Zmodyfikowana technika wykorzystania mysich serc noworodków w preparacie Langendorffa

Takie podejście niezawodnie ustala wsteczną perfuzję serca myszy ex vivo noworodka w czasie krótszym niż trzy minuty. Tym samym obniżając najmłodszy możliwy wiek badania z kilku tygodni do 10 dni po porodzie. Ten izolowany model perfuzji wstecznej pozwala na badanie serca noworodka w krytycznym okresie rozwoju serca u genetycznie modyfikowalnych i tanich gatunków.

Chociaż model ten nadaje się do badania fizjologicznych i farmakologicznych reakcji na niedokrwienie-reperfuzję w sercu noworodka. Może być również wykorzystany do izolacji kardiomiocytów. Aby wytworzyć kaniulę aortalną nowonarodzonej myszy, użyj ostrych nożyczek, aby odciąć końcówkę i stępić koniec igły ze stali nierdzewnej o rozmiarze 26, uważając, aby nie zacisnąć ani nie ograniczyć średnicy światła igły.

Następnie wygładź krawędź cięcia, aby usunąć wszelkie zadziory, delikatnie zeskrobując stępiony koniec na blacie stołu laboratoryjnego, poruszając się w przód iw tył. Następnie podłącz wyprodukowaną kaniulę do aparatu Langendorffa i oceń przepływ i opór. Zmierz natężenie przepływu przez kaniulę, zbierając i mierząc ilość buforu w odstępie jednej minuty.

Aby określić ilościowo różnicę ciśnień w kaniuli podczas przepływu buforu Krebsa-Heneseleita, należy zmierzyć ciśnienie w systemie z podłączoną kaniulą i bez niej. Następnie oblicz opór kaniuli, korzystając z poniższego wzoru. Następnie wyjmij kaniulę o rozmiarze 26 z aparatu Langendorffa i przymocuj rurkę wysokociśnieniową do miejsca kaniulacji na aparacie.

Następnie przymocuj kaniulę aorty do dystalnego końca rurki i przewietrz rurkę i kaniulę za pomocą natlenionego buforu, upewniając się, że wszystkie pęcherzyki zostały usunięte. Aby zapobiec tworzeniu się mikroskrzeplin wieńcowych, należy podać dootrzewnowe wstrzyknięcie heparyny 10-dniowemu szczeniakowi myszy za pomocą igły o rozmiarze 26 na strzykawce o pojemności jednego mililitra. Odczekaj kilka minut, aby heparyna zaczęła krążyć przed przystąpieniem do wstrzykiwania jakiegokolwiek środka znieczulającego.

Następnie umieść znieczuloną mysz w pozycji leżącej na plecach i zabezpiecz kończyny natychmiast po utracie przytomności. Zbiór należy rozpocząć, gdy tylko zwierzę przestanie reagować na szczypanie palców u stóp, ponieważ zwierzę spontanicznie oddycha podczas początkowego rozbioru roślin. Za pomocą prostych nożyczek preparacyjnych wykonaj poprzeczne nacięcie podmieczykowate na szerokość zwierzęcia, odsłaniając jamę brzuszną.

Poproś asystenta, aby chwycił wyrostek mieczykowaty kleszczami, a następnie przetnij klatkę piersiową dwustronnie wzdłuż środkowej linii pachowej w kierunku głowodu i odbij mostek i żebra czaszkowo, aby odsłonić narządy klatki piersiowej. Po lepszym zidentyfikowaniu przepony należy całkowicie naciąć przednią część. Zidentyfikuj podprzeponową żyłę główną dolną nad wątrobą i przeciąć ją zakrzywionymi nożycami tęczówki, zachowując lekkie wnętrze w napięciu głowowym na bliższym segmencie za pomocą kleszczy tęczówki.

Następnie przetnij z tyłu wzdłuż wewnętrznej powierzchni kręgosłupa za pomocą zakrzywionych nożyczek do tęczówki, jednocześnie ciągnąc żyłę główną dolną do góry i na zewnątrz jamy klatki piersiowej. Gdy serce jest zmobilizowane, ustaw nożyczki pod kątem do przodu i przetnij wielkie naczynia górnie, aby całkowicie usunąć serce i płuca. Natychmiast zanurz próbkę w lodowatym buforze Krebs-Henseleit lub soli fizjologicznej.

Serce powinno przestać bić w ciągu kilku sekund. Umieść kawałek ręcznika papierowego na dnie płytkiej szalki Petriego, aby zapewnić tarcie i ustabilizować serce podczas kaniulacji. Zwilż ręcznik papierowy lodowatym buforem Krebs-Henseleit, aby zapobiec przyleganiu do niego serca.

Umieść przygotowaną szalkę Petriego pod mikroskopem preparacyjnym i wyreguluj ostrość. Teraz umieść kaniulę aorty przymocowaną do wysokociśnieniowej rurki przedłużającej pod mikroskopem preparacyjnym wraz z jedwabnym szwem 5-0 luźno zawiązanym wokół piasty. Po umieszczeniu wyciętych narządów klatki piersiowej na szalce Petriego, zidentyfikuj grasicę po jej białym połysku i dwóch płatach i ustaw próbkę tak, aby grasica była przednia i górna.

Następnie za pomocą kleszczy tępo oddzielaj płaty grasicy, odsłaniając wielkie naczynia. Następnie zidentyfikuj aortę, lokalizując charakterystyczne cechy rozgałęzienia łuku aorty i przeciąć ją tuż proksymalnie do startu tętnicy podobojczykowej za pomocą cienkich, ostrych nożyczek. Teraz delikatnie chwyć przeciętą aortę za pomocą cienkich zakrzywionych kleszczyków w stylu jubilera i ostrożnie kaniuluj aortę igłą o rozmiarze 26, uważając, aby nie uszkodzić zastawki aortalnej.

Za pomocą cienkich zakrzywionych kleszczyków chwyć aortę wokół kaniuli i zainicjuj perfuzję wsteczną, aby ograniczyć czas niedokrwienia. Poproś asystenta, aby chwycił końce luźno zawiązanego szwu i ostrożnie unieruchomił aortę wokół kaniuli. Zaciśnij szew powyżej lub poniżej cienkich zakrzywionych kleszczy, a następnie zaciśnij szew i potwierdź adekwatność przepływu wieńcowego.

Odłącz rurkę wysokociśnieniową od aparatu Langendorffa, chwyć piastę kaniuli i odłącz igłę od przedłużacza wysokociśnieniowego. Następnie szybko przymocuj piastę kaniuli do aparatu. Po zawieszeniu serca na aparacie Langendorffa w zwykłej pozycji potwierdza się odpowiednią perfuzję.

Ostrożnie odetnij płuca, grasicę i nadmiar tkanki. Następnie naciąć prawy przedsionek, aby umożliwić swobodny wyciek z zatok wieńcowych. Zrób mały węzeł na końcu jedwabnego szwu 5-0, a następnie przebij igłą mały kawałek folii parafinowej i wsuń parafinę do zawiązanego końca.

Ostrożnie przełóż igłę przez wierzchołek komory i przeciągnij szew przez serce, aż film parafinowy przylega do bocznej ściany komory. Przełóż igłę przez otwór wypełnionej wodą kurtki rozgrzewającej aparatu Langendorffa, aby można było zamknąć i ogrzać serce. Następnie przymocuj igłę do przetwornika siły, unikając kroplówki z zatoki wieńcowej.

Dostosuj szew, aby nałożyć od jednego do dwóch gramów napięcia podstawowego, zgodnie ze wskazaniami napięcia rozkurczowego lub śledzenia intencji nadiru. Następnie umieść elektrody powierzchniowe na górnym i dolnym biegunie serca, aby zarejestrować elektrokardiogram. Na koniec pobierz próbkę ścieków z zatok wieńcowych do analizy za pomocą cewnika dożylnego o rozmiarze 24.

Elektrody powierzchniowe wykorzystano do zapisu ciągłego elektrokardiogramu, który pozwolił na określenie wewnętrznej częstości i rytmu. Wszystkie odpowiednio ukrwione serca biją spontanicznie w rytmie zatokowym. Ta strategia perfuzji zaspokoiła potrzeby metaboliczne nowonarodzonego serca myszy, biorąc pod uwagę znikomą produkcję mleczanu oraz niski procent ekstrakcji tlenu i zużycia glukozy.

Zarejestrowano i obliczono również średnie zmienne fizjologiczne, takie jak średnia wewnętrzna częstość akcji serca odnerwionego i średnie obserwowane ciśnienie perfuzji w aortach. Niektóre kryteria wykluczające, takie jak czas potrzebny do rozpoczęcia reperfuzji, czas trwania arytmii i ciśnienie perfuzji w aorty, muszą być brane pod uwagę, aby zapewnić spójność preparatu dla noworodków. Po ustaleniu perfuzji może dojść do interwencji, takiej jak podanie leku, indukcja uszkodzenia niedokrwienno-reperfuzyjnego, zmiany metabolitów lub dostarczenie środków enzymatycznych do izolacji kardiomiocytów.