Name: Dynamiczne monitorowanie serokonwersji za pomocą wieloanalitowego testu immunobeadowego w kierunku Covid-19 (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-02-16T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 48 s
Description: Poznaj metodę wieloanalitowego testu immunobeadowego do dynamicznego monitorowania serokonwersji przeciwciał IgA, IgM i IgG w odpowiedzi na zakażenie lub szczepienie SARS-CoV-2. Technika zapewnia wysoką przepustowość i precyzję w analizach serologicznych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy pragną podziękować Rush Biomarker Development Core za korzystanie z ich obiektów, Rush Biorepository do rejestracji podmiotów i przetwarzania próbek biologicznych, a także Fundacji Walder's Chicago Coronavirus Assessment Network (Chicago CAN) Initiative granty o numerach SCI16 (J.R.S. i J.A.B.) i 21-00147 (J.R.S. i J.A.B.) oraz nagrodzie od Fundacji Swim Across America (J.A.B.).

Wszyscy badani zostali zapisani za pisemną świadomą zgodą z pełną aprobatą Institutional Review Board (IRB) Rush University Medical Center zgodnie z protokołem ORA 20101207 przestrzegając wszystkich wytycznych instytucjonalnych dotyczących etycznego prowadzenia badań. Krew pobrano za pomocą konwencjonalnej flebotomii do lawendowych wakutainerów (K2EDTA) i przetworzono zgodnie z zalecanymi protokołami. Uzyskane osocze zostało zarchiwizowane w temperaturze -80 °C do czasu przeprowadzenia oceny.
1. Przygotowanie mikrosfer sprzężonych z antygenem
<ol>
	<li>Wybierz trzy różne fiolki z mikrosferami magnetycznymi z unikalnymi obszarami kulek, zapisując identyfikator kulki i informacje o partii dla każdej użytej fiolki. 
	UWAGA: Poniższe kroki zostaną wykonane dla każdego odrębnego regionu mikrosfery. Mikrosfery są wrażliwe na światło i należy je chronić przed długotrwałym działaniem światła. Podczas etapów prania należy uważać, aby nie naruszyć mikrosfer. W przypadku zakłóceń odczekaj drugie 60 sekund separacji.</li>
	<li>Wiruj mikrosferę przez 60 s i sonikuj przez 5 minut przed użyciem, aby zdysocjować zagregowane kulki.</li>
	<li>Przenieś 1,0 x 106 kulek do 1,5 ml niskobiałkowych probówek wirówkowych.</li>
	<li>Włóż rurkę do separatora magnetycznego i pozwól, aby separacja nastąpiła przez 60 sekund. Trzymając rurkę nadal w separatorze magnetycznym, ostrożnie usuń supernatant, nie naruszając osadu kulkowego.</li>
	<li>Wyjmij probówkę z separatora magnetycznego, ponownie zawieś kulki za pomocą 100 μl wody klasy HPLC i wiruj przez 30 sekund. Umieść probówkę z powrotem w separatorze magnetycznym na 60 s, a następnie usuń supernatant. Powtórz ten protokół prania dwukrotnie.</li>
	<li>Wyjąć probówkę z separatora magnetycznego i ponownie zawiesić umyte mikrosfery w 90 μl 100 mM jednozasadowego fosforanu sodu o pH 6,2 (bufor aktywacyjny) przez wirowanie przez 30 s.</li>
	<li>Dodać 10 μl 50 mg/ml Sulfo-NHS (rozcieńczonego buforem aktywacyjnym) do mikrosfer i delikatnie wirować przez 10 s. Dodać 10 μl 50 mg/ml roztworu EDC (rozcieńczonego buforem aktywacyjnym) i delikatnie wirować przez 10 s. Inkubować mikrosfery przez 20 minut w temperaturze pokojowej (RT) z delikatnym wirem co 10 minut.</li>
	<li>Powtórz kroki mycia 1,4-1,5 z 50 mM MES, pH 5,0 (bufor sprzęgający) zamiast wody klasy LC/MS, w sumie dwa mycia.</li>
	<li>Wyjąć probówkę z separatora magnetycznego i ponownie zawiesić kulki ze 100 μl buforu sprzęgającego za pomocą wiru przez 30 s, a następnie natychmiast dodać żądaną ilość białka.</li>
	<li>Doprowadzić całkowitą objętość do 150 μl za pomocą bufora sprzęgającego. Mieszać reakcję sprzęgania wirowego przez 30 s i inkubować przez 2 godziny przez obrót w temperaturze RT. 
	UWAGA: Dla testów zdefiniowanych w niniejszym dokumencie koniugacje przeprowadzono z następującymi stężeniami białka: Spike S1: 5 μg; Nukleokapsyd: 5 μg; Membrana: 12,5 μg.</li>
	<li>Powtórz etap płukania 1.4 z solą fizjologiczną buforowaną fosforanami (PBS) -1% albuminą surowicy koziej, 0,01% polisorbatem-20 (buforem hartującym) zamiast wody klasy LC/MS, w sumie dwa płukania. Ponownie zawiesić przemyte mikrosfery w 100 μl buforu hartowniczego zawierającego 0,05% azydku sodu wirowo przez 30 s. 
	UWAGA: Pozwól koralikom całkowicie ugasnąć przez co najmniej 6 godzin przed przystąpieniem do jakiejkolwiek innej procedury.</li>
	<li>Policz liczbę odzyskanych mikrosfer za pomocą automatycznego licznika komórek lub hemocytometru. Zapisz zaobserwowane stężenie kulek.</li>
	<li>Sprzężone mikrosfery przechowywać w lodówce w temperaturze 4 °C w ciemności.</li>
</ol>
2. Procedury
<ol>
	<li>Wydajność testu (protokół podstawowy)
	<ol>
		<li>Ponownie zawiesić sprzężone mikrosfery za pomocą wiru na 30 s i sonikować przez ~60-90 s.</li>
		<li>Usuń wymaganą ilość koloidu z każdego koloidu kulek z odpowiedniej probówki i połącz koloidy kulek w nowej probówce do mikrowirówek o pojemności 1,5 ml.</li>
		<li>Włóż rurkę do separatora magnetycznego i pozwól, aby separacja nastąpiła przez 60 sekund. Trzymając rurkę nadal w separatorze magnetycznym, ostrożnie usuń supernatant, nie naruszając osadu kulkowego.</li>
		<li>Wyjmij kulki z separatora, ponownie zawieś je ze 100 μl PBS-1% albuminy surowicy bydlęcej, 0,01% polisorbatu-20 (bufor testowy) i wiruj przez 30 s. Umieść probówkę w separatorze magnetycznym i pozwól na separację przez 60 s. Powtórz ten protokół prania (tj. kroki 2.1.3-2.1.4) dwukrotnie</li>
		<li>Dostosuj stężenie mieszaniny mikrosfer roboczych 3-plex, dodając odpowiednią objętość buforu testowego, aby uzyskać końcowe stężenie 100 mikrosfer na 1 μl dla każdego celu.</li>
		<li>Podwielokrotność 12,5 μl mieszaniny mikrosfer przygotowanej w kroku 2.1.5 do każdego dołka płytki 384-dołkowej lub 25 μl do każdej studzienki płytki 96-dołkowej.</li>
		<li>Rozcieńczyć próbki osocza/surowicy 500-krotnie w buforze testowym. Przygotować próbki wzorcowe zgodnie z pożądanym miareczkowaniem.</li>
		<li>Dodać 12,5 μl buforu do oznaczania jako próbkę ślepą i dodać każdą z rozcieńczonych próbek lub wzorców do każdego wyznaczonego dołka na 384-dołkowej płytce do pobierania próbek lub 25 μl ślepej, rozcieńczonej próbki lub wzorca do każdego dołka na 96-dołkowej płytce do pobierania próbek.</li>
		<li>Przykryj płytkę aluminiową uszczelką lub folią i inkubuj przez 1 godzinę w temperaturze suchej na wytrząsarce płytowej ustawionej na 700 obr./min. 
		UWAGA: Schemat krzywych rozcieńczania znajduje się w tabeli 1.</li>
		<li>Przygotować roztwór przeciwciał wykrywających przeciwciała anty-ludzkie (roztwory przeciwciał drugorzędowych) o stężeniu 4 μg/ml z buforem do oznaczania, jak określono w kroku 2.1.11.</li>
		<li>Przygotować przeciwciała przeciwko ludzkim IgM, sprzężone z Super Bright 436 (SB)/Kozioł-anty-ludzka IgA, skoniugowane przeciwciała wykrywające fikoerytrynę (PE) w stężeniu 4 μg/ml; lub przeciwciała przeciwko ludzkim IgM, SB Sprzężone/Koziołko-anty-ludzkiemu IgG, PE Sprzężone przeciwciała wykrywające w 4 μg/ml. 
		UWAGA: W przypadku płytki 384-dołkowej wymagane jest 12,5 μl/basenik przygotowanego roztworu przeciwciał drugorzędowych, a w przypadku formatu płytki 96-dołkowej wymagane jest 25 μL/basenik.</li>
		<li>Umieść płytkę na separatorze magnetycznym, szybko umyj i mocno odwróć nad pojemnikiem na zagrożenie biologiczne, aby usunąć płyn ze studni. Trzymając talerz nadal odwrócony, mocno uderz nim o gruby zwitek papieru.</li>
		<li>Przemyć każdą studzienkę 100 μl buforu do oznaczania i usunąć ciecz przez wymuszoną inwersję nad pojemnikiem stanowiącym zagrożenie biologiczne, jak opisano wcześniej. Powtórz te kroki (2.1.12-2.1.13), co daje w sumie dwa prania. Wyrzuć wszystkie zużyte zwitki papieru do pojemnika na zagrożenie biologiczne.</li>
		<li>Dodać 12,5 μl roztworu roboczego przeciwciała wtórnego do każdego dołka płytki 384-dołkowej lub 25 μl do każdego dołka płytki 96-dołkowej. Przykryj płytkę aluminiową uszczelką lub folią i inkubuj przez 30 minut w temperaturze pokojowej na wytrząsarce płytowej ustawionej na 700 obr./min.</li>
		<li>Powtórz kroki prania 2.1.12-2.1.13</li>
		<li>Dodać 75 μl buforu testowego do każdego dołka na płytce 384-dołkowej lub 100 μl do każdego dołka płytki 96-dołkowej. Przykryj płytkę aluminiową uszczelką lub folią i inkubuj przez 5 minut w temperaturze suchej na wytrząsarce płytowej ustawionej na 700 obr./min.</li>
		<li>Analizuj 60 μl za pomocą analizatora przyrządów zgodnie z instrukcją obsługi systemu.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Optymalizacja czasu inkubacji pobierania próbek
	<ol>
		<li>Wykonaj czynności opisane w sekcji 2.1, stosując czas inkubacji wynoszący 30 min, 60 min i 120 min w kroku 2.1.9. 
		UWAGA: Inkubacje mogą być przeprowadzane albo z oddzielnymi płytkami, albo przez pauzę na kroku 2.1.6 do czasu przejścia do kroku 2.1.9. aby osiągnąć pożądane czasy inkubacji.</li>
		<li>Kontynuuj odczyt płytki na analizatorze, używając 60 μl mieszaniny testowej zgodnie z zaleceniami producenta.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Optymalizacja stężenia przeciwciał drugorzędowych
	<ol>
		<li>Wykonać tę procedurę zgodnie z opisem w sekcji 2.1, z wyjątkiem końcowych stężeń odczynników w roztworze roboczym przeciwciał drugorzędowych (przygotowanym w kroku 2.1.10-2.1.11) zmodyfikowanym w następujący sposób: 
		Kozie przeciwciała anty-ludzkie (lub królicze) IgM, sprzężone SB wykrywające 8, 4, 2, 1 i 0,5 μg/ml. 
		Kozie przeciwciała anty-ludzkie (lub królicze) IgA, PE-sprzężone przeciwciała wykrywające 8, 4, 2, 1 i 0,5 μg/ml. 
		Kozio-anty-ludzkie (lub królicze) przeciwciała IgG, PE-sprzężone przeciwciała wykrywające przy 8, 4, 2, 1 i 0,5 μg/ml. 
		Kozie przeciwciała anty-ludzkie (lub królicze) IgG, koniugat PE/kozioł anty-ludzki (lub króliczy) IgM, SB-sprzężone przeciwciała wykrywające przy 8, 4, 2, 1 i 0,5 μg/ml. 
		Kozie przeciwciała anty-ludzkie (lub królicze) IgA, koniugat PE/kozioł anty-ludzki (lub króliczy) IgM, SB-koniugowane przeciwciała wykrywające przy 8, 4, 2, 1 i 0,5 μg / ml.</li>
		<li>Kontynuuj odczyt płytki na analizatorze, używając 60 μl mieszaniny testowej zgodnie z zaleceniami producenta.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Optymalizacja czasu inkubacji przeciwciał wtórnych
	<ol>
		<li>Wykonaj tę procedurę zgodnie z opisem w sekcji 2.1 z 15 minutami, 30 minutami, 60 minutami i 120 minutami czasu inkubacji określonymi w kroku 2.1.14.</li>
		<li>Kontynuuj odczyt płytki na analizatorze, używając 60 μl mieszaniny testowej zgodnie z zaleceniami producenta.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Ocena badanych próbek za pomocą zoptymalizowanych testów dwukanałowych
	<ol>
		<li>Pobrać próbki osocza pacjenta (n = 4) w dniach -21, -11, -1/0, +14, +28, +60, +90 i +120 w stosunku do zakończenia podawania szczepionki Covid-19 (tj. drugiej dawki). 
		UWAGA: Dzień 0 reprezentuje punkt czasowy, w którym szczepienie zostało zakończone.</li>
		<li>Wszystkie testy należy wykonać przy użyciu protokołu podstawowego (sekcja 2.1.) jako dwukanałowego testu IgG/IgM lub IgA/IgM.</li>
		<li>Znormalizuj wyniki do maksymalnej obserwowanej wartości mediany intensywności fluorescencji (MFI) dla każdej specyficznej immunoglobuliny i testu.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Tighe, P. J., Ryder, R. R., Todd, I., Fairclough, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ELISA+in+the+multiplex+era%3A+potentials+and+pitfalls%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics+-+Clinical+Applications%22%5BJournal%5D)">ELISA in the multiplex era: potentials and pitfalls.</a> Proteomics - Clinical Applications. 9, 406-422 (2015).</li>
<li>Baker, H. N., Murphy, R., Lopez, E., Garcia, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conversion+of+a+capture+ELISA+to+a+Luminex+xMAP+assay+using+a+multiplex+antibody+screening+method%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Conversion of a capture ELISA to a Luminex xMAP assay using a multiplex antibody screening method.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (65), e4084(2012).</li>
<li>Powell, R. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+multiplex+microsphere-based+immunoassay+increases+the+sensitivity+of+siv-specific+antibody+detection+in+serum+samples+and+mucosal+specimens+collected+from+rhesus+macaques+infected+with+SIVmac239%5BTitle%5D)+AND+%22BioResearch+Open+Access%22%5BJournal%5D)">A multiplex microsphere-based immunoassay increases the sensitivity of siv-specific antibody detection in serum samples and mucosal specimens collected from rhesus macaques infected with SIVmac239.</a> BioResearch Open Access. 2 (3), 171-178 (2013).</li>
<li>Volpetti, F., Garcia-Cordero, J., Maerkl, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+microfluidic+platform+for+high-throughput+multiplexed+protein+quantitation%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">A microfluidic platform for high-throughput multiplexed protein quantitation.</a> PLoS One. 10 (2), 0117744(2015).</li>
<li>Rabi, F. A., Al Zoubi, M. S., Kasasbeh, G. A., Salameh, D. M., Al-Nasser, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SARS-CoV-2+and+coronavirus+disease+2019%3A+What+we+know+so+far%5BTitle%5D)+AND+%22Pathogens%22%5BJournal%5D)">SARS-CoV-2 and coronavirus disease 2019: What we know so far.</a> Pathogens. 9 (3), 231(2020).</li>
<li>Asif, M., Xu, Y., Xiao, F., Sun, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diagnosis+of+COVID-19%2C+vitality+of+emerging+technologies+and+preventive+measures%5BTitle%5D)+AND+%22Chemical+Engineering+Journal%22%5BJournal%5D)">Diagnosis of COVID-19, vitality of emerging technologies and preventive measures.</a> Chemical Engineering Journal. 423, Lausanne, Switzerland. 130189(2021).</li>
<li>La Marca, A., Capuzzo, M., Paglia, T., Roli, L., Trenti, T., Nelson, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Testing+for+SARS-CoV-2+%28COVID-19%29%3A+a+systematic+review+and+clinical+guide+to+molecular+and+serological+in-vitro+diagnostic+assays%5BTitle%5D)+AND+%22Reproductive+Biomedicine+Online%22%5BJournal%5D)">Testing for SARS-CoV-2 (COVID-19): a systematic review and clinical guide to molecular and serological in-vitro diagnostic assays.</a> Reproductive Biomedicine Online. 41 (3), 483-499 (2020).</li>
<li>Armbruster, D. A., Pry, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Limit+of+blank%2C+limit+of+detection+and+limit+of+quantitation%5BTitle%5D)+AND+%22The+Clinical+Biochemist.+Reviews%22%5BJournal%5D)">Limit of blank, limit of detection and limit of quantitation.</a> The Clinical Biochemist. Reviews. 29, Suppl 1 49-52 (2008).</li>
<li>Tarhoni, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Relationship+between+circulating+tumor-associated+autoantibodies+and+clinical+outcomes+in+advanced-stage+NSCLC+patients+receiving+PD-1%2F-L1+directed+immune+checkpoint+inhibition%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunological+Methods%22%5BJournal%5D)">Relationship between circulating tumor-associated autoantibodies and clinical outcomes in advanced-stage NSCLC patients receiving PD-1/-L1 directed immune checkpoint inhibition.</a> Journal of Immunological Methods. 490, 112956(2021).</li>
<li>Deeks, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antibody+tests+for+identification+of+current+and+past+infection+with+SARS-CoV-2%5BTitle%5D)+AND+%22The+Cochrane+Database+of+Systematic+Reviews%22%5BJournal%5D)">Antibody tests for identification of current and past infection with SARS-CoV-2.</a> The Cochrane Database of Systematic Reviews. 6, 013652(2020).</li>
<li>Mahalingam, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Landscape+of+humoral+immune+responses+against+SARS-CoV-2+in+patients+with+COVID-19+disease+and+the+value+of+antibody+testing%5BTitle%5D)+AND+%22Heliyon%22%5BJournal%5D)">Landscape of humoral immune responses against SARS-CoV-2 in patients with COVID-19 disease and the value of antibody testing.</a> Heliyon. 7 (4), 06836(2021).</li>
<li>Ruano-Gallego, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+multiplex+antigen+microarray+for+simultaneous+IgG+and+IgM+detection+against+SARS-CoV-2+reveals+higher+seroprevalence+than+reported%5BTitle%5D)+AND+%22Microbial+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">A multiplex antigen microarray for simultaneous IgG and IgM detection against SARS-CoV-2 reveals higher seroprevalence than reported.</a> Microbial Biotechnology. 14 (3), 1228-1236 (2021).</li>
<li>Shah, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IgG+and+IgM+antibody+formation+to+spike+and+nucleocapsid+proteins+in+COVID-19+characterized+by+multiplex+immunoblot+assays%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Infectious+Diseases%22%5BJournal%5D)">IgG and IgM antibody formation to spike and nucleocapsid proteins in COVID-19 characterized by multiplex immunoblot assays.</a> BMC Infectious Diseases. 21 (1), 325(2021).</li>
<li>Gambino, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+a+rapid+immunochromatographic+test+with+a+chemiluminescence+immunoassay+for+detection+of+anti-SARS-CoV-2+IgM+and+IgG%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemia+Medica+%28Zagreb%29%22%5BJournal%5D)">Comparison of a rapid immunochromatographic test with a chemiluminescence immunoassay for detection of anti-SARS-CoV-2 IgM and IgG.</a> Biochemia Medica (Zagreb). 30 (3), 030901(2020).</li>
<li>Algaissi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SARS-CoV-2+S1+and+N-based+serological+assays+reveal+rapid+seroconversion+and+induction+of+specific+antibody+response+in+COVID-19+patients%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">SARS-CoV-2 S1 and N-based serological assays reveal rapid seroconversion and induction of specific antibody response in COVID-19 patients.</a> Scientific Reports. 10, 16561(2020).</li>
<li>Chiereghin, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+advances+in+the+evaluation+of+serological+assays+for+the+diagnosis+of+SARS-CoV-2+infection+and+COVID-19%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Public+Health%22%5BJournal%5D)">Recent advances in the evaluation of serological assays for the diagnosis of SARS-CoV-2 infection and COVID-19.</a> Frontiers in Public Health. 8, 620222(2020).</li>
<li>Nicol, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessment+of+SARS-CoV-2+serological+tests+for+the+diagnosis+of+COVID-19+through+the+evaluation+of+three+immunoassays%3A+Two+automated+immunoassays+%28Euroimmun+and+Abbott%29+and+one+rapid+lateral+flow+immunoassay+%28NG+Biotech%29%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Virology%3A+The+Official+Publication+of+the+Pan+American+Society+for+Clinical+Virology%22%5BJournal%5D)">Assessment of SARS-CoV-2 serological tests for the diagnosis of COVID-19 through the evaluation of three immunoassays: Two automated immunoassays (Euroimmun and Abbott) and one rapid lateral flow immunoassay (NG Biotech).</a> Journal of Clinical Virology: The Official Publication of the Pan American Society for Clinical Virology. 129, 104511(2020).</li>
<li>Butt, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((From+multiplex+serology+to+serolomics-A+novel+approach+to+the+antibody+response+against+the+SARS-CoV-2+proteome%5BTitle%5D)+AND+%22Viruses%22%5BJournal%5D)">From multiplex serology to serolomics-A novel approach to the antibody response against the SARS-CoV-2 proteome.</a> Viruses. 13 (5), 749(2021).</li>
<li>Byrum, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((multiSero%3A+open+multiplex-ELISA+platform+for+analyzing+antibody+responses+to+SARS-CoV-2+infection%5BTitle%5D)+AND+%22medRxiv%22%5BJournal%5D)">multiSero: open multiplex-ELISA platform for analyzing antibody responses to SARS-CoV-2 infection.</a> medRxiv. , (2021).</li>
<li>Dobano, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+sensitive+and+specific+multiplex+antibody+assays+to+quantify+immunoglobulins+m%2C+a%2C+and+g+against+SARS-CoV-2+antigens%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Highly sensitive and specific multiplex antibody assays to quantify immunoglobulins m, a, and g against SARS-CoV-2 antigens.</a> Journal of Clinical Microbiology. 59 (2), 01731(2021).</li>
<li>Schultz, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+and+validation+of+a+multiplex+microsphere+immunoassay+using+dried+blood+spots+for+SARS-CoV-2+seroprevalence%3A+Application+in+first+responders+in+first+responders+in+Colorado%2C+USA%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Development and validation of a multiplex microsphere immunoassay using dried blood spots for SARS-CoV-2 seroprevalence: Application in first responders in first responders in Colorado, USA.</a> Journal of Clinical Microbiology. 59 (6), 00290(2021).</li>
<li>Beavis, K. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+the+EUROIMMUN+anti-SARS-CoV-2+ELISA+assay+for+detection+of+IgA+and+IgG+antibodies%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Virology%3A+The+Official+Publication+of+the+Pan+Americal+Society+for+Clinical+Virology%22%5BJournal%5D)">Evaluation of the EUROIMMUN anti-SARS-CoV-2 ELISA assay for detection of IgA and IgG antibodies.</a> Journal of Clinical Virology: The Official Publication of the Pan Americal Society for Clinical Virology. 129, 104468(2020).</li>
<li>Jung, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clinical+performance+of+a+semi-quantitative+assay+for+SARS-CoV2+IgG+and+SARS-CoV2+IgM+antibodies%5BTitle%5D)+AND+%22Clinica+Chimica+Acta%3A+International+Journal+of+Clinical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Clinical performance of a semi-quantitative assay for SARS-CoV2 IgG and SARS-CoV2 IgM antibodies.</a> Clinica Chimica Acta: International Journal of Clinical Chemistry. 510, 790-795 (2020).</li>
</ol>

Dr Borgia jest wynalazcą testu serologicznego użytego w tym manuskrypcie, który oczekuje na opatentowanie. Artykuł jest przedstawiony w sposób opisowy, bez przedstawionych analiz statystycznych, aby uniknąć potencjalnej stronniczości wynikającej z konfliktu autorów.

Ocena odpowiedzi immunologicznej na ekspozycję na SARS-CoV-2, w połączeniu z nadzorem stanu zakażenia opartym na RT-PCR, została dobrze opisana jako recepta na wyjaśnienie przebiegu powrotu do zdrowia po Covid-19, służąca jako środek do identyfikacji osocza ozdrowieńców o potencjalnej wartości terapeutycznej oraz do badania wskaźników infekcji w skali populacji10,11. Różne przykłady zrozumienia serokonwersji u ludzi obejmują macierze białek (antygenów)12, immunobloty13, szybkie konstrukty immunochromatograficzne14 i testy immunoenzymatyczne (ELISA)15,16,17. Każda z wyżej wymienionych technik może oceniać wiele izotypów immunoglobulin indywidualnie z niewielkimi modyfikacjami. Procedury te nie mogą być jednak praktycznie ponownie wykorzystane, aby umożliwić równoległą analizę wielu izotypów, jak przedstawiono w tym manuspekcie, co sprawia, że czynniki związane z kosztem i przepustowością stanowią ograniczenia w ich podawaniu w strategii testowania w skali populacyjnej. Niektóre z tych aplikacji dają również możliwość łączenia poziomów wielu antygenów równolegle, tak jak są prezentowane, lub w zmienionych formatach, takich jak multipleksowy ELISA18,19. Wreszcie, platforma immunobead zapewnia możliwość oceny poziomów wielu antygenów równolegle20,21, ale została ograniczona do jednego epitopu (tj. izotypu immunoglobuliny) na test, chyba że jednak zastosowano najnowszy instrument z możliwościami testowania "dwukanałowego".
W niniejszym raporcie wymieniono protokoły, które zapewniają wiarygodny pomiar wielu epitopów w teście immunokulkowym przy użyciu instrumentu w trybie "dwukanałowym" w studium przypadku serokonwersji osób zaszczepionych Covid-19. Metoda wykazała się doskonałą precyzją (wartości %CV zwykle <20%) przy użyciu ręcznych projektów testów, które można ulepszyć dzięki integracji zautomatyzowanych systemów laboratoryjnych. Czułość testu i zakres dynamiki dla wszystkich wybranych analitów i epitopów były odpowiednie do rutynowych ocen. Chociaż brak dostępnych na rynku immunoodczynników antyantygenowych IgA i IgM ograniczał ilościowe oznaczanie do izotypu IgG, takie ograniczenie nie wyklucza możliwości oferowania ocen półilościowych lub ocen w odniesieniu do określonej próbki w kalibrze22,23.
Zwalidowany test immunobeadowy został przydzielony do zbadania serokonwersji w kohorcie osób zaszczepionych szczepionką Covid-19. W przeciwieństwie do innych podobnych platform, rodzina oprzyrządowania umożliwia poszukiwanie serokonwersji u setek osób dziennie w ręcznym przepływie pracy i tysięcy dziennie w schemacie automatycznym. Ogólnie rzecz biorąc, wyniki te potwierdzają, że podejście "dwukanałowe" ma odpowiednią czułość do opisu wielu epitopów równolegle dla identycznego testu i jest wykonalne w kontekście wieloanalitowym. Różnica w czułości na kanał 1 i kanał 2, jak przeprowadzono odpowiednio w przypadku fikoerytryny i fluoroforów Super Bright 436, może uzasadniać zaprojektowanie konkretnego eksperymentu w celu zapewnienia uzyskania realnych wyników analitycznych dla danego eksperymentu. Oznacza to, że rezerwacja kanału 1 dla epitopów lub analitów o mniejszej częstości występowania może być konieczna do utrzymania zakresu dynamicznego testu, który obejmuje obserwowane wartości niewiadomych. Poza tym projekt testu był oczywisty i powinien być łatwo dostępny dla laboratoriów o ograniczonych możliwościach analitycznych. Z pewnością należy wziąć pod uwagę tę kwestię przy rozważaniu zakłóceń między kanałem 1 a kanałem 2, jak zauważyliśmy na rysunku 5, przy czym zakłócenia z izotypów o wyższej liczebności mogą powodować mylące błędy analityczne dla izotypów o znacznie niższej liczebności, gdy są mierzone w formacie dwukanałowym. Ta potencjalna ingerencja w sytuacje o bardzo różnych stężeniach analitu może stanowić istotne ograniczenie podejścia, jeśli nie zostanie odpowiednio wykorzystana w fazie projektowania testu.
Podsumowując, przedstawiono metodę szybkiego pomiaru miana przeciwciał z głównych izotypów immunoglobulin związanych z odpowiedzią immunologiczną na zakażenie Covid-19 lub szczepienie. Zastosowanie tego podejścia w sposób długofalowy do oceny serokonwersji może dostarczyć informacji, które można lepiej wykorzystać do zarządzania i/lub monitorowania przebiegu choroby lub, alternatywnie, kierowania potencjalnymi programami szczepień przypominających przeciwko Covid-19.

Jednoczesny pomiar wielu biomarkerów związanych z chorobą w próbkach biologicznych pozwala na opisowy i predykcyjny wgląd w procesy patologiczne. Podczas gdy konwencjonalne procedury immunologiczne z pojedynczym analitem, takie jak testy immunoenzymatyczne (ELISA), są podstawą analiz ilościowych zarówno w warunkach klinicznych, jak i badawczych, techniki te mogą mieć znaczne ograniczenia dotyczące przepustowości, ilości próbki wymaganej do każdego pomiaru i opłacalności, które znacznie ograniczają badanie wielu elementów biologicznych, które często przeplatają się w przebiegu choroby1. Technologia multipleksowania oparta na mikrosferze stała się niezastąpioną platformą zarówno dla ośrodków diagnostycznych, jak i badawczych ze względu na jej zdolność do łączenia testów w celu zwiększenia przepustowości laboratorium, złagodzenia niedoboru próbek i zmniejszenia liczby powtarzających się testów w celu maksymalizacji oszczędności kosztów1,2,3,4. Ostatnio wprowadzono dalsze rozszerzenie tej mocy multipleksowania za pomocą instrumentów posiadających możliwości podwójnego reportera. Funkcja podwójnego reportera implementuje dwa kanały fluorescencyjne do detekcji, zapewniając kolejny wymiar multipleksowania, umożliwiając wykrywanie wielu epitopów na tym samym analicie.
Koronawirus zespołu ciężkiej ostrej niewydolności oddechowej 2 (SARS-CoV-2) jest patogenem odpowiedzialnym za obecną pandemię choroby koronawirusowej 2019 (COVID-19)5. Podczas gdy testy RT-PCR mają kluczowe znaczenie dla potwierdzenia zakażenia na początku przebiegu choroby, badania serologiczne mian przeciwciał okazały się niezbędne do dokładnej i pełnej krytyki osób pod kątem wcześniejszej ekspozycji lub powrotu do zdrowia; odpowiedź na szczepienia; i/lub ocena skuteczności szczepionki Covid-19 6,7.
Ten raport przedstawia metody pomiaru serokonwersji dla wielu antygenów wirusa SARS-CoV-2, które wykorzystują oparty na przepływie, podwójny system raportowania czytnika multipleksowego. W szczególności opisano jednoczesne wykrywanie dwóch podtypów przeciwciał (skonfigurowanych jako IgG/IgM lub IgA/IgM) dla panelu antygenów SARS-CoV-2 3-plex, który obejmuje testy na glikoproteiny Spike S1, nukleokapsyd i błonę (inaczej Matrix). Podejście to stanowi idealne przedsięwzięcie do uchwycenia podłużnej serokonwersji i stanowi cenne narzędzie w arsenale przeciwko pandemii Covid-19.

<table><tbody><tr><td>384-dołkowe czarne płytki do mikromiareczkowania polistyrenu</td><td>Thermo Fisher</td><td>12-565-346</td><td></td></tr><tr><td>Bufor aktywacyjny (0,1 M NaH2PO4, pH 6,2)</td><td>Przygotowany w domowym</td><td></td><td></td></tr><tr><td>buforze testowym (PBS, 1% albumina surowicy bydlęcej, 0,01% polisorbat-20)</td><td>Przygotowany w domu</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Albumina surowicy bydlęcej, frakcja szoku cieplnego</td><td>MilliporeSigma</td><td>A-7888-50G</td><td></td></tr><tr><td>Bufor sprzęgający (50 mM MES, pH 5,0)</td><td>Przygotowany we własnym zakresie</td><td></td><td></td></tr><tr><td>COVID 19 M Coronavirus Rekombinowane białko matrycowe (6xJego tag)</td><td>MyBioSource</td><td>MBS8574735</td><td></td></tr><tr><td>Jednorazowe końcówki</td><td></td><td></td><td></td>do pipet</tr><tr><td>EDC (chlorowodorek 1-etylo-3-[3-dimetyloaminopropylo]karbodimidu)</td><td>Thermo Fisher</td><td>PIA35391</td><td></td></tr><tr><td>Albumina kozia, frakcja V w proszku</td><td>miliporeSigma</td><td>A2514-1G</td><td></td></tr><tr><td>IgA Koza anty-ludzka, R-PE, poliklonalna</td><td>Thermo Fisher</td><td>OB205009</td><td></td></tr><tr><td>IgG Koza anty-ludzka, R-PE, Poliklonalna</td><td>Thermo Fisher</td><td>OB204009</td><td></td></tr><tr><td>IgG Koza anty-Królik, R-PE, Poliklonalna</td><td>Thermo Fisher</td><td>OB403009</td><td></td></tr><tr><td>IgM Koza anty-ludzka, R-PE, Poliklonalny</td><td>Thermo Fisher</td><td></td><td></td>OB202009</tr><tr><td>Mysz IgM anty-ludzka, SB 436, klon SA-DA4</td><td>Thermo Fisher</td><td>62999842</td><td></td></tr><tr><td>Analizator przyrządów</td><td>Luminex Corp.</td><td>INTELLIFLEX-RUO</td><td></td></tr><tr><td>Probówki do mikrowirówek o niskim poziomie wiązania (1,5 ml)</td><td>Thermo Fisher</td><td>13-698-794</td><td></td></tr><tr><td>MagPlex-C Microspheres, Region XXX</td><td>Luminex Corp.</td><td>MC10XXX-01</td><td></td></tr><tr><td>Hydrat MES (hydrat kwasu 2-(N-Morfolino)etanosulfonowego)</td><td>MilliporeSigma</td><td>M2933</td><td></td></tr><tr><td>Aluminiowa taśma uszczelniająca Microplate</td><td>Thermo Fisher</td><td>07-200-683</td><td></td></tr><tr><td>Polysorbate-20</td><td>Thermo Fisher</td><td>BP337-500</td><td></td></tr><tr><td>Quality Biological Inc. PBS, pH 7,2</td><td>Thermo Fisher</td><td>50-751-7328</td><td></td></tr><tr><td>Bufor hartujący (PBS, 1% albumina surowicy koziej, 0,01% polisorbat-20)</td><td>Przygotowany w domu</td><td></td><td></td></tr><tr><td>SARS-CoV-2 (2019-nCoV) Białko nukleokapsydu (jego tag)</td><td>Sino Biologicals</td><td>40588-V08B</td><td></td></tr><tr><td>SARS-CoV-2 (2019-nCoV) Białko kolca (podjednostka S1, jego tag)</td><td>Sino Biologicals</td><td>40591-V08H</td><td></td></tr><tr><td>SARS-CoV-2 (2019-nCoV) Przeciwciało RBD Pike, pAb królika</td><td>Sino Biologicals</td><td>40592-T62</td><td></td></tr><tr><td>SARS-CoV-2 (2019-nCoV) Przeciwciało nukleokapsydowe, mAb królika</td><td>Sino Biologicals</td><td>40588-R0004</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało błonowe (IN) SARS-CoV-2 (COVID-19), pAb królika</td><td>ProSci</td><td>10-516</td><td></td></tr><tr><td>Sulfo-NHS (N-hydroksysulfobursztynimid)</td><td></td><td>Bufor</td> do płukania Thermo Fisher PIA39269 <td></td></tr><tr><td>(PBS, 0,01% polisorbatu-20)</td><td>Przygotowane we własnym zakresie</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Woda klasy LC/MS</td><td>Thermo Fisher</td><td>W-64</td><td></td></tr></tbody></table>

dynamiczne monitorowanie serokonwersji za pomocą wieloanalitowego testu immunobeadowego w kierunku covid-19

Dynamic Monitoring of Seroconversion using a Multianalyte Immunobead Assay for Covid-19

Technologie multipleksowe do wspólnego badania wielu biomarkerów istnieją od kilkudziesięciu lat; jednak metody oceny wielu epitopów na tym samym analicie pozostają ograniczone. W niniejszym raporcie opisano rozwój i optymalizację multipleksowanego testu immunokulkowego do testów serologicznych powszechnych izotypów immunoglobulin (np. IgA, IgM i IgG) związanych z odpowiedzią immunologiczną na zakażenie SARS-CoV-2 lub szczepienie. Testy przeprowadzono przy użyciu przepływowego, multipleksowego czytnika fluorescencyjnego z możliwością pracy dwukanałowej. Optymalizacje koncentrowały się na czasie wychwytywania analitu, stężeniu przeciwciał wykrywania i czasie inkubacji przeciwciał detekcji. Charakterystykę skuteczności testu analitycznego (np. zakres testu (w tym dolną i górną granicę oznaczalności) oraz precyzję wewnątrz i między testami) ustalono dla kombinacji serotypów IgG/IgM lub IgA/IgM w tandemie przy użyciu trybu "dwukanałowego". Czas wychwytywania analitu wynoszący 30 minut dla IgG, 60 minut dla IgM i 120 minut dla IgA był odpowiedni dla większości zastosowań, zapewniając równowagę między wydajnością testu a przepustowością. Zaobserwowano optymalną inkubację przeciwciał detekcyjnych w stężeniu 4 μg/ml przez 30 minut, które są zalecane do zastosowań ogólnych, biorąc pod uwagę ogólną doskonałą precyzję (procentowy współczynnik wariancji (%CV) ≤ 20%) i obserwowane wartości czułości. Zakres dynamiki izotypu IgG obejmował kilka rzędów wielkości dla każdego testu (Spike S1, nukleokapsyd i glikoproteiny błonowe), co wspiera solidne oceny miana przy współczynniku rozcieńczenia 1:500 do zastosowań klinicznych. Na koniec zoptymalizowany protokół zastosowano do monitorowania serokonwersji Spike S1 u osób (n = 4), które ukończyły schemat szczepienia przeciwko SARS-CoV-2. W tej kohorcie zaobserwowano, że poziomy IgG Spike S1 osiągają maksymalne miana po 14 dniach od podania drugiej dawki, przy znacznie wyższej (~40-krotnej) intensywności sygnału niż izotypy IgM lub IgA. Co ciekawe, zaobserwowaliśmy bardzo zmienne tempo zaniku miana Spike S1 IgG, które było w dużej mierze zależne od pacjenta, co będzie tematem przyszłych badań.

Ten artykuł opisuje wygodną metodę monitorowania dynamicznych zmian w mianach przeciwciał dla dwóch izotypów immunoglobulin jednocześnie (IgA, IgM lub IgG) wynikających z odpowiedzi immunologicznej na zakażenie SARS-CoV-2 lub szczepienie. Ten "Multianalitowy panel odpowiedzi immunologicznej Covid-19" wykorzystuje trzy pośrednie testy immunologiczne zbudowane na kodowanych mikrosferach, które są odczytywane za pomocą przepływowego czytnika multipleksowego z funkcją "dwukanałową".

Dynamiczne monitorowanie serokonwersji za pomocą wieloanalitowego testu immunobeadowego w kierunku Covid-19

Multiplex technologies for interrogating multiple biomarkers in concert have existed for several decades; however, methods to evaluate multiple epitopes ...

Metoda, którą zademonstrujemy dzisiaj, zapewnia wysokowydajne rozwiązanie do oceny serokonwersji przeciwciał związanych z infekcjami COVID-19 lub szczepieniem do rutynowych analiz. Co ciekawe, takie podejście pozwala nam ocenić wiele epitopów na tym samym analicie. Ma to liczne zastosowania w naukach biologicznych, w tym w badaniach sygnalizacji komórkowej i monitorowaniu odpowiedzi immunologicznej.Dzisiaj tę technikę zademonstruje Ci dr Imad Tarhoni, adiunkt w moim laboratorium. Aby rozpocząć, wybierz trzy różne fiolki z mikrosferami magnetycznymi z unikalnymi obszarami kulek i zapisz identyfikator kulki oraz informacje o partii dla każdej użytej fiolki. Następnie wiruj wybrany materiał mikrosferyczny przez 60 sekund i sonikuj przez pięć minut.Przenieś 1,0 razy 10 do sześciu kulek do 1,5-mililitrowej probówki wirówkowej o niskiej zawartości białka i włóż probówkę do separatora magnetycznego. aby umożliwić separację na 60 sekund. Trzymając rurkę nadal w separatorze magnetycznym, ostrożnie usuń supernatant, nie naruszając osadu kulkowego.Wyjmij rurkę z separatora magnetycznego, a następnie ponownie zawieś kulki za pomocą 100 mikrolitrów wody klasy HPLC i wiruj przez 30 sekund. Ponownie umieścić probówkę z powrotem w separatorze magnetycznym na 60 sekund, a następnie usunąć supernatant. Powtórz protokół prania dwukrotnie.Po ostatnim płukaniu wyjmij rurkę z separatora magnetycznego i ponownie zawieś umyte mikrosfery w 90 mikrolitrach buforu aktywacyjnego o pH 6,2 za pomocą wiru na 30 sekund. Następnie sekwencyjnie potraktuj mikrosfery 10 mikrolitrami po 50 miligramów na mililitr anhydroksysulfosuktaniznamidu i 10 mikrolitrami po 50 miligramów na mililitr roztworu EDC przez wir przez 10 sekund. Później inkubuj mikrosfery przez 20 minut w temperaturze pokojowej z delikatnym wirem co 10 minut.Po inkubacji przemyj mikrosfery dwukrotnie 50-milimolowym MES lub buforem sprzęgającym o pH 5,0, jak opisano wcześniej. Powtórz pranie dwukrotnie. Po zakończeniu wyjmij rurkę z separatora magnetycznego i ponownie zawieś kulki ze 100 mikrolitrami buforu sprzęgającego za pomocą wiru na 30 sekund, a następnie natychmiast dodaj żądaną ilość białka do probówki.Doprowadzić całkowitą objętość do 150 mikrolitrów za pomocą buforu sprzęgającego i mieszać reakcję wirowo przez 30 sekund. Następnie inkubuj probówkę przez dwie godziny przez obracanie w temperaturze pokojowej. Po inkubacji przemyć mikrosfery dwukrotnie buforem hartowniczym PBS i ponownie zawiesić umyte mikrosfery w 100 mikrolitrach buforu hartowniczego zawierającego 0,05% azydku sodu przez wir na 30 sekund.Policz liczbę odzyskanych mikrosfer za pomocą automatycznego licznika komórek i zapisz zaobserwowane stężenie kulek. Aby uzyskać wydajność testu, ponownie zawiesić sprzężone mikrosfery za pomocą wiru na 30 sekund i poddać sonikacji przez 60 do 90 sekund. Następnie usuń wymaganą ilość każdego koloidu kulek z odpowiedniej probówki i połącz koloidy kulek w nowej 1,5-mililitrowej probówce do mikrowirówki.Następnie włóż rurkę do separatora magnetycznego i pozostaw na 60 sekund. Trzymając rurkę nadal w separatorze magnetycznym, usuń supernatant bez naruszania granulki kulki. Po wyjęciu kulek z separatora ponownie zawiesić kulki w 100 mikrolitrach buforu testowego.Wiruj przez 30 sekund przed umieszczeniem rurki w separatorze magnetycznym na 60 sekund, aby oddzielić kulki. Powtórz pranie dwukrotnie. Następnie dostosuj stężenie mieszaniny mikrosfery roboczej z trzema pleksami, dodając odpowiednią objętość buforu testowego, aby wygenerować końcowe stężenie 100 mikrosfer na jeden mikrolitr dla każdego celu.Podaniec 25 mikrolitrów mieszaniny mikrosfer do każdego dołka 96-dołkowej płytki. Rozcieńczyć próbki osocza lub surowicy 500-krotnie w buforze do testów i przygotować próbki wzorcowe zgodnie z pożądanym miareczkowaniem. Dodać 25 mikrolitrów buforu do oznaczania jako próbkę ślepą i dodać każdą z rozcieńczonych próbek lub wzorca do każdego wyznaczonego dołka na 96-dołkowej płytce z próbką.Po zakończeniu przykryj płytkę aluminiową uszczelką lub folią, aby inkubować przez godzinę w temperaturze pokojowej na wytrząsarce talerzowej ustawionej na 700 obrotów na minutę. Przygotować roztwór przeciwciał wykrywających przeciwciała anty-ludzkie lub roztwory przeciwciał drugorzędowych w stężeniu czterech mikrogramów na mikrolitr z buforem do oznaczania, jak opisano w manuskrypcie. Umieść płytkę na separatorze magnetycznym, aby szybko ją umyć, a następnie mocno odwróć płytkę nad pojemnikiem na zagrożenie biologiczne, aby usunąć płyn ze studzienek.Trzymając talerz nadal odwrócony, mocno uderz nim o gruby zwitek papieru. Następnie umyj każdą studzienkę 100 mikrolitrami buforu do oznaczania i usuń płyn przez wymuszoną inwersję nad pojemnikiem stanowiącym zagrożenie biologiczne. Powtórz pranie dwa razy.Po ostatnim praniu wyrzuć wszystkie zużyte zwitki papieru do pojemnika na zagrożenie biologiczne. Następnie dodaj 25 mikrolitrów wtórnego roztworu roboczego przeciwciała do każdego dołka 96-dołkowej płytki i przykryj płytkę folią aluminiową, aby inkubować na wytrząsarce płytkowej z prędkością 700 obrotów na minutę. Po 30 minutach inkubacji przemyć studzienki płytki dwukrotnie buforem do oznaczania, jak wykazano wcześniej.Następnie dodaj 100 mikrolitrów buforu testowego do każdego dołka 96-dołkowej płytki. Przykryj płytkę folią aluminiową i inkubuj przez pięć minut na wytrząsarce do płytek w temperaturze pokojowej. Przeanalizuj próbkę o pojemności 60 mikrolitrów za pomocą analizatora przyrządu zgodnie z instrukcją systemu.W celu optymalizacji czasu inkubacji wychwytywania próbki, należy inkubować płytki przez 30, 60 i 120 minut. Po inkubacji przeanalizować 60 mikrolitrów mieszaniny testowej na analizatorze. Siedmiopunktową krzywą wzorcową opartą na serii seryjnych rozcieńczeń 1:5 oceniono dla kolca S1, przeciwciał błonowych i nukleokapsydu.Test precyzji wewnątrz testu przeprowadzono na płytce w celu oceny precyzji testu obliczonej jako procentowy współczynnik zmienności, odchylenie standardowe i średnia. Aby zapewnić precyzję między testami, dla każdego testu przygotowano trzy odrębne partie zestawów kulek. Obliczono zmienne precyzji testu z próbkami wzorca i osocza ludzkiego.Średnie wartości mediany intensywności fluorescencji po 120 minutach inkubacji były optymalne dla miana IgG dla kolca S1, błony i przeciwciał nukleokapsydu, co wskazuje na szybką kinetykę wiązania przeciwciał pierwotnych. Wtórne optymalizacje stężenia przeciwciał w trybie dwukanałowym wykazały szeroki zakres sygnałów w pomiarze liniowym dla wszystkich stężeń. Poniżej przedstawiono obserwowane sygnały z różnych inkubacji przeciwciał drugorzędowych w różnych czasach oraz szczegóły dotyczące zmian sygnału dla wszystkich czasów inkubacji.W ocenach swoistości dla testów dwukanałowych zaobserwowano znikome zanieczyszczenie sygnałem krzyżowym między ślepą próbą a pojedynczym kanałem reporterowym. Na ilustracji zdarzeń serokonwersji po szczepieniu COVID 19 zaobserwowane wartości skoku S1, IgA i IgM były około 40-krotnie niższe niż miano izotypu IgG. Metoda ta ma ważne implikacje dla monitorowania odpowiedzi na szczepionki u osób z obniżoną odpornością.Pozwoli nam to określić, czy ci pacjenci są rzeczywiście chronieni przez te szczepienia.

dynamic-monitoring-seroconversion-using-multianalyte-immunobead-assay

Research

JoVE Journal

Medicine

Medycyna

Ten film opisuje technikę testu immunologicznego wykorzystującą fluorescencyjne kulki magnetyczne lub mikrosfery w połączeniu z różnymi antygenami do jednoczesnego wykrywania różnych izotypów przeciwciał w próbce surowicy. Test jest pomocny w zrozumieniu serokonwersji podczas infekcji lub po szczepieniu.

Multianalitowy test immunobealikowy: Technika testu immunologicznego oparta na przepływie do jednoczesnego wykrywania wielu podtypów przeciwciał w próbce ludzkiej surowicy

W obecnym klimacie ograniczonych zasobów, pojawiają się nowe technologie, które pozwalają badaczom prowadzić badania taniej, szybciej i z większą precyzją. W tym miejscu opisujemy rozwój multipleksowego testu immunologicznego na bazie przeciwciał ślinowych na bazie kulek do pomiaru narażenia ludzi na wiele patogenów środowiskowych jednocześnie.

Opracowanie testu immunologicznego Multiplex opartego na przeciwciałach ślinowych do pomiaru narażenia ludzi na patogeny środowiskowe

System analizy przepływu dla testów multipleksowych opartych na koralikach, który zapewnia odczyt z dwoma reporterami, został wykorzystany do opracowania multipleksowych testów serologicznych i neutralizacji przeciwciał, które mogą jednocześnie mierzyć neutralizujące przeciwciała IgG i IgM dla SARS-CoV-2.

Szybki, multipleksowy test neutralizacji IgG i IgM SARS-CoV-2 z podwójnym reporterem dla multipleksowanego systemu analizy przepływu opartego na kulkach

Opisany protokół opisuje procedurę wytwarzania kompleksu białkowego HiBiT wiążącego receptor domeny oraz jego zastosowanie do szybkiego i czułego wykrywania przeciwciał SARS-CoV-2.

Wykrywanie przeciwciała domeny wiążącej receptor SARS-CoV-2 za pomocą bioreportera opartego na HiBiT

Zgodnie z pilną potrzebą badań przesiewowych w kierunku cukrzycy typu 1, celiakii i choroby koronawirusowej 2019, opracowaliśmy wysokoprzepustowy test elektrochemiluminescencyjny 6-Plex do jednoczesnego wykrywania wszystkich czterech autoprzeciwciał wysp trzustkowych, autoprzeciwciał transglutaminazy tkankowej oraz przeciwciał przeciwko domenie wiążącej receptor koronawirusa 2 zespołu ciężkiej ostrej niewydolności oddechowej.

Wysokoprzepustowe, multipleksowane badania przesiewowe w kierunku cukrzycy typu 1, celiakii i COVID-19

Trzykanałowy system analizy przepływu fluorescencji z podwójnym reporterem został wykorzystany do opracowania multipleksowego testu immunologicznego opartego na koralikach, który jednocześnie ocenia próbki surowicy pod kątem IgG i IgM wywołanych przez wiele antygenów różnych gatunków Borrelia, które powodują boreliozę z Lyme w Europie i Ameryce Północnej.

Jednoczesne wykrywanie różnych klas przeciwciał w multipleksowanym teście serologicznym

Tutaj opisujemy nowo opracowany multipleksowy fluorescencyjny test immunologiczny, który wykorzystuje system cytometrii z podwójnym przepływem reporterowym do jednoczesnego wykrywania dwóch unikalnych epitopów białka kolca na nienaruszonych cząsteczkach wirusa SARS-CoV-2 (SARS-CoV-2) zespołu ciężkiej ostrej niewydolności oddechowej, które zostały wychwycone przez mikrosfery magnetyczne sprzężone z enzymem konwertującym angiotensynę.

Profilowanie epitopów białek powierzchniowych na cząsteczkach wirusa za pomocą strategii multipleksu dual-reporter

Badanie to oceniało seroprewalencję COVID-19 w Dżuddzie w Arabii Saudyjskiej wśród zdrowych dawców krwi w okresach przed, w trakcie lockdownu i po lockdownie. Spośród 3 825 próbek, 4,5% uzyskało pozytywny wynik testu na obecność przeciwciał IgG. Seroprewalencja znacząco wzrosła po lockdownie, podkreślając rolę bezobjawowego przenoszenia oraz skuteczność początkowych ograniczeń.

Test seroprewalencji COVID-19 na poziom przeciwciał IgG wśród zdrowych dawców w różnych fazach pandemii w Dżuddzie

Opisujemy niedawno opracowaną platformę testów immunologicznych opartą na zasadach bezkomórkowej biologii syntetycznej i technice dot-blot do konfigurowalnego wykrywania odpowiedzi przeciwciał w surowicach ludzkich i zwierzęcych.

Bezkomórkowa plama punktowa jako praktyczna i elastyczna platforma testów immunologicznych do wykrywania odpowiedzi przeciwciał w surowicach ludzkich i zwierzęcych

Multipleksowe fluorescencyjne testy immunologiczne stają się źródłem informacji do badań serologicznych. Ich zastosowanie jest jednak ograniczone ze względu na złożoność i czasochłonne procesy sprzężenia kulki z analizą koralików. Raport ten przedstawia półautomatyczny, powtarzalny protokół multipleksowego mikrokulkowego sprzężenia kulek, który jest porównywalny ze standardową metodą, a jednocześnie znacznie skraca czas oczekiwania na uzyskanie rezultatów.

Multipleksowy test serologiczny do wykrywania odpowiedzi przeciwciał na arbowirusy

Poznaj metodę wieloanalitowego testu immunobeadowego do dynamicznego monitorowania serokonwersji przeciwciał IgA, IgM i IgG w odpowiedzi na zakażenie lub szczepienie SARS-CoV-2. Technika zapewnia wysoką przepustowość i precyzję w analizach serologicznych.

Dynamiczne monitorowanie serokonwersji za pomocą wieloanalitowego testu immunobeadowego w kierunku Covid-19

Przeglądaj więcej filmów