife. 7, 35800(2018).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia

R.MIW umożliwia obrazowanie podłużne zdrowego i chorego gruczołu sutkowego w jego naturalnym i minimalnie zakłóconym środowisku oraz umożliwia wielokrotną wizualizację gruczołu sutkowego na różnych etapach rozwoju. Konstrukcja R.MIW pozwala na otwarcie okna w dowolnym momencie eksperymentu. Długotrwały dostęp wzrokowy do tkanki będącej przedmiotem zainteresowania może być utrudniony, na przykład przez gromadzenie się resztek komórkowych na szkiełku nakrywkowym. W takich przypadkach R.MIW można otworzyć przed lub bezpośrednio po sesji obrazowania, aby umożliwić oczyszczenie całego widocznego obszaru tkanki i pokrywy. Zdejmowana pokrywa umożliwia również manipulacje tkanką, a także miejscowe nakładanie substancji, takich jak określone inhibitory i terapie, barwniki znakujące lub określone typy komórek będących przedmiotem zainteresowania.
Metoda ta przezwycięża ograniczenia wcześniej opisanych procedur płata sutka 4,7,8,13, które są ograniczone do jednej sesji obrazowania i mogą wizualizować procesy, takie jak rozgałęziona morfogeneza (ryc. 5), homeostatyczny obrót tkankowy (ryc. 6) lub wzrost guza na poziomie komórkowym (ryc. 3B). Jednocześnie jednak R.MIW umożliwia miejscową manipulację tkanką pomiędzy sesjami obrazowania, co stanowi wielką zaletę R.MIW w porównaniu z wcześniej opublikowanym MIW 3,18 i wszystkimi innymi oknami obrazowania20,22. Podczas otwierania R.MIW ważne jest, aby przez cały czas utrzymywać warunki aseptyki, aby zapobiec jakiemukolwiek źródłu infekcji. Możliwość otwarcia R.MIW w aseptycznym środowisku pozwala na optymalizację warunków obrazowania przed każdą sesją obrazowania, co znacznie poprawia długoterminowy dostęp wzrokowy do tkanki będącej przedmiotem zainteresowania. W szczególności w gruczole sutkowym, który jest osadzony w zrębie bogatym w adipocyty, ma to wielką wartość. Co więcej, wymienna pokrywa może w unikalny sposób umożliwić miejscowe podawanie środków terapeutycznych, różnych typów komórek, barwników znakujących, mikrodysekcji sterowanej obrazem lub jakiejkolwiek innej lokalnej manipulacji tkanką bez konieczności przerywania eksperymentu IVM. Na przykład, aby zbadać inicjację guza, określone populacje komórek rakowych można wstrzyknąć bezpośrednio do drzewa przewodowego lub zrębu w określonym punkcie czasowym IVM i dokładnej lokalizacji gruczołu sutkowego, o ile ten zwrot z inwestycji jest dostępny przez pierścień R.MIW. Aby zbadać progresję guza, określone populacje komórek nowotworowych (w określonym miejscu, w określonym mikrośrodowisku lub o określonym zachowaniu) mogą być oznaczone zdjęciem podczas sesji IVM, a następnie poddane mikrosekcji za pomocą fluorescencyjnego mikroskopu preparacyjnego po otwarciu R.MIW. Wyizolowane komórki mogą być dalej przetwarzane do dalszych analiz, takich jak sekwencjonowanie mRNA (pojedynczych komórek). Stosując to podejście, można połączyć zachowanie komórek in vivo z profilami ekspresji molekularnej. Zaletą miejscowego podawania leków przez R.MIW jest możliwość obrazowania tkanki przed i bezpośrednio po zabiegu. Interwał potrzebny do wyjęcia myszy z pudełka do obrazowania, a następnie do wykonania miejscowego podania leku po otwarciu pokrywy R.MIW można wykonać w ciągu kilku minut, co pozwala na natychmiastowe wychwycenie fazy szybko działających leków.
Pokazujemy, że IVM gruczołu sutkowego za pośrednictwem R.MIW jest kompatybilny z wieloma różnymi fluorescencyjnymi modelami myszy reporterowych. Środowisko bogate w tłuszcz jest trudne do zobrazowania, dlatego zaleca się stosowanie jasnych fluoroforów. Jednak, jak pokazano tutaj, nawet mniej jasne fluorofory, takie jak mCFP, mogą być wizualizowane przez R.MIW w optymalnych warunkach obrazowania. Nieuchronnie poduszeczka tłuszczowa uniemożliwi obrazowanie głębszych struktur przewodowych i ograniczy obrazowanie do bardziej powierzchownych przewodów. Obraz poglądowy o niskiej rozdzielczości na początku każdego eksperymentu IVM pomoże zidentyfikować interesujące struktury przewodowe, które są wystarczająco powierzchowne do obrazowania w wysokiej rozdzielczości. Miejscowa manipulacja tkanką, usunięcie tkanki łącznej lub repozycja tkanki tłuszczowej po otwarciu R.MIW może zoptymalizować IVM pod kątem określonych zwrotów z inwestycji, które są nakładane przez tkankę tłuszczową. Jest to ważna zaleta w stosunku do wszystkich poprzednich konstrukcji okien, które nie pozwalają na wykonywanie tych manipulacji i wymagałyby całkowitego usunięcia samego okna. W szczególności w celu wizualizacji pachwinowego węzła chłonnego zaleca się delikatne usunięcie leżącej nad nim tkanki tłuszczowej, co zmniejsza rozpraszanie światła i umożliwia obrazowanie w wysokiej rozdzielczości. Podczas manipulowania tkanką należy zawsze zachowywać warunki aseptyczne i zapobiegać krwawieniu lub poważnemu uszkodzeniu tkanki, ponieważ mogą one wpływać na procesy badane podczas eksperymentu IVM.
R.MIW jest wykonany z tytanu, materiału, który jest powszechnie stosowany w praktyce klinicznej do zastępowania tkanek twardych, takich jak stawy lub płytki kostne. Tytan ma kilka zalet w porównaniu z oknami stalowymi, w tym lekkość i obojętność21. Ostatnio wykorzystano kilka innych materiałów do wygenerowania nowatorskich typów okien obrazowania, w tym elastycznego okna krzemowego20. W przeciwieństwie do R.MIW, elastyczne okienko nie wymaga żadnych szwów do implantacji i nadaje się do prawie każdej pozycji anatomicznej, szczególnie w przypadku tkanek miękkich i delikatnych. Okna silikonowe mają minimalny wpływ na ruchliwość zwierząt ze względu na ich lekką i odkształcalną naturę i być może bardziej nadają się do eksperymentów badających szybką ekspansję i wzrost tkanek20. Kolejną zaletą w stosunku do wersji tytanowej jest to, że okienka krzemowe są kompatybilne z innymi metodami obrazowania, w tym z rezonansem magnetycznym20,27. Należy jednak pamiętać, że obiektywy są zoptymalizowane pod kątem szkiełek nakrywkowych o grubości 0,17 mm. Ponadto tkanka sutka jest podatna na ruchy oddechowe, które trudno ograniczyć za pomocą elastycznego okienka, zwłaszcza podczas korzystania z mikroskopu odwróconego. Artefakty oddychania są zminimalizowane dzięki konstrukcji R.MIW i zamocowaniu R.MIW we wkładce pudełka do obrazowania. W rezultacie obrazy uzyskane przy użyciu proponowanej konfiguracji R.MIW nie są zniekształcone z powodu artefaktów oddychania. Mogą jednak wystąpić niewielkie odchylenia w lokalizacji tkanki, które zwykle są stopniowe i można je skorygować za pomocą oprogramowania do korekcji ruchu po akwizycji28. Wraz z rosnącym zestawem narzędzi technologii IVM 2,20, szczegółowe wymagania dla każdego eksperymentu ostatecznie określą najlepszy sposób wizualizacji in vivo tkanki będącej przedmiotem zainteresowania. Różne konstrukcje okien mają różne zalety i wady i w zależności od pytania badawczego, dostępnej konfiguracji mikroskopowej, wymaganej rozdzielczości przestrzennej i czasowej oraz całkowitej długości badanego procesu, należy określić optymalne podejście.
Podsumowując, R.MIW ułatwia charakterystykę dynamiki komórkowej w wysokiej rozdzielczości podczas rozwoju gruczołu sutkowego, homeostazy i choroby w ciągu wielu dni do tygodni.

Nabłonek gruczołu mlekowego jest unikalnym organem wydzielniczym występującym u ssaków, który produkuje i wydziela mleko w celu odżywienia potomstwa. W ciągu życia gruczoł mlekowy przechodzi wielokrotne cykle rozwoju i wzrostu, którym towarzyszą zmiany strukturalne i funkcjonalne tkanki1. W zależności od stadium rozwoju różne są typy komórek biorących udział w przebudowie tkanki, a także ich lokalizacja w obrębie drzewa przewodowego.
Wielofotonowa mikroskopia intravitalna (IVM) umożliwia badanie dynamiki komórek gruczołu mlekowego in vivo w naturalnym i minimalnie zaburzonym środowisku2,3,4. Aby uzyskać dostęp wizualny do gruczołu mlekowego, opublikowano kilka tymczasowych technik obrazowania ex vivo lub z wykorzystaniem płata skóry dla różnych etapów rozwoju gruczołu mlekowego, w tym okresu dojrzewania4,5,6,7, dorosłości2,8, laktacji9,10,11,12 oraz dynamiki nowotworów13,14,15. Choć techniki te pozwalają na uzyskanie obrazów dynamiki komórek gruczołu mlekowego o wysokiej rozdzielczości przestrzennej i czasowej, ramy czasowe są ograniczone do godzin, podczas gdy większość procesów przebudowy gruczołu mlekowego trwa od kilku dni do kilku tygodni. W związku z tym wymagane są metody umożliwiające dostęp optyczny do badanej tkanki przez dłuższe okresy czasu. Na przestrzeni lat opracowano kilka trwałych okien obrazujących do badania nowotworów gruczołu mlekowego15,16,17,18, w tym tytanowe okno obrazujące gruczoł mlekowy (MIW)2,3,19. Mimo że jest ono bardzo użyteczne w badaniu wzrostu nowotworu gruczołu mlekowego, wizualizacja struktury zdrowego gruczołu mlekowego pozostawała ograniczona do kilku dni. Niedawno opracowano elastyczne silikonowe okno obrazujące, które pozwala na wizualizację gruczołu mlekowego w okresie dojrzewania przez wiele tygodni20. Jednak gruczoł mlekowy jest zanurzony w bogatej w adipocyty poduszce tłuszczowej, co prowadzi do rozproszonego światła i w konsekwencji do ograniczonej widoczności struktur przewodowych gruczołu. Dlatego w każdej chwili wymagane są lepsze warunki obrazowania, aby wizualizować dynamikę tkanki w gruczole mlekowym przez dłuższe okresy czasu. Ani klasyczne okno MIW, ani elastyczne okno silikonowe nie pozwalają na manipulację tkanką ani optymalizację fizycznego położenia tkanki przed obrazowaniem, ponieważ okno stanowi system zamknięty po operacji i implantacji. W rezultacie optymalny dostęp optyczny do leżącej poniżej tkanki gruczołowej prawdopodobnie zostanie uniemożliwiony w dłuższych przedziałach czasowych. W przeciwieństwieństwie do nich, technika płata skóry pozwala na optymalizację i repozycjonowanie tkanki podczas sesji obrazowania, a zabieg z użyciem płata skóry można powtarzać wielokrotnie2. Jednak wielokrotne sesje obrazowania poprzez płat skóry są możliwe tylko wtedy, gdy pomiędzy operacjami przewidziano wystarczający czas (co najmniej 7 dni) na regenerację skóry, dlatego metoda ta nadaje się głównie do badania procesów w dłuższych skalach czasowych. Ponadto, ze względu na inwazyjny charakter tej procedury oraz duże ryzyko infekcji i bliznowacenia przy zamykaniu rany, nie zaleca się wykonywania jej zbyt wiele razy.
Aby przełamać te ograniczenia, t.j. zapewnić optymalne warunki obrazowania przez dłuższy czas z wysoką częstotliwością, a jednocześnie umożliwić manipulację tkanką, zaprojektowano ulepszoną tytanową wersję MIW z wymienną pokrywą (R.MIW), pozwalającą na wizualizację zdrowego i chorobowego gruczołu mlekowego przez okres od kilku dni do kilku tygodni2 (Rysunek 1A,B). R.MIW został zaprojektowany specjalnie w celu zapewnienia optymalnego dostępu do tkanki, umożliwiając bezpośrednią manipulację nią przez cały czas trwania eksperymentu IVM, co pozwala na wizualizację gruczołu mlekowego we właściwym czasie i miejscu w dłuższych przedziałach czasowych. Po zamknięciu R.MIW tworzy szczelny system porównywalny z klasycznym MIW (Rysunek 1C). Po otwarciu w warunkach aseptycznych R.MIW pozwala na lokalną manipulację tkanką w celu poprawy dostępu optycznego, a także umożliwia lokalne podawanie substancji, takich jak inhibitory lub agoniści szlaków sygnałowych, wstrzykiwanie różnych interesujących typów komórek, np. populacji komórek nowotworowych lub komórek odpornościowych, lub dodawanie barwników do znakowania tkanek. Pokrywę można otworzyć w dowolnym momencie między sesjami obrazowania, nie powodując uszkodzenia tkanki podścielącej.
<img alt="Kompaktowa konstrukcja zestawu komórkowego; schemat i szczegóły zdjęć; zastosowania spektroskopowe." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63326/63326fig01.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1: Konstrukcja okna obrazowego gruczołu mlekowego z wymienną pokrywą. (A) Widok z góry i z boku wymiennej pokrywy okna obrazowego gruczołu mlekowego z przyklejonym do pierścienia szkiełkiem kryjącym o grubości 10 mm. (B) Widok z góry i z boku okna obrazowego gruczołu mlekowego, które składa się z pierścienia zewnętrznego i wewnętrznego z rowkiem pomiędzy nimi, służącym do zamocowania okna w skórze myszy za pomocą szwu typu „marszczenie”. Pierścień zewnętrzny posiada mały rowek dopasowany do czterech wypustek (ramion) pokrywy. (C) Schemat i zdjęcia demonstrujące mechanizmy otwierania i zamykania pokrywy. Skośne wypustki zapewniają stabilne zamocowanie pokrywy w ramie okna. Rysunek zmodyfikowany na podstawie pracy Messal et al. 2. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63326/63326fig01large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
Niniejszy protokół opisuje procedurę projektowania i implantacji R.MIW, a także podłużną strategię IVM w celu ponownego badania tych samych przewodów mlecznych oraz ich wizualizacji w rozdzielczości komórkowej. R.MIW umożliwia śledzenie podziałów komórkowych i zmian morfologicznych podczas różnych faz rozwoju gruczołu mlekowego w różnorodnych fluorescencyjnych modelach mysich reporterowych. Wraz ze sobą, R.MIW ułatwia wysokorozdzielczą charakterystykę dynamiki komórkowej podczas rozwoju, homeostazy i chorób gruczołu mlekowego.

<table><tbody><tr><td>0,9% NaCl</td><td>BD</td><td>306573</td><td>Dostępne inne marki</td></tr><tr><td>Okrągła szklana szklana nakrywka 10 mm</td><td>Fisher scientific</td><td>10696365</td><td>Inne dostępne marki</td></tr><tr><td>5-0 plecione jedwabne nici</td><td>Ethicon</td><td>W580</td><td></td></tr><tr><td>80% etanolu</td><td>domowej roboty</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Pudełko indukcyjne do anestezjologii</td><td>Kentscientific</td><td>VetFlo-MSEKIT</td><td></td></tr><tr><td>Buprenorfina (Vetergesic&reg;)</td><td>Ecuphar</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Bawełniane końcówki (sterylne)</td><td>Fisher scientific</td><td>13113743</td><td>Dostępne inne marki</td></tr><tr><td>Klej cyjanoakrylowy</td><td>Loctite</td><td>NA</td><td>Dostępne inne marki</td></tr><tr><td>Maść do oczu</td><td>Duratears</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Elastyczna igła motylkowa</td><td>Greiner Bio-One</td><td>450120</td><td>Dostępne inne marki</td></tr><tr><td>Kleszcze Graefe ()</td><td>Fine Science Tools</td><td>11051-10</td><td></td></tr><tr><td>Poduszka grzewcza</td><td>Kentscientific</td><td>RightTemp Jr.</td><td>Dostępne inne marki</td></tr><tr><td>Pudełko do</td><td>obrazowania Wykonane na zamówienie</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Mieszanka składników odżywczych do zaparzania</td><td>Braun</td><td>Nutriflex special 70/240</td><td></td></tr><tr><td>Strzykawki insulinowe</td><td>BD</td><td>324911</td><td>Dostępne inne marki</td></tr><tr><td>Odwrócony mikroskop wielofotonowy z automatycznym stolikiem</td><td>Leica Microsystems</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Waporyzator izofluranowy</td><td>Kentscientific</td><td>VetFlo-1231K</td><td></td></tr><tr><td>Uchwyt na igłę</td><td>Fine Science Tools</td><td>12510-14</td><td></td></tr><tr><td>Parafilm</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P7793</td><td>taśma półprzezroczysta</td></tr><tr><td>Taśma papierowa tesa tesa</td><td>NA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Petroleum Jelly</td><td>Wazelina</td><td>NA</td> Żyletki Fisher <td></td></tr><tr><td></td><td>scientific</td><td>11904325</td><td>Dostępne inne marki</td></tr><tr><td>Rurki silikonowe</td><td>Rozwiązania Elastomery</td><td>NA</td><td>Dowolne artykuły gospodarstwa domowego</td></tr><tr><td>Nożyczki sprężynowe (małe)</td><td>Fine Science Tools</td><td>15018-10</td><td></td></tr> Sterylna strzykawka <tr><td>PBS</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>10010023</td><td></td></tr><tr><td>(10 ml)</td><td>BD</td><td>305482</td><td>Dostępne inne marki</td></tr><tr><td>Cienkie kleszcze</td><td>Fine Science Tools</td><td>11413-11</td><td></td></tr><tr><td>Tytanowa pokrywa do okienka</td> <td>do obrazowania sutkaWykonane na zamówienie</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Tytanowe okienko do obrazowania sutka</td><td>Wykonane na zamówienie</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Drewniane patyczki Wykałaczki</td><td>Fisher scientific</td><td>NC1678836</td><td>Dostępne inne marki</td></tr></tbody></table>

podłużna mikroskopia przyżyciowa z wykorzystaniem okienka do obrazowania sutkowego z wymienną pokrywą

Longitudinal Intravital Microscopy Using a Mammary Imaging Window with Replaceable Lid

Rozgałęziona struktura gruczołu sutkowego jest bardzo dynamiczna i przechodzi kilka faz wzrostu i przebudowy po urodzeniu. Mikroskopia przyżyciowa w połączeniu z chirurgią płata skórnego lub implantacją okien obrazowych została wykorzystana do zbadania dynamiki zdrowego gruczołu sutkowego na różnych etapach rozwoju. Większość technologii obrazowania gruczołu sutkowego jest ograniczona do ram czasowych od godzin do dni, podczas gdy większość procesów przebudowy gruczołu sutkowego zachodzi w ramach czasowych od dni do tygodni. Aby zbadać przebudowę gruczołu sutkowego, wymagane są metody, które umożliwiają optyczny dostęp do tkanki będącej przedmiotem zainteresowania przez dłuższy czas. W tym miejscu opisano ulepszoną wersję tytanowego okienka obrazowania sutka z wymienną pokrywą (R.MIW), która umożliwia obrazowanie gruczołu sutkowego w wysokiej rozdzielczości z rozdzielczością komórkową przez okres do kilku tygodni. Co ważne, R.MIW zapewnia dostęp do tkanek przez cały czas trwania eksperymentu obrazowania przyżyciowego i dlatego może być używany do miejscowej manipulacji tkankami, znakowania, podawania leków lub mikrodysekcji sterowanej obrazem. Podsumowując, R.MIW umożliwia charakteryzację dynamiki komórkowej w wysokiej rozdzielczości podczas rozwoju gruczołu sutkowego, homeostazy i choroby.

W celu zbadania dynamiki proliferacji komórek nabłonka gruczołu mlekowego w różnych etapach rozwoju gruczołu zastosowano opisany protokół. Budowa R.MIW przedstawiona jest na Ryc. 1, a procedura implantacji R.MIW została podsumowana na Ryc. 2. R.MIW jest chirurgicznie implantowany pomiędzy gruczołem mlekowym a skórą. Do utrzymania pierścienia okna i zapobiegania wyciąganiu szwów przez myszy stosuje się szew (Ryc. 2). Szwy utrzymujące R.MIW wykonano z niewchłanialnego jedwabiu, który wykazuje właściwości hipoalergiczne, posiada miękką teksturę i jest łatwy w obsłudze. Pierścień R.MIW wykonany jest z tytanu, jednego z najbardziej biokompatybilnych materiałów, który nie indukuje stanu zapalnego ani martwicy po implantacji21. Przy zachowaniu warunków aseptycznych i prawidłowym wykonaniu szwów, implantacja R.MIW w gruczole mlekowym wiąże się z niskim ryzykiem powikłań pooperacyjnych. Co więcej, w przeciwieństwie do implantacji okna obrazującego w jamie brzusznej22, implantacja R.MIW nie jest czynnikiem ograniczającym przeżywalność myszy, ponieważ gruczoł mlekowy nie jest organem życiowo ważnym, co umożliwia codzienne obrazowanie do limitu określonego w protokole etycznym. Jedynym czynnikiem ograniczającym czas trwania implantacji okna jest homeostatyczna wymiana skóry, co w konsekwencji doprowadzi do wypadnięcia szwów po 4 - 6 tygodniach. Dlatego ważne jest regularne kontrolowanie stabilności szwów. W razie potrzeby szwy można usunąć i zastąpić nowym szwem typu woreczek w warunkach aseptycznych (zgodnie z opisem w krokach 3.5 - 3.8), aby zapewnić stabilność okna.
Głównym wyzwaniem przy zastosowaniu podejścia obrazowania wielodniowego jest ponowne odnalezienie ROI w kolejnych dniach. W tym celu przed wyborem ROI można przeprowadzić szybki skan przeglądowy (Rycina 3B). Do ponownego zlokalizowania tego samego obszaru tkanki można wykorzystać wiele punktów orientacyjnych, w tym sygnał sieci kolagenowej (wizualizowany za pomocą generacji drugiej harmonicznej), strukturę tkanki, a także lokalne wzorce komórek różnicowo lub stochastycznie znakowanych barwnikami lub białkami fluorescencyjnymi (Rycina 3B). W tym reprezentatywnym przykładzie R.MIW wszczepiono do 4. gruczołu mlekowego samicy myszy MMTV-PyMT;R26-CreERT2het;R26-Confettihet w momencie rozpoczęcia tworzenia się wyczuwalnego guza. Następnie indukowano stochastyczną rekombinację poprzez wstrzyknięcie 1,5 mg tamoksyfenu, co doprowadziło do rekombinacji konstrukcji Confetti w niektórych komórkach (Rycina 3C). Rekombinowane komórki nowotworowe śledzono przez okres 20 dni (Rycina 3B,C). Jeśli obrazowanie tego samego obszaru gruczołu mlekowego w kolejnych dniach jest niemożliwe, okno można otworzyć w środowisku aseptycznym (zgodnie z opisem w kroku 5.1), aby dodatkowo go oczyścić i repozycjonować tkankę w celu poprawy widoczności i akwizycji obrazu (Rycina 3A).
Zastosowanie tej metody pozwoliło na obserwację rozwijającego się gruczołu mlekowego w okresie dojrzewania na poziomie pojedynczych komórek. Powtarzalne IVM za pomocą R.MIW przeprowadzono u samic myszy R26-CreERT2het;R26-mTmGhet w wieku od 4 do 6 tygodni, w których wszystkie komórki są oznakowane błonowym białkiem tdTomato (Rysunek 4A)23. Myszy wstrzyknięto niską dawką tamoksyfenu (0,2 mg/25 g masy ciała), co doprowadziło do sporadycznej rekombinacji konstruktu mTmG, powodując zmianę koloru z czerwonego na zielony w niektórych komórkach we wszystkich tkankach, w tym w gruczole mlekowym (Rysunek 4B). Te same obszary zainteresowania (ROI) analizowano przez wiele dni, aby zwizualizować zmiany morfologiczne w gruczole mlekowym, w tym wydłużanie i rozgałęzianie przewodów (Rysunek 4C) z rozdzielczością komórkową. Co istotne, ta kombinacja stochastycznego znakowania komórek i wielodniowego IVM pozwala również na wizualizację dynamicznych zmian w środowisku przewodowym, takich jak dynamika pojedynczych komórek w zrębie otaczającym wydłużające się i rozgałęziające przewody (Rysunek 4D), a także dynamika komórkowa w węźle chłonnym pachwinowym (Rysunek 4E).
<img alt="Rekombinacja indukowana tamoksyfenem, konstrukt mT/mG, obrazowanie 3D, ekspresja Cre, mikroskopia w płaszczyźnie Z." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63326/63326fig04.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rysunek 4"> 
Rysunek 4: Wielodniowy IVM morfogenezy rozgałęziania w okresie dojrzewania płciowego. (A) Myszy w okresie dojrzewania płciowego R26-CreERT2; R26-mTmG w wieku od 4 do 6 tygodni otrzymały wstrzykniętą niską dawkę tamoksyfenu, co doprowadziło do rekombinacji allelu R26-mTmG zapośredniczonej przez białko Cre; obrazy wykonano w dniach 1, 3 i 5, aby śledzić dynamiczne zmiany w rozwijającym się gruczole mlekowym. (B) Schematyczny rysunek konstruktu mysiego R26-mTmG , który w warunkach braku rekombinacji skutkuje powszechną ekspresją błonowego tdTomato (mT). Po rekombinacji zapośredniczonej przez białko Cre, ekspresja mT zostaje zastąpiona ekspresją błonowego eGFP (mG). (C) Rendering 3D wydłużającego się i rozgałęziającego przewodu mlecznego w ciągu wielu dni, obrazowanego przez R.MIW u samicy myszy R26-CreERT2; R26-mTmG w wieku 6 tygodni. (D) Pojedyncze obrazy w płaszczyźnie Z końcówki rozgałęzienia (panele górne) i wydłużającego się odgałęzienia (panele dolne). mT przedstawiono w kolorze czerwonym, a mG w cyjanowym; paski skali oznaczają 100 µm (A i B). Pojedyncze komórki w zrębie zaznaczono białymi gwiazdkami. Należy zauważyć, że intensywność sygnału została zwiększona ręcznie, aby uwydatnić pojedyncze komórki w zrębie, co doprowadziło do lekkiego prześwietlenia komórek nabłonkowych gruczołu mlekowego. (E) Reprezentatywne obrazy węzła chłonnego pachwinowego samicy myszy R26-CreERT2; R26-mTmG obrazowanego przez R.MIW, przedstawiające ogólny skan mozaikowy (panel lewy), obrazy powiększone (panele prawe) pojedynczej płaszczyzny Z (góra) oraz rendering 3D (dół). Generacja drugiej harmonicznej (kolagen I) pokazana jest w kolorze zielonym, mT w czerwonym, a mG w cyjanowym. Paski skali oznaczają 500 µm (ogólny skan mozaikowy) i 100 µm (obrazy powiększone). Panele rysunku C i D zostały zmodyfikowane z pracy Messal i wsp. 2. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63326/63326fig04large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.</a>
Podobnie w dorosłym gruczole piersiowym zaproponowane podejście R.MIW umożliwia wizualizację tych samych struktur przewodowych przez wiele dni przy zachowaniu niezakłóconej widoczności. Nawet zastosowanie mniej jasnych modeli reporterowych z fluorescencją24, takich jak model mysi Cdh1-mCFP (Ecadherin-mCFP), pozwala na wizualizację stabilności przewodów oraz subtelnych zmian morfologicznych w rozdzielczości komórkowej (Rysunek 5). Należy zauważyć, że widoczność między 3. a 5. dniem uległa znacznej poprawie po repozycjonowaniu tkanki (Rysunek 5).
<img alt="Schemat obrazowania in vivo; ustawienie myszy; Cdh1-mCFP; wizualizacja kolagenu I w czasie; wynik eksperymentu." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63326/63326fig05.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rysunek 5"> 
Rysunek 5: Wielodniowe obrazowanie dorosłego gruczołu mlekowego. Renderowane obrazy 3D struktury przewodowej gruczołu mlekowego dorosłej samicy myszy Cdh1-mCFP (cyjan, znakowanie ekspresji komórek luminalnych wykazujących obecność ekadheryny) w ciągu wielu kolejnych dni. Wzorzec kolagenu I (generowanie drugiej harmonicznej, magenta) posłużył do ponownego zlokalizowania tego samego ROI, a sygnał Cdh1-mCFP został użyty do oznaczenia komórek przewodowych (luminalnych). Należy zauważyć, że widoczność po 3. dniu poprawiła się dzięki otwarciu pokrywy R.MIW i repozycjonowaniu tkanki. Paski skali reprezentują 100 µm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63326/63326fig05large.jpg" target="_blank">Proszę kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
Aby ocenić heterogenność proliferacyjną komórek nabłonkowych gruczołu mlekowego podczas cyklu hormonalnego na poziomie pojedynczych komórek, wykorzystano fotokonwertowalny model mysi z reporterem Kikume Green-Red (KikGR)25,26, charakteryzujący się powszechną ekspresją białka KikGR. KikGR jest jasnym fluorophorem, który ulega konwersji z koloru zielonego na czerwony po ekspozycji na światło fioletowe, a stosunek czerwieni do zieleni może służyć jako wskaźnik aktywności proliferacyjnej komórki2 (Rysunek 6A,B). Stosując podejście R.MIW, śledziliśmy te same komórki w obrębie drzewa przewodowego dorosłego gruczołu mlekowego przez kilka dni i stwierdziliśmy wcześniej nieprzewidzianą heterogenność proliferacyjną w całym drzewie przewodowym (Rysunek 6C). Komórki o wysokiej i niskiej aktywności proliferacyjnej były równomiernie rozmieszczone w różnych konwertowanych obszarach (Rysunek 6C,D). Uderzające jest to, że na poziomie lokalnym sąsiednie komórki wykazywały duże różnice w stosunku czerwieni do zieleni (Rysunek 6C,D). Ilościowe oznaczenie stosunku czerwieni do zieleni w różnych komórkach (jako wskaźnika ich aktywności proliferacyjnej) 10 dni po fotokonwersji wykazało bardzo zmienne tempo rozcieńczania niektórych komórek w tym samym mikrośrodowisku przewodowym (Rysunek 6E). Łącznie dane te ujawniają niezwykłą lokalną heterogenność proliferacyjną w dorosłym gruczole mlekowym i jednocześnie globalnie jednolity wskaźnik wymiany komórkowej.
<img alt="Schemat podziału komórek i degradacji białek z mikroskopią fotokonwersyjną; analiza stosunku czerwonego do zielonego sygnału." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63326/63326fig06.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rysunek 6"> 
Rysunek 6: Podłużna IVM heterogeniczności proliferacyjnej w dorosłym gruczole mlekowym z wykorzystaniem modelu mysiego KikGR. (A) Myszy KikGR obrazowano w dniu 0 przed i po ekspozycji na światło fioletowe. Sesje obrazowania powtarzano w dniach 2, 6 i 10 po konwersji. (B) Schematyczne przedstawienie hipotetycznych wyników po fotokonwersji komórek nabłonkowych gruczołu mlekowego KikGR w zależności od czasu, w przypadku wystąpienia proliferacji (panel lewy) oraz braku proliferacji (panel prawy). (C) Ten sam obszar gruczołu mlekowego obrazowano przez R.MIW w okresie 10 dni. Mniejsze regiony poddano fotokonwersji w dniu 0, a analiza wykazuje podobną szybkość rozcieńczenia czerwonego sygnału Kikume w czasie, co wskazuje na jednakową częstotliwość wymiany komórek w całym nabłonku. (D) Powiększone obrazy (pojedyncze płaszczyzny Z) wskazanych regionów w panelu C pokazują heterogeniczność proliferacyjną na poziomie komórkowym 6 i 10 dni po fotokonwersji. Paski skali reprezentują 100 µm (panel C) oraz 10 µm (panel D). (E) Ilościowe oznaczenie stosunku czerwonego do zielonego sygnału w losowo wybranych komórkach (n = 48 komórek) w trzech obszarach poddanych fotokonwersji. Wysoki stosunek czerwonego do zielonego sygnału świadczy o niskiej szybkości rozcieńczenia i niskiej aktywności proliferacyjnej, natomiast niski stosunek czerwonego do zielonego sygnału świadczy o wysokiej szybkości rozcieńczenia i proliferacji. Panele C-E zostały zmodyfikowane z pracy Messal i wsp. 2. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63326/63326fig06large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>

Ten protokół opisuje nowatorskie okno obrazowania sutka z wymienną pokrywą (R.MIW). Mikroskopia przyżyciowa po wszczepieniu R.MIW pozwala na podłużne i wielodniowe obrazowanie zdrowego i chorego gruczołu sutkowego z rozdzielczością komórkową na różnych etapach rozwoju.

Podłużna mikroskopia przyżyciowa z wykorzystaniem okienka do obrazowania sutkowego z wymienną pokrywą

The branched structure of the mammary gland is highly dynamic and undergoes several phases of growth and remodeling after birth. Intravital microscopy in ...

Gruczoł sutkowy jest bardzo dynamiczny i przechodzi wiele rund przebudowy w ciągu życia. Nasz protokół pozwala uchwycić dynamikę komórkową napędzającą rearanżacje tkanek w zdrowym i chorym gruczole sutkowym. Nasze okienko do obrazowania sutka z wymienną pokrywą umożliwia wykonywanie podłużnych obrazowań przyżyciowych gruczołu sutkowego przez długi okres czasu, do kilku tygodni.Wymienna pokrywa okienka obrazowania sutka zapewnia optymalne warunki obrazowania przez cały czas i umożliwia manipulację tkankami lub podawanie leków między sesjami obrazowania. Nasza metoda nie tylko zapewnia wgląd w biologię zdrowego gruczołu sutkowego, ale także pozwala nam badać inicjację i progresję guza sutka na poziomie pojedynczej komórki. Zacznij od umieszczenia pokrywy okienka do obrazowania sutka na sterylnej powierzchni i nałożenia kleju klejowego z cyjanoakrylanu na całym obwodzie pokrywy obręczy.Ostrożnie umieść 10-milimetrową okrągłą szklaną szkiełko nakrywkowe na pokrywie. Użyj sterylnego drewnianego patyczka, aby ustawić szklane szkiełko nakrywkowe i przyłóż pewną siłę, aby go docisnąć, aby zapewnić hermetyczne uszczelnienie między szkiełkiem nakrywkowym a ramą pokrywy. Upewnij się, że szkło nie zakrywa otworów w ramionach pokrywy.Zdezynfekować powieki i okienko do obrazowania ssaka, zanurzając je w 80% etanolu na co najmniej 30 minut na zamkniętej szalce Petriego. Użyj bawełnianej końcówki nasączonej acetonem, aby usunąć nadmiar kleju cyjanoakrylowego z szkiełka nakrywkowego. Aby przygotować mysz do operacji, ogol obszar wokół czwartego gruczołu sutkowego za pomocą żyletki.Użyj czwartego sutka jako punktu orientacyjnego i usuń luźne włoski za pomocą taśmy klejącej. Wykonaj test wycofania łapy, aby sprawdzić, czy zwierzę jest odpowiednio znieczulone. Delikatnie unieś skórę za pomocą cienkich kleszczyków Graefe i użyj małych nożyczek sprężynowych, aby wykonać 10-15-milimetrowe nacięcie po przekątnej skóry na czwartej poduszce tłuszczowej sutka Użyj czwartego sutka jako punktu orientacyjnego i upewnij się, że nie przecięłeś ani nie uszkodziłeś otrzewnej ani gruczołu sutkowego.Oddziel skórę od poduszeczki tłuszczowej sutka i leżących pod nią warstw tkanki, wykonując rozwarstwienie o długości do pięciu do ośmiu milimetrów wokół linii nacięcia, aby utworzyć kieszeń pasującą do ramy okienka obrazowania sutka. Zdefiniuj obszar zainteresowania lub ROI na podstawie makroskopowych cech tkanki sutkowej, w tym lokalizacji węzła chłonnego lub zmiany nowotworowej. Staraj się, aby ROI był centralny w odniesieniu do nacięcia.Podnieś okienko obrazowania sutka za pomocą sterylnych kleszczy i sprawdź, czy nacięcie jest wystarczająco duże, aby wprowadzić okienko. W razie potrzeby nieznacznie powiększ nacięcie, aż okienko obrazowania sutka będzie pasować. Usuń okienko i użyj jedwabnego szwu 5-0, aby umieścić szew sznurkowy w torebce w odległości od jednego do dwóch milimetrów od krawędzi nacięcia, zaczynając od końca ogonowego i od zewnątrz do wnętrza skóry.Przesuń się około pięciu milimetrów w górę wzdłuż nacięcia i przełóż nić szwu przez skórę od wewnątrz na zewnątrz. Powtórz tę procedurę wzdłuż krawędzi nacięcia, tworząc w ten sposób okrągły szew składający się z pięciu do sześciu pętli. Końcowe wyjście nici do szwu powinno znajdować się w odległości około dwóch do pięciu milimetrów od pierwszego wejścia.Dopasuj okienko do obrazowania sutka wewnątrz nacięcia i użyj kleszczyków Graefe, aby ostrożnie umieścić skórę w rowku okienka. Upewnij się, że pętle szwu zostały pozostawione na zewnątrz. Pociągnij za pętle szwu sznurkowego torebki i delikatnie pociągnij oba końce szwu, aby zacisnąć go w rowku okienka obrazowania sutka.Zawiąż węzłami chirurgicznymi i odetnij nadmiar nici. Użyj wykałaczki, aby nałożyć wazelinę na wewnętrzną krawędź okna, omijając tkankę znajdującą się pod spodem. Delikatnie popchnij ramę okienną w dół za pomocą sterylnych kleszczyków i umieść pokrywę w ramie okiennej.Pozwoli to uniknąć przepływu powietrza między tkanką gruczołu piersiowego a pokrywą okienka do obrazowania sutka. Umieść końcówki cienkich kleszczy przez otwory w ramionach pokrywki i dokręć pokrywkę, przekręcając ją zgodnie z ruchem wskazówek zegara. Jeśli po dokręceniu pokrywki pozostanie trochę powietrza, wprowadzić sterylną igłę insulinową przez skórę do jamy między tkanką sutkową a pokrywką i powoli wyciągnąć tłok, tworząc w ten sposób podciśnienie między tkanką gruczołu piersiowego a pokrywą okienka do obrazowania sutka.Teraz po tej procedurze można łatwo zaobserwować węzeł chłonny. Sprawdź stan ramy okienka do obrazowania sutka i pokrywy, w tym stabilność szwów lub ewentualne uszkodzenia powieki. Umieść mysz na wkładce w taki sposób, aby okienko do obrazowania sutka wpadło w otwór we wkładce pudełka do obrazowania.Nałóż półprzezroczystą i papierową taśmę na grzbiet myszy, aby ustabilizować mysz i zmniejszyć ruch tkanek spowodowany oddychaniem. W przypadku sesji obrazowania trwających dłużej niż trzy godziny umieść elastyczną igłę podskórnie w szyi myszy i zabezpiecz ją taśmą papierową. Podłącz 10-milimetrową strzykawkę z mieszanką składników odżywczych do elastycznej silikonowej rurki i wciskaj mieszankę składników odżywczych, aż dotrze do końca tubki.Podłącz silikonową rurkę do elastycznej igły i wstrzykuj 50 mikrolitrów roztworu w infuzji co 30 minut. Umieść pokrywę nad pudełkiem do obrazowania, aby je zamknąć. Następnie zabezpiecz pudełko obrazowania w stoliku mikroskopu.Sprawdź, czy mysz jest stabilnie osadzona w polu obrazowania. Zdefiniuj obszar zainteresowania za pomocą trybu epifluorescencji mikroskopu i zastosuj ustawienia mikroskopu. Użyj funkcji Spirala w trybie nawigatora oprogramowania do obrazowania, aby wygenerować duży skan kafelka przeglądowego i utworzyć mapę referencyjną tkanki.Zdefiniuj obszar zainteresowania w przeglądzie krzywej przejściowej, a następnie zdefiniuj górną i dolną płaszczyznę Z, aby określić stos Z. Naciśnij Start, aby uzyskać szczegółowe trójwymiarowe lub czterowymiarowe stosy Z tkanki. Umieść końcówki cienkich kleszczyków przez otwory okienka obrazowania sutka w ramionach pokrywy i poluzuj pokrywkę, przekręcając ją w kierunku przeciwnym do ruchu wskazówek zegara.Alternatywnie, tkanka może być manipulowana lub repozycjonowana za pomocą sterylnych kleszczy, aby zoptymalizować warunki obrazowania dla określonego obszaru zainteresowania. Nałóż wazelinę na wewnętrzną krawędź okienka obrazowania sutka, omijając tkankę znajdującą się pod spodem. Delikatnie popchnij ramę okienną w dół za pomocą sterylnych kleszczyków i umieść pokrywę w ramie okiennej.Na koniec umieść końcówki cienkich kleszczyków w otworach w ramionach pokrywy i rozjaśnij pokrywkę, przekręcając ją zgodnie z ruchem wskazówek zegara. Dojrzewanie Rosa26 Cre / ERT2 Myszom GFP z błoną pomidorową Rosa26 wstrzyknięto niską dawkę tamoksyfenu, co doprowadziło do rekombinacji allelu GFP błony pomidorowej Rosa26 za pośrednictwem Cre. Myszy były obrazowane w pierwszym, trzecim i piątym dniu, aby śledzić dynamiczne zmiany w rozwijającym się gruczole sutkowym.Reprezentatywne obrazy pokazują renderowanie 3D wydłużonego i rozgałęziającego się przewodu sutkowego przez wiele dni, zobrazowane przez okno obrazowania sutka. W tym miejscu pokazane są pojedyncze obrazy w płaszczyźnie Z rozgałęzionej końcówki i wydłużającej się gałęzi. Pojedyncze komórki w zrębie są wyróżnione białymi gwiazdkami.Reprezentatywne obrazy pokazują pachwinowy węzeł chłonny myszy zobrazowany przez okienko obrazowania sutka. Druga generacja harmoniczna jest przedstawiona na zielono. Pokazano tutaj renderowane w 3D obrazy struktury przewodowej sutka dorosłej samicy myszy CFP z membraną E-kadheryny przez wiele kolejnych dni.Wzór kolagenu I został użyty do odtworzenia tego samego ROI, a sygnał CFP membrany E-kadheryny został wykorzystany do oznaczenia komórek przewodowych. Zielono-czerwone myszy Kikume sfotografowano w dniu zero, przed i po ekspozycji na światło fioletowe. Sesje obrazowania powtarzano w drugim, szóstym i dziesiątym dniu po konwersji.Ten sam obszar gruczołu sutkowego był obrazowany przez okienko obrazowania sutka przez 10 dni. Mniejsze obszary zostały poddane fotokonwersji w dniu zero i wykazały podobny stopień rozcieńczenia czerwonego sygnału Kikume w czasie, co wskazuje na równe tempo rotacji w całym nabłonku. Powiększone obrazy wskazanych regionów pokazują heterogeniczność proliferacyjną na poziomie komórkowym sześć i 10 dni po fotokonwersji.Kwantyfikacja stosunku czerwieni do zieleni różnych komórek 10 dni po fotokonwersji ujawniła bardzo zmienne szybkości rozcieńczania niektórych komórek w tym samym mikrośrodowisku przewodowym. Kluczowym etapem tej procedury jest otwarcie pokrywy pomiędzy sesjami obrazowania. Ta unikalna cecha okienka poprawia warunki obrazowania i pozwala na obrazowanie podłużne tkanki.Okienko do obrazowania sutka z wymienną pokrywą ułatwi zadawanie nowych pytań dotyczących in vivo, szybko działających testów leków i badań przesiewowych w dziedzinie inicjacji i progresji guza w mysim gruczole sutkowym.

longitudinal-intravital-microscopy-using-mammary-imaging-window-with

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Intrawitalne przełączanie fotofizyczne i śledzenie komórek nowotworowych znakowanych Dendra2 za pomocą okna obrazowania gruczołu mlekowego (Mammary Imaging Window) to technika, która pozwala na obrazowanie zachowania przerzutowego komórek nowotworowych w wybranych mikrośrodowiskach guza w skali czasowej obejmującej wiele dni.

Przełączanie fotonowe Dendra2 przez okno obrazowania piersi

Ten protokół opisuje użycie mikroskopii wielofotonowej do wykonywania długoterminowego, wysokorozdzielczego, jednokomórkowego obrazowania nienaruszonego płuca w czasie rzeczywistym przy użyciu stabilizowanego próżniowo okna obrazowania.

Długotrwała mikroskopia przyżyciowa o wysokiej rozdzielczości w płucach z okienkiem obrazowania stabilizowanym podciśnieniowo

Ten protokół opisuje obrazowanie intrażyciowe transgenicznych myszy wykazujących ekspresję specyficznych dla komórek markerów fluorescencyjnych. Obrazowanie przyżyciowe zapewnia nieinwazyjną metodę obserwacji w wysokiej rozdzielczości u żywych zwierząt za pomocą wszczepialnych okien, przez które możliwa jest mikroskopowa wizualizacja procesów. Ta metoda jest szczególnie przydatna do badania procesów podłużnych.

Mikroskopia przyżyciowa naczyń krwionośnych związanych z nowotworem przy użyciu zaawansowanych komór okiennych grzbietowych fałdów skórnych na transgenicznych myszach fluorescencyjnych

Opisujemy metodę wizualizacji IELs γδ znakowanych GFP za pomocą obrazowania przyżyciowego mysiego jelita cienkiego za pomocą mikroskopii konfokalnej z odwróconym wirującym dyskiem. Technika ta umożliwia śledzenie żywych komórek w błonie śluzowej przez okres do 4 godzin i może być wykorzystana do badania różnych interakcji jelitowych między układem odpornościowym a nabłonkiem.

Obrazowanie przyżyciowe limfocytów śródnabłonkowych w jelicie cienkim myszy

Obrazowanie in vivo trzustki w wysokiej rozdzielczości było ułatwione dzięki oknu obrazowania przyżyciowego trzustki.

Stabilizowana podłużna wizualizacja trzustki na poziomie komórkowym in vivo w modelu mysim z oknem obrazowania przyżyciowego trzustki

Przedstawiono tutaj podejście do długoterminowego obrazowania przyżyciowego za pomocą optycznie przezroczystych, silikonowych okienek, które można przykleić bezpośrednio do tkanki/organu zainteresowania i skóry. Te okna są tańsze i bardziej wszechstronne niż inne obecnie używane w terenie, a chirurgiczne wprowadzenie powoduje ograniczone stany zapalne i stres u zwierząt.

Podłużne obrazowanie przyżyciowe przez przezroczyste okienka silikonowe

Opisana tutaj metoda obrazowania intravital wykorzystuje generowanie drugiej harmonii kolagenu i endogenną fluorescencję z metabolicznego kofaktora NAD(P)H do nieinwazyjnej segmentacji nieoznaczonego mikrośrodowiska guza na przedziały guza, zrębu i naczyń krwionośnych w celu dogłębnej analizy obrazów 4D intravital.

Bezznacznikowe podejście do segmentacji w obrazowaniu przyżyciowym mikrośrodowiska guza sutka

Niniejszy protokół opisuje łatwą technikę obrazowania gruczołu sutkowego myszy w okresie laktacji za pomocą skaningu laserowego, mikroskopii konfokalnej i wielofotonowej.

Mikroskopia subkomórkowa przyżyciowych gruczołu sutkowego

Protokół przedstawia nowe narzędzie do uproszczenia obrazowania przyżyciowego za pomocą odwróconej mikroskopii konfokalnej.

Uproszczone podejście do obrazowania przyżyciowego do długoterminowego monitorowania dynamiki tkanki nabłonkowej pod odwróconym mikroskopem konfokalnym

Komórki guza piersi wykazujące ekspresję lucyferazy są wszczepiane myszom podskórnie i obrazowane za pomocą obrazowania optycznego w celu nieinwazyjnego monitorowania wzrostu i rozwoju guza w badaniu podłużnym.

In vivo obrazowanie bioluminescencyjne guzów piersi z użyciem systemu IVIS Spectrum

Poznaj metodę podłużnej mikroskopii przyżyciowej gruczołu sutkowego z wymienną pokrywą okienka obrazującego. Technika umożliwia obserwację dynamiki komórkowej i przebudowy tkanek na poziomie pojedynczych komórek u myszy.

Podłużna mikroskopia przyżyciowa z wykorzystaniem okienka do obrazowania sutkowego z wymienną pokrywą

Przeglądaj więcej filmów