Dynamiczne monitorowanie serokonwersji za pomocą wieloanalitowego testu immunobeadowego w kierunku Covid-19

Metoda, którą zademonstrujemy dzisiaj, zapewnia wysokowydajne rozwiązanie do oceny serokonwersji przeciwciał związanych z infekcjami COVID-19 lub szczepieniem do rutynowych analiz. Co ciekawe, takie podejście pozwala nam ocenić wiele epitopów na tym samym analicie. Ma to liczne zastosowania w naukach biologicznych, w tym w badaniach sygnalizacji komórkowej i monitorowaniu odpowiedzi immunologicznej.

Dzisiaj tę technikę zademonstruje Ci dr Imad Tarhoni, adiunkt w moim laboratorium. Aby rozpocząć, wybierz trzy różne fiolki z mikrosferami magnetycznymi z unikalnymi obszarami kulek i zapisz identyfikator kulki oraz informacje o partii dla każdej użytej fiolki. Następnie wiruj wybrany materiał mikrosferyczny przez 60 sekund i sonikuj przez pięć minut.

Przenieś 1,0 razy 10 do sześciu kulek do 1,5-mililitrowej probówki wirówkowej o niskiej zawartości białka i włóż probówkę do separatora magnetycznego. aby umożliwić separację na 60 sekund. Trzymając rurkę nadal w separatorze magnetycznym, ostrożnie usuń supernatant, nie naruszając osadu kulkowego.

Wyjmij rurkę z separatora magnetycznego, a następnie ponownie zawieś kulki za pomocą 100 mikrolitrów wody klasy HPLC i wiruj przez 30 sekund. Ponownie umieścić probówkę z powrotem w separatorze magnetycznym na 60 sekund, a następnie usunąć supernatant. Powtórz protokół prania dwukrotnie.

Po ostatnim płukaniu wyjmij rurkę z separatora magnetycznego i ponownie zawieś umyte mikrosfery w 90 mikrolitrach buforu aktywacyjnego o pH 6,2 za pomocą wiru na 30 sekund. Następnie sekwencyjnie potraktuj mikrosfery 10 mikrolitrami po 50 miligramów na mililitr anhydroksysulfosuktaniznamidu i 10 mikrolitrami po 50 miligramów na mililitr roztworu EDC przez wir przez 10 sekund. Później inkubuj mikrosfery przez 20 minut w temperaturze pokojowej z delikatnym wirem co 10 minut.

Po inkubacji przemyj mikrosfery dwukrotnie 50-milimolowym MES lub buforem sprzęgającym o pH 5,0, jak opisano wcześniej. Powtórz pranie dwukrotnie. Po zakończeniu wyjmij rurkę z separatora magnetycznego i ponownie zawieś kulki ze 100 mikrolitrami buforu sprzęgającego za pomocą wiru na 30 sekund, a następnie natychmiast dodaj żądaną ilość białka do probówki.

Doprowadzić całkowitą objętość do 150 mikrolitrów za pomocą buforu sprzęgającego i mieszać reakcję wirowo przez 30 sekund. Następnie inkubuj probówkę przez dwie godziny przez obracanie w temperaturze pokojowej. Po inkubacji przemyć mikrosfery dwukrotnie buforem hartowniczym PBS i ponownie zawiesić umyte mikrosfery w 100 mikrolitrach buforu hartowniczego zawierającego 0,05% azydku sodu przez wir na 30 sekund.

Policz liczbę odzyskanych mikrosfer za pomocą automatycznego licznika komórek i zapisz zaobserwowane stężenie kulek. Aby uzyskać wydajność testu, ponownie zawiesić sprzężone mikrosfery za pomocą wiru na 30 sekund i poddać sonikacji przez 60 do 90 sekund. Następnie usuń wymaganą ilość każdego koloidu kulek z odpowiedniej probówki i połącz koloidy kulek w nowej 1,5-mililitrowej probówce do mikrowirówki.

Następnie włóż rurkę do separatora magnetycznego i pozostaw na 60 sekund. Trzymając rurkę nadal w separatorze magnetycznym, usuń supernatant bez naruszania granulki kulki. Po wyjęciu kulek z separatora ponownie zawiesić kulki w 100 mikrolitrach buforu testowego.

Wiruj przez 30 sekund przed umieszczeniem rurki w separatorze magnetycznym na 60 sekund, aby oddzielić kulki. Powtórz pranie dwukrotnie. Następnie dostosuj stężenie mieszaniny mikrosfery roboczej z trzema pleksami, dodając odpowiednią objętość buforu testowego, aby wygenerować końcowe stężenie 100 mikrosfer na jeden mikrolitr dla każdego celu.

Podaniec 25 mikrolitrów mieszaniny mikrosfer do każdego dołka 96-dołkowej płytki. Rozcieńczyć próbki osocza lub surowicy 500-krotnie w buforze do testów i przygotować próbki wzorcowe zgodnie z pożądanym miareczkowaniem. Dodać 25 mikrolitrów buforu do oznaczania jako próbkę ślepą i dodać każdą z rozcieńczonych próbek lub wzorca do każdego wyznaczonego dołka na 96-dołkowej płytce z próbką.

Po zakończeniu przykryj płytkę aluminiową uszczelką lub folią, aby inkubować przez godzinę w temperaturze pokojowej na wytrząsarce talerzowej ustawionej na 700 obrotów na minutę. Przygotować roztwór przeciwciał wykrywających przeciwciała anty-ludzkie lub roztwory przeciwciał drugorzędowych w stężeniu czterech mikrogramów na mikrolitr z buforem do oznaczania, jak opisano w manuskrypcie. Umieść płytkę na separatorze magnetycznym, aby szybko ją umyć, a następnie mocno odwróć płytkę nad pojemnikiem na zagrożenie biologiczne, aby usunąć płyn ze studzienek.

Trzymając talerz nadal odwrócony, mocno uderz nim o gruby zwitek papieru. Następnie umyj każdą studzienkę 100 mikrolitrami buforu do oznaczania i usuń płyn przez wymuszoną inwersję nad pojemnikiem stanowiącym zagrożenie biologiczne. Powtórz pranie dwa razy.

Po ostatnim praniu wyrzuć wszystkie zużyte zwitki papieru do pojemnika na zagrożenie biologiczne. Następnie dodaj 25 mikrolitrów wtórnego roztworu roboczego przeciwciała do każdego dołka 96-dołkowej płytki i przykryj płytkę folią aluminiową, aby inkubować na wytrząsarce płytkowej z prędkością 700 obrotów na minutę. Po 30 minutach inkubacji przemyć studzienki płytki dwukrotnie buforem do oznaczania, jak wykazano wcześniej.

Następnie dodaj 100 mikrolitrów buforu testowego do każdego dołka 96-dołkowej płytki. Przykryj płytkę folią aluminiową i inkubuj przez pięć minut na wytrząsarce do płytek w temperaturze pokojowej. Przeanalizuj próbkę o pojemności 60 mikrolitrów za pomocą analizatora przyrządu zgodnie z instrukcją systemu.

W celu optymalizacji czasu inkubacji wychwytywania próbki, należy inkubować płytki przez 30, 60 i 120 minut. Po inkubacji przeanalizować 60 mikrolitrów mieszaniny testowej na analizatorze. Siedmiopunktową krzywą wzorcową opartą na serii seryjnych rozcieńczeń 1:5 oceniono dla kolca S1, przeciwciał błonowych i nukleokapsydu.

Test precyzji wewnątrz testu przeprowadzono na płytce w celu oceny precyzji testu obliczonej jako procentowy współczynnik zmienności, odchylenie standardowe i średnia. Aby zapewnić precyzję między testami, dla każdego testu przygotowano trzy odrębne partie zestawów kulek. Obliczono zmienne precyzji testu z próbkami wzorca i osocza ludzkiego.

Średnie wartości mediany intensywności fluorescencji po 120 minutach inkubacji były optymalne dla miana IgG dla kolca S1, błony i przeciwciał nukleokapsydu, co wskazuje na szybką kinetykę wiązania przeciwciał pierwotnych. Wtórne optymalizacje stężenia przeciwciał w trybie dwukanałowym wykazały szeroki zakres sygnałów w pomiarze liniowym dla wszystkich stężeń. Poniżej przedstawiono obserwowane sygnały z różnych inkubacji przeciwciał drugorzędowych w różnych czasach oraz szczegóły dotyczące zmian sygnału dla wszystkich czasów inkubacji.

W ocenach swoistości dla testów dwukanałowych zaobserwowano znikome zanieczyszczenie sygnałem krzyżowym między ślepą próbą a pojedynczym kanałem reporterowym. Na ilustracji zdarzeń serokonwersji po szczepieniu COVID 19 zaobserwowane wartości skoku S1, IgA i IgM były około 40-krotnie niższe niż miano izotypu IgG. Metoda ta ma ważne implikacje dla monitorowania odpowiedzi na szczepionki u osób z obniżoną odpornością.

Pozwoli nam to określić, czy ci pacjenci są rzeczywiście chronieni przez te szczepienia.