Kwantyfikacja reaktywnych form tlenu za pomocą sondy dioctanu 2′,7′-dichlorofluoresceiny i cytometrii przepływowej w komórkach glejowych Müllera
13 maja 2022
Tutaj proponujemy usystematyzowany, dostępny i powtarzalny protokół do wykrywania komórkowych reaktywnych form tlenu (ROS) za pomocą sondy dioctanu 2′,7′-dichlorofluoresceiny (DCFH-DA) w komórkach glejowych Müllera (MGC). Ta metoda określa ilościowo całkowite komórkowe poziomy ROS za pomocą cytometru przepływowego. Ten protokół jest bardzo łatwy w użyciu, odpowiedni i powtarzalny.
Istnieje kilka metod pomiaru produkcji ROS, czyli stresu oksydacyjnego w komórkach. Wśród nich sonda dioctanu 2'7'dichlorofluoresceiny jest jedną z najczęściej stosowanych technik bezpośredniego pomiaru stanu redoks. Ta sonda jest lipofilowa i niefluorescencyjna. Dyfuzja tej sondy przez błonę komórkową umożliwia rozszczepienie esterazy wewnątrzkomórkowych w dwóch wiązaniach estrowych, wytwarzając stosunkowo polarny i nieprzepuszczalny dla błony komórkowej produkt. Te niefluorescencyjne cząsteczki gromadzą się wewnątrzkomórkowo, a następnie utlenianie przez ROS daje wysoce fluorescencyjny produkt dichlorofluoresceinę. Utlenianie sondy jest produktem działania wielu rodzajów ROS. Które można wykryć za pomocą cytometrii przepływowej lub mikroskopii konfokalnej. W tym artykule użyliśmy sondy dioctanu dichlorofluoresceiny do pomiaru i ilościowego oznaczania ROS za pomocą cytometrii przepływowej. Przenieść płytki 6-dołkowe z inkubatora do okapu z przepływem laminarnym. Odessać supernatant. I umyj komórki raz za pomocą PBS. Dodaj 2 ml DMEM o niskiej surowicy na dołek. I inkubować 6-dołkową płytkę przez dwie godziny w inkubatorze. Traktuj komórki przeciwutleniaczem przez sześć godzin. Traktuj komórki induktorem ROS, A lub B, przez 30 minut. Odessać supernatant. I umyj komórkę trzy razy PBS, aby usunąć wszystkie bodźce. Wyłącz światło okapu z przepływem laminarnym i pracuj w ciemności. Dodać 1 ml sondy dioctanu dichlorofluoresceiny w DMEM bez czerwieni fenolowej. Dodaj 1 ml DMEM bez czerwieni fenolowej do kontrolnych komórek kontrolnych autofluorescencji. Inkubować 6-dołkową płytkę przez 30 minut w inkubatorze. Przenieś płytki na lodzie do laboratorium. Umyj komórki trzy razy 2 ml zimnego PBS na studzienkę. Dodać 0,5 ml zimnego buforu odłączającego do każdej studzienki. Zbierz komórki, delikatnie pipetując w górę i w dół za pomocą pipety P1000. Zbierz je do oznaczonej probówki o pojemności 1,5 ml. I odwirować je przy 600 x g przez pięć minut w temperaturze 4 C. Ostrożnie odrzucić supernatant i delikatnie oddzielić osad przez stukanie. Dodaj 1 ml buforu FACS, aby przepłukać komórki do każdej oznakowanej probówki. Jeśli jest to konieczne, użyj wiru o najniższej intensywności, aby całkowicie zdysocjować osad. Odwiruj je w temperaturze 600 x g przez pięć minut w temperaturze 4 C. Powtórz ten krok jeszcze dwa razy. W sumie trzy prania. Zawiesić granulki komórkowe w 200 l bufora FACS. Delikatnie całkowicie rozdziel osad w każdej probówce za pomocą wiru. I przenieś do oznaczonych 5 ml dla probówek cytometru przepływowego. Trzymaj probówki na lodzie do czasu analizy na cytometrze przepływowym. Korzystając z oprogramowania do cytometrii przepływowej, utwórz nowy eksperyment. Kliknij próbkę, a otworzy się lista probówek. Kliknij dwukrotnie i zmień ich nazwy. Umieść rurkę kontrolującą autofluorescencję na ramieniu aspiratora, ostrożnie przesuwając podstawę tylko w lewo. Kliknij opcję Pobierz dane, a następnie pozycję Zapisz dane i wybierz żądany warunek zatrzymania. Narysuj bramę wokół interesujących komórek, z wyłączeniem martwych komórek i gruzu. Wyjmij rurkę. Kliknij przycisk Następna probówka i uruchom podstawową próbkę kontrolną. Kliknij przycisk Pobierz dane, a następnie w obszarze Nagraj dane.Otwórz oprogramowanie. Dodaj próbki za pomocą przycisku akcji Dodaj próbki. Kliknij przycisk Dodaj próbkę.Wybierz folder Data eksperymentu, a następnie kliknij przycisk Wybierz.Kliknij dwukrotnie pierwszą próbkę w obszarze roboczym, w tym przypadku jest to kontrola autofluorescencji. Narysuj bramkę wielokątną, aby wyizolować komórkę zainteresowania, z wyłączeniem martwych komórek i szczątków. Zmień wykres na histogram. Kliknij dwukrotnie w obrębie litery M
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejsze badanie przedstawia protokół wykrywania poziomu wewnątrzkomórkowych reaktywnych form tlenu (ROS) z wykorzystaniem sondy 2′,7′-dichlorofluorescein diacetate (DCFH-DA) w komórkach glejowych Müllera (MGCs). Metoda ta została opracowana tak, aby była przystępna, powtarzalna i umożliwiała ilościowe oznaczenie ROS za pomocą cytometrii przepływowej.
Kluczowe komponenty badania
Dziedzina nauki
- Biologia komórki
- Stres oksydacyjny
- Neuronauka
Wstęp
- Reaktywne formy tlenu (ROS) odgrywają kluczową rolę w różnych procesach komórkowych.
- Pomiar poziomu ROS jest niezbędny do zrozumienia stresu oksydacyjnego w komórkach.
- Sonda DCFH-DA jest powszechnie stosowaną metodą wykrywania ROS.
- Protokół kładzie nacisk na powtarzalność i łatwość zastosowania.
Cel badania
- Aby zapewnić przejrzysty protokół wykrywania ROS w komórkach glejowych Müllera.
- Aby umożliwić kwantyfikację stresu oksydacyjnego w komórkach neuronalnych.
- Aby ułatwić badania nad rolą ROS w funkcji gleju i neurobiologii.
Zastosowane metody
- W celu stworzenia modelu biologicznego przeprowadzono hodowlę komórkową komórek glejowych Müllera.
- Komórki poddano działaniu przeciwutleniaczy oraz induktorów ROS w celu oceny poziomu ROS.
- Do detekcji ROS wykorzystano sondę DCFH-DA, a ilościowe oznaczenie przeprowadzono za pomocą cytometrii przepływowej.
- Kluczowe etapy obejmowały przemywanie komórek w PBS oraz kontrolowanie ekspozycji na światło podczas przeprowadzania analiz.
Główne wyniki
- Protokół skutecznie pozwolił na pomiar poziomu wewnątrzkomórkowych ROS w komórkach glejowych Müllera.
- Cytometria przepływowa zapewniła ilościową analizę akumulacji ROS.
- Wyniki potwierdziły możliwość zastosowania sondy DCFH-DA w określonych warunkach.
Wnioski
- Niniejsze badanie ustanawia wiarygodną metodę oceny stresu oksydacyjnego w komórkach glejowych.
- Protokół ten upraszcza pomiar ROS, zwiększając dostępność metody dla badaczy.
- Wyniki mają znaczenie dla zrozumienia stresu oksydacyjnego w neurobiologii oraz potencjalnych celów terapeutycznych.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Ilościowy pomiar reaktywnych form tlenu (ROS) w komórkach glejowych Müllera z wykorzystaniem DCFH-DA i cytometrii przepływowej umożliwia rzetelną ocenę mechanizmów stresu oksydacyjnego istotnych dla modeli chorób neurodegeneracyjnych i siatkówki. Możliwość ta wspiera wczesną walidację celów oraz ograniczanie ryzyka mechanistycznego w zakresie modulacji szlaków antyoksydacyjnych. Wiarygodna kwantyfikacja ROS dostarcza informacji niezbędnych do podejmowania decyzji portfelowych dotyczących cząsteczek kandydujących, których celem jest homeostaza redoks w systemach istotnych dla danej jednostki chorobowej.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Umożliwia badanie aktywacji ścieżek antyoksydacyjnych i modulacji redoks w modelach komórek glejowych.
- Wspiera walidację funkcjonalną celów zaangażowanych w stres oksydacyjny i mechanizmy obrony komórkowej.
- Zapewnia redukcję ryzyka mechanistycznego dla potencjalnych interwencji wpływających na poziomy ROS.
Przesiew i opracowywanie testów
- Ułatwia przygotowanie walidowanych układów komórkowych do przesiewania związków pod kątem punktów końcowych stresu oksydacyjnego.
- Zapewnia zestandaryzowane, ilościowe odczyty ROS, odpowiednie dla powtarzalności testu i porównań między badaniami.
- Umożliwia wiarygodną ocenę efektów związków przeciwutleniających lub prooksydacyjnych w skalowalnym formacie.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Jest zgodne z modelami chorób istotnymi dla patologii siatkówki związanych ze stresem oksydacyjnym, takich jak retinopatia cukrzycowa.
- Wspiera ciągłość translacyjną poprzez powiązanie modulacji ROS in vitro ze strategiami biomarkerów przedklinicznych.
- Umożliwia dostosowanie ryzyka w rozwoju kandydatów na antyoksydanty w oparciu o ilościowe wyniki komórkowe.
Integracja potoku i przepływu pracy
Ten schemat kwantyfikacji ROS znajduje zastosowanie na etapie wczesnego odkrywania oraz identyfikacji związków wiodących, wspierając zarówno testowanie hipotez, jak i integrację z późniejszymi badaniami przesiewowymi.
- Biologia odkrywcza: dostarcza ilościowych dowodów na zaangażowanie szlaków redoks i odpowiedź komórkową na stres oksydacyjny.
- Przesiewanie: zapewnia powtarzalne pomiary ROS oparte na cytometrii przepływowej do selekcji związków.
- Analityka: umożliwia statystyczne porównanie poziomów ROS w różnych warunkach doświadczalnych z wykorzystaniem geometrycznej średniej intensywności fluorescencji.
- Badania translacyjne: łączą in vitro modulację stresu oksydacyjnego z punktami końcowymi istotnymi dla choroby w modelach siatkówki.
- Zastosowania w przedsiębiorstwie: ustanawia zestandaryzowaną platformę analizy ROS, którą można dostosować do różnych typów komórek i czynników modulujących stan redoks.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorczy
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność predykcyjną w odkrywaniu celów redoxowych i zmniejsza niejednoznaczność mechanistyczną.
- Wartość operacyjna: Zapewnia zestandaryzowaną, skalowalną i powtarzalną kwantyfikację ROS dla przepływów pracy międzyzespołowych.
- Wartość strategiczna: Usprawnia podejmowanie decyzji go/no-go w przypadku modulatorów szlaków antyoksydacyjnych i zwiększa efektywność kapitałową.
- Wpływ na portfolio: Wspiera priorytetyzację kandydatów ukierunkowanych na mechanizmy stresu oksydacyjnego z uwzględnieniem ryzyka.
Uwagi dotyczące wdrożenia
- Wymaga doświadczenia w obsłudze cytometrii przepływowej oraz analizie danych.
- Wymaga dostępu do aparatury do cytometrii przepływowej oraz kompatybilnego oprogramowania analitycznego.
- Wymaga standaryzacji protokołów bramkowania i ilościowego oznaczania fluorescencji pomiędzy zespołami.
- Metoda może być dostosowana do innych modeli komórkowych poprzez optymalizację protokołu w zakresie ładowania sond i kontroli.
- Skuteczność zależy od rygorystycznego obchodzenia się z próbkami w celu zminimalizowania zmienności testu oraz artefaktów wywołanych działaniem światła.
