Name: Kwantyfikacja reaktywnych form tlenu za pomocą sondy dioctanu 2′,7′-dichlorofluoresceiny i cytometrii przepływowej w komórkach glejowych Müllera (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-05-13T14:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 25 s
Description: Poznaj metodę kwantyfikacji reaktywnych form tlenu w komórkach glejowych Müllera za pomocą sondy DCFH-DA i cytometrii przepływowej. Protokół umożliwia dokładne pomiary stresu oksydacyjnego w komórkach nerwowych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy chcieliby podziękować Maríi Pilar Crespo i Pauli Alejandrze Abadie z CIBICI (Centro de Investigaciones en Bioquímica Clínica e Inmunología, CONICET-UNC, Córdoba, Argentyna) za pomoc w cytometrii przepływowej oraz Gabrieli Furlan i Noelii Maldonado za pomoc w hodowli komórek. Dziękujemy również Victorowi Diazowi (Pro-Sekretarzowi ds. Komunikacji Instytucjonalnej FCQ) za produkcję i montaż wideo.
Ten artykuł został sfinansowany z grantów od Secretaría de Ciencia y Tecnología, Universidad Nacional de Córdoba (SECyT-UNC) Consolidar 2018-2021, Fondo para la Investigación Científica y Tecnológica (FONCyT), oraz Proyecto de Investigación en Ciencia y Tecnología (PICT) 2015 No 1314 (wszystkie dla M.C.S.).

<ol><li>Hoon, M., Okawa, H., Della Santina, L., Wong, R. O. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+architecture+of+the+retina%3A+Development+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Progress+in+Retinal+and+Eye+Research%22%5BJournal%5D)">Functional architecture of the retina: Development and disease.</a> Progress in Retinal and Eye Research. 42, 44-84 (2014).</li>
<li>Cowan, C. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+types+of+the+human+retina+and+its+organoids+at+single-cell+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Cell types of the human retina and its organoids at single-cell resolution.</a> Cell. 182 (6), 1623-1640 (2020).</li>
<li>Subirada, P. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+journey+into+the+retina%3A+M%C3%BCller+glia+commanding+survival+and+death%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">A journey into the retina: Müller glia commanding survival and death.</a> European Journal of Neuroscience. 47 (12), 1429-1443 (2018).</li>
<li>Coughlin, B. A., Feenstra, D. J., Mohr, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((M%C3%BCller+cells+and+diabetic+retinopathy%5BTitle%5D)+AND+%22Vision+Research%22%5BJournal%5D)">Müller cells and diabetic retinopathy.</a> Vision Research. 139, 93-100 (2017).</li>
<li>Goldman, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((M%C3%BCller+glial+cell+reprogramming+and+retina+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Neurosciences%22%5BJournal%5D)">Müller glial cell reprogramming and retina regeneration.</a> Nature Reviews Neurosciences. 15 (7), 431-442 (2014).</li>
<li>Kamalden, T. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exosomal+microRNA-15a+transfer+from+the+pancreas+augments+diabetic+complications+by+inducing+oxidative+stress%5BTitle%5D)+AND+%22Antioxidation+Redox+Signaling%22%5BJournal%5D)">Exosomal microRNA-15a transfer from the pancreas augments diabetic complications by inducing oxidative stress.</a> Antioxidation Redox Signaling. 27 (13), 913-930 (2017).</li>
<li>Feng, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcription+of+inflammatory+cytokine+TNF%CE%B1+is+upregulated+in+retinal+angiogenesis+under+hyperoxia%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Physiology+and+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Transcription of inflammatory cytokine TNFα is upregulated in retinal angiogenesis under hyperoxia.</a> Cell Physiology and Biochemistry. 39 (2), 573-583 (2016).</li>
<li>Rojas, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NOX2-induced+activation+of+arginase+and+diabetes-induced+retinal+endothelial+cell+senescence%5BTitle%5D)+AND+%22Antioxidants%22%5BJournal%5D)">NOX2-induced activation of arginase and diabetes-induced retinal endothelial cell senescence.</a> Antioxidants. 6 (2), 43(2017).</li>
<li>Sennlaub, F., Courtois, Y., Goureau, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inducible+nitric+oxide+synthase+mediates+retinal+apoptosis+in+ischemic+proliferative+retinopathy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Inducible nitric oxide synthase mediates retinal apoptosis in ischemic proliferative retinopathy.</a> Journal of Neuroscience. 22 (10), 3987-3993 (2002).</li>
<li>Wilkinson-Berka, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NADPH+oxidase%2C+NOX1%2C+mediates+vascular+injury+in+ischemic+retinopathy%5BTitle%5D)+AND+%22Antioxidation+and+Redox+Signaling%22%5BJournal%5D)">NADPH oxidase, NOX1, mediates vascular injury in ischemic retinopathy.</a> Antioxidation and Redox Signaling. 20 (17), 2726-2740 (2014).</li>
<li>Wang, H., Zhang, S. X., Hartnett, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Signaling+pathways+triggered+by+oxidative+stress+that+mediate+features+of+severe+retinopathy+of+prematurity%5BTitle%5D)+AND+%22JAMA+Ophthalmology%22%5BJournal%5D)">Signaling pathways triggered by oxidative stress that mediate features of severe retinopathy of prematurity.</a> JAMA Ophthalmology. 131 (1), 80-85 (2013).</li>
<li>Sies, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oxidative+stress%3A+a+concept+in+redox+biology+and+medicine%5BTitle%5D)+AND+%22Redox+Biology%22%5BJournal%5D)">Oxidative stress: a concept in redox biology and medicine.</a> Redox Biology. 4, 180-183 (2015).</li>
<li>Zorov, D. B., Juhaszova, M., Sollott, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+reactive+oxygen+species+%28ROS%29+and+ROS-induced+ROS+release%5BTitle%5D)+AND+%22Physiological+Reviews%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial reactive oxygen species (ROS) and ROS-induced ROS release.</a> Physiological Reviews. 94 (3), 909-950 (2014).</li>
<li>Navneet, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Excess+homocysteine+upregulates+the+NRF2-antioxidant+pathway+in+retinal+M%C3%BCller+glial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Experiments+in+Eye+Research%22%5BJournal%5D)">Excess homocysteine upregulates the NRF2-antioxidant pathway in retinal Müller glial cells.</a> Experiments in Eye Research. 178, 228-237 (2019).</li>
<li>Navneet, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hyperhomocysteinemia-induced+death+of+retinal+ganglion+cells%3A+The+role+of+M%C3%BCller+glial+cells+and+NRF2%5BTitle%5D)+AND+%22Redox+Biology%22%5BJournal%5D)">Hyperhomocysteinemia-induced death of retinal ganglion cells: The role of Müller glial cells and NRF2.</a> Redox Biology. 24, 101199(2019).</li>
<li>Wang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sigma+1+receptor+regulates+the+oxidative+stress+response+in+primary+retinal+M%C3%BCller+glial+cells+via+NRF2+signaling+and+system+xc%28-%29%2C+the+Na%28%2B%29-independent+glutamate-cystine+exchanger%5BTitle%5D)+AND+%22Free+Radical+Biology+and+Medicine%22%5BJournal%5D)">Sigma 1 receptor regulates the oxidative stress response in primary retinal Müller glial cells via NRF2 signaling and system xc(-), the Na(+)-independent glutamate-cystine exchanger.</a> Free Radical Biology and Medicine. 86, 25-36 (2015).</li>
<li>Nakamura, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nrf2+activator+RS9+suppresses+pathological+ocular+angiogenesis+and+hyperpermeability%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Ophthalmology+and+Visual+Science%22%5BJournal%5D)">Nrf2 activator RS9 suppresses pathological ocular angiogenesis and hyperpermeability.</a> Investigative Ophthalmology and Visual Science. 60 (6), 1943-1952 (2019).</li>
<li>Xu, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NRF2+plays+a+protective+role+in+diabetic+retinopathy+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetologia%22%5BJournal%5D)">NRF2 plays a protective role in diabetic retinopathy in mice.</a> Diabetologia. 57 (1), 204-213 (2014).</li>
<li>Chen, W. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nrf2+protects+photoreceptor+cells+from+photo-oxidative+stress+induced+by+blue+light%5BTitle%5D)+AND+%22Experiments+in+Eye+Research%22%5BJournal%5D)">Nrf2 protects photoreceptor cells from photo-oxidative stress induced by blue light.</a> Experiments in Eye Research. 154, 151-158 (2017).</li>
<li>Wei, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nrf2+in+ischemic+neurons+promotes+retinal+vascular+regeneration+through+regulation+of+semaphorin+6A%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Science+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Nrf2 in ischemic neurons promotes retinal vascular regeneration through regulation of semaphorin 6A.</a> Proceedings of the National Academy of Science of the United States of America. 112 (50), 6927-6936 (2015).</li>
<li>Wei, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nrf2+has+a+protective+role+against+neuronal+and+capillary+degeneration+in+retinal+ischemia-reperfusion+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Free+Radical+Biology+and+Medicine%22%5BJournal%5D)">Nrf2 has a protective role against neuronal and capillary degeneration in retinal ischemia-reperfusion injury.</a> Free Radical Biology and Medicine. 51 (1), 216-224 (2011).</li>
<li>Wei, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nrf2+acts+cell-autonomously+in+endothelium+to+regulate+tip+cell+formation+and+vascular+branching%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Science+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Nrf2 acts cell-autonomously in endothelium to regulate tip cell formation and vascular branching.</a> Proceedings of the National Academy of Science of the United States of America. 110 (41), 3910-3918 (2013).</li>
<li>Wei, Y., Gong, J., Xu, Z., Duh, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nrf2+promotes+reparative+angiogenesis+through+regulation+of+NADPH+oxidase-2+in+oxygen-induced+retinopathy%5BTitle%5D)+AND+%22Free+Radical+Biology+and+Medicine%22%5BJournal%5D)">Nrf2 promotes reparative angiogenesis through regulation of NADPH oxidase-2 in oxygen-induced retinopathy.</a> Free Radical Biology and Medicine. 99, 234-243 (2016).</li>
<li>Xu, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuroprotective+role+of+Nrf2+for+retinal+ganglion+cells+in+ischemia-reperfusion%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurochemistry%22%5BJournal%5D)">Neuroprotective role of Nrf2 for retinal ganglion cells in ischemia-reperfusion.</a> Journal of Neurochemistry. 133 (2), 233-241 (2015).</li>
<li>Armstrong, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advanced+protocols+in+oxidative+stress+III%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Advanced protocols in oxidative stress III.</a> Methods in Molecular Biology. 1208, (2015).</li>
<li>Shehat, M. G., Tigno-Aranjuez, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow+cytometric+measurement+of+ROS+production+in+macrophages+in+response+to+Fc%CE%B3R+cross-linking%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Flow cytometric measurement of ROS production in macrophages in response to FcγR cross-linking.</a> Journal of Visualized Experiments. (145), e59167(2019).</li>
<li>Wu, D., Yotnda, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+and+detection+of+reactive+oxygen+species+%28ROS%29+in+cancers%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Production and detection of reactive oxygen species (ROS) in cancers.</a> Journal of Visualized Experiments. (57), e3357(2011).</li>
<li>Halliwell, B., Whiteman, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measuring+reactive+species+and+oxidative+damage+in+vivo+and+in+cell+culture%3A+how+should+you+do+it+and+what+do+the+results+mean%5BTitle%5D)+AND+%22British+Journal+of+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">Measuring reactive species and oxidative damage in vivo and in cell culture: how should you do it and what do the results mean.</a> British Journal of Pharmacology. 142 (2), 231-255 (2004).</li>
<li>Kalyanaraman, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measuring+reactive+oxygen+and+nitrogen+species+with+fluorescent+probes%3A+challenges+and+limitations%5BTitle%5D)+AND+%22Free+Radical+Biology+and+Medicine%22%5BJournal%5D)">Measuring reactive oxygen and nitrogen species with fluorescent probes: challenges and limitations.</a> Free Radical Biology and Medicine. 52 (1), 1-6 (2012).</li>
<li>Fernandes, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+DHE-derived+oxidation+products+by+HPLC+in+the+assessment+of+superoxide+production+and+NADPH+oxidase+activity+in+vascular+systems%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology+and+Cell+Physiology%22%5BJournal%5D)">Analysis of DHE-derived oxidation products by HPLC in the assessment of superoxide production and NADPH oxidase activity in vascular systems.</a> American Journal of Physiology and Cell Physiology. 292 (1), 413-422 (2007).</li>
<li>Zielonka, J., Kalyanaraman, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hydroethidine-+and+MitoSOX-derived+red+fluorescence+is+not+a+reliable+indicator+of+intracellular+superoxide+formation%3A+another+inconvenient+truth%5BTitle%5D)+AND+%22Free+Radical+Biology+and+Medicine%22%5BJournal%5D)">Hydroethidine- and MitoSOX-derived red fluorescence is not a reliable indicator of intracellular superoxide formation: another inconvenient truth.</a> Free Radical Biology and Medicine. 48 (8), 983-1001 (2010).</li>
<li>Roelofs, B. A., Ge, S. X., Studlack, P. E., Polster, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Low+micromolar+concentrations+of+the+superoxide+probe+MitoSOX+uncouple+neural+mitochondria+and+inhibit+complex+IV%5BTitle%5D)+AND+%22Free+Radical+Biology+and+Medicine%22%5BJournal%5D)">Low micromolar concentrations of the superoxide probe MitoSOX uncouple neural mitochondria and inhibit complex IV.</a> Free Radical Biology and Medicine. 86, 250-258 (2015).</li>
</ol>

Autorzy nie mają do ujawnienia żadnych konfliktów interesów.

Kilka stanów patologicznych, takich jak rak, choroby zapalne, niedokrwienie/reperfuzja, choroba niedokrwienna serca, cukrzyca i retinopatie, a także sytuacje fizjologiczne, takie jak starzenie się, prowadzi do nadprodukcji ROS 6,7,8,9,10,11. Dlatego wykrywanie, pomiar i zrozumienie szlaku zaangażowanego w modulację ROS jest ...

Siatkówka nerwowa to bardzo zorganizowana tkanka, która posiada dobrze zdefiniowane warstwy neuronalne. W nich neurony (komórki ganglionowe, amakrynowe, dwubiegunowe, poziome i fotoreceptorowe) są połączone ze sobą, a także z komórkami glejowymi Müllera (MGC) i astrocytami, co prowadzi do odpowiedniej fototransdukcji i przetwarzania informacji wizualnej1,2. Wiadomo, że MGC odgrywają ważną rolę w utrzymaniu homeostazy siatkówki, ponieważ przecinają cały odcinek siatkówki, a tym samym mogą wchodzić w interakcje ze wszystkimi typami komórek, które modulują wiele procesów ochronnych. Doniesiono, że MGC pełnią kilka ważnych funkcji dla utrzymania i przetrwania neuronów siatkówki, w tym glikolizę w celu dostarczania energii neuronom, usuwanie odpadów neuronalnych, recykling neuroprzekaźników i uwalnianie czynników neurotroficznych, między innymi3,4,5.
Z drugiej strony, stany zapalne, stres oksydacyjny i nitrosative są zaangażowane w patogenezę i postęp wielu chorób ludzkich, w tym retinopatii6,7,8,9,10,11. Równowaga redoks w komórkach zależy od ścisłej regulacji poziomu ROS. ROS są stale generowane w warunkach fizjologicznych, głównie w wyniku oddychania tlenowego. Głównymi członkami rodziny ROS są reaktywne wolne rodniki, takie jak anion ponadtlenkowy (O2͘͘͘͘•−), rodniki hydroksylowe (•OH), różne nadtlenki (ROOR′), wodoronadtlenki (ROOH) i bezrodnikowy nadtlenek wodoru (H2O2)12,13. W ostatnich latach stało się jasne, że ROS odgrywa ważną rolę sygnalizacyjną w komórkach, kontrolując podstawowe procesy. MGC mają silną obronę antyoksydacyjną poprzez aktywację czynnika 2 związanego z erytroidem-2 (Nrf2) i późniejszą ekspresję białek przeciwutleniających w celu wyeliminowania nadmiernej produkcji ROS w warunkach patologicznych14,15,16. Kiedy komórki tracą równowagę redoks z powodu nadmiernej produkcji ROS lub wadliwej zdolności do usuwania ROS, akumulacja stresu oksydacyjnego sprzyja szkodliwym modyfikacjom białek, lipidów i DNA, prowadząc do stresu komórkowego lub śmierci. Wzrost systemu obrony antyoksydacyjnej siatkówki poprawia rozdzielczość i zapobieganie retinopatiom, takim jak ROP i RD17,18,19,20,21,22,23,24. Dlatego pomiar produkcji ROS w czasie rzeczywistym jest potężnym i użytecznym narzędziem.
Istnieje kilka metod pomiaru produkcji ROS lub stresu oksydacyjnego w komórkach. Wśród nich sonda dioctanu 2′,7′-dichlorofluoresceiny (DCFH-DA) jest jedną z najczęściej stosowanych technik bezpośredniego ilościowego określania stanu redoks komórki<klasa sup="xref">25,26,27,28. Ta sonda jest lipofilowa i niefluorescencyjna. Dyfuzja tej sondy przez błonę komórkową umożliwia jej rozszczepienie przez wewnątrzkomórkowe esterazy na dwóch wiązaniach estrowych, wytwarzając stosunkowo polarny i nieprzepuszczalny dla błony komórkowej produkt, 2′,7′-dichlorofluoresceinę (H2DCF). Ta niefluorescencyjna cząsteczka gromadzi się wewnątrzkomórkowo, a następnie utlenianie przez ROS daje wysoce fluorescencyjny produkt DCF. Utlenianie sondy jest produktem działania wielu rodzajów ROS (nadtlenoazotynów, rodników hydroksylowych, tlenku azotu lub nadtlenków), które można wykryć za pomocą cytometrii przepływowej lub mikroskopii konfokalnej (emisja przy 530 nm i wzbudzenie przy 485 nm). Ograniczeniem tej techniki jest to, że nadtlenek i nadtlenek wodoru nie reagują silnie z H2DCF25,29. W tym artykule używamy sondy DCFH-DA do pomiaru i ilościowego oznaczania ROS za pomocą cytometrii przepływowej. Z tego powodu indukujemy produkcję ROS poprzez stymulację MGC za pomocą induktora ROS, A lub B, przed załadowaniem komórek sondą fluorescencyjną. Dodatkowo stosujemy związek przeciwutleniający. Na koniec pokazujemy reprezentatywne i wiarygodne dane uzyskane za pomocą tego protokołu.

<table><tbody><tr><td>2&prime;,7&prime;-DCFH-DA</td><td>Sigma</td><td>35845-1G</td><td></td></tr><tr><td>Kwas 4-(2-hydroksyetylo)-1-piperazynoetanosulfonowy (HEPES)</td><td>Gibco firmy life technologies</td><td>15630-080</td><td></td></tr><tr><td>Cytometr przepływowy BD FACSCanto II</td><td>BD Biosciences</td><td>FACSCanto</td><td></td></tr><tr><td>BD FACSDiva oprogramowanie</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Naczynia do hodowli komórkowych 100x20 mm</td><td>Cell Star- Greiner Bio-One</td><td>664 160</td><td></td></tr><tr><td>Wirówka</td><td>Thermo</td><td>Sorvall legend micro 17 R</td><td></td></tr><tr><td>Probówki wirówkowe (15 ml)</td><td>Probówki</td> wirówkowe BIOFIL <td>CFT011150</td><td></td></tr><tr><td>(50 ml)</td><td>BIOFIL</td><td>CFT011500</td><td></td></tr><tr><td>Cryovial</td><td>CRYO. S - Greiner Bio-One</td><td>126263</td><td></td></tr><tr><td>Dimethylsulfoxide</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>W387520-1KG</td><td></td></tr><tr><td>Fosforan disodowo-wodorowy siedmiowodny</td><td>Merck</td><td>106575</td><td></td></tr><tr><td>DMEM bez czerwieni fenolowej</td><td>Gibco firmy life technologies</td><td>31053-028</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco' s zmodyfikowany Orzeł" s medium (DMEM)</td><td>Gibco by life technologies</td><td>11995065</td><td></td></tr><tr><td>Kwas etylenodiaminotetraoctowy (EDTA), sól disodowa, dwuwodzian</td><td>Merck</td><td>324503</td><td></td></tr><tr><td>Płodowa surowica bydlęca</td><td>Internegocios</td><td></td><td></td></tr><tr><td>FlowJo v10 Oprogramowanie</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Glukoza</td><td>Merck</td><td>108337</td><td></td></tr><tr><td>hemocytometr, komora Neubauera</td><td>BOECO,Niemcy</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Okap z przepływem laminarnym</td><td>ESCO</td><td>AC2-6E8</td><td></td></tr><tr><td>L-glutamina (GlutaMAX)</td><td>Gibco by life technologies</td><td>A12860-01</td><td></td></tr><tr><td>MitoSOX Red</td><td>Invitrogen</td><td>&nbsp; M36008</td><td></td></tr><tr><td>Penicylina/Streptomycyna</td><td>Gibco firmy life technologies</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek potasu</td><td>Merck</td><td>104936</td><td></td></tr><tr><td>Diwodorofosforan potasu</td><td>Merck</td><td>4878</td><td></td></tr><tr><td>Okrągłe rurki polistyrenowe 5 ml (probówki do cytometrii przepływowej)</td><td>Falcon - Corning</td><td>BD-352008</td><td></td></tr><tr><td>Azydek sodu</td><td>Merck</td><td>822335</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek sodu</td><td>Merck</td><td>106404</td><td></td></tr><tr><td>Wodorotlenek sodu</td><td>Merck</td><td>106462</td><td></td></tr><tr><td>Mikroprobówka wirówkowa SPINWIN 1,5 ml</td><td>Tarson</td><td>500010-N</td><td></td></tr><tr><td>Płytka do kultur tkankowych 6-dołkowa</td><td>BIOFIL</td><td>TCP011006</td><td></td></tr><tr><td>Trypan Blue</td><td>Merck</td><td>111732</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA 0,5% 10X</td><td>Gibco firmy life technologies</td><td>15400-054</td><td></td></tr><tr><td>Mieszalnik wirowy</td><td>Labnet International, Inc.</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

kwantyfikacja reaktywnych form tlenu za pomocą sondy dioctanu 2′,7′-dichlorofluoresceiny i cytometrii przepływowej w komórkach glejowych müllera

Quantification of Reactive Oxygen Species Using 2&#8242;,7&#8242;-Dichlorofluorescein Diacetate Probe and Flow-Cytometry in M&#252;ller Glial Cells

Równowaga redoks odgrywa ważną rolę w utrzymaniu homeostazy komórkowej. Zwiększona generacja reaktywnych form tlenu (ROS) sprzyja modyfikacji białek, lipidów i DNA, co ostatecznie może prowadzić do zmiany funkcji komórkowych i śmierci komórki. Dlatego korzystne dla komórek jest zwiększenie obrony antyoksydacyjnej w odpowiedzi na szkodliwe zniewagi, albo poprzez aktywację szlaku przeciwutleniającego, takiego jak Keap1 / Nrf2, albo poprzez poprawę zmiataczy redoks (między innymi witaminy A, C i E, β-karoten i polifenole). Stan zapalny i stres oksydacyjny są zaangażowane w patogenezę i progresję retinopatii, takich jak retinopatia cukrzycowa (DR) i retinopatia wcześniaków (ROP). Ponieważ komórki glejowe Müllera (MGC) odgrywają kluczową rolę w homeostazie nerwowej tkanki siatkówki, uważa się je za idealny model do badania tych komórkowych mechanizmów ochronnych. W tym sensie ilościowe określenie poziomów ROS za pomocą powtarzalnej i prostej metody jest niezbędne do oceny udziału szlaków lub cząsteczek, które uczestniczą w mechanizmie obrony komórek przeciwutleniających. W tym artykule przedstawiamy pełny opis procedur wymaganych do pomiaru ROS za pomocą sondy DCFH-DA i cytometrii przepływowej w MGC. Przedstawiono tutaj kluczowe kroki przetwarzania danych cytometrii przepływowej za pomocą oprogramowania, dzięki czemu czytelnicy będą mogli mierzyć poziomy ROS (geometryczne średnie FITC) i analizować histogramy fluorescencji. Narzędzia te są bardzo pomocne nie tylko w ocenie wzrostu ROS po uszkodzeniu komórkowym, ale także w badaniu działania przeciwutleniającego niektórych cząsteczek, które mogą działać ochronnie na komórki.

Zgodnie z opisem w sekcji protokołu, przedstawiliśmy reprezentatywne dane ilościowe wykazujące detekcję produkcji ROS za pomocą cytometrii przepływowej z użyciem sondy fluorescencyjnej DCFH-DA w komórkach MIO-M1 stymulowanych induktorem ROS, A lub B. Zgodnie z oczekiwaniami, zaobserwowaliśmy zmiany w fluorescencji FITC w komórkach niestymulowanych powyżej poziomów autofluorescencji (Rysunek 1A, porównanie „basal control” vs. „autofluorescence control”, wykresy kropkowe). Wynikało to z podsta...

Tutaj proponujemy usystematyzowany, dostępny i powtarzalny protokół do wykrywania komórkowych reaktywnych form tlenu (ROS) za pomocą sondy dioctanu 2′,7′-dichlorofluoresceiny (DCFH-DA) w komórkach glejowych Müllera (MGC). Ta metoda określa ilościowo całkowite komórkowe poziomy ROS za pomocą cytometru przepływowego. Ten protokół jest bardzo łatwy w użyciu, odpowiedni i powtarzalny.

Kwantyfikacja reaktywnych form tlenu za pomocą sondy dioctanu 2′,7′-dichlorofluoresceiny i cytometrii przepływowej w komórkach glejowych Müllera

The redox balance has an important role in maintaining cellular homeostasis. The increased generation of reactive oxygen species (ROS) promotes the ...

Istnieje kilka metod pomiaru produkcji ROS, czyli stresu oksydacyjnego w komórkach. Wśród nich sonda dioctanu 2'7'dichlorofluoresceiny jest jedną z najczęściej stosowanych technik bezpośredniego pomiaru stanu redoks. Ta sonda jest lipofilowa i niefluorescencyjna. Dyfuzja tej sondy przez błonę komórkową umożliwia rozszczepienie esterazy wewnątrzkomórkowych w dwóch wiązaniach estrowych, wytwarzając stosunkowo polarny i nieprzepuszczalny dla błony komórkowej produkt. Te niefluorescencyjne cząsteczki gromadzą się wewnątrzkomórkowo, a następnie utlenianie przez ROS daje wysoce fluorescencyjny produkt dichlorofluoresceinę. Utlenianie sondy jest produktem działania wielu rodzajów ROS. Które można wykryć za pomocą cytometrii przepływowej lub mikroskopii konfokalnej. W tym artykule użyliśmy sondy dioctanu dichlorofluoresceiny do pomiaru i ilościowego oznaczania ROS za pomocą cytometrii przepływowej. Przenieść płytki 6-dołkowe z inkubatora do okapu z przepływem laminarnym. Odessać supernatant. I umyj komórki raz za pomocą PBS. Dodaj 2 ml DMEM o niskiej surowicy na dołek. I inkubować 6-dołkową płytkę przez dwie godziny w inkubatorze. Traktuj komórki przeciwutleniaczem przez sześć godzin. Traktuj komórki induktorem ROS, A lub B, przez 30 minut. Odessać supernatant. I umyj komórkę trzy razy PBS, aby usunąć wszystkie bodźce. Wyłącz światło okapu z przepływem laminarnym i pracuj w ciemności. Dodać 1 ml sondy dioctanu dichlorofluoresceiny w DMEM bez czerwieni fenolowej. Dodaj 1 ml DMEM bez czerwieni fenolowej do kontrolnych komórek kontrolnych autofluorescencji. Inkubować 6-dołkową płytkę przez 30 minut w inkubatorze. Przenieś płytki na lodzie do laboratorium. Umyj komórki trzy razy 2 ml zimnego PBS na studzienkę. Dodać 0,5 ml zimnego buforu odłączającego do każdej studzienki. Zbierz komórki, delikatnie pipetując w górę i w dół za pomocą pipety P1000. Zbierz je do oznaczonej probówki o pojemności 1,5 ml. I odwirować je przy 600 x g przez pięć minut w temperaturze 4 C. Ostrożnie odrzucić supernatant i delikatnie oddzielić osad przez stukanie. Dodaj 1 ml buforu FACS, aby przepłukać komórki do każdej oznakowanej probówki. Jeśli jest to konieczne, użyj wiru o najniższej intensywności, aby całkowicie zdysocjować osad. Odwiruj je w temperaturze 600 x g przez pięć minut w temperaturze 4 C. Powtórz ten krok jeszcze dwa razy. W sumie trzy prania. Zawiesić granulki komórkowe w 200 l bufora FACS. Delikatnie całkowicie rozdziel osad w każdej probówce za pomocą wiru. I przenieś do oznaczonych 5 ml dla probówek cytometru przepływowego. Trzymaj probówki na lodzie do czasu analizy na cytometrze przepływowym. Korzystając z oprogramowania do cytometrii przepływowej, utwórz nowy eksperyment. Kliknij próbkę, a otworzy się lista probówek. Kliknij dwukrotnie i zmień ich nazwy. Umieść rurkę kontrolującą autofluorescencję na ramieniu aspiratora, ostrożnie przesuwając podstawę tylko w lewo. Kliknij opcję Pobierz dane, a następnie pozycję Zapisz dane i wybierz żądany warunek zatrzymania. Narysuj bramę wokół interesujących komórek, z wyłączeniem martwych komórek i gruzu. Wyjmij rurkę. Kliknij przycisk Następna probówka i uruchom podstawową próbkę kontrolną. Kliknij przycisk Pobierz dane, a następnie w obszarze Nagraj dane.Otwórz oprogramowanie. Dodaj próbki za pomocą przycisku akcji Dodaj próbki. Kliknij przycisk Dodaj próbkę.Wybierz folder Data eksperymentu, a następnie kliknij przycisk Wybierz.Kliknij dwukrotnie pierwszą próbkę w obszarze roboczym, w tym przypadku jest to kontrola autofluorescencji. Narysuj bramkę wielokątną, aby wyizolować komórkę zainteresowania, z wyłączeniem martwych komórek i szczątków. Zmień wykres na histogram. Kliknij dwukrotnie w obrębie litery M

quantification-reactive-oxygen-species-using-27-dichlorofluorescein

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Ten film demonstruje test cytometrii przepływowej do ilościowego określenia poziomów ROS w organoidach jelitowych 3D uzyskanych od transgenicznych myszy wykazujących ekspresję GFP. Metoda ta zapewnia eksperymentalny model in vitro do zbadania skuteczności badanych związków w produkcji ROS.

Test cytometrii przepływowej do ilościowego określania stresu oksydacyjnego: Test do ilościowego określania reaktywnych form tlenu w organoidach jelitowych za pomocą sond fluorogennych

Ten film demonstruje cytometrię przepływową do pomiaru wychwytu mikrogleju przez fluorescencyjne biocząstki po dostrzodowisku do ciała szklistego w oku myszy. Cytometria przepływowa wykrywa żywe komórki wykazujące ekspresję CD11b i odróżnia fagocytarne komórki mikrogleju wykazujące zieloną fluorescencję od innych komórek szpikowych, w tym monocytów eksprymujących Ly6C i neutrofili wykazujących ekspresję Ly6G.

Pomiar wychwytu mikrogleju przez cząstki fluorescencyjne dostarczane do ciała szklistkowego za pomocą cytometrii przepływowej

Fagocytoza mikrogleju jest kluczowa dla utrzymania homeostazy tkanek, a nieodpowiednia funkcja fagocytarna została zamieszana w patologię. Jednak ocena funkcji mikrogleju in vivo jest technicznie trudna. Opracowaliśmy prostą, ale solidną technikę precyzyjnego monitorowania i ilościowego określania potencjału fagocytarnego mikrogleju w warunkach fizjologicznych.

Ocena funkcji fagocytarnej mikrogleju siatkówki in vivo przy użyciu testu opartego na cytometrii przepływowej

To badanie demonstruje użycie cytometrii przepływowej do wykrywania produkcji reaktywnych form tlenu (ROS) wynikającej z aktywacji FcγR. Metoda ta może być stosowana do oceny zmian w funkcji sygnalizacji przeciwdrobnoustrojowej i redoks fagocytów w odpowiedzi na kompleksy immunologiczne, opsonizowane mikroorganizmy lub bezpośrednie sieciowanie FcγR.

Pomiar cytometryczny przepływu produkcji ROS w makrofagach w odpowiedzi na sieciowanie FcγR

Opisujemy metodę użycia wieloparametrowej cytometrii przepływowej do wykrywania mitochondrialnych reaktywnych form tlenu (ROS) w mysich zdrowych hematopoetycznych komórkach macierzystych i progenitorowych (HSPC) oraz komórkach białaczkowych z mysiego modelu ostrej białaczki szpikowej (AML) sterowanej przez MLL-AF9.

Analiza cytometryczna przepływowa mitochondrialnych reaktywnych form tlenu w mysich hematopoetycznych komórkach macierzystych i progenitorowych oraz białaczka napędzana przez MLL-AF9

Tutaj prezentujemy protokół wykrywania całkowitej komórkowej reaktywnej formy tlenu (ROS) za pomocą dioctanu 2',7'-dichlorodihydrofluoresceiny (DCFH-DA). Ta metoda może wizualizować komórkową lokalizację ROS w przylegających komórkach za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego i określać ilościowo intensywność ROS za pomocą czytnika płytek fluorescencyjnych. Ten protokół jest prosty, wydajny i opłacalny.

Wykrywanie całkowitych reaktywnych form tlenu w przylegających komórkach za pomocą barwienia dioctianem 2',7'-dichlorodihydrofluoresceiny

Ten protokół opisuje ocenę statusu redoks specyficznego dla kompartmentu subkomórkowego w komórce. Wrażliwa na redoks sonda fluorescencyjna umożliwia wygodną analizę ratiometryczną w nienaruszonych komórkach.

Ocena utleniania komórkowego przy użyciu subkomórkowego białka zielonej fluorescencji wrażliwego na redoks specyficznego dla przedziału subkomórkowego

Tutaj prezentujemy metodę opartą na cytometrii przepływowej do wizualizacji i kwantyfikacji wielu markerów związanych ze starzeniem się w pojedynczych komórkach.

Jednoczesne obrazowanie i wykrywanie za pomocą cytometrii przepływowej wielu fluorescencyjnych markerów starzenia w starczych komórkach nowotworowych wywołanych terapią

Ta praca opisuje protokół do kwantyfikacji globalnych modyfikacji histonów za pomocą wewnątrzjądrowej cytometrii przepływowej w izolowanym mikrogleju mózgu. Praca zawiera również protokół izolacji mikrogleju, który został wykorzystany do zebrania danych.

Kwantyfikacja globalnych modyfikacji potranslacyjnych histonów za pomocą wewnątrzjądrowej cytometrii przepływowej w izolowanym mikrogleju mózgu myszy

Tutaj prezentujemy dwa protokoły do ilościowego oznaczania pochłaniania mikrogleju przez synapsy vGLUT1-dodatnie oraz surowych synaptosomów pHRodo znakowanych na czerwono za pomocą cytometrii przepływowej.

Kwantyfikacja pochłaniania mikrogleju przez materiał synaptyczny za pomocą cytometrii przepływowej

Poznaj metodę kwantyfikacji reaktywnych form tlenu w komórkach glejowych Müllera za pomocą sondy DCFH-DA i cytometrii przepływowej. Protokół umożliwia dokładne pomiary stresu oksydacyjnego w komórkach nerwowych.

Kwantyfikacja reaktywnych form tlenu za pomocą sondy dioctanu 2′,7′-dichlorofluoresceiny i cytometrii przepływowej w komórkach glejowych Müllera (Wideo) | JoVE Journal

Kwantyfikacja reaktywnych form tlenu za pomocą sondy dioctanu 2′,7′-dichlorofluoresceiny i cytometrii przepływowej w komórkach glejowych Müllera

Przeglądaj więcej filmów