Pomiar właściwości okresowego szkieletu błonowego początkowego segmentu aksonu przy użyciu mikroskopii oświetlenia strukturalnego 3D (3D-SIM)

Protokół ten pozwala na rozdzielenie okresowego szkieletu błonowego w początkowym segmencie aksonu hodowanych neuronów. Badając lokalizację białek, można uzyskać wgląd w funkcję w szkielecie okresowym błony. Główną zaletą tej techniki jest jej solidność i łatwość użycia.

Mikroskopia oświetlenia strukturalnego jest w stanie rozdzielić okresowy szkielet błony, a przygotowanie próbki jest łatwe i proste. Każdy, kto ma wcześniejsze doświadczenie w mikroskopii fluorescencyjnej, może z łatwością wdrożyć tę technikę. Protokół ten ma na celu maksymalizację stosunku sygnału do szumu podczas przygotowywania i obrazowania próbki.

Na początek utrwal neurony za pomocą 4% paraformaldehydu przez 12 minut w temperaturze pokojowej. Umyć szkiełko nakrywkowe raz w 0,2% BSA w buforowym roztworze fosforanowym i inkubować przez 10 minut w 1% roztworze Triton X w PBS w temperaturze pokojowej. Przemyć szkiełko nakrywkowe BSA w roztworze buforu fosforanowego, rozcieńczyć przeciwciała antyankyryny G za pomocą BSA w roztworze buforu fosforanowego w stosunku jeden do 200.

Dodać roztwór przeciwciała do szkiełka nakrywkowego i inkubować przez noc w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Umyć komórki raz w roztworze buforu fosforanowego BSA, raz w 0,1%Triton X w roztworze buforu fosforanowego i raz w roztworze buforu fosforanowego. Rozcieńczyć Fluoro 4 oznaczone, dodać więcej przeciwciał drugorzędowych do roztworu buforowego fosforanu BSA i dodać do szkiełka nakrywkowego.

Przemyć komórki raz w roztworze buforu fosforanowego BSA, raz w 0,1% Triton X w roztworze buforu fosforanowego, a następnie raz w roztworze buforu fosforanowego. Przygotuj jednomikromolowy roztwór znakowanej ferodyny w fosforanowym roztworze buforowym i dodaj go do komórek. Umyć komórki raz w roztworze buforowym fosforanu albuminy surowicy bydlęcej raz w 0,1% Triton X w roztworze buforu fosforanowego, a następnie raz w roztworze buforu fosforanowego.

Aby zamontować szkiełko nakrywkowe na szkiełku podstawowym, nałóż kroplę środka montażowego na szkiełko, zanurz szkiełko nakrywkowe w wodzie dejonizowanej i postukaj w nie miękkim ręcznikiem papierowym, aby usunąć nadmiar wody. Umieścić szkiełko nakrywkowe na szkiełku podstawowym i inkubować w temperaturze pokojowej przez 24 godziny. Jeśli to możliwe, przed obrazowaniem skonsultuj się z personelem zakładu mikroskopowego i skorzystaj z kalkulatora olejków immersyjnych, aby wybrać olejek immersyjny odpowiedni dla próbki.

Gdy próbki są gotowe, upewnij się, że szkiełka nakrywkowe są czyste i wolne od wszelkich pozostałości, czyszcząc je bawełnianą końcówką zamoczoną w wodzie lub etanolu. Umieść próbkę w mikroskopie 3D-SIM i znajdź komórkę, aby uchwycić obraz. Dostosuj moc odpowiednich linii laserowych.

Oraz czasy ekspozycji, aby zmaksymalizować stosunek sygnału do szumu bez znacznego wybielania próbki. Ustaw górną i dolną granicę próbki w wymiarze Z i przystąp do pobierania stosu. Uruchom algorytm rekonstrukcji na stosie, aby uzyskać rekonstrukcję w super rozdzielczości

Sprawdź rekonstrukcje pod kątem znanych artefaktów i jeśli to konieczne, dostosuj parametry, aby je poprawić. Porównaj rekonstrukcję karty SIM z obrazem o szerokim polu, aby zaobserwować poprawę rozdzielczości. Podczas wykonywania wielokolorowej mikroskopii oświetlenia strukturalnego należy użyć algorytmu wyrównania, aby prawidłowo wyrównać różne kanały, gdy zadowalająca rekonstrukcja jest gotowa

Pierścienie aktynowe w szkielecie okresowym błony mają charakterystyczny okresowy wygląd. Utwórz obraz projekcji o maksymalnej intensywności w oprogramowaniu do analizy obrazu, wykorzystując wszystkie płaszczyzny ogniskowe, w których widoczne są pierścienie aktynowe. Na obrazie projekcji o maksymalnej intensywności narysuj prostopadłą linię w poprzek widocznych sąsiednich pierścieni i zapisz intensywność fluorescencji wraz z funkcją profilu wykresu liniowego oprogramowania.

Aby obliczyć średnią odległość między pikami, należy zanotować lokalne maksima w profilu linii i zmierzyć odległość między poszczególnymi sąsiednimi pikami intensywności fluorescencji. Aby ocenić kolokalizację różnych białek z pierścieniami aktynowymi w błonowym szkielecie okresowym, należy przeprowadzić procedurę analizy kolokalizacji rekonstrukcji SIM aktyny i białka kandydującego. Ręcznie narysuj zaznaczenie, aby zdefiniować początkowy segment aksonu jako obszar zainteresowania, dla wtyczki łatwej kolokalizacji na platformie oprogramowania, i uruchom analizę, aby obliczyć współczynnik korelacji Pearsona dla kolokalizacji.

Podczas analizy obrazu SIM rekonstrukcje stosów obrazów wykazały wyraźną okresowość pierścieni aktynowych. Do wizualizacji ankyryny G użyto przeciwciała anty ankyryny G. Kolokalizację pierścieni ankyryny G i aktyny przetestowano w początkowym segmencie aksonu przy użyciu procedury analizy kolokalizacji w celu obliczenia współczynnika korelacji Pearsona. Współczynnik korelacji Pearsona dla kolokalizacji fluorescencji pierścieni ankyryny G i aktyny wynosił 0,36 plus minus 0,03.

Niezbędne jest użycie odpowiedniego olejku immersyjnego i dostosowanie mocy lasera oraz czasu naświetlania, aby linie siatki były widoczne. Po ustaleniu, że białko jest częścią błonowego szkieletu okresowego, można zbadać jego funkcję i ustalić w utrzymaniu okresowego szkieletu błonowego. Na przykład można przeanalizować wpływ strącenia białka na pierścienie aktynowe.

Rozwój technik mikroskopii superrozdzielczej jest powodem, dla którego wiemy, że początkowy segment aksonu zawiera błonowy szkielet okresowy składający się z pierścieni aktynowych, widma i ankyryny. Projekt SIM umożliwił naukowcom łatwą wizualizację okresowych składników szkieletu błony i przyjrzenie się pierścieniom aktynowym w żywych komórkach.