Stereotaktyczne podejście chirurgiczne do mikroiniekcji ogonowego pnia mózgu i górnego odcinka szyjnego rdzenia kręgowego za pośrednictwem Cisterna magna u myszy
21 stycznia 2022
Stereotaktyczna operacja celowania w miejsca mózgu u myszy zwykle obejmuje dostęp przez kości czaszki i jest prowadzona przez punkty orientacyjne czaszki. Poniżej przedstawiamy alternatywne podejście stereotaktyczne do celowania w ogonowy pień mózgu i górny odcinek szyjny rdzenia kręgowego za pomocą cisterna magna, które opiera się na bezpośredniej wizualizacji punktów orientacyjnych pnia mózgu.
Protokół ten zawiera wytyczne krok po kroku dotyczące powtarzalnej drogi dostępu do obszarów zainteresowania w ogonowym pniu mózgu i górnym rdzeniu szyjnym. Technika ta zwiększa precyzję podczas dostarczania małych objętości iniekcji do ograniczonych obszarów zainteresowania w ogonowym pniu mózgu i górnym rdzeniu szyjnym. Technika ta była i może być stosowana do innych modeli zwierzęcych.
Dr Veronique VanderHorst, profesor nadzwyczajny neurologii i główny badacz Laboratorium VanderHorst, zademonstruje tę procedurę. Upewnij się, że przepływ tlenu jest skierowany do stożka nosowego. Przesuń mysz do ramki stereotaktycznej i umieść nos w elastycznym stożku nosowym.
Umieść mysz w ramce stereotaktycznej tylko za pomocą pasków na uszy. Nałóż lubrykant na oczy. Anteroflex głowę myszy pod kątem 90 stopni, ręcznie prowadząc nos.
Aby zabezpieczyć tę pozycję, umieść plastikową barierę między słupkami paska nausznego adaptera myszy równolegle do słupków, tak aby płaska część czaszki służyła jako odniesienie. Umieść poduszkę grzewczą pod myszą i upewnij się, że szyja i reszta ciała są ustawione równolegle do stołu, podnosząc korpus za pomocą małego pudełka. Umieść zasłonę pod ciałem.
Wstrzyknąć pojedynczą dawkę czterech miligramów na kilogram meloksykamu o powolnym uwalnianiu podskórnie w objętości dwóch mikrolitrów na gram masy ciała. Oczyść miejsce nacięcia chirurgicznego najpierw podkładką do przygotowywania 70% alkoholu, następnie podkładką z betainą, a następnie ponownie wacikiem nasączonym alkoholem i pozostaw do wyschnięcia. Zdezynfekuj ręce i załóż sterylne rękawiczki, a następnie umieść serwetę w miejscu operacji.
Upewnij się, że mysz jest odpowiednio znieczulona, ściskając palce u nóg lub sprawdzając odruch rogówkowy. Zmniejsz poziom izofluranu, aby utrzymać jego poziom na poziomie 2,0. Wykonaj nacięcie od jednego do 1,2 centymetra za pomocą chirurgicznego ostrza 10 od krawędzi kości potylicznej w kierunku ramion jednym płynnym ruchem.
Ostrożnie wykonaj nacięcie w szwie linii środkowej mięśnia czworobocznego, odsłaniając sparowane mięśnie długie główki. Umieść oba haki zwijacza między sparowanymi mięśniami longus capitis, jeden zorientowany w lewo, a drugi w prawo. Użyj kleszczy laminektomijnych, aby oddzielić lewy i prawy brzuch sparowanego długiego mięśnia główki, zaczynając od potylicy, gdzie linia środkowa jest dobrze widoczna.
Poprowadź kleszcze przez kość potylicy w linii środkowej w dół do miejsca, w którym styka się z oponą twardą cisterny, a następnie kontynuuj przez oponę twardą do atlasu. Zmień położenie retraktorów i wyreguluj napięcie, zmieniając położenie hemostatów. Użyj kleszczy do laminektomii, aby oddzielić mięśnie dalej w linii środkowej, aby uzyskać dobry widok pnia mózgu i móżdżku.
W razie potrzeby powtarzaj powyższą procedurę, aż móżdżek i pień mózgu pojawią się poniżej opony twardej. Za pomocą kleszczyków do laminektomii oczyść oponę twardą z małych pasm tkanki łącznej, przesuwając kleszcze od linii środkowej w kierunku bocznym, aż uzyskasz wyraźny widok pnia mózgu, tworząc więcej przestrzeni bocznej. Zobacz grzbietową powierzchnię pnia mózgu ze szczegółowymi punktami orientacyjnymi przez otwartą oponę twardą.
Użyj kątowych kleszczy, aby chwycić oponę twardą rozciągającą się od kości potylicznej do atlasu, a następnie użyj nożyczek sprężynowych, aby zrobić mały otwór o długości około 0,5 do 1,5 milimetra w oponie twardej. Po otwarciu opony twardej spuść nadmiar płynu mózgowo-rdzeniowego za pomocą sterylnej końcówki higienicznej. Zasuwka, punkt, w którym kanał centralny otwiera się do czwartej komory, jest standardowym przednio-tylnym i przyśrodkowym punktem zerowym.
Ustawić pipetę lub strzykawkę w kierunku celu za pomocą ramienia stereotaktycznego. Opuść ramię grzbietu na powierzchnię grzbietową, która tworzy się z grzbietowo-brzusznego punktu zerowego. Następnie opuść pipetę na pień mózgu i wstrzyknij roztwór.
Pozostawić igłę na miejscu przez jedną do pięciu minut po wstrzyknięciu, aby uniknąć śladu igły w przypadku stosowania objętości od trzech do 50 nanolitrów. Następnie podnieś pipetę lub strzykawkę za pomocą ramienia stereotaktycznego i powtórz tę czynność dla wielu celów. Ostrożnie usuń haczyki z pola operacyjnego.
Sparowane mięśnie długie główki opadną z powrotem do neutralnej pozycji, całkowicie zakrywając cisterna magna. Nie zamykaj mięśnia czworobocznego i opony twardej w linii środkowej, ponieważ są one zbyt delikatne, aby utrzymać szwy. Zamknij skórę za pomocą 3 szwów nylonowych lub polipropylenowych.
Podejście cisterna magna umożliwia celowanie w ogonowe struktury pnia mózgu i górnego odcinka szyjnego rdzenia szyjnego, które w przeciwnym razie są trudno dostępne za pomocą standardowych podejść stereotaktycznych lub są podatne na niespójne celowanie. U myszy struktury takie jak jądro podjęzykowe, brzuszna grupa oddechowa i przylegająca siatkowata formacja w ogonowym pniu mózgu były rutynowo celowane przy użyciu podejścia cisterna magna, jak pokazano tutaj dla jądra podjęzykowego i rdzenia brzuszno-przyśrodkowego. W celu określenia dokładności podejścia cisterna magna w porównaniu z podejściem standardowym, zmierzono odległość między zamierzonymi i rzeczywistymi miejscami docelowymi w płaszczyźnie przednio-tylnej, przyśrodkowej i grzbietowo-brzusznej dla obszarów brzusznych i grzbietowych.
Wyniki wskazują na znacznie mniejsze błędy w płaszczyźnie przednio-tylnej, przyśrodkowej i grzbietowo-brzusznej w porównaniu z podejściem standardowym, podkreślając zwiększoną dokładność podejścia cisterna magna dla tych celów. Podczas próby tego protokołu ważne jest, aby upewnić się, że przednio-zgięcie głowy i uniesienie ciała jest wykonywane zgodnie z opisem. Następnie ważne jest, aby rozpoznać kluczowe punkty orientacyjne przed manipulowaniem mięśniem lub oponą twardą.
Jeśli te punkty orientacyjne nie zostaną rozpoznane lub zostaną utracone, trudno będzie zachować orientację i wykonać procedurę zgodnie z przeznaczeniem. Technika ta pomogła odpowiedzieć na pytania koncepcyjne związane z funkcjonalną organizacją anatomiczną w obrębie ogonowego pnia mózgu i górnego odcinka szyjnego rdzenia szyjnego.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
W niniejszym artykule opisano stereotaktyczną procedurę chirurgiczną umożliwiającą dostęp do tylnej części pnia mózgu oraz górnego odcinka rdzenia kręgowego u myszy poprzez cysternę wielką (cisterna magna). Ta alternatywna metoda zwiększa precyzję celowania w ograniczone obszary mózgu, umożliwiając wstrzykiwanie niewielkich objętości bezpośrednio pod kontrolą wizualną punktów orientacyjnych anatomii.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Chirurgia stereotaktyczna
- Neuronauka
- Badania na modelach zwierzęcych
Wstęp
- Standardowe metody obejmują dostęp do mózgu poprzez kości czaszki i punkty orientacyjne.
- Dostęp przez cisterna magna zapewnia bardziej bezpośrednią drogę do celu.
- Technikę tę można zastosować w różnych modelach zwierzęcych.
- Umożliwia ona celowanie w obszary takie jak jądro języka oraz brzuszna grupa oddechowa.
Cel badania
- W celu zaprezentowania techniki umożliwiającej dokładniejsze celowanie w struktury pnia mózgu.
- W celu zwiększenia precyzji iniekcji w ograniczonych obszarach.
- W celu oceny skuteczności tej metody w porównaniu do standardowych podejść.
Zastosowane metody
- Metoda opiera się na wizualnie sterowanym podejściu stereotaktycznym z precyzyjną orientacją anatomiczną.
- Zastosowanym modelem biologicznym są myszy, które są szczególnie odpowiednie do badań neuroanatomicznych.
- Etapy procedury obejmują wykonanie nacięć, odsuniecie mięśni oraz użycie retraktorów w celu odsłonięcia obszaru.
- Kluczowe kroki obejmują rozpoznanie istotnych punktów orientacyjnych oraz prawidłowe ustawienie do iniekcji.
- Iniekcje wykonuje się w objętościach od 3 do 50 nanolitrów w pobliżu określonych obszarów docelowych.
Główne wyniki
- Podejście przez cysternę wielką (cisterna magna) wykazało znacznie mniejsze błędy celowania w strukturach mózgu w porównaniu do metod tradycyjnych.
- Osiągnięto dokładne celowanie w jądro języka oraz brzuszną część rdzenia przedłużonego.
- Technika ta wykazała większą skuteczność w docieraniu do obszarów wcześniej trudnodostępnych przy minimalnej inwazyjności.
- Punkty orientacyjne są kluczowe dla zachowania orientacji i zapewnienia skutecznego przeprowadzenia procedury.
Wnioski
- Badanie przedstawia nową technikę, która poprawia dostęp i celowanie w tylną część pnia mózgu.
- Precyzja tej metody otwiera drogę do bardziej wyrafinowanych badań nad neuromodulacją.
- Wyniki wspierają lepsze zrozumienie organizacji anatomicznej w obrębie pnia mózgu.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Celowanie w struktury tylnej części pnia mózgu oraz górnego odcinka rdzenia szyjnego pozostaje wyzwaniem w przedklinicznych badaniach neuronaukowych ze względu na niedostępność anatomiczną, co ogranicza badania mechanistyczne funkcji życiowych, takich jak oddychanie i kontrola motoryczna. Metoda dostępu przez cysternę wielką (cisterna magna) zapewnia powtarzalną, prowadzoną wizualnie drogę, która zwiększa dokładność iniekcji w ograniczonych obszarach, wspierając niezawodne dotarcie do celu w fazie wczesnych odkryć. To udoskonalenie metodologiczne zmniejsza zmienność biologiczną i zwiększa pewność prognostyczną podczas oceny celów neuromodulacyjnych w systemach istotnych dla przebiegu chorób.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne etapy odkrywania i walidacja celu
- Wartość naukowa: Umożliwia precyzyjną weryfikację hipotez terapeutycznych w jadrach tylnej części pnia mózgu zaangażowanych w funkcje sensoryczno-motoryczne i autonomiczne.
- Wartość operacyjna: Zmniejsza błąd celowania w porównaniu z metodami opartymi na punktach orientacyjnych czaszki, zwiększając powtarzalność w kohortach eksperymentalnych.
- Wartość strategiczna: Wspiera podejmowanie decyzji o kontynuacji lub przerwaniu badań (go/no-go) poprzez zwiększenie pewności co do skuteczności i specyficzności modulacji celu.
Przesiew i opracowanie testu
- Wartość naukowa: Ułatwia przygotowanie zwalidowanych modeli mikroiniekcji w OUN do przesiewu związków w obwodach pnia mózgu.
- Wartość operacyjna: Zapewnia standaryzowany dostęp chirurgiczny z wykorzystaniem wizualnych punktów orientacyjnych, co poprawia powtarzalność testów.
- Wartość strategiczna: Umożliwia wiarygodną ocenę zależności dawka-odpowiedź w trudno dostępnych obszarach, wspierając procesy identyfikacji związków wiodących.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Wartość naukowa: Zachowuje istotność w kontekście choroby, umożliwiając celowane dostarczanie substancji do struktur pnia mózgu zaangażowanych w zaburzenia oddechowe i neurodegeneracyjne.
- Wartość operacyjna: Zapewnia ciągłość od etapu odkrycia po walidację przedkliniczną dzięki powtarzalnej dokładności celowania.
- Wartość strategiczna: Redukuje ryzyko w procesie translacyjnym poprzez minimalizację efektów pozacelowych oraz zmienności anatomicznej.
Integracja potoku i przepływu pracy
Metoda ta jest włączona do wczesnych etapów procesów odkrywania leków, w których celowane w oparciu o hipotezy badania obwodów pnia mózgu poprzedzają identyfikację związku wiodącego oraz przedkliniczne badania skuteczności.
- Biologia odkrywcza: Wspiera redukcję ryzyka mechanistycznego poprzez umożliwienie precyzyjnej modulacji jąder tylnego mózgu w celu wyjaśnienia funkcji szlaków.
- Przesiewanie: Zwiększa gotowość testów dzięki precyzji stereotaksycznej i spójnemu dostarczaniu objętości nanolitrowych do określonych celów.
- Analityka: Generuje ilościowe dane dotyczące celowania przestrzennego (metryki błędów w osiach przednio-tylnej, przyśrodkowej-bocznej oraz grzbietowo-brzusznej) w celu porównania dokładności dostarczania w różnych warunkach.
- Badania translacyjne: Zapewnia ciągłość przedkliniczną poprzez umożliwienie niezawodnego celowania w obszary pnia mózgu istotne dla ludzkich modeli chorób.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Ustanawia wielokrotnego użytku platformę chirurgiczną, którą można zastosować w wielu projektach z zakresu neurofarmakologii i neuromodulacji.
Wpływ operacyjny i korporacyjny
- Wartość naukowa: Poprawia pewność prognostyczną w walidacji celów poprzez zmniejszenie niepewności anatomicznej podczas interwencji w pniu mózgu.
- Wartość operacyjna: Zwiększa powtarzalność i standaryzację procedur mikroiniekcji w OUN pomiędzy laboratoriami.
- Wartość strategiczna: Zwiększa efektywność kapitałową poprzez redukcję liczby nieudanych eksperymentów wynikających z błędnego podania substancji, co wspiera lepszą alokację zasobów.
- Wpływ na portfolio: Umożliwia priorytetyzację terapeutyków celowanych w pień mózgu z uwzględnieniem ryzyka, w oparciu o bardziej wiarygodne dane przedkliniczne.
Uwagi dotyczące wdrożenia
- Wymagana jest biegłość w przeprowadzaniu operacji stereotaksycznych u gryzoni oraz w identyfikacji punktów orientacyjnych neuroanatomicznych.
- Metoda opiera się na zastosowaniu instrumentów mikrochirurgicznych, w tym pincetek tępych, nożyczek sprężynowych oraz manipulatorów stereotaksycznych.
- Niezbędne jest stosowanie techniki aseptycznej oraz protokołów opieki pooperacyjnej w celu zapewnienia dobrostanu zwierząt i rzetelności danych.
- Adaptacja metody do różnych modeli może wymagać korekt w zakresie unieruchomienia głowy i ułożenia ciała ze względu na zmienność anatomiczną.
- Ograniczenia praktyczne obejmują konieczność precyzyjnej wizualizacji opony twardej oraz odprowadzania CSF w celu utrzymania czystego pola operacyjnego.
Najczęściej zadawane pytania dotyczące biofarmacji
Chapters in this video
0:04
Introduction
0:52
Positioning of the Mouse in the Stereotaxic Frame
2:04
Surgery to Access the Cisterna Magna
3:34
Opening of the Cisternal Membrane and Identification of Landmarks and Zero Point
4:11
Injection of the Target
4:45
Closure of the Surgical Field
5:10
Results: Stereotaxic Surgical Approach in Mice
6:14
Conclusion
