Name: Badanie metabolizmu energii mitochondrialnej pojedynczych sferoid mikrotkankowych 3D za pomocą analizy strumienia zewnątrzkomórkowego (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-02-03T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 15 s
Description: Poznaj metodę analizy strumienia zewnątrzkomórkowego Seahorse do badania metabolizmu mitochondrialnego w sferoidach 3D. Protokół umożliwia precyzyjne pomiary na poziomie pojedynczych sferoidów w badaniach nad rakiem.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

N.J.C otrzymał nagrodę BBSRC MIBTP CASE Award od Sygnature Discovery Ltd (BB/M01116X/1, 1940003)

Autorzy nie mają do zadeklarowania konfliktu interesów.

Główne ustalenia i wyniki Ten artykuł zawiera szczegółowy protokół badania metabolizmu energii mitochondrialnej pojedynczych sferoid 3D przy użyciu szeregu linii komórkowych pochodzących z raka za pomocą analizatora XFe96 XF. Opracowano i opisano metodę szybkiej hodowli sferoid komórkowych A549, HepG2/C3A, MCF7 i SK-OV-3 przy użyciu technologii odstraszających komórki do wymuszonej agregacji. Protokół ten odnosi się do wielu kwestii związanych z sondowaniem metabolizmu sferoidów za pomocą technologi...

An erratum was issued for: <a href="https://www.jove.com/t/63346">Exploring Mitochondrial Energy Metabolism of Single 3D Microtissue Spheroids using Extracellular Flux Analysis</a>. The Representative Results section was updated.
Figure 5 was updated from:
<img alt="Oxygen consumption rate (OCR) graphs with oligomycin effects on A549, HepG2/C3A, MCF-7, SK-OV-3 cells." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63346/63346fig05.jpg" data-altupdatedat="1761830439000" data-alt="Figure 5"> 
Figure 5: Single or sequential injection of mitochondrial respiratory compounds. Cancer-cell-derived spheroids of MCF-7, HEPG2/C3A, SK-OV-3, and A549 were placed into wells of an XFe96 spheroid microplate in XF RPMI and probed for OCR using the Agilent Seahorse XFe96 analyzer. OCR was measured 5x, after which 2 µg/mL oligomycin (injection Port A: green trace) or 5 µM BAM15 (injection Port A: blue trace or injection port B: green trace) to inhibit the mitochondrial ATP synthase and determine maximal respiratory capacity, respectively. Kinetic OCR data are expressed as % basal (A-D). Maximal respiratory capacity (OCRmax) was calculated as a factor of basal OCR by the equation: OCRmax = OCRBAM15 / OCRbasal. OCRmax was obtained from OCR averages across measurement cycles 8-10 post BAM15 injection with (green bars) and without (blue bars) oligomycin. Data are averages ± SEM from 3-8 individual well replicates across the spheroid assay microplate. Abbreviations: OCR = oxygen consumption rate. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63346/63346fig05large.jpg" target="_blank">Please click here to view a larger version of this figure.</a>
to:
<img alt="Oligomycin effect on OCR in cancer cell lines; comparison graph; metabolic activity analysis." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63346/63346fig5v2.jpg" data-altupdatedat="1761830439000" data-alt="Figure 5"> 
Figure 5: Single or sequential injection of mitochondrial respiratory compounds. Cancer-cell-derived spheroids of MCF-7, HEPG2/C3A, SK-OV-3, and A549 were placed into wells of an XFe96 spheroid microplate in XF RPMI and probed for OCR using the Agilent Seahorse XFe96 analyzer. OCR was measured 5x, after which 2 µg/mL oligomycin (injection Port A: green trace) or 5 µM BAM15 (injection Port A: blue trace or injection port B: green trace) to inhibit the mitochondrial ATP synthase and determine maximal respiratory capacity, respectively. Kinetic OCR data are expressed as % basal (A-D). Maximal respiratory capacity (OCRmax) was calculated as a factor of basal OCR by the equation: OCRmax = OCRBAM15 / OCRbasal. OCRmax was obtained from OCR averages across measurement cycles 8-10 post BAM15 injection with (green bars) and without (blue bars) oligomycin. Data are averages ± SEM from 3-8 individual well replicates across the spheroid assay microplate. Abbreviations: OCR = oxygen consumption rate. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63346/63346fig5v2large.jpg" target="_blank">Please click here to view a larger version of this figure.</a>

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/63346">Exploring Mitochondrial Energy Metabolism of Single 3D Microtissue Spheroids using Extracellular Flux Analysis</a>. The Representative Results&#160;section was&#160;updated.

Erratum: Exploring Mitochondrial Energy Metabolism of Single 3D Microtissue Spheroids using Extracellular Flux Analysis

Postęp w modelach in vitro w badaniach biologicznych nastąpił gwałtownie w ciągu ostatnich 20 lat. Takie modele obejmują obecnie metody narządów na chipie, organoidy i sferoidy mikrotkanek 3D, z których wszystkie stały się wspólnym celem poprawy translacji między badaniami in vitro i in vivo. Wykorzystanie zaawansowanych modeli in vitro, w szczególności sferoid, obejmuje kilka dziedzin badawczych, w tym inżynierię tkankową, badania nad komórkami macierzystymi, nowotwory i biologię chorób1,2,3,4,5,6,7 oraz testy bezpieczeństwa, w tym toksykologia genetyczna8,9,10, toksykologia nanomateriałów11,12,13,14, oraz testy bezpieczeństwa i skuteczności leków8,15,16,17,18,19.
Normalna morfologia komórek jest kluczowa dla biologicznego fenotypu i aktywności. Hodowla komórek w sferoidach mikrotkanek 3D pozwala komórkom przyjąć morfologię, funkcję fenotypową i architekturę, bardziej zbliżoną do tej obserwowanej in vivo, ale trudną do uchwycenia za pomocą klasycznych technik hodowli komórek jednowarstwowych. Zarówno in vivo, jak i in vitro, na funkcję komórkową bezpośredni wpływ ma mikrośrodowisko komórkowe, które nie ogranicza się do komunikacji i programowania komórkowego (np. tworzenie połączeń komórka-komórka, możliwości tworzenia nisz komórkowych); narażenie komórek na hormony i czynniki wzrostu w bezpośrednim otoczeniu (np. narażenie na cytokiny komórkowe w ramach odpowiedzi zapalnej); skład matryc fizycznych i chemicznych (np. czy komórki są hodowane w sztywnym plastiku tkankowym, czy w elastycznym środowisku tkankowym); A co najważniejsze, jak na metabolizm komórkowy wpływa odżywianie i dostęp do tlenu, a także przetwarzanie produktów przemiany materii, takich jak kwas mlekowy.
Analiza strumienia metabolicznego to skuteczny sposób na badanie metabolizmu komórkowego w określonych systemach in vitro. W szczególności technologia XF pozwala na analizę zmian w czasie rzeczywistym w bioenergetyce komórkowej nienaruszonych komórek i tkanek. Biorąc pod uwagę, że wiele wewnątrzkomórkowych zdarzeń metabolicznych zachodzi w ciągu kilku sekund do minut, podejścia funkcjonalne w czasie rzeczywistym mają zasadnicze znaczenie dla zrozumienia zmian w czasie rzeczywistym w komórkowym przepływie metabolicznym w nienaruszonych komórkach i tkankach in vitro.
Ten artykuł zawiera protokoły hodowli linii komórkowych pochodzących z raka: A549 (gruczolakorak płuc), HepG2/C3A (rak wątrobowokomórkowy), MCF-7 (gruczolakorak piersi) i SK-OV-3 (gruczolakorak jajnika) jako modele sferoidalne 3D in vitro przy użyciu metod wymuszonej agregacji (Rysunek 1). Również (i) szczegółowo opisuje, jak badać metabolizm energii mitochondrialnej pojedynczych sferoid 3D za pomocą analizatora Agilent XFe96 XF, (ii) podkreśla sposoby optymalizacji testów XF przy użyciu pojedynczych sferoidów 3D oraz (iii) omawia ważne rozważania i ograniczenia sondowania metabolizmu sferoidów 3D przy użyciu tego podejścia. Co najważniejsze, w artykule opisano, w jaki sposób gromadzone są zestawy danych, które umożliwiają obliczenie wskaźnika zużycia tlenu (OCR) w celu określenia fosforylacji oksydacyjnej, a tym samym funkcji mitochondriów w sferoidach komórkowych. Chociaż nie jest to analizowane pod kątem tego protokołu, szybkość zakwaszenia zewnątrzkomórkowego (ECAR) jest kolejnym parametrem, który jest mierzony wraz z danymi OCR w eksperymentach XF. Jednak ECAR jest często słabo lub nieprawidłowo interpretowany na podstawie zestawów danych XF. Przedstawiamy komentarz dotyczący ograniczeń związanych z obliczaniem ECAR zgodnie z podstawowymi podejściami producenta technologii.

<table><tbody><tr><td>A549</td><td>ECACC&</td><td>nbsp;#86012804</td><td>Linia komórkowa raka płuc</td></tr><tr><td>Agilent Seahorse XF RPMI Medium, pH 7,4</td><td>Agilent Technologies Inc.</td><td>103576-100</td><td>Pożywka testowa XF z 1 mM HEPES, bez czerwieni fenolowej, wodorowęglanu sodu, glukozy, L-glutaminy i pirogronianu sodu</td></tr><tr><td>Analizator strumienia zewnątrzkomórkowego Agilent Seahorse XFe96</td><td>Agilent Technologies Inc.</td><td>-</td><td>Przyrząd do pomiaru szybkości sferoidalnego poboru tlenu w pojedynczych sferoidach</td></tr><tr><td>Antymycyna A</td><td>Merck Life Science</td><td>A8674</td><td>Mitochondrialny kompleks oddechowy III inhibitor</td></tr><tr><td>BAM15</td><td>TOCRIS bio-techne</td><td>5737</td><td>Mitochondrialny rozprzęgacz protnoforowy</td></tr><tr><td>Mikropłytka czarnościenna</td><td>Greiner Bio-One</td><td>655076</td><td>Do testów</td></tr> <tr><td>opartych na fluorescencjiPowierzchnia odpychająca komórki CELLSTAR 96 Mikropłytki U U</td><td>Greiner Bio-One</td><td>650970</td><td>Mikropłytki do generowania sferoid</td></tr><tr><td>Test żywotności komórek CellTiter-Glo 3D</td><td>Promega</td><td>G9681</td><td>Test do oznaczania żywotności komórek w sferoidach mikrotkanek 3D</td></tr><tr><td>Cultrex Poly-D-Lysine</td><td>R& D Systems marka biotechne</td><td>3439-100-01</td><td>Molekularny klej komórkowy do powlekania mikropłytek sferoidalnych XFe96 w celu ułatwienia mocowania sferoidów</td></tr><tr><td>D-(+)-Glukoza</td><td>Merck Life Sciences</td><td>G8270</td><td>Suplement do wzrostu kultur komórkowych i pożywki do oznaczania XF</td></tr><tr><td>Dulbecco' s Zmodyfikowana pożywka Eagle Medium (DMEM)</td> <td>Gibco</td><td>11885084</td><td>Pożywka hodowlana dla sferoid HepG2/C3A</td></tr> System <tr><td>obrazowania rdzenia EVOS XL</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>AMEX1000</td><td>Mikroskop do obrazowania z kontrastem fazowym</td></tr><tr><td>Zestaw testowy EZ-PCR Mykoplazma</td><td>Przemysł biologiczny</td><td>20-700-20</td><td>Badania przesiewowe mykoplazmy w hodowlach komórkowych</td></tr><tr><td>FIDŻI to tylko obraz J</td><td></td><td></td><td>Analiza zestawionych obrazów</td></tr><tr><td>Surowica bydlęca płodu</td><td>Merck Life Science</td><td>F7524</td><td>Suplement do pożywki do hodowli komórkowych</td></tr><tr><td>HepG2/C3A</td><td>ATCC</td><td>&nbsp;#CRL-10741</td><td>Linia komórkowa raka wątroby, klonalna pochodna macierzystej linii komórkowej HepG2</td></tr><tr><td>Mleczan-Glo</td><td>Promega</td><td>J5021</td><td>Test do pomiaru mleczanu w pożywce do hodowli sferydów</td></tr><tr><td>L-glutamina (roztwór 200 mM)</td><td>Merk Life Sciences</td><td>G7513</td><td>Suplement do wzrostu hodowli komórkowych i pożywki testowej XF</td></tr><tr><td>Mikroskop stereoskopowy M50</td><td>Mikrosytemy Leica</td><td>LEICAM50</td><td>Stereoskopowy mikroskop preparacyjny; używany do obsługi sfeorydów</td></tr><tr><td>MCF-7</td><td>ECACC</td><td>#86012803</td><td>Linia komórkowa gruczolakoraka piersi</td></tr><tr><td>Oligomycyna z Streptomyces diastatochromogenes</td><td>Merck Life Science</td><td>O4876</td><td>Inhibitor syntazy ATP</td></tr><tr><td>Penicilin-Streptomycyna</td><td>Gibco</td><td>15140122</td><td>Antybiotyki dodane do pożywki do hodowli komórkowych</td></tr><tr><td>Quant-iT Zestaw do oznaczania dsDNA PicoGreen</td><td>Iazot</td><td>P7589</td><td>Analiza dsDNA w spehroidach</td></tr><tr><td>Rotenon</td><td>Merck Life Science</td><td>R8875</td><td>Mitochondrialny kompleks oddechowy I Inhibitor</td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>Gibco</td><td>21875091</td><td>Pożywka hodowlana dla A549, MCF7 i SK-OV-3 sferoidy</td></tr><tr><td>Seahorse Analytics</td><td>Agilent Technologies Inc.</td><td>Kompilacja 421</td><td>https://seahorseanalytics.agilent.com</td></tr><tr><td>Seahorse XFe96 Spheroid FluxPak</td><td>Agilent Technologies Inc.</td><td>102905-100</td><td>Każdy Seahorse XFe96 Spheroid FluxPak zawiera: 6 mikropłytek sferoidalnych Seahorse XFe96 (102978-100), 6 wkładów z czujnikiem XFe96 i 1 butelkę roztworu Seahorse XF Calibrant Solution 500 ml (100840-000)</td></tr><tr><td>Pipeta serologiczna: 5, 10 i 25 ml</td><td>Greiner Bio-One</td><td>606107; 607107; 760107</td><td>Materiały eksploatacyjne do hodowli komórkowych</td></tr><tr><td>SK-OV-3</td><td>ECACC&</td><td>nbsp;#HTB-77</td><td>Linia</td></tr> <tr><td>komórkowa gruczolakoraka jajnikaPirogronian sodu (roztwór 100 mM)</td><td>Merck Life Science</td><td>S8636</td><td>Suplement do wzrostu kultur komórkowych i pożywki do oznaczania XF</td></tr><tr><td>Kolba do hodowli komórkowych T75 cm2</td><td>Greiner Bio-One</td><td>658175</td><td>Kolby poddane hodowli tkankowej do utrzymywania kultur komórkowych</td></tr><tr><td>TrypLExpress</td><td>Gibco</td><td>12604-021</td><td>Odczynnik do dysocjacji komórek</td></tr><tr><td>Oprogramowanie kontrolera fal</td><td>Agilent Technologies Inc.</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>Końcówka z szerokim otworem</td><td>STARLAB International GmbH</td><td>E1011-8400</td><td>Końcówki do pipet z szerokim otworem do obsługi sferoidów</td></tr></tbody></table>

badanie metabolizmu energii mitochondrialnej pojedynczych sferoid mikrotkankowych 3d za pomocą analizy strumienia zewnątrzkomórkowego

Exploring Mitochondrial Energy Metabolism of Single 3D Microtissue Spheroids Using Extracellular Flux Analysis

Trójwymiarowe (3D) agregaty komórkowe, zwane sferoidami, stały się w ostatnich latach liderem hodowli komórkowych in vitro. W przeciwieństwie do hodowli komórek jako dwuwymiarowych, jednokomórkowych monowarstw (hodowla 2D), hodowla komórek sferoidalnych promuje, reguluje i wspiera fizjologiczną architekturę komórkową i cechy, które istnieją in vivo, w tym ekspresję białek macierzy zewnątrzkomórkowej, sygnalizację komórkową, ekspresję genów, produkcję białek, różnicowanie i proliferację. Znaczenie hodowli 3D zostało dostrzeżone w wielu dziedzinach badawczych, w tym w onkologii, cukrzycy, biologii komórek macierzystych i inżynierii tkankowej. W ciągu ostatniej dekady opracowano ulepszone metody produkcji sferoidów oraz oceny ich funkcji metabolicznych i losu.
Analizatory strumienia zewnątrzkomórkowego (XF) zostały użyte do zbadania funkcji mitochondriów w mikrotkankach 3D, takich jak sferoidy, przy użyciu płytki wychwytującej wysepki XF24 lub mikropłytki sferoidalnej XFe96. Jednak odrębne protokoły i optymalizacja sondowania metabolizmu energii mitochondrialnej w sferoidach przy użyciu technologii XF nie zostały szczegółowo opisane. W artykule przedstawiono szczegółowe protokoły badania metabolizmu energii mitochondrialnej w pojedynczych sferoidach 3D przy użyciu mikropłytek sferoidalnych z analizatorem XFe96 XF. Wykorzystując różne linie komórek rakowych, wykazano, że technologia XF jest w stanie rozróżnić oddychanie komórkowe w sferoidach 3D nie tylko o różnych rozmiarach, ale także o różnych objętościach, liczbie komórek, zawartości i typie DNA.
Optymalne stężenia mitochondrialnych związków efektorowych oligomycyny, BAM15, rotenonu i antymycyny A są używane do badania określonych parametrów metabolizmu energii mitochondrialnej w sferoidach 3D. W artykule omówiono również metody normalizacji danych uzyskanych ze sferoid i poruszono wiele kwestii, które należy wziąć pod uwagę podczas badania metabolizmu sferoidów przy użyciu technologii XF. Protokół ten pomoże w prowadzeniu badań nad zaawansowanymi modelami sferoidalnymi in vitro.

Aby uzyskać dobrze uformowane, zwarte sferoidy, każda linia komórkowa była optymalizowana indywidualnie pod kątem gęstości siewu oraz czasu hodowli (Rycina 3). Linie komórkowe A549, HepG2/C3A i SK-OV-3 początkowo tworzyły luźne agregaty, które nie przekształciły się w okrągłe sferoidy z wyraźnie zdefiniowanymi obrysami aż do 7. dnia hodowli. Z kolei komórki MCF-7 były zdolne do tworzenia sferoidów w ciągu 3 dni. W przypadku wszystkich modeli sferoidów zaobserwowano wyraźną korelację między p...

Te protokoły pomogą użytkownikom badać metabolizm energii mitochondrialnej w sferoidach 3D pochodzących z linii komórek rakowych za pomocą analizy strumienia zewnątrzkomórkowego Seahorse.

Badanie metabolizmu energii mitochondrialnej pojedynczych sferoid mikrotkankowych 3D za pomocą analizy strumienia zewnątrzkomórkowego

Three-dimensional (3D) cellular aggregates, termed spheroids, have become the forefront of in vitro cell culture in recent years. In contrast to culturing ...

Nasz protokół pozwala naukowcom badać metabolizm energii mitochondrialnej i bezszwowe sferoidy, aby umożliwić porównania między kilkoma różnymi liniami komórkowymi, liczbą komórek i fenotypami, a także terapiami lekowymi w ramach odkrywania leków w terenie i badań nad rakiem. Nasza praca przedstawia szczegółowy protokół badania metabolizmu energii mitochondrialnej przy użyciu sferoid 3D, zapewniając lepszy model fizjologiczny w porównaniu z eksperymentami jednowarstwowymi komórek. Obserwacje biologiczne mogą prowadzić do ekstrapolacji ze sferoid ciała szklistego na guzy in vivo i identyfikować szlaki, które mogą być ukierunkowane na metabolizm guza sferoidalnego.Na przykład użyteczność węglowodanów podczas wzrostu sferoidów. Wszystkie dane instrumentu Seahorse Excellular flux 96 są bardzo czułe. Pozycjonowanie sferoid in vitro na płytce testowej ma zasadnicze znaczenie dla uzyskania dokładnych danych na poziomie pojedynczej sferoidy.Sprawdź żywotność sferoidy za pomocą mikroskopu światła odwróconego z kontrastem fazowym przy 4-krotnym powiększeniu, aby zapewnić nienaruszoną strukturę sferoidalną, morfologię i ogólną jednorodność między próbkami. Aby uwodnić wkład czujnika, podwielokrotność około 20 mililitrów kalibru należy umieścić w stożkowej probówce. Umieść stożkową rurkę zawierającą kalibert w inkubatorze bez dwutlenku węgla o temperaturze 37 stopni Celsjusza na noc.Wyjmij zawartość zestawu do oznaczania. Umieść wkład czujnika do góry nogami obok tabliczki użytkowej. Odpipetować 200 mikrolitrów sterylnej podwójnie destylowanej wody do każdej studzienki płytki użytkowej za pomocą wielokanałowej pipety P300.Umieść wkład czujnika na górze tabliczki użytkowej. Sprawdź, czy poziom wody w każdej studzience jest wystarczająco wysoki, aby zanurzyć sondy czujnika. Przenieś zmontowany wkład czujnika do inkubatora bez dwutlenku węgla o temperaturze 37 stopni Celsjusza i pozostaw go na noc.Aby pokryć mikropłytkę do testu sferoidalnego, dodaj 30 mikrolitrów sterylnego roztworu poli-D-lizyny 0,1 miligrama na mililitr na studzienkę mikropłytki sferoidalnej przy użyciu techniki septycznej. Odessać roztwór z każdej studzienki mikropłytki sferoidalnej, odwrócić płytkę i mocno uderzyć nią w bibułkę, aby usunąć resztki roztworu. Umyj każdą studzienkę płytki 200 mikrolitrami sterylnej podwójnie destylowanej wody.Po ostatnim umyciu odwróć mikropłytkę i mocno uderz nią w bibułę, aby usunąć resztki wody. Pozostaw płytkę do wyschnięcia na powietrzu przez 30 minut przed przyszłym użyciem. Przygotuj podłoże XF RPMI zgodnie z opisem w manuskrypcie.Podgrzej uzupełnioną pożywkę testową XF RPMI do 37 stopni Celsjusza na godzinę przed testem. I podgrzej powlekaną mikropłytkę do testu sferoidalnego w inkubatorze bez dwutlenku węgla o temperaturze 37 stopni Celsjusza. Wyjąć stożkową rurkę zawierającą kaliber i wkład czujnika z inkubatora powietrza.Wyjmij wkład czujnika z tabliczki użytkowej i umieść go do góry nogami na powierzchni roboczej. Za pomocą pipety wielokanałowej P300 odessać wodę z płytki użytkowej i wylać ją. Dodaj 200 mikrolitrów podgrzanego kalibru do każdej studzienki płytki użytkowej.Umieść wkład czujnika na tabliczce narzędziowej, upewniając się, że czujniki są dobrze zanurzone w kalibrze. Przenieś zmontowany wkład czujnika do inkubatora bez dwutlenku węgla o temperaturze 37 stopni Celsjusza, aż będzie gotowy do załadowania roztworów do wstrzykiwań portów. Wyjąć płytkę do hodowli sferoidów z inkubatora i obserwować sferoidy pod mikroskopem, aby upewnić się, że są nienaruszone przed etapem transferu sferoidów.Załadować 180 mikrolitrów wstępnie ciepłej pożywki testowej do każdej studzienki płytki sferoidalnej, w tym do wszelkich dołków korekcyjnych tła. Częściowo napełnij siedmiocentymetrową szalkę Petriego trzema mililitrami pożywki do oznaczania. Przenieś sferoidy z 96-dołkowej płytki hodowlanej na szalkę Petriego, używając wielokanałowej pipety załadowanej końcówkami pipet z szerokim otworem i objętością ustawioną na 10 do 50 mikrolitrów.Ustaw objętość pipetara jednokanałowego wyposażonego w końcówkę pipety z szerokim otworem na 20 mikrolitrów i ostrożnie zassaj pojedynczą sferoidę. Umieść końcówkę bezpośrednio na środku każdej studzienki tej mikropłytki do oznaczania sferoidów i pozwól, aby działanie kapilarne wycofało sferoidę z końcówki pipety. Potwierdzić ewolucję pod mikroskopem, pipetując zawartość pipety z powrotem na szalkę Petriego.Po przeniesieniu wszystkich tych sferoid na mikropłytkę do testu sferoidalnego, przenieś płytkę do inkubatora bez dwutlenku węgla o temperaturze 37 stopni Celsjusza na co najmniej jedną godzinę. Przygotować robocze stężenia wyjściowe każdego związku zgodnie z opisem w manuskrypcie, używając w pełni uzupełnionej, wstępnie podgrzanej pożywki testowej XF RPMI. Dozowano 20 mikrolitrów roztworu roboczego każdego związku do wszystkich odpowiednich portów za pomocą skalibrowanej pipety wielokanałowej P100.Przygotuj analizator do załadowania wkładu czujnika. Aby uzyskać dobrze uformowane, zwarte sferoidy, każda linia komórkowa została indywidualnie zoptymalizowana pod kątem gęstości wysiewu i czasu trwania uprawy. Przy zoptymalizowanych strategiach wysiewu objętość sferoidalna dla SK-OV-3 wynosiła około 5,46 x 10 do siedmiu mikrometrów sześciennych, a dla A549 1,45 x 10 do ośmiu mikrometrów sześciennych.Wszystkie typy sferoidów miały liniową korelację między początkową gęstością wysiewu a objętością sferoidy. Idealna symetria sferoidalna miała kołowość 1,0, a odchylenie od 1,0 wskazywało na utratę kolistości. Dla wszystkich typów sferoidów tempo zużycia tlenu wzrastało wraz z rozmiarem sferoidów i było liniowo skorelowane z objętością sferoidów z najwyższą w sferoidach MCF-7 i najniższą w sferoidach SK-OV-3.Sferoidy MCF-7 nie reagowały na kontrolę pojazdu przez cały czas trwania eksperymentu. Szybkość zużycia tlenu w sferoidach MCF-7 została obniżona za pomocą oligomycyny po pięciu cyklach pomiarowych po pierwszym wstrzyknięciu 0,5 mikrograma na mililitr. W odpowiedzi na BAM15 tempo zużycia tlenu zostało zwiększone przed drugim wstrzyknięciem.Natomiast połączenie rotenonu i antymycyny A obniżyło go. Protokół do dokładnego sondowania podstawowego oddychania mitochondrialnego. Oddychanie fosforylacyjne ADP, oddychanie nieszczelne, skuteczność sprzężenia, maksymalna wydolność oddechowa i zapasowa wydolność oddechowa zostały opracowane przy użyciu sferoid 3D pochodzących z raka.Wszystkie związki oddechowe dały oczekiwane profile kinetycznego zużycia tlenu dla wybranych związków, ujawniając średnią stałą podstawową częstość oddychania od 20 do 30 pikomoli tlenu na minutę na studzienkę. Lokalizacja sferoid w mikropłytce i numer cyklu pomiarowego po wstrzyknięciu związku w celu zapewnienia stabilnego tempa oddychania między dodatkami związku. Podczas badania wydolności oddechowej mitochondriów za pomocą rozłączaczy, kluczowe jest nie tylko stężenie, ale także jego zdolność do rozłączania oddychania w obecności oligomycyny, która jest zwykle dodawana przed rozprzęgaczem w eksperymentach sondujących metabolizm energii mitochondrialnej.

exploring-mitochondrial-energy-metabolism-single-3d-microtissue

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Badania nad rakiem

Przedstawiono opis metody profilowania funkcji mitochondriów w komórkach. Wygenerowany profil mitochondrialny dostarcza czterech parametrów funkcji mitochondriów, które można zmierzyć w jednym eksperymentcie: podstawowego tempa oddychania, oddychania związanego z syntezą ATP, przecieku protonów oraz wydolności rezerwowej.

Eksperyment profilu bioenergetycznego z wykorzystaniem komórek mioblastów C2C12

Ten protokół opisuje technikę przeprowadzania testu przepływu zewnątrzkomórkowego na sferoidach 3D wygenerowanych z kohodowli komórek raka trzustki (Patu8902) i aktywowanych fibroblastów trzustki (PS1) w celu zmierzenia dwóch głównych szlaków produkcji energii, glikolizy i oddychania mitochondrialnego.

Test strumienia zewnątrzkomórkowego w sferoidach 3D: metoda pomiaru aktywności metabolicznej sferoid guza trzustki

Tutaj opisana jest metoda przygotowania trójwymiarowej (3D) sferoidalnej kokultury komórek raka trzustki i fibroblastów, a następnie pomiaru funkcji metabolicznych za pomocą analizatora strumienia zewnątrzkomórkowego.

Otrzymywanie i oznaczanie metaboliczne 3-wymiarowych sferoidalnych kokultur komórek raka trzustki i fibroblastów

Ta technika opisuje rejestrowanie w czasie rzeczywistym zużycia tlenu i wskaźników zakwaszenia zewnątrzkomórkowego w eksplantowanych tkankach siatkówki myszy za pomocą analizatora strumienia zewnątrzkomórkowego.

Pomiar metabolizmu energetycznego w eksplantowanej tkance siatkówki za pomocą analizy strumienia zewnątrzkomórkowego

Celem tego protokołu jest zilustrowanie, jak używać mysich noworodków kardiomiocytów jako systemu modelowego do badania, jak różne czynniki mogą wpływać na zużycie tlenu w sercu.

Analiza wskaźnika zużycia tlenu w pierwotnych kardiomiocytach noworodków myszy z hodowlą pierwotną przy użyciu analizatora strumienia zewnątrzkomórkowego

W tej pracy opisujemy zmodyfikowany protokół badania strumienia mitochondrialnego substratu oddechowego za pomocą rekombinowanej perfringolizyny O w połączeniu z respirometrią opartą na mikropłytkach. Dzięki temu protokołowi pokazujemy, jak metformina wpływa na oddychanie mitochondrialne dwóch różnych linii komórek nowotworowych.

Pomiar strumienia substratu mitochondrialnego w rekombinowanych komórkach perfringolizyny O-permeabilizowanej

Przedstawiona tutaj metoda podsumowuje zoptymalizowane protokoły oceny bioenergetyki komórkowej w nieprzylegających mysich hematopoetycznych komórkach macierzystych i prymitywnych komórkach progenitorowych (HSPC) przy użyciu analizatora strumienia zewnątrzkomórkowego do pomiaru wskaźnika zakwaszenia zewnątrzkomórkowego (ECAR) i wskaźnika zużycia tlenu (OCR) HSPC w czasie rzeczywistym.

Ocena bioenergetyki komórkowej w krwiotwórczych komórkach macierzystych myszy i prymitywnych komórkach progenitorowych przy użyciu analizatora strumienia zewnątrzkomórkowego

Opisujemy stopniowe protokoły mierzące oddychanie mitochondrialne mysich i ludzkich neutrofili oraz komórek HL60 za pomocą analizatora metabolicznego przepływu zewnątrzkomórkowego.

Pomiar w czasie rzeczywistym mitochondrialnego profilu bioenergetycznego neutrofili

Tutaj szczegółowo opisujemy metody ekstrakcji makrofagów ze szpiku kostnego, śledziony i serca po zawale serca, a następnie oceny przepływu metabolicznego w żywych komórkach.

Analiza przepływu metabolicznego ex vivo w makrofagach śledziony i serca oraz monocytach szpiku kostnego

W tym miejscu tworzymy platformę profilowania metabolicznego integrującą trójwymiarowe (3D) sferoidy glejaka i normalizację opartą na obrazowaniu za pomocą analizy strumienia zewnątrzkomórkowego. Podejście to umożliwia dokładniejszą ocenę odpowiedzi metabolicznych guza na leczenie farmakologiczne i zapewnia wgląd w potencjalne mechanizmy oporności.

Postępy w profilowaniu metabolicznym trójwymiarowych sferoid guza mózgu do badań przesiewowych leków

Protokół ten opisuje opłacalny sposób przeprowadzenia testu stresowego glikolizy w celu ilościowego przeprogramowania metabolizmu w pierwotnym mikrogleju myszy. Po izolacji i stymulacji zapalnej mierzy się tempo zakwaszenia zewnątrzkomórkowego (ECAR) przy użyciu świeżo przygotowanych, pH-skorygowanych odczynników, a następnie następuje normalizacja białek, umożliwiająca dokładną i powtarzalną ocenę zmian glikolitycznych.

Badanie glikolizy w mikrogleju pierwotnym za pomocą testu strumienia zewnętrznego

Poznaj metodę analizy strumienia zewnątrzkomórkowego Seahorse do badania metabolizmu mitochondrialnego w sferoidach 3D. Protokół umożliwia precyzyjne pomiary na poziomie pojedynczych sferoidów w badaniach nad rakiem.

Badanie metabolizmu energii mitochondrialnej pojedynczych sferoid mikrotkankowych 3D za pomocą analizy strumienia zewnątrzkomórkowego (Wideo) | JoVE Journal

Badanie metabolizmu energii mitochondrialnej pojedynczych sferoid mikrotkankowych 3D za pomocą analizy strumienia zewnątrzkomórkowego

Przeglądaj więcej filmów