Badanie metabolizmu energii mitochondrialnej pojedynczych sferoid mikrotkankowych 3D za pomocą analizy strumienia zewnątrzkomórkowego

Nasz protokół pozwala naukowcom badać metabolizm energii mitochondrialnej i bezszwowe sferoidy, aby umożliwić porównania między kilkoma różnymi liniami komórkowymi, liczbą komórek i fenotypami, a także terapiami lekowymi w ramach odkrywania leków w terenie i badań nad rakiem. Nasza praca przedstawia szczegółowy protokół badania metabolizmu energii mitochondrialnej przy użyciu sferoid 3D, zapewniając lepszy model fizjologiczny w porównaniu z eksperymentami jednowarstwowymi komórek. Obserwacje biologiczne mogą prowadzić do ekstrapolacji ze sferoid ciała szklistego na guzy in vivo i identyfikować szlaki, które mogą być ukierunkowane na metabolizm guza sferoidalnego.

Na przykład użyteczność węglowodanów podczas wzrostu sferoidów. Wszystkie dane instrumentu Seahorse Excellular flux 96 są bardzo czułe. Pozycjonowanie sferoid in vitro na płytce testowej ma zasadnicze znaczenie dla uzyskania dokładnych danych na poziomie pojedynczej sferoidy.

Sprawdź żywotność sferoidy za pomocą mikroskopu światła odwróconego z kontrastem fazowym przy 4-krotnym powiększeniu, aby zapewnić nienaruszoną strukturę sferoidalną, morfologię i ogólną jednorodność między próbkami. Aby uwodnić wkład czujnika, podwielokrotność około 20 mililitrów kalibru należy umieścić w stożkowej probówce. Umieść stożkową rurkę zawierającą kalibert w inkubatorze bez dwutlenku węgla o temperaturze 37 stopni Celsjusza na noc.

Wyjmij zawartość zestawu do oznaczania. Umieść wkład czujnika do góry nogami obok tabliczki użytkowej. Odpipetować 200 mikrolitrów sterylnej podwójnie destylowanej wody do każdej studzienki płytki użytkowej za pomocą wielokanałowej pipety P300.

Umieść wkład czujnika na górze tabliczki użytkowej. Sprawdź, czy poziom wody w każdej studzience jest wystarczająco wysoki, aby zanurzyć sondy czujnika. Przenieś zmontowany wkład czujnika do inkubatora bez dwutlenku węgla o temperaturze 37 stopni Celsjusza i pozostaw go na noc.

Aby pokryć mikropłytkę do testu sferoidalnego, dodaj 30 mikrolitrów sterylnego roztworu poli-D-lizyny 0,1 miligrama na mililitr na studzienkę mikropłytki sferoidalnej przy użyciu techniki septycznej. Odessać roztwór z każdej studzienki mikropłytki sferoidalnej, odwrócić płytkę i mocno uderzyć nią w bibułkę, aby usunąć resztki roztworu. Umyj każdą studzienkę płytki 200 mikrolitrami sterylnej podwójnie destylowanej wody.

Po ostatnim umyciu odwróć mikropłytkę i mocno uderz nią w bibułę, aby usunąć resztki wody. Pozostaw płytkę do wyschnięcia na powietrzu przez 30 minut przed przyszłym użyciem. Przygotuj podłoże XF RPMI zgodnie z opisem w manuskrypcie.

Podgrzej uzupełnioną pożywkę testową XF RPMI do 37 stopni Celsjusza na godzinę przed testem. I podgrzej powlekaną mikropłytkę do testu sferoidalnego w inkubatorze bez dwutlenku węgla o temperaturze 37 stopni Celsjusza. Wyjąć stożkową rurkę zawierającą kaliber i wkład czujnika z inkubatora powietrza.

Wyjmij wkład czujnika z tabliczki użytkowej i umieść go do góry nogami na powierzchni roboczej. Za pomocą pipety wielokanałowej P300 odessać wodę z płytki użytkowej i wylać ją. Dodaj 200 mikrolitrów podgrzanego kalibru do każdej studzienki płytki użytkowej.

Umieść wkład czujnika na tabliczce narzędziowej, upewniając się, że czujniki są dobrze zanurzone w kalibrze. Przenieś zmontowany wkład czujnika do inkubatora bez dwutlenku węgla o temperaturze 37 stopni Celsjusza, aż będzie gotowy do załadowania roztworów do wstrzykiwań portów. Wyjąć płytkę do hodowli sferoidów z inkubatora i obserwować sferoidy pod mikroskopem, aby upewnić się, że są nienaruszone przed etapem transferu sferoidów.

Załadować 180 mikrolitrów wstępnie ciepłej pożywki testowej do każdej studzienki płytki sferoidalnej, w tym do wszelkich dołków korekcyjnych tła. Częściowo napełnij siedmiocentymetrową szalkę Petriego trzema mililitrami pożywki do oznaczania. Przenieś sferoidy z 96-dołkowej płytki hodowlanej na szalkę Petriego, używając wielokanałowej pipety załadowanej końcówkami pipet z szerokim otworem i objętością ustawioną na 10 do 50 mikrolitrów.

Ustaw objętość pipetara jednokanałowego wyposażonego w końcówkę pipety z szerokim otworem na 20 mikrolitrów i ostrożnie zassaj pojedynczą sferoidę. Umieść końcówkę bezpośrednio na środku każdej studzienki tej mikropłytki do oznaczania sferoidów i pozwól, aby działanie kapilarne wycofało sferoidę z końcówki pipety. Potwierdzić ewolucję pod mikroskopem, pipetując zawartość pipety z powrotem na szalkę Petriego.

Po przeniesieniu wszystkich tych sferoid na mikropłytkę do testu sferoidalnego, przenieś płytkę do inkubatora bez dwutlenku węgla o temperaturze 37 stopni Celsjusza na co najmniej jedną godzinę. Przygotować robocze stężenia wyjściowe każdego związku zgodnie z opisem w manuskrypcie, używając w pełni uzupełnionej, wstępnie podgrzanej pożywki testowej XF RPMI. Dozowano 20 mikrolitrów roztworu roboczego każdego związku do wszystkich odpowiednich portów za pomocą skalibrowanej pipety wielokanałowej P100.

Przygotuj analizator do załadowania wkładu czujnika. Aby uzyskać dobrze uformowane, zwarte sferoidy, każda linia komórkowa została indywidualnie zoptymalizowana pod kątem gęstości wysiewu i czasu trwania uprawy. Przy zoptymalizowanych strategiach wysiewu objętość sferoidalna dla SK-OV-3 wynosiła około 5,46 x 10 do siedmiu mikrometrów sześciennych, a dla A549 1,45 x 10 do ośmiu mikrometrów sześciennych.

Wszystkie typy sferoidów miały liniową korelację między początkową gęstością wysiewu a objętością sferoidy. Idealna symetria sferoidalna miała kołowość 1,0, a odchylenie od 1,0 wskazywało na utratę kolistości. Dla wszystkich typów sferoidów tempo zużycia tlenu wzrastało wraz z rozmiarem sferoidów i było liniowo skorelowane z objętością sferoidów z najwyższą w sferoidach MCF-7 i najniższą w sferoidach SK-OV-3.

Sferoidy MCF-7 nie reagowały na kontrolę pojazdu przez cały czas trwania eksperymentu. Szybkość zużycia tlenu w sferoidach MCF-7 została obniżona za pomocą oligomycyny po pięciu cyklach pomiarowych po pierwszym wstrzyknięciu 0,5 mikrograma na mililitr. W odpowiedzi na BAM15 tempo zużycia tlenu zostało zwiększone przed drugim wstrzyknięciem.

Natomiast połączenie rotenonu i antymycyny A obniżyło go. Protokół do dokładnego sondowania podstawowego oddychania mitochondrialnego. Oddychanie fosforylacyjne ADP, oddychanie nieszczelne, skuteczność sprzężenia, maksymalna wydolność oddechowa i zapasowa wydolność oddechowa zostały opracowane przy użyciu sferoid 3D pochodzących z raka.

Wszystkie związki oddechowe dały oczekiwane profile kinetycznego zużycia tlenu dla wybranych związków, ujawniając średnią stałą podstawową częstość oddychania od 20 do 30 pikomoli tlenu na minutę na studzienkę. Lokalizacja sferoid w mikropłytce i numer cyklu pomiarowego po wstrzyknięciu związku w celu zapewnienia stabilnego tempa oddychania między dodatkami związku. Podczas badania wydolności oddechowej mitochondriów za pomocą rozłączaczy, kluczowe jest nie tylko stężenie, ale także jego zdolność do rozłączania oddychania w obecności oligomycyny, która jest zwykle dodawana przed rozprzęgaczem w eksperymentach sondujących metabolizm energii mitochondrialnej.