Name: Zmodyfikowana technika wykorzystania mysich serc noworodków w preparacie Langendorffa (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-03-04T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 23 s
Description: Poznaj zmodyfikowaną technikę perfuzji wstecznej serc noworodków mysich w preparacie Langendorffa. Metoda umożliwia badanie fizjologii serca w krytycznym okresie rozwoju już od 10. dnia życia.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

NIH/NINDS R01NS112706 (R.L.)

Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt Centrum Medycznego Uniwersytetu Columbia uzyskał zgody na wszystkie opisane metody. Do badania wykorzystano myszy 10 samców C57Bl/6 typu dzikiego po urodzeniu.
1. Przygotowanie aparatu Langendorffa
<ol>
	<li>Aby zminimalizować złożoność, w aparacie Langendorffa należy stosować nierecyrkulacyjny utleniony perfuzat (patrz tabela materiałów) przy stałym przepływie lub stałym ciśnieniu.
	<ol>
		<li>Użyć buforu Krebsa-Henseleita (KHB), zawierającego 120 mmol/L NaCl, 4,7 mmol/L KCl, 1,2 mmol/L MgSO4, 1,2 mmol/L KH2PO4, 1,25 mmol/L CaCl2, 25 mmol/LNaHCO3 i 11 mmol/L glukozy o pH 7,4 (patrz tabela materiałów), zrównoważyć z 95% O2 i 5% CO2 w aparacie Langendorffa i utrzymać w temperaturze 37 ° C.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>W przypadku podejścia o stałym przepływie utrzymuj ciągłe natężenie przepływu na poziomie ~ 2,5 ml ∙min-1, 
	UWAGA: To natężenie przepływu będzie w przybliżeniu zgodne z przepływem wieńcowym ~75-80 ml / g∙min, biorąc pod uwagę, że średnia waga 10-dniowego serca myszy (P10) wynosi ~30 mg17,18.</li>
</ol>
2. Produkcja kaniuli aortalnej
<ol>
	<li>Wykonaj kaniulę aortalną nowonarodzonej myszy z igły ze stali nierdzewnej 26 G (patrz Tabela materiałów). Za pomocą ostrych nożyczek odetnij końcówkę igły, aby stępić koniec. Należy uważać, aby nie zacisnąć ani nie ograniczyć średnicy światła igły. Wygładź krawędź cięcia i usuń wszelkie zadziory, delikatnie zeskrobując stępiony koniec na blacie laboratoryjnym, poruszając się w przód iw tył. 
	UWAGA: Mikroskopijne wiertła i ostre krawędzie należy usunąć, ponieważ mogą one rozerwać aortę nowonarodzonej myszy i uszkodzić zastawkę aortalną. Alternatywnie użyj papieru ściernego o drobnej ziarnistości.</li>
	<li>Przymocuj wyprodukowaną kaniulę do aparatu Langendorffa i oceń przepływ i opór. Zmierz natężenie przepływu przez kaniulę, zbierając i mierząc ilość buforu w znanym okresie czasu. Upewnij się, że rzeczywisty przepływ jest równy ustawionemu natężeniu przepływu 2.5 ml min-1.</li>
	<li>Określ ilościowo różnicę ciśnień w poprzek kaniuli z przepływającym KHB, wykonując poniższe czynności.
	<ol>
		<li>Zmierz ciśnienie w systemie z dołączoną fabryczną kaniulą i bez niej.</li>
		<li>Podziel różnicę ciśnień na kaniuli przez natężenie przepływu, aby uzyskać rezystancję kaniuli zgodnie z prawem Ohma15.</li>
		<li>Upewnij się, że wytworzona rezystancja kaniuli zawiera ~16,0 ± 1,9 mmHg∙min∙mL-1 całkowitej rezystancji6. Nadmierny opór sugeruje potencjalnie naruszoną średnicę lumenu kaniuli. 
		UWAGA: Przykładowe obliczenie: Pz kaniulą - P bez kaniuli = ΔP. Jeśli Pz = 48 i Pbez = 8, to ΔP = 40. Przy natężeniu przepływu (Q) 2,5 ml min-1 i ΔP 40 rezystancja kaniuli wynosi 16 mmHg∙min∙mL-1 przy użyciu R = ΔP/Q = 40 / 2,5 = 16.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wyjmij kaniulę 26 G i podłącz rurkę wysokociśnieniową (patrz Tabela materiałów) do miejsca kaniulacji w aparacie Langendorffa. Podłącz kaniulę aorty do dystalnego końca rurki. Odpowietrzyć rurkę i kaniulę buforem natlenionym, upewniając się, że wszystkie pęcherzyki zostały usunięte. 
	UWAGA: Zastosowanie w ten sposób przewodów wysokociśnieniowych pozwala na wysunięcie kaniuli do bardziej odległej pozycji. Jest to konieczne, aby umożliwić kaniulację aorty za pomocą mikroskopu preparacyjnego przylegającego do zestawu (<silna klasa = "xfig">Rysunek 1).</li>
</ol>
3. Grabież organów
<ol>
	<li>Myszy przeciwzakrzepowe należy stosować leki przeciwzakrzepowe poprzez dootrzewnowe (IP) wstrzyknięcie heparyny (10 kU/kg) (patrz tabela materiałów), aby zapobiec tworzeniu się mikroskrzeplin wieńcowych za pomocą igły 26 G na strzykawce o pojemności 1 ml. Odczekaj kilka minut, aby heparyna zaczęła krążyć przed przystąpieniem do wstrzykiwania jakiegokolwiek środka znieczulającego.</li>
	<li>Znieczulić zwierzę za pomocą wstrzyknięcia IP za pomocą igły 26 G na strzykawce 1 ml. 
	UWAGA: Konieczne jest uważne monitorowanie zwierzęcia po wstrzyknięciu środka znieczulającego, aby uniknąć bezdechu i późniejszego niedotlenienia. Pentobarbital (70 mg/kg) jest niezawodnym środkiem znieczulającym, ponieważ pozwala na szybkie rozpoczęcie sedacji bez wywoływania bezdechu19,20. Można stosować inne środki znieczulające, pod warunkiem, że stosowane dawki nie powodują bezdechu21. Badacze powinni rozważyć wpływ alternatywnych leków uspokajająco-nasennych na czynność serca22,23. Zwichnięcie szyjki macicy jako podstawowy sposób eutanazji może przedłużyć niedotlenienie i niedokrwienie przed kaniulacją.</li>
	<li>Umieść mysz w pozycji leżącej na plecach i zabezpiecz kończyny natychmiast po utracie przytomności. Użyj igieł podskórnych o małej średnicy, aby zabezpieczyć każdą kończynę. Rozpocznij zbiory, gdy tylko zwierzę przestanie reagować na szczypanie palców u stóp; Zwierzę powinno oddychać spontanicznie podczas wstępnego rozbioru.</li>
	<li>Wykonaj poprzeczne nacięcie podmieczykowate w poprzek szerokości zwierzęcia, aby odsłonić jamę brzuszną za pomocą prostych nożyczek preparacyjnych (patrz Tabela materiałów). 
	UWAGA: Technika sterylna nie jest konieczna, biorąc pod uwagę, że procedura stanowi operację nieprzeżywalną.
	<ol>
		<li>Zidentyfikuj przeponę lepiej i całkowicie naciąć przednią część. Przeciąć klatkę piersiową obustronnie wzdłuż środkowej linii pachowej w kierunku głowowy. Poproś asystenta, aby chwycił wyrostek mieczykowaty za pomocą kleszczy i odbił mostek i żebra czaszkowo, aby odsłonić narządy klatki piersiowej.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Zidentyfikuj podprzeponową żyłę główną dolną (IVC) nad wątrobą. Przeciąć IVC zakrzywionymi nożycami do tęczówki, utrzymując lekkie napięcie przednie i głowowe na bliższym segmencie za pomocą kleszczyków do tęczówki (patrz tabela materiałów).
	<ol>
		<li>Przeciąć z tyłu wzdłuż przedniej powierzchni kręgosłupa za pomocą zakrzywionych nożyczek do tęczówki, jednocześnie wyciągając IVC w górę i na zewnątrz jamy piersiowej. Gdy serce jest mobilizowane, ustaw nożyczki pod kątem do przodu i przetnij wielkie naczynia górnie, aby całkowicie usunąć serce i płuca. 
		UWAGA: Ta metoda pozwala na szybką eksplantację serca i płuc en bloc.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Natychmiast zanurz próbkę w lodowatym KHB lub soli fizjologicznej. Serce powinno przestać bić w ciągu kilku sekund.</li>
</ol>
4. Kaniulacja
<ol>
	<li>Wytnij kawałek ręcznika papierowego i umieść go na dnie płytkiej szalki Petriego, aby zapewnić tarcie i ustabilizować serce podczas kaniulacji. Zwilż lodowatym KHB, aby zapobiec przyleganiu do niego serca.
	<ol>
		<li>Umieść przygotowaną szalkę Petriego pod mikroskopem preparacyjnym i wyreguluj ostrość. Umieść kaniulę aorty przymocowaną do wysokociśnieniowej rurki przedłużającej pod mikroskopem preparacyjnym wraz z jedwabnym szwem 5-0 luźno zawiązanym wokół jej piasty (patrz Tabela materiałów). 
		UWAGA: Należy zachować ostrożność, aby ograniczyć ilość płynu na szalce Petriego, ponieważ płuca wypełnione powietrzem mogą unosić się na wodzie i powodować ruch wyciętych narządów.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Umieść wycięte narządy klatki piersiowej na szalce Petriego. Pod mikroskopem zidentyfikuj grasicę po jej białym połysku i dwóch płatach, a następnie ustaw próbkę tak, aby grasica była przednia i wyższa24. Zapewni to prawidłową orientację serca.</li>
	<li>Za pomocą kleszczy tępo oddziel płaty grasicy, aby odsłonić wielkie naczynia. Zidentyfikuj aortę, lokalizując charakterystyczne cechy rozgałęzień łuku aorty. 
	UWAGA: Ciemnofioletowy odcień często wyznacza prawą komorę i tętnicę płucną. Aorta wstępująca znajduje się między główną tętnicą płucną a prawym przedsionkiem.</li>
	<li>Przeciąć aortę cienkimi, ostrymi nożyczkami (patrz tabela materiałów) tuż obok startu tętnicy podobojczykowej. 
	UWAGA: Jeśli aorta zostanie przecięta zbyt blisko zastawki aortalnej, nie będzie wystarczającej ilości tkanki aortalnej, aby umożliwić zabezpieczenie kaniuli. Alternatywnie, jeśli aorta jest przecięta zbyt wysoko, perfuzat może wyciekać z jednej lub więcej gałęzi aorty (takich jak tętnica podobojczykowa).</li>
	<li>Delikatnie chwyć przeciętą aortę za pomocą cienkich, zakrzywionych kleszczyków jubilerskich (patrz Tabela materiałów). Ostrożnie kanuluj aortę igłą o sile 26 G, uważając, aby nie uszkodzić zastawki aortalnej. Przytrzymaj w miejscu, chwytając aortę cienkimi zakrzywionymi kleszczami wokół kaniuli. Po ustaleniu kontroli nad aortą rozpocznij perfuzję wsteczną, aby ograniczyć czas niedokrwienia. 
	UWAGA: Serce powinno zacząć bić i stanie się blade, gdy krew będzie odprowadzana z mięśnia sercowego, a KHB ukrwi tętnice wieńcowe. Brak spontanicznego bicia, obecność obrzęku komór lub brak zmiany koloru serca wskazuje na nieprawidłowo ustawioną kaniulę.</li>
	<li>Poproś asystenta, aby chwycił końce luźno zawiązanego szwu i ostrożnie unieruchomił aortę wokół kaniuli. Zaciśnij szew powyżej lub poniżej zakrzywionych cienkich kleszczy (przytrzymując kaniulę na miejscu), w zależności od ilości tkanki aorty i uwarunkowań anatomicznych. Zaciśnij szew i potwierdź adekwatność przepływu wieńcowego.</li>
	<li>Odłączyć przewód wysokociśnieniowy od aparatu Langendorffa. Chwyć piastę kaniuli i odłącz igłę od wysokociśnieniowej rurki przedłużającej. Szybko przymocuj piastę kaniuli do aparatu. 
	UWAGA: Należy uważać, aby nie przemieścić serca ani nie wciągnąć powietrza do kaniuli.</li>
	<li>Gdy serce zostanie zawieszone na aparacie Langendorffa w zwykłej pozycji i potwierdzona zostanie odpowiednia perfuzja, ostrożnie odetnij płuca, grasicę i nadmiar tkanki. Naciąć prawy przedsionek, aby umożliwić swobodny przepływ ścieku z zatok wieńcowych.</li>
</ol>
5. Pomiar funkcjonalny
<ol>
	<li>Zrób mały węzeł na końcu jedwabnego szwu 5-0 (przymocowanego do zakrzywionej igły). Przekłuj igłą mały kawałek folii parafinowej (2-3 mm x 2-3 mm) i wsuń parafinę na zawiązany koniec. Ostrożnie przełóż igłę przez wierzchołek komory i przeciągnij szew przez serce, aż film parafinowy przylega do bocznej ściany komory. 
	UWAGA: Film parafinowy pomaga zapobiegać rozerwaniu serca przez węzeł i przeciągnięciu się przez komorę.</li>
	<li>Przełóż igłę przez otwór wypełnionej wodą kurtki rozgrzewającej aparatu Langendorffa. Serce można teraz objąć i ogrzać.</li>
	<li>Przymocuj igłę do przetwornika siły (patrz Tabela materiałów) w taki sposób, aby uniknąć wycieku z zatoki wieńcowej. Wyreguluj szew, aby nałożyć 1-2 g napięcia podstawowego, zgodnie z napięciem rozkurczowym lub nadirem w śledzeniu napięcia. 
	UWAGA: Unikaj ściągania serca z kaniuli lub skręcania aorty, pogarszając w ten sposób perfuzję wieńcową.</li>
	<li>Umieść elektrody powierzchniowe na górnym i dolnym biegunie serca, aby zarejestrować elektrokardiogram. 
	UWAGA: Użyj pediatrycznego tymczasowego drutu do stymulacji nasierdzia z usuniętą igłą do elastycznej elektrody powierzchniowej podłączonej do Bio Amp (patrz Tabela materiałów).</li>
	<li>Pobrać próbkę ścieku z zatok wieńcowych do analizy za pomocą cewnika dożylnego 24 G (patrz tabela materiałów).</li>
	<li>Odejmij opór kaniuli od całkowitego oporu układu, aby uzyskać opór wieńcowy zgodnie z prawem Kirchhoffa25.</li>
</ol>

<ol><li>Bell, R., Mocanu, M., Yellon, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retrograde+heart+perfusion%3A+The+Langendorff+technique+of+isolated+heart+perfusion%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+and+Cellular+Cardiology%22%5BJournal%5D)">Retrograde heart perfusion: The Langendorff technique of isolated heart perfusion.</a> Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 50 (6), 940-950 (2011).</li>
<li>Skrzypiec-Spring, M., Grotthus, B., Szeląg, A., Schulz, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolated+heart+perfusion+according+to+Langendorff-still+viable+in+the+new+millennium%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Pharmacological+and+Toxicological+Methods%22%5BJournal%5D)">Isolated heart perfusion according to Langendorff-still viable in the new millennium.</a> Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. 55 (2), 113-126 (2007).</li>
<li>Olejnickova, V., Novakova, M., Provaznik, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolated+heart+models%3A+Cardiovascular+system+studies+and+technological+advances%5BTitle%5D)+AND+%22Medical+and+Biological+Engineering+and+Computing%22%5BJournal%5D)">Isolated heart models: Cardiovascular system studies and technological advances.</a> Medical and Biological Engineering and Computing. 53 (7), 669-678 (2015).</li>
<li>Döring, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+isolated+perfused+heart+according+to+Langendorff+technique--function--application%5BTitle%5D)+AND+%22Physiologia+Bohemoslovaca%22%5BJournal%5D)">The isolated perfused heart according to Langendorff technique--function--application.</a> Physiologia Bohemoslovaca. 39 (6), 481-504 (1990).</li>
<li>Liao, R., Podesser, B., Lim, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+continuing+evolution+of+the+Langendorff+and+ejecting+murine+heart%3A+New+advances+in+cardiac+phenotyping%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology-Heart+and+Circulatory+Physiology%22%5BJournal%5D)">The continuing evolution of the Langendorff and ejecting murine heart: New advances in cardiac phenotyping.</a> American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 303 (2), 156-167 (2012).</li>
<li>Barajas, M., Yim, P., Gallos, G., Levy, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+isolated+retrograde-perfused+newborn+mouse+heart+preparation%5BTitle%5D)+AND+%22MethodsX%22%5BJournal%5D)">An isolated retrograde-perfused newborn mouse heart preparation.</a> MethodsX. 7, 101058(2020).</li>
<li>De Leiris, J., Harding, D., Pestre, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+isolated+perfused+rat+heart%3A+A+model+for+studying+myocardial+hypoxia+or+ischaemia%5BTitle%5D)+AND+%22Basic+Research+in+Cardiology%22%5BJournal%5D)">The isolated perfused rat heart: A model for studying myocardial hypoxia or ischaemia.</a> Basic Research in Cardiology. 79 (3), 313-321 (1984).</li>
<li>Liaw, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Postnatal+shifts+in+ischemic+tolerance+and+cell+survival+signaling+in+murine+myocardium%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology-Regulatory%2C+Integrative+and+Comparative+Physiology%22%5BJournal%5D)">Postnatal shifts in ischemic tolerance and cell survival signaling in murine myocardium.</a> American Journal of Physiology-Regulatory, Integrative and Comparative Physiology. 305 (10), 1171-1181 (2013).</li>
<li>Chaudhary, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+effects+of+soluble+epoxide+hydrolase+inhibition+and+CYP2J2+overexpression+on+postischemic+cardiac+function+in+aged+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Prostaglandins+and+Other+Lipid+Mediators%22%5BJournal%5D)">Differential effects of soluble epoxide hydrolase inhibition and CYP2J2 overexpression on postischemic cardiac function in aged mice.</a> Prostaglandins and Other Lipid Mediators. 104, 8-17 (2013).</li>
<li>Dutta, S., Sengupta, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Men+and+mice%3A+Relating+their+ages%5BTitle%5D)+AND+%22Life+Sciences%22%5BJournal%5D)">Men and mice: Relating their ages.</a> Life Sciences. 152, 244-248 (2016).</li>
<li>Onay-Besikci, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+cardiac+energy+metabolism+in+newborn%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cellular+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Regulation of cardiac energy metabolism in newborn.</a> Molecular and Cellular Biochemistry. 287 (1), 1-11 (2006).</li>
<li>Milani-Nejad, N., Janssen, P. M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Small+and+large+animal+models+in+cardiac+contraction+research%3A+Advantages+and+disadvantages%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmacology+and+Therapeutics%22%5BJournal%5D)">Small and large animal models in cardiac contraction research: Advantages and disadvantages.</a> Pharmacology and Therapeutics. 141 (3), 235-249 (2014).</li>
<li>Kaese, S., Verheule, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardiac+electrophysiology+in+mice%3A+A+matter+of+size%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Physiology%22%5BJournal%5D)">Cardiac electrophysiology in mice: A matter of size.</a> Frontiers in Physiology. 3 (345), 00345(2012).</li>
<li>Tan, C., Lewandowski, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+transitional+heart%3A+From+early+embryonic+and+fetal+development+to+neonatal+life%5BTitle%5D)+AND+%22Fetal+Diagnosis+and+Therapy%22%5BJournal%5D)">The transitional heart: From early embryonic and fetal development to neonatal life.</a> Fetal Diagnosis and Therapy. 47 (5), 373-386 (2020).</li>
<li>Zhang, P., Lv, J., Li, Y., Zhang, L., Xiao, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neonatal+lipopolysaccharide+exposure+gender-dependently+increases+heart+susceptibility+to+ischemia%2Freperfusion+injury+in+male+rats%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Medical+Sciences%22%5BJournal%5D)">Neonatal lipopolysaccharide exposure gender-dependently increases heart susceptibility to ischemia/reperfusion injury in male rats.</a> International Journal of Medical Sciences. 14 (11), 1163(2017).</li>
<li>Ziyatdinova, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+If+Current+Blockade+on+Newborn+Rat+Heart+Isolated+According+to+Langendorff%5BTitle%5D)+AND+%22Bulletin+of+Experimental+Biology+and+Medicine%22%5BJournal%5D)">Effect of If Current Blockade on Newborn Rat Heart Isolated According to Langendorff.</a> Bulletin of Experimental Biology and Medicine. 167 (4), 424-427 (2019).</li>
<li>Teng, B., Tilley, S., Ledent, C., Mustafa, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+assessment+of+coronary+flow+and+cardiac+function+after+bolus+adenosine+injection+in+adenosine+receptor+knockout+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Physiological+reports%22%5BJournal%5D)">In vivo assessment of coronary flow and cardiac function after bolus adenosine injection in adenosine receptor knockout mice.</a> Physiological reports. 4 (11), 12818(2016).</li>
<li>Xu, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lethal+cardiomyopathy+in+mice+lacking+transferrin+receptor+in+the+heart%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Lethal cardiomyopathy in mice lacking transferrin receptor in the heart.</a> Cell Reports. 13 (3), 533-545 (2015).</li>
<li>Gargiulo, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mice+anesthesia%2C+analgesia%2C+and+care%2C+Part+I%3A+Anesthetic+considerations+in+preclinical+research%5BTitle%5D)+AND+%22Institute+for+Laboratory+Animal+Research%22%5BJournal%5D)">Mice anesthesia, analgesia, and care, Part I: Anesthetic considerations in preclinical research.</a> Institute for Laboratory Animal Research. 53 (1), 55-69 (2012).</li>
<li>Gargiulo, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mice+anesthesia%2C+analgesia%2C+and+care%2C+Part+I%3A+Anesthetic+considerations+in+preclinical+research%5BTitle%5D)+AND+%22ILAR+Journal%22%5BJournal%5D)">Mice anesthesia, analgesia, and care, Part I: Anesthetic considerations in preclinical research.</a> ILAR Journal. 53 (1), 55-69 (2012).</li>
<li>Erhardt, W., Hebestedt, A., Aschenbrenner, G., Pichotka, B., Blümel, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+comparative+study+with+various+anesthetics+in+mice+%28pentobarbitone%2C+ketamine-xylazine%2C+carfentanyl-etomidate%29%5BTitle%5D)+AND+%22Research+in+Experimental+Medicine%22%5BJournal%5D)">A comparative study with various anesthetics in mice (pentobarbitone, ketamine-xylazine, carfentanyl-etomidate).</a> Research in Experimental Medicine. 184 (3), 159-169 (1984).</li>
<li>Janssen, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+anesthetics+on+systemic+hemodynamics+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology-Heart+and+Circulatory+Physiology%22%5BJournal%5D)">Effects of anesthetics on systemic hemodynamics in mice.</a> American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 287 (4), 1618-1624 (2004).</li>
<li>Zuurbier, C., Koeman, A., Houten, S., Hollmann, M., Florijn, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimizing+anesthetic+regimen+for+surgery+in+mice+through+minimization+of+hemodynamic%2C+metabolic%2C+and+inflammatory+perturbations%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Biology+and+Medicine%22%5BJournal%5D)">Optimizing anesthetic regimen for surgery in mice through minimization of hemodynamic, metabolic, and inflammatory perturbations.</a> Experimental Biology and Medicine. 239 (6), 737-746 (2014).</li>
<li>Hard, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thymectomy+in+the+neonatal+rat%5BTitle%5D)+AND+%22Laboratory+Animals%22%5BJournal%5D)">Thymectomy in the neonatal rat.</a> Laboratory Animals. 9 (2), 105-110 (1975).</li>
<li>Sun, Z., Ambrosi, E., Bricalli, A., Ielmini, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Logic+computing+with+stateful+neural+networks+of+resistive+switches%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Materials%22%5BJournal%5D)">Logic computing with stateful neural networks of resistive switches.</a> Advanced Materials. 30 (38), 1802554(2018).</li>
<li>Clancy, B., Finlay, B., Darlington, R., Anand, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extrapolating+brain+development+from+experimental+species+to+humans%5BTitle%5D)+AND+%22Neurotoxicology%22%5BJournal%5D)">Extrapolating brain development from experimental species to humans.</a> Neurotoxicology. 28 (5), 931-937 (2007).</li>
<li>Hornig, M., Chian, D., Lipkin, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurotoxic+effects+of+postnatal+thimerosal+are+mouse+strain+dependent%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Psychiatry%22%5BJournal%5D)">Neurotoxic effects of postnatal thimerosal are mouse strain dependent.</a> Molecular Psychiatry. 9 (9), 833-845 (2004).</li>
<li>Langendorff, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Untersuchungen+am+%C3%BCberlebenden+S%C3%A4ugethierherzen%5BTitle%5D)+AND+%22Archiv+f%C3%BCr+die+gesamte+Physiologie+des+Menschen+und+der+Tiere%22%5BJournal%5D)">Untersuchungen am überlebenden Säugethierherzen.</a> Archiv für die gesamte Physiologie des Menschen und der Tiere. 61 (6), 291-332 (1895).</li>
<li>Edlund, A., Wennmalm, Å <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oxygen+consumption+in+rabbit+Langendorff+hearts+perfused+with+a+saline+medium%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Physiologica+Scandinavica%22%5BJournal%5D)">Oxygen consumption in rabbit Langendorff hearts perfused with a saline medium.</a> Acta Physiologica Scandinavica. 113 (1), 117-122 (1981).</li>
<li>Kuzmiak-Glancy, S., Jaimes, R., Wengrowski, A., Kay, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oxygen+demand+of+perfused+heart+preparations%3A+How+electromechanical+function+and+inadequate+oxygenation+affect+physiology+and+optical+measurements%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Physiology%22%5BJournal%5D)">Oxygen demand of perfused heart preparations: How electromechanical function and inadequate oxygenation affect physiology and optical measurements.</a> Experimental Physiology. 100 (6), 603-616 (2015).</li>
<li>Wiesmann, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Developmental+changes+of+cardiac+function+and+mass+assessed+with+MRI+in+neonatal%2C+juvenile%2C+and+adult+mice%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology-Heart+and+Circulatory+Physiology%22%5BJournal%5D)">Developmental changes of cardiac function and mass assessed with MRI in neonatal, juvenile, and adult mice.</a> American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 278 (2), 652-657 (2000).</li>
<li>Le, V., Kovacs, A., Wagenseil, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measuring+left+ventricular+pressure+in+late+embryonic+and+neonatal+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+visualized+experiments%22%5BJournal%5D)">Measuring left ventricular pressure in late embryonic and neonatal mice.</a> Journal of visualized experiments. (60), e3756(2012).</li>
<li>Bednarczyk, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Incorporating+dynamic+assessment+of+fluid+responsiveness+into+goal-directed+therapy%3A+A+systematic+review+and+meta-analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Critical+Care+Medicine%22%5BJournal%5D)">Incorporating dynamic assessment of fluid responsiveness into goal-directed therapy: A systematic review and meta-analysis.</a> Critical Care Medicine. 45 (9), 1538(2017).</li>
<li>Louch, W., Sheehan, K., Wolska, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+in+cardiomyocyte+isolation%2C+culture%2C+and+gene+transfer%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+and+Cellular+Cardiology%22%5BJournal%5D)">Methods in cardiomyocyte isolation, culture, and gene transfer.</a> Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 51 (3), 288-298 (2011).</li>
<li>Ackers-Johnson, M., Foo, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Langendorff-free+isolation+and+propagation+of+adult+mouse+cardiomyocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Langendorff-free isolation and propagation of adult mouse cardiomyocytes.</a> Methods in Molecular Biology. 1940, 193-204 (2019).</li>
<li>Peng, Y., Buller, C., Charpie, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impact+of+N-acetylcysteine+on+neonatal+cardiomyocyte+ischemia-reperfusion+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Pediatric+Research%22%5BJournal%5D)">Impact of N-acetylcysteine on neonatal cardiomyocyte ischemia-reperfusion injury.</a> Pediatric Research. 70 (1), 61-66 (2011).</li>
<li>Jarmakani, J., Nakazawa, M., Nagatomo, T., Langer, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+hypoxia+on+mechanical+function+in+the+neonatal+mammalian+heart%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology-Heart+and+Circulatory+Physiology%22%5BJournal%5D)">Effect of hypoxia on mechanical function in the neonatal mammalian heart.</a> American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 235 (5), 469-474 (1978).</li>
<li>Podesser, B., Hausleithner, V., Wollenek, G., Seitelberger, R., Wolner, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Langendorff+and+ischemia+in+immature+and+neonatal+myocardia%3A+Two+essential+key-words+in+Today%27s+cardiothoracic+research%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Chirurgica+Austriaca%22%5BJournal%5D)">Langendorff and ischemia in immature and neonatal myocardia: Two essential key-words in Today's cardiothoracic research.</a> Acta Chirurgica Austriaca. 25 (6), 434-437 (1993).</li>
<li>Popescu, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Getting+an+early+start+in+understanding+perinatal+asphyxia+impact+on+the+cardiovascular+system%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Pediatrics%22%5BJournal%5D)">Getting an early start in understanding perinatal asphyxia impact on the cardiovascular system.</a> Frontiers in Pediatrics. 8, 68(2020).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Niniejsza praca opisuje udaną kaniulację aorty i perfuzję wsteczną w izolowanym sercu nowonarodzonego myszy. Co ważne, pozwala to naukowcom pokonać bariery, które wcześniej stanowił młody wiek myszy i mały rozmiar serca8. Chociaż podejście to nie jest skomplikowane w projektowaniu, wymaga znacznego stopnia umiejętności technicznych. Kluczowymi krokami, które nieuchronnie będą wyzwaniem nawet dla najbardziej biegłych technicznie badaczy, będzie kaniulacja aorty i zabezpieczenie kaniuli na miejscu. ...

Preparaty na serce ex-vivo są podstawą badań fizjologicznych, patofizjologicznych i farmakologicznych od ponad stu lat. Wywodząc się z pracy Eliasa Cyona w latach sześćdziesiątych XIX wieku, Oskar Langendorff zaadaptował izolowany model żaby do perfuzji wstecznej, zwiększając ciśnienie w korzeniu aorty, aby zapewnić przepływ wieńcowy za pomocą natlenionego perfuzatu 1. Korzystając ze swojej adaptacji, Langendorff był w stanie wykazać korelację między krążeniem wieńcowym a funkcją mechaniczną2. Perfundowane serce retrogradacyjne ex-vivo, nazwane później techniką Langendorffa, pozostało kamieniem węgielnym badań fizjologicznych, wykorzystując jego prostotę do silnego badania izolowanego serca przy braku potencjalnych czynników zakłócających. Preparat Langendorffa został jeszcze bardziej zmodyfikowany, aby umożliwić wyrzucenie serca (tzw. "pracujące serce") i umożliwić recyrkulację perfuzatu3. Jednak pierwszorzędowe fizjologiczne punkty końcowe będące przedmiotem zainteresowania pozostały niezmienione. Takie punkty końcowe obejmują pomiary funkcji skurczowej, przewodnictwa elektrycznego, metabolizmu serca i odporności wieńcowej4.
Aby ocenić funkcję serca w swoim oryginalnym przygotowaniu dla serca żaby, Langendorff zmierzył napięcie generowane przez skurcz komorowy w osi podłużnej za pomocą szwu połączonego między wierzchołkiem serca a przetwornikiem siły. 5 Skurcz izometryczny został określony ilościowo w ten sposób, z napięciem podstawowym zastosowanym do serca przy braku wypełnienia komory. Udoskonalenie metody doprowadziło do umieszczenia wypełnionych płynem balonów w lewej komorze przez lewy przedsionek w celu oceny wydajności mięśnia sercowego podczas skurczu izowolumicznego6. Aby ocenić rytm serca i częstość akcji serca, przewody powierzchniowe można umieścić na biegunach serca, aby umożliwić badaczom rejestrację elektrokardiogramu. Można jednak spodziewać się bradykardii względnej, biorąc pod uwagę obowiązkowe odnerwienie. Stymulacja zewnętrzna może służyć do przezwyciężenia tego problemu i wyeliminowania zmienności rytmu serca między eksperymentami1. Inną miarą wyniku, metabolizm mięśnia sercowego, można ocenić, mierząc zawartość tlenu i substratu metabolicznego w perfuzacie wieńcowym i ściekach oraz obliczając różnicę między nimi7. Kwantyfikacja mleczanów w ściekach wieńcowych może pomóc w scharakteryzowaniu okresów metabolizmu beztlenowego, co obserwuje się w przypadku niedotlenienia, hipoperfuzji, niedokrwienia-reperfuzji lub zaburzeń metabolicznych7.
Oryginalna praca Langendorffa umożliwiła badanie serca ssaków ex-vivo, używając kotów jako głównego tematu5. Ocena izolowanego serca szczura zyskała popularność w połowie XX wieku u Howarda Morgana, który szczegółowo opisał model szczura "pracującego serca" w 1967 roku5. Wykorzystanie myszy rozpoczęło się zaledwie 25 lat temu ze względu na złożoność techniczną, kruchość tkanek i stosunkowo mały rozmiar mysiego serca. Pomimo wyzwań związanych z badaniami na myszach, niższe koszty i łatwość manipulacji genetycznej zwiększyły atrakcyjność i popyt na takie mysie preparaty ex-vivo. Niestety, zastosowanie tej techniki zostało ograniczone do dorosłych zwierząt, przy czym młode 4-tygodniowe myszy były najmłodszymi obiektami wykorzystywanymi do badań ex-vivo do niedawna8,9. Podczas gdy młode myszy są "stosunkowo niedojrzałe" w porównaniu z dorosłymi, ich użyteczność jako obiektów badań biologii rozwojowej jest ograniczona, ponieważ w większości przypadków odstawiły od piersi i wkrótce rozpoczną dojrzewanie10. Okres dojrzewania następuje znacznie po okresie pourodzeniowym w wykorzystaniu substratów mięśnia sercowego z glukozy i mleczanu na kwasy tłuszczowe11. Tak więc większość informacji na temat zmian metabolicznych w sercu noworodków historycznie wynikała z badań ex-vivo na większych gatunkach, takich jak króliki i świnki morskie11.
Rzeczywiście, istnieją alternatywne podejścia do przygotowania Langendorffa. Należą do nich eksperymenty in vitro, w których brakuje danych i kontekstu funkcjonalnego całego narządu, lub badania in vivo. Może to być technicznie trudne i skomplikowane ze względu na mylące zmienne, takie jak wpływ wymaganego środka znieczulającego na układ sercowo-naczyniowy i oddechowy, wpływ danych neurohumoralnych, konsekwencje temperatury głębokiej, stan odżywienia zwierzęcia i dostępność substratu12,13. Ponieważ podejście Langendorffa pozwala na badanie serca z izolowaną perfuzją w sposób ex-vivo w bardziej kontrolowany sposób przy braku takich czynników zakłócających, było ono i nadal jest uważane za potężne narzędzie badawcze. W związku z tym przedstawiona tutaj technika daje naukowcom eksperymentalne podejście do badania ex-vivo nowonarodzonego mysiego serca i ogranicza czas do reperfuzji.
Badanie serca w okresach rozwoju jest ważnym czynnikiem, biorąc pod uwagę szeroki zakres biochemicznych, fizjologicznych i anatomicznych przemian, które zachodzą podczas dojrzewania mięśnia sercowego. Przejścia od metabolizmu beztlenowego do fosforylacji oksydacyjnej, zmiany w wykorzystaniu substratu i progresja od proliferacji komórek do hipertrofii to dynamiczne procesy, które wyjątkowo zachodzą w niedojrzałym sercu11,14. Innym krytycznym aspektem rozwijającego się serca jest to, że stresory napotkane w niezbędnych okresach mogą powodować zwiększone reakcje w sercu noworodka i zmieniać przyszłą podatność na zniewagi w wieku dorosłym15. Chociaż wcześniejsze prace wykorzystywały nowonarodzone szczury, jagnięta i króliki do badania serca noworodków z perfuzją Langendorffa, postęp pozwalający na wykorzystanie myszy jest konieczny ze względu na znaczenie tego gatunku dla badań nad biologią rozwojową16. Aby zaspokoić tę potrzebę, niedawno stworzono pierwszy mysi model serca noworodka z perfuzją Langendorffa z wykorzystaniem 10-dniowych zwierząt6. Przedstawiono metodę umożliwiającą udaną kaniulację aorty i ustanowienie wstecznej perfuzji izolowanego mysiego serca noworodka. Podejście to może być wykorzystane w farmakologii, badaniach niedokrwienno-reperfuzyjnych lub metabolicznych koncentrujących się na funkcji całego narządu lub może być dostosowane do izolacji kardiomiocytów.

<table><tbody><tr><td>Aparat Langendorffa dla gryzoni</td><td>Radnoti</td><td>130102EZ</td><td></td></tr><tr><td>Cewnik 24 G</td><td>BD</td><td>381511</td><td></td></tr><tr><td>Igła 26 G na strzykawce 1 ml combo Igła</td><td>stalowa BD</td><td>309597</td><td></td></tr><tr><td>26 G</td><td>BD</td><td>305111</td><td></td></tr><tr><td>5-0 Szew jedwabny</td><td>Ethicon</td><td>S1173</td><td></td></tr><tr><td>Bio Amp</td><td>ADInstruments</td><td>FE135</td><td></td></tr><tr><td>Akcesoria do biologicznych</td><td></td><td>MLA1515</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C4901-100G</td><td></td></tr><tr><td>Obiegowa woda grzewcza Kąpiel</td><td>Haake</td><td>DC10</td><td></td></tr><tr><td>zakrzywione nożyczki do tęczówki</td><td>Medline</td><td>MDS10033Z</td><td></td></tr><tr><td>mikroskop preparacyjny</td><td>Nikon</td><td>SMZ-2B</td><td></td></tr><tr><td>znajdź nożyczki sprężynowe</td><td>Kent</td><td></td><td></td>Przetwornik</tr><tr><td>siły</td><td>INS600127 ADInstruments</td><td>MLT1030/D</td><td></td></tr><tr><td>glukoza</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G8270-100G</td><td></td></tr><tr><td>Heparyna</td><td>Sagent</td><td>400-01</td><td></td></tr><tr><td>Rurki wysokociśnieniowe</td><td>Edwards Lifesciences</td><td>50P184</td><td></td></tr><tr><td>kleszczyki opatrunkowe do tęczówki</td><td>Kent</td><td>INS650915-4</td><td></td></tr><tr><td>Zakrzywiony w stylu jubilera kleszcze drobne</td><td>Miltex</td><td>17-307-MLTX</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P3911-25G</td><td></td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P0662-25G</td><td></td></tr><tr><td>MgSO4</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M7506-500G</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9888-25G</td><td></td></tr><tr><td>NaHCO3</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S6014-25G</td><td></td></tr><tr><td>Pompa rolkowa</td><td>Gilson</td><td>Minipuls 3</td><td></td></tr><tr><td>proste nożyczki preparacyjne</td><td>Kent</td><td>INS600393-G</td><td></td></tr><tr><td>Tymczasowy drut stymulacyjny serca</td><td>Ethicon</td><td>TPW30</td><td></td></tr><tr><td>Przetwornik siły o szerokim zakresie</td><td>ADInstruments</td><td>MLT1030/A</td><td></td></tr></tbody></table>

zmodyfikowana technika wykorzystania mysich serc noworodków w preparacie langendorffa

Modified Technique for the Use of Neonatal Murine Hearts in the Langendorff Preparation

Użycie perfundowanego serca ex-vivo wstecznego od dawna jest kamieniem węgielnym badań nad niedokrwieniem i reperfuzją, odkąd zostało opracowane przez Oskara Langendorffa ponad sto lat temu. Chociaż technika ta była stosowana u myszy w ciągu ostatnich 25 lat, jej zastosowanie u tego gatunku było ograniczone do dorosłych zwierząt. Opracowanie skutecznej metody konsekwentnej kanulacji mysiej aorty noworodka pozwoliłoby na systematyczne badanie izolowanego wstecznie perfundowanego serca w krytycznym okresie rozwoju serca u genetycznie modyfikowalnego i taniego gatunku. Modyfikacja preparatu Langendorffa umożliwia kaniulację i ustanowienie reperfuzji w mysim sercu noworodka przy jednoczesnym zminimalizowaniu czasu niedokrwiennego. Optymalizacja wymaga techniki dwuosobowej, aby umożliwić pomyślną kaniulację aorty noworodka myszy przy użyciu mikroskopu preparacyjnego i zmodyfikowanej dostępnej na rynku igły. Zastosowanie tego podejścia niezawodnie ustali perfuzję wsteczną w ciągu 3 minut. Ponieważ kruchość serca noworodka myszy i rozmiar jamy komorowej uniemożliwiają bezpośredni pomiar ciśnienia wewnątrzkomorowego wytwarzanego za pomocą balonu, konieczne jest użycie przetwornika siły połączonego szwem z wierzchołkiem lewej komory w celu ilościowego określenia podłużnego napięcia skurczowego. Metoda ta pozwala badaczom z powodzeniem ustalić izolowany preparat nowonarodzonego mysiego serca z perfuzją wsteczną o stałym przepływie, co pozwala na badanie biologii rozwojowej serca w sposób ex-vivo. Co ważne, model ten będzie potężnym narzędziem do badania fizjologicznych i farmakologicznych reakcji na niedokrwienie i reperfuzję w sercu noworodka.

Myszy P10 zostały wykorzystane do modelowania punktu czasowego odpowiadającego ludzkiej niemowlęcości26,27. Pomyślnie pobrano i kaniulowano piętnaście izolowanych serc noworodkowych myszy szczepu C57Bl/6. Serca perfundowano ciągłym przepływem 2,5 mL min-1 ogrzanego, natlenionego roztworu KHB. Zmierzono parametry metaboliczne, w tym ekstrakcję glukozy, zużycie tlenu i produkcję mleczanów, a także parametry fizjologiczne, takie jak częstość akcji serca, ...

Obecny protokół opisuje kaniulację aorty i wsteczną perfuzję mysiego serca ex-vivo. Strategia dwuosobowa, wykorzystująca mikroskop preparacyjny i igłę o małym grubym rozmiarze, pozwala na niezawodną kaniulację. Kwantyfikacja podłużnego napięcia skurczowego uzyskuje się za pomocą przetwornika siły podłączonego do wierzchołka lewej komory.

Zmodyfikowana technika wykorzystania mysich serc noworodków w preparacie Langendorffa

The use of the ex-vivo retrograde perfused heart has long been a cornerstone of ischemia-reperfusion investigation since its development by Oskar ...

Takie podejście niezawodnie ustala wsteczną perfuzję serca myszy ex vivo noworodka w czasie krótszym niż trzy minuty. Tym samym obniżając najmłodszy możliwy wiek badania z kilku tygodni do 10 dni po porodzie. Ten izolowany model perfuzji wstecznej pozwala na badanie serca noworodka w krytycznym okresie rozwoju serca u genetycznie modyfikowalnych i tanich gatunków.Chociaż model ten nadaje się do badania fizjologicznych i farmakologicznych reakcji na niedokrwienie-reperfuzję w sercu noworodka. Może być również wykorzystany do izolacji kardiomiocytów. Aby wytworzyć kaniulę aortalną nowonarodzonej myszy, użyj ostrych nożyczek, aby odciąć końcówkę i stępić koniec igły ze stali nierdzewnej o rozmiarze 26, uważając, aby nie zacisnąć ani nie ograniczyć średnicy światła igły.Następnie wygładź krawędź cięcia, aby usunąć wszelkie zadziory, delikatnie zeskrobując stępiony koniec na blacie stołu laboratoryjnego, poruszając się w przód iw tył. Następnie podłącz wyprodukowaną kaniulę do aparatu Langendorffa i oceń przepływ i opór. Zmierz natężenie przepływu przez kaniulę, zbierając i mierząc ilość buforu w odstępie jednej minuty.Aby określić ilościowo różnicę ciśnień w kaniuli podczas przepływu buforu Krebsa-Heneseleita, należy zmierzyć ciśnienie w systemie z podłączoną kaniulą i bez niej. Następnie oblicz opór kaniuli, korzystając z poniższego wzoru. Następnie wyjmij kaniulę o rozmiarze 26 z aparatu Langendorffa i przymocuj rurkę wysokociśnieniową do miejsca kaniulacji na aparacie.Następnie przymocuj kaniulę aorty do dystalnego końca rurki i przewietrz rurkę i kaniulę za pomocą natlenionego buforu, upewniając się, że wszystkie pęcherzyki zostały usunięte. Aby zapobiec tworzeniu się mikroskrzeplin wieńcowych, należy podać dootrzewnowe wstrzyknięcie heparyny 10-dniowemu szczeniakowi myszy za pomocą igły o rozmiarze 26 na strzykawce o pojemności jednego mililitra. Odczekaj kilka minut, aby heparyna zaczęła krążyć przed przystąpieniem do wstrzykiwania jakiegokolwiek środka znieczulającego.Następnie umieść znieczuloną mysz w pozycji leżącej na plecach i zabezpiecz kończyny natychmiast po utracie przytomności. Zbiór należy rozpocząć, gdy tylko zwierzę przestanie reagować na szczypanie palców u stóp, ponieważ zwierzę spontanicznie oddycha podczas początkowego rozbioru roślin. Za pomocą prostych nożyczek preparacyjnych wykonaj poprzeczne nacięcie podmieczykowate na szerokość zwierzęcia, odsłaniając jamę brzuszną.Poproś asystenta, aby chwycił wyrostek mieczykowaty kleszczami, a następnie przetnij klatkę piersiową dwustronnie wzdłuż środkowej linii pachowej w kierunku głowodu i odbij mostek i żebra czaszkowo, aby odsłonić narządy klatki piersiowej. Po lepszym zidentyfikowaniu przepony należy całkowicie naciąć przednią część. Zidentyfikuj podprzeponową żyłę główną dolną nad wątrobą i przeciąć ją zakrzywionymi nożycami tęczówki, zachowując lekkie wnętrze w napięciu głowowym na bliższym segmencie za pomocą kleszczy tęczówki.Następnie przetnij z tyłu wzdłuż wewnętrznej powierzchni kręgosłupa za pomocą zakrzywionych nożyczek do tęczówki, jednocześnie ciągnąc żyłę główną dolną do góry i na zewnątrz jamy klatki piersiowej. Gdy serce jest zmobilizowane, ustaw nożyczki pod kątem do przodu i przetnij wielkie naczynia górnie, aby całkowicie usunąć serce i płuca. Natychmiast zanurz próbkę w lodowatym buforze Krebs-Henseleit lub soli fizjologicznej.Serce powinno przestać bić w ciągu kilku sekund. Umieść kawałek ręcznika papierowego na dnie płytkiej szalki Petriego, aby zapewnić tarcie i ustabilizować serce podczas kaniulacji. Zwilż ręcznik papierowy lodowatym buforem Krebs-Henseleit, aby zapobiec przyleganiu do niego serca.Umieść przygotowaną szalkę Petriego pod mikroskopem preparacyjnym i wyreguluj ostrość. Teraz umieść kaniulę aorty przymocowaną do wysokociśnieniowej rurki przedłużającej pod mikroskopem preparacyjnym wraz z jedwabnym szwem 5-0 luźno zawiązanym wokół piasty. Po umieszczeniu wyciętych narządów klatki piersiowej na szalce Petriego, zidentyfikuj grasicę po jej białym połysku i dwóch płatach i ustaw próbkę tak, aby grasica była przednia i górna.Następnie za pomocą kleszczy tępo oddzielaj płaty grasicy, odsłaniając wielkie naczynia. Następnie zidentyfikuj aortę, lokalizując charakterystyczne cechy rozgałęzienia łuku aorty i przeciąć ją tuż proksymalnie do startu tętnicy podobojczykowej za pomocą cienkich, ostrych nożyczek. Teraz delikatnie chwyć przeciętą aortę za pomocą cienkich zakrzywionych kleszczyków w stylu jubilera i ostrożnie kaniuluj aortę igłą o rozmiarze 26, uważając, aby nie uszkodzić zastawki aortalnej.Za pomocą cienkich zakrzywionych kleszczyków chwyć aortę wokół kaniuli i zainicjuj perfuzję wsteczną, aby ograniczyć czas niedokrwienia. Poproś asystenta, aby chwycił końce luźno zawiązanego szwu i ostrożnie unieruchomił aortę wokół kaniuli. Zaciśnij szew powyżej lub poniżej cienkich zakrzywionych kleszczy, a następnie zaciśnij szew i potwierdź adekwatność przepływu wieńcowego.Odłącz rurkę wysokociśnieniową od aparatu Langendorffa, chwyć piastę kaniuli i odłącz igłę od przedłużacza wysokociśnieniowego. Następnie szybko przymocuj piastę kaniuli do aparatu. Po zawieszeniu serca na aparacie Langendorffa w zwykłej pozycji potwierdza się odpowiednią perfuzję.Ostrożnie odetnij płuca, grasicę i nadmiar tkanki. Następnie naciąć prawy przedsionek, aby umożliwić swobodny wyciek z zatok wieńcowych. Zrób mały węzeł na końcu jedwabnego szwu 5-0, a następnie przebij igłą mały kawałek folii parafinowej i wsuń parafinę do zawiązanego końca.Ostrożnie przełóż igłę przez wierzchołek komory i przeciągnij szew przez serce, aż film parafinowy przylega do bocznej ściany komory. Przełóż igłę przez otwór wypełnionej wodą kurtki rozgrzewającej aparatu Langendorffa, aby można było zamknąć i ogrzać serce. Następnie przymocuj igłę do przetwornika siły, unikając kroplówki z zatoki wieńcowej.Dostosuj szew, aby nałożyć od jednego do dwóch gramów napięcia podstawowego, zgodnie ze wskazaniami napięcia rozkurczowego lub śledzenia intencji nadiru. Następnie umieść elektrody powierzchniowe na górnym i dolnym biegunie serca, aby zarejestrować elektrokardiogram. Na koniec pobierz próbkę ścieków z zatok wieńcowych do analizy za pomocą cewnika dożylnego o rozmiarze 24.Elektrody powierzchniowe wykorzystano do zapisu ciągłego elektrokardiogramu, który pozwolił na określenie wewnętrznej częstości i rytmu. Wszystkie odpowiednio ukrwione serca biją spontanicznie w rytmie zatokowym. Ta strategia perfuzji zaspokoiła potrzeby metaboliczne nowonarodzonego serca myszy, biorąc pod uwagę znikomą produkcję mleczanu oraz niski procent ekstrakcji tlenu i zużycia glukozy.Zarejestrowano i obliczono również średnie zmienne fizjologiczne, takie jak średnia wewnętrzna częstość akcji serca odnerwionego i średnie obserwowane ciśnienie perfuzji w aortach. Niektóre kryteria wykluczające, takie jak czas potrzebny do rozpoczęcia reperfuzji, czas trwania arytmii i ciśnienie perfuzji w aorty, muszą być brane pod uwagę, aby zapewnić spójność preparatu dla noworodków. Po ustaleniu perfuzji może dojść do interwencji, takiej jak podanie leku, indukcja uszkodzenia niedokrwienno-reperfuzyjnego, zmiany metabolitów lub dostarczenie środków enzymatycznych do izolacji kardiomiocytów.

modified-technique-for-use-neonatal-murine-hearts-langendorff

Research

JoVE Journal

Medicine

Medycyna

Niniejszy artykuł opisuje technikę o wysokiej rozdzielczości czasowej i przestrzennej do obrazowania optycznego przemieszczania się potencjału czynnościowego na powierzchni serca szczura perfundowanego metodą Langendorffa z wykorzystaniem barwnika potencjometrycznego (di-8-ANEPPS).

Mapowanie optyczne serc szczurzych perfundowanych metodą Langendorffa

W tym filmie wykonujemy retrogradacyjną perfuzję Langendorffa izolowanego serca myszy. Podczas zabiegu czynność serca jest utrzymywana poprzez jego wsteczne perfuzję roztworem perfuzyjnym przez tętnice wieńcowe za pomocą kaniuli wprowadzanej do aorty wstępującej. Model służy do badania patofizjologii serca serca.

Wsteczna perfuzja serca Langendorffa: technika ex vivo perfuzji izolowanego serca myszy

Pierwotne hodowle kardiomiocytów myszy są jednym z kluczowych narzędzi do badania organizacji i funkcji miofibrylarów. Poniższy protokół opisuje izolację i hodowlę pierwotnych kardiomiocytów z serca noworodków myszy. Uzyskane w ten sposób kultury kardiomiocytów mogą być następnie wykorzystane do różnych testów biomechanicznych, biochemicznych i biologicznych.

Izolacja i hodowla nowonarodzonych kardiomiocytów myszy

Ten protokół opisuje wysoce powtarzalny model regeneracji serca poprzez chirurgiczną indukcję zawału mięśnia sercowego w lewej komorze myszy po urodzeniu 1. dnia. Metoda polega na indukcji znieczulenia hipotermicznego i podwiązaniu lewej przedniej zstępującej tętnicy wieńcowej.

Zawał mięśnia sercowego u nowonarodzonych myszy, model regeneracji serca

W tych badaniach podajemy metodologię nowatorskich, noworodkowych, mysich rusztowań serca do wykorzystania w badaniach regeneracyjnych.

Rusztowania serca noworodków: nowe matryce do badań regeneracyjnych

Opracowaliśmy prostąmetodę izolowania wysokiej jakości pojedynczych komórek serca myszy za pomocą techniki perfuzji antegrade. Metoda ta nie zawiera metody Langendorffa i jest przydatna do izolowania miocytów komorowych i przedsionkowych lub komórek śródmiąższowych, takich jak fibroblasty serca lub komórki progenitorowe.

Metoda perfuzji antegrade do izolacji kardiomiocytów od myszy

Udostępniamy protokół separacji makrofagów serca noworodków i przeszczepu do serca dorosłej myszy, co może być obiecującym sposobem na wspomaganie naprawy serca.

Przeszczepianie makrofagów sercowych nowonarodzonych myszy do dorosłych myszy

Ten protokół opisuje modyfikacje metody Langendorffa, w tym głębokość kaniulacji aorty do jednoczesnej izolacji miocytów przedsionkowych i komorowych od dorosłych myszy.

Modyfikacje metody Langendorffa do jednoczesnej izolacji miocytów przedsionkowych i komorowych od dorosłych myszy

Złotym standardem w kardiologii dla komórkowych i molekularnych eksperymentów funkcjonalnych są kardiomiocyty. W artykule opisano adaptacje techniki innej niż Langendorff do izolowania kardiomiocytów myszy.

Prosta i skuteczna metoda konsekwentnego izolowania kardiomiocytów myszy

Prezentowany tutaj jest protokół do wiarygodnego ilościowego określenia funkcji prawej i lewej komory serca dawcy po konserwacji na zimno przy użyciu systemu perfuzji ex vivo.

Ocena funkcji dwukomorowej myszy ex vivo w modelu Langendorffa

Poznaj zmodyfikowaną technikę perfuzji wstecznej serc noworodków mysich w preparacie Langendorffa. Metoda umożliwia badanie fizjologii serca w krytycznym okresie rozwoju już od 10. dnia życia.

Zmodyfikowana technika wykorzystania mysich serc noworodków w preparacie Langendorffa

Przeglądaj więcej filmów