Izolacja mezenchymalnych komórek macierzystych tkanki tłuszczowej szczura w celu różnicowania w komórki produkujące insulinę

Ogólnym celem tego protokołu jest wyizolowanie i scharakteryzowanie czerwonej tkanki tłuszczowej, wysuszonych mezenchymalnych komórek macierzystych i różnicowanie ich w kierunku komórek produkujących insulinę za pomocą prostych metod. Mezenchymalne komórki macierzyste znalazły zastosowanie w dziedzinie genetyki. Można je izolować z różnych źródeł, takich jak szpik kostny, tkanka tłuszczowa i tkanka okołoporodowa.

Akceptują doskonałe cechy kulturowe. Są one wielosilne i mogą potencjalnie leczyć różne choroby. Tkanka tłuszczowa stanowi bogate źródło mezenchymalnych komórek macierzystych.

Te MSCs tkanki tłuszczowej można łatwo wyizolować z aspiratów lipo z wysoką wydajnością w porównaniu z innymi źródłami, takimi jak szpik kostny. Mogą one stanowić dobre źródło zarówno do przeszczepów autologicznych, jak i allogenicznych. W tym filmie przedstawiono prosty protokół izolacji i charakterystyki mezenchymalnych komórek macierzystych tkanki tłuszczowej z tłuszczu najądrza szczura.

Ta procedura jest prostą, bardzo skuteczną metodą izolacji. Po izolacji będziemy znosić różnicowanie się tych mezenchymalnych komórek macierzystych tkanki tłuszczowej w komórki produkujące insulinę za pomocą prostego, stosunkowo krótkiego protokołu. Zaczniemy od wyizolowania mezenchymalnych komórek macierzystych tkanki tłuszczowej poprzez trawienie kolagenowe tłuszczu najądrza w celu uzyskania silniejszej frakcji naczyniowej.

Następnie mezenchymalne komórki macierzyste będą charakteryzować się plastycznym przyleganiem, a także ekspresją markerów CD i różnicowaniem się w wiele linii mezodermalnych. Znieczulić zwierzę, a następnie poddać go eutanazji za pomocą zwichnięcia szyjki macicy. Spryskaj całe ciało 70% etanolem i zacznij od wycięcia skóry i mięśni w dolnej części brzucha.

Następnie odsłoń jądra tłuszczem najądrza. Delikatnie odetnij tłuszcz z najądrza. Uważaj, aby nie przeciąć naczyń krwionośnych tłuszczami.

W komorze bezpieczeństwa biologicznego pokrój tkankę tłuszczową na małe kawałki za pomocą kleszczy i skalpela. Przenieś tkankę tłuszczową do probówki wirówkowej zawierającej 10 mililitrów sterylnego PBS. Rozpocznij mycie, przechylając rurkę Falcon na 45 sekund.

Następnie trzymaj probówkę w pozycji odstawionej przez pięć minut, aby rozdzielić ją na dwie warstwy. Usunąć PBS w podczerwieni za pomocą 10-mililitrowej strzykawki. Powtórz te kroki mycia cztery do pięciu razy, aż PBS będzie czysty.

Po umyciu ponownie zawiesić tkankę tłuszczową w roztworze kolagenowym, a następnie inkubować w wytrząsającej kąpieli wodnej, aż tkanka będzie prawie jednorodna. Następnie wirować mieszaninę kolagenu tkankowego przez 15 sekund, a następnie odwirować przez pięć minut. Po odwirowaniu będziesz miał trzy warstwy.

Ostrożnie wyrzuć supernatant na frakcję naczyniową zrębu. Najpierw ostrożnie wyrzuć warstwę oleju na górze, a następnie warstwę echa, nie naruszając osadu frakcji zrębu naczyniowego. Ponownie zawiesić frakcję naczyniową zrębu w sterylnym BSA i ponownie odwirować przez pięć minut.

Całe wirowanie, umieść kompletną pożywkę DMEM F-12 w kolbie o powierzchni 25 centymetrów kwadratowych. Po odwirowaniu odrzucić supernatant i ponownie zawiesić osad zrębu naczyniowego w kompletnych pożywkach DMEM F-12. I przenieś do kolby hodowlanej.

Umieść w inkubatorze z 5% dwutlenkiem węgla o temperaturze 37 stopni. Następnego dnia usuń niepodłączone komórki i zastąp nośnik świeżym. Począwszy od następnego dnia izolacji, zaczną pojawiać się komórki podobne do fibroblastów.

Potem stopniowo, w miarę upływu czasu, będą one rosły pod względem liczby i rozmiaru. Poprzez pasażowanie komórki staną się bardziej jednorodne. Komórki te wykazują wszystkie kryteria charakterystyki mezenchymalnych komórek macierzystych.

Komórki te różnicowano w kierunku komórek produkujących insulinę przy użyciu tego prostego protokołu zawierającego nikotynamid beta merkaptoetanol i Exendin-4. Na wszystkich etapach różnicowania komórki zaczynają tracić swój kształt fibroblastyczny i myślę, że morfologia podobna do klastrów. Po zastosowaniu komórki produkujące insulinę wykazują dodatnie szkarłatnoczerwone barwienie disytonem, następnie używane komórki produkujące insulinę wyrażają różne markery komórek beta, takie jak Pdx-1, mafA i insulina.

Ponadto indukowane komórki produkujące insulinę wydzielają wyższe poziomy insuliny w supernatancie pod wpływem wyższego stężenia glukozy. Dostarczyliśmy szczegółowy, krokowy protokół izolacji i charakterystyki mezenchymalnych komórek macierzystych tkanki tłuszczowej. Udostępniamy tutaj również stosunkowo krótki, prosty i skuteczny protokół różnicowania mezenchymalnych komórek macierzystych tkanki tłuszczowej w komórki produkujące insulinę.

Stanowi to dla badacza furtkę do wejścia w dziedzinę mezenchymalnych komórek macierzystych i zbadania ich różnicowania w komórki produkujące insulinę.