Pomiar właściwości okresowego szkieletu błonowego początkowego segmentu aksonu przy użyciu mikroskopii oświetlenia strukturalnego 3D (3D-SIM)
February 11th, 2022
Obecny protokół opisuje metodę wizualizacji i pomiaru pierścieni aktynowych i innych składników okresowego szkieletu błony początkowego segmentu aksonu przy użyciu hodowanych neuronów hipokampa szczura i mikroskopii iluminacyjnej o strukturze 3D (3D-SIM).
Protokół ten pozwala na rozdzielenie okresowego szkieletu błonowego w początkowym segmencie aksonu hodowanych neuronów. Badając lokalizację białek, można uzyskać wgląd w funkcję w szkielecie okresowym błony. Główną zaletą tej techniki jest jej solidność i łatwość użycia.
Mikroskopia oświetlenia strukturalnego jest w stanie rozdzielić okresowy szkielet błony, a przygotowanie próbki jest łatwe i proste. Każdy, kto ma wcześniejsze doświadczenie w mikroskopii fluorescencyjnej, może z łatwością wdrożyć tę technikę. Protokół ten ma na celu maksymalizację stosunku sygnału do szumu podczas przygotowywania i obrazowania próbki.
Na początek utrwal neurony za pomocą 4% paraformaldehydu przez 12 minut w temperaturze pokojowej. Umyć szkiełko nakrywkowe raz w 0,2% BSA w buforowym roztworze fosforanowym i inkubować przez 10 minut w 1% roztworze Triton X w PBS w temperaturze pokojowej. Przemyć szkiełko nakrywkowe BSA w roztworze buforu fosforanowego, rozcieńczyć przeciwciała antyankyryny G za pomocą BSA w roztworze buforu fosforanowego w stosunku jeden do 200.
Dodać roztwór przeciwciała do szkiełka nakrywkowego i inkubować przez noc w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Umyć komórki raz w roztworze buforu fosforanowego BSA, raz w 0,1%Triton X w roztworze buforu fosforanowego i raz w roztworze buforu fosforanowego. Rozcieńczyć Fluoro 4 oznaczone, dodać więcej przeciwciał drugorzędowych do roztworu buforowego fosforanu BSA i dodać do szkiełka nakrywkowego.
Przemyć komórki raz w roztworze buforu fosforanowego BSA, raz w 0,1% Triton X w roztworze buforu fosforanowego, a następnie raz w roztworze buforu fosforanowego. Przygotuj jednomikromolowy roztwór znakowanej ferodyny w fosforanowym roztworze buforowym i dodaj go do komórek. Umyć komórki raz w roztworze buforowym fosforanu albuminy surowicy bydlęcej raz w 0,1% Triton X w roztworze buforu fosforanowego, a następnie raz w roztworze buforu fosforanowego.
Aby zamontować szkiełko nakrywkowe na szkiełku podstawowym, nałóż kroplę środka montażowego na szkiełko, zanurz szkiełko nakrywkowe w wodzie dejonizowanej i postukaj w nie miękkim ręcznikiem papierowym, aby usunąć nadmiar wody. Umieścić szkiełko nakrywkowe na szkiełku podstawowym i inkubować w temperaturze pokojowej przez 24 godziny. Jeśli to możliwe, przed obrazowaniem skonsultuj się z personelem zakładu mikroskopowego i skorzystaj z kalkulatora olejków immersyjnych, aby wybrać olejek immersyjny odpowiedni dla próbki.
Gdy próbki są gotowe, upewnij się, że szkiełka nakrywkowe są czyste i wolne od wszelkich pozostałości, czyszcząc je bawełnianą końcówką zamoczoną w wodzie lub etanolu. Umieść próbkę w mikroskopie 3D-SIM i znajdź komórkę, aby uchwycić obraz. Dostosuj moc odpowiednich linii laserowych.
Oraz czasy ekspozycji, aby zmaksymalizować stosunek sygnału do szumu bez znacznego wybielania próbki. Ustaw górną i dolną granicę próbki w wymiarze Z i przystąp do pobierania stosu. Uruchom algorytm rekonstrukcji na stosie, aby uzyskać rekonstrukcję w super rozdzielczości
.Sprawdź rekonstrukcje pod kątem znanych artefaktów i jeśli to konieczne, dostosuj parametry, aby je poprawić. Porównaj rekonstrukcję karty SIM z obrazem o szerokim polu, aby zaobserwować poprawę rozdzielczości. Podczas wykonywania wielokolorowej mikroskopii oświetlenia strukturalnego należy użyć algorytmu wyrównania, aby prawidłowo wyrównać różne kanały, gdy zadowalająca rekonstrukcja jest gotowa
.Pierścienie aktynowe w szkielecie okresowym błony mają charakterystyczny okresowy wygląd. Utwórz obraz projekcji o maksymalnej intensywności w oprogramowaniu do analizy obrazu, wykorzystując wszystkie płaszczyzny ogniskowe, w których widoczne są pierścienie aktynowe. Na obrazie projekcji o maksymalnej intensywności narysuj prostopadłą linię w poprzek widocznych sąsiednich pierścieni i zapisz intensywność fluorescencji wraz z funkcją profilu wykresu liniowego oprogramowania.
Aby obliczyć średnią odległość między pikami, należy zanotować lokalne maksima w profilu linii i zmierzyć odległość między poszczególnymi sąsiednimi pikami intensywności fluorescencji. Aby ocenić kolokalizację różnych białek z pierścieniami aktynowymi w błonowym szkielecie okresowym, należy przeprowadzić procedurę analizy kolokalizacji rekonstrukcji SIM aktyny i białka kandydującego. Ręcznie narysuj zaznaczenie, aby zdefiniować początkowy segment aksonu jako obszar zainteresowania, dla wtyczki łatwej kolokalizacji na platformie oprogramowania, i uruchom analizę, aby obliczyć współczynnik korelacji Pearsona dla kolokalizacji.
Podczas analizy obrazu SIM rekonstrukcje stosów obrazów wykazały wyraźną okresowość pierścieni aktynowych. Do wizualizacji ankyryny G użyto przeciwciała anty ankyryny G. Kolokalizację pierścieni ankyryny G i aktyny przetestowano w początkowym segmencie aksonu przy użyciu procedury analizy kolokalizacji w celu obliczenia współczynnika korelacji Pearsona. Współczynnik korelacji Pearsona dla kolokalizacji fluorescencji pierścieni ankyryny G i aktyny wynosił 0,36 plus minus 0,03.
Niezbędne jest użycie odpowiedniego olejku immersyjnego i dostosowanie mocy lasera oraz czasu naświetlania, aby linie siatki były widoczne. Po ustaleniu, że białko jest częścią błonowego szkieletu okresowego, można zbadać jego funkcję i ustalić w utrzymaniu okresowego szkieletu błonowego. Na przykład można przeanalizować wpływ strącenia białka na pierścienie aktynowe.
Rozwój technik mikroskopii superrozdzielczej jest powodem, dla którego wiemy, że początkowy segment aksonu zawiera błonowy szkielet okresowy składający się z pierścieni aktynowych, widma i ankyryny. Projekt SIM umożliwił naukowcom łatwą wizualizację okresowych składników szkieletu błony i przyjrzenie się pierścieniom aktynowym w żywych komórkach.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Przegląd
To badanie opisuje protokół wizualizacji i pomiaru pierścieni aktynowych w obrębie okresowego szkieletu membranowego początkowego odcinka aksonu za pomocą hodowanych neuronów hipokampalnych szczura i mikroskopii oświetlenia strukturalnego 3D (3D-SIM). Technika ta pozwala badaczom na zbadanie lokalizacji białek, poprawiając rozumienie funkcji okresowego szkieletu membranowego.
Kluczowe elementy badania
Obszar nauki
- Neuronauki
- Biologia komórki
- Technika mikroskopi
Tło
- Początkowy odcinek aksonu jest kluczowy dla przekazywania sygnałów neuronowych.
- Pierścienie aktynowe odgrywają znaczącą rolę w utrzymaniu okresowego szkieletu membranowego.
- Mikroskopia oświetlenia strukturalnego poprawia rozdzielczość w obrazowaniu próbek biologicznych.
- Rozumienie lokalizacji białek daje wgląd w ich funkcjonalne role.
Cel badania
- Ustanowienie wiarygodnego protokołu obrazowania pierścieni aktynowych w hodowanych neuronach.
- Wyjaśnienie składników okresowego szkieletu membranowego.
- Ułatwienie analizy kolokalizacji różnych białek w początkowym odcinku aksonu.
Zastosowane metody
- Zastosowanie mikroskopii oświetlenia strukturalnego 3D do obrazowania.
- Kluczowym modelem biologicznym były hodowane neurony hipokampalne szczura.
- W tekście nie odnaleziono wzmianki o przepływach multiomicznych.
- Kluczowe kroki obejmowały fiksację, inkubację przeciwciał i przygotowanie do obrazowania.
- Analiza obrazów została przeprowadzona w celu oceny okresowości pierścieni aktynowych i kolokalizacji białek.
Główne wyniki
- Protokół umożliwił wizualizację pierścieni aktynowych o wyraźnej okresowości.
- Zkolokowany ankyryn G i pierścienie aktynowe zostały zmierzone, dając współczynnik Pearsona 0,36 ± 0,03.
- Identyfikacja pierścieni aktynowych potwierdza ich rolę w okresowym szkielecie membranowym.
- SIM umożliwił wyraźne poprawy rozdzielczości w porównaniu z tradycyjnymi metodami obrazowania szerokokątnego.
Wnioski
- Badanie pokazuje solidną metodę analizy okresowego szkieletu membranowego w neuronach.
- Ulepszone techniki obrazowania przyczyniają się do zrozumienia struktury komórkowej w komórkach neuronowych.
- Wglądy z tego badania są podstawą dla przyszłych badań funkcji białek neuronowych i ich implikacji w zdrowiu i chorobie.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
Understanding the structural organization of the axon initial segment's membrane periodic skeleton supports target validation in neuroscience drug discovery by clarifying the spatial context of ion channels and scaffolding proteins. This mechanistic insight enables predictive de-risking of therapeutic hypotheses related to neuronal excitability disorders. The method enhances confidence in target engagement studies by providing quantitative spatial data on protein localization within a disease-relevant subcellular compartment.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by resolving the nanoscale architecture of the axon initial segment membrane periodic skeleton.
- Operational Value: Provides a robust, accessible super-resolution method for validating target localization in neuronal models.
- Predictive Value: Supports mechanistic de-risking through quantitative assessment of protein periodicity and colocalization with actin rings.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates quantitative fluorescence intensity profiles and Pearson's correlation coefficients for assessing protein-actin ring spatial relationships.
- Operational Value: Delivers reproducible, standardized imaging workflows compatible with multi-well neuronal culture formats.
- Assay Readiness: Produces super-resolved reconstructions that enable reliable detection of subcellular protein localization patterns.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Links molecular target localization to functional maintenance of the membrane periodic skeleton in a disease-relevant neuronal system.
- Mechanistic De-risking: Clarifies whether candidate proteins are structural components of the axon initial scaffold, informing target selection for neuropsychiatric indications.
- Predictive Confidence: Supports go/no-go decisions by determining if a protein is part of the periodic skeleton prior to functional validation.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the early discovery continuum, supporting target validation through subcellular resolution and enabling progression to mechanistic studies in neuronal models.
- Discovery Biology: Facilitates hypothesis testing by determining if a protein exhibits periodic localization consistent with membrane periodic skeleton integration.
- Screening: Enables assay development for high-content analysis of protein localization patterns in fixed neuronal cultures.
- Analytics: Provides quantitative readouts including inter-peak distance measurements and colocalization coefficients for objective comparison across conditions.
- Translational Research: Connects molecular findings to structural integrity of the axon initial segment, a key determinant of neuronal polarity and signaling.
- Enterprise Reuse: Establishes a standardized imaging platform applicable to multiple targets across neuroscience discovery programs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduces mechanistic ambiguity by defining the nanoscale spatial organization of axon initial segment proteins.
- Operational Value: Offers ease of use and robustness, requiring only standard fluorescence microscopy experience and accessible super-resolution instrumentation.
- Strategic Value: Improves target selection confidence by validating subcellular localization before investing in functional assays.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of targets based on their integration into the axon initial segment scaffold.
Implementation Considerations
- Requires familiarity with fluorescence microscopy and super-resolution imaging principles.
- Dependent on access to 3D-SIM instrumentation and appropriate immersion oil optimization.
- Necessitates standardized antibody validation and blocking conditions to minimize nonspecific signal.
- Involves careful laser power and exposure calibration to balance signal-to-noise ratio with photobleaching.
- Applicable primarily to fixed neuronal cultures; live-cell applications require additional validation.
