Name: Porównanie metod izolowania grzybów entomopatogenicznych z próbek gleby (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-01-06T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 16 s
Description: Poznaj metody izolacji grzybów entomopatogenicznych z gleby przy użyciu przynęt owadzich Galleria mellonella i Tenebrio molitor. Technika ta wspiera rozwój biopestycydów i badania nad bioróżnorodnością grzybów.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

To badanie zostało częściowo sfinansowane przez Coordenacão de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) z Brazylii, kod finansowy 001, Fundação Carlos Chagas Filho de Amparo à Pesquisa do Estado do Rio de Janeiro (FAPERJ) (numer projektu E-26/010.001993/2015), oraz Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) z Brazylii.

Ponieważ niniejsze badanie dotyczyło brazylijskiego dziedzictwa genetycznego, zostało zarejestrowane w Krajowym Systemie Zarządzania Dziedzictwem Genetycznym i Związaną Wiedzą Tradycyjną (Sisgen) pod kodem AA47CB6.
1. Pobieranie próbek gleby
<ol>
	<li>Zbierz 800 g gleby (z lub bez incydentalnych wtórnych korzeni roślin) na głębokość 10 cm za pomocą małej łopaty. Przechowuj je w polipropylenowych torebkach w temperaturze pokojowej do rozpoczęcia eksperymentu. 
	UWAGA: Można również zbierać małe korzenie, ponieważ według doniesień EPF ma kompetencję ryzosfery. Im szybsze przetwarzanie próbek, tym lepiej, ponieważ zarodniki grzybów mogą z czasem stać się mniej żywotne. W niniejszym badaniu próbki analizowano nie później niż 7 dni po pobraniu.</li>
	<li>Użyj GPS, aby określić lokalizację pobranych próbek pod względem szerokości i długości geograficznej oraz sklasyfikować pobrany obszar według rodzaju gleby (na przykład łąki, rodzime lasy deszczowe, brzegi jezior lub pola uprawne).</li>
</ol>
2. Metody izolacji grzybów entomopatogenicznych
<ol>
	<li>Izolacja za pomocą selektywnego sztucznego podłoża CTC.
	<ol>
		<li>Aby przygotować pożywkę CTC [agar z dekstrozą ziemniaczaną plus ekstrakt drożdżowy (PDAY) uzupełniony 0,5 g/l chloramfenikolu, 0,001 g/l tiabendazolu i 0,25 g/l cykloheksymidu9], zważ wszystkie odczynniki indywidualnie, wymieszaj je z wodą destylowaną i wysterylizuj pożywkę w autoklawie. W komorze bezpieczeństwa biologicznego rozłóż 23 ml pożywki na płytki Petriego o wymiarach 60 mm x 15 mm. 
		UWAGA: Podczas ważenia odczynników CTC używaj fartucha laboratoryjnego, maski, rękawiczek i okularów, ponieważ cykloheksymym i chloramfenikol są toksyczne.</li>
		<li>Odważyć 0,35 ± 0,05 g każdej próbki gleby (z korzeniami lub bez) i umieścić ją w mikroprobówce o pojemności 1,5 ml.</li>
		<li>W komorze bezpieczeństwa biologicznego dodać 1 ml sterylnej zawiesiny wodnej monooleinianu polioksyetylenosorbitanu o stężeniu 0,01% (obj./obj.) do mikroprobówki zawierającej glebę i wirować przez 30 s.</li>
		<li>Usunąć 50 μl supernatantu i odpipetować go na środek płytki Petriego za pomocą pożywki CTC. Zawiesiny rozprowadzić równomiernie na powierzchni podłoża za pomocą sterylnej szpatułki Drigalskiego (o średnicy 6 mm). 
		UWAGA: Dla każdej próbki gleby należy przygotować co najmniej trzy powtórzenia.</li>
		<li>Inkubować płytki w komorach klimatycznych (25 ± 1 °C, wilgotność względna ≥80%) w ciemności i obserwować wzrost kolonii grzybów po 7, 14 i 21 dniach inkubacji.</li>
		<li>Obserwuj makromorfologię i mikromorfologię kolonii grzybów poszukujących EPF. Przenieść kultury EPF na podłoże z dekstrozą ziemniaczaną z dodatkiem 0,05% chloramfenikolu (PDAC) aż do uzyskania czystych kultur. 
		UWAGA: Do identyfikacji kolonii EPF należy użyć kluczy opisowych przedstawionych poniżej w kroku 3.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Izolacja za pomocą przynęt na owady
	<ol>
		<li>Stosować zdezynfekowane powierzchniowo larwy G. mellonella i T. molitor w późnym stadium. Zanurz larwy w 0,5% podchlorynie sodu na 1 minutę w celu sterylizacji. Umyj larwy dwukrotnie sterylną wodą. 
		UWAGA: W niniejszym badaniu wykorzystano larwy G. mellonella z czwartego etapu. Stadia larwalne T. molitor nie były standaryzowane.</li>
		<li>Użyj plastikowych doniczek do złożenia przynęt. Dodaj 250 g zebranej ziemi do każdej plastikowej doniczki (98 mm szerokości x 47 mm wysokości x 142 mm długości). Oddziel 15 larw każdego gatunku (T. molitor i G. mellonella) i umieść pięć larw w plastikowej doniczce. Przechowuj doniczki w temperaturze 25 ± 1 °C, a wilgotność względna ≥ 80% w ciemności. 
		UWAGA: Wywierć 10 małych otworów (o średnicy 2 mm) w pokrywkach garnków, aby umożliwić wentylację. Do wiercenia otworów można użyć ostrego, rozgrzanego żelazka.</li>
		<li>Homogenizuj glebę co drugi dzień, aby umożliwić maksymalny kontakt larw z glebą. 
		UWAGA: Wilgoć jest ważna, aby wspierać infekcję grzybiczą larw. Aby utrzymać wilgoć w glebie, w razie potrzeby spryskaj powierzchnię gleby sterylną wodą destylowaną. Nie moczyć próbki gleby w wodzie.</li>
		<li>Codziennie analizuj doniczki w poszukiwaniu martwych owadów. 
		UWAGA: Codziennie obserwuj pozostałe larwy w kolonii pod kątem patologicznych objawów bezkręgowców, aby upewnić się, że owady nie są zainfekowane. Alternatywnie do badania można włączyć doniczki kontrolne ze sterylną glebą w celu sprawdzenia stanu zdrowia larw owadów.</li>
		<li>Usuń martwe owady i wysterylizuj je powierzchniowo 0,5% podchlorynem sodu przez 1 min. Umieść sterylne owady w wilgotnej komorze (wilgotność względna ≥ 80%) w temperaturze 25 ± 1 °C na 7 dni, aby sprzyjać eksterioryzacji grzybów entomopatogenicznych (grzybicy).</li>
		<li>W przypadku grzybicy zbierz konidia z powierzchni owada. Użyj pętli mikrobiologicznej, aby umieścić konidia na pożywce PDAC pod mikroskopem stereoskopowym. Alternatywnie należy umieścić całe zainfekowane larwy na pożywce PDAC. Inkubować płytki hodowlane w komorze klimatycznej w temperaturze 25 ± 1 °C i wilgotności względnej ≥ 80%.</li>
		<li>Obserwuj makromorfologię i mikromorfologię kolonii grzybów na płytkach, aby potwierdzić tożsamość EPF. Powtarzaj hodowlę na PDAC, aż do uzyskania czystych kolonii grzybów. 
		UWAGA: Do identyfikacji kolonii EPF należy użyć kluczy opisowych przedstawionych poniżej w kroku 3.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Identyfikacja EPF (Metarhizium spp. i Beauveria spp.)
<ol>
	<li>Przeanalizuj cechy makromorfologiczne kultur grzybów na płytkach (tj. powierzchnię i odwrotność kolonii, ich kształt, krawędź, tempo wzrostu, kolor, teksturę, dyfuzyjny pigment, wysięki i konidia powietrzne) po 14 dniach w temperaturze 25 ± 1 °C i wilgotności względnej ≥ 80%.</li>
	<li>Przenieś konidia powietrzne do kultur szkiełkowych (technika mikrokultur)16 przez 3 dni w temperaturze 25 ± 1 °C i wilgotności względnej ≥ 80% i zabarwić błękitem laktofenolowym, aby obserwować cechy mikroskopowe (tj. układ konidiów, konidiofory, kształt i rozmiar konidii)17,18,19,20.</li>
	<li>Obserwuj mikroskopijne struktury grzybów pod kątem 400x za pomocą mikroskopu optycznego, aby potwierdzić identyfikację EPF. 
	UWAGA: Klucze morfologiczne dla EPF są opisane w raportach Bischoffa i wsp., Rehnera i wsp., Seiferta i wsp., oraz Humber17,18,19,20. Makromorfologia i mikromorfologia kolonii grzybów są najczęstszymi kryteriami stosowanymi do identyfikacji grzybów strzępkowych na poziomie rodzaju. W zależności od rodzaju EPF te cechy morfologiczne ulegną zmianie. Humber20 przedstawia klucz identyfikacyjny do głównych rodzajów entomopatogenów grzybów. Na przykład kolonie Metarhizium spp. są zwykle okrągłe, sproszkowane, mają różne odcienie zieleni i mogą wykazywać wysięk. Mikroskopowo kolonie te mają komórki konidiogenne wierzchołkowe na szeroko rozgałęzionych, gęsto splecionych konidioforach tworzących zwarte hymenium oraz konidia cylindryczne do elipsoidalnych w równoległych łańcuchach tworzących kolumny lub masy przypominające płytki. Kolonie Beauveria spp. są zwykle białe, pudrowe lub podobne do bawełny. Wykazują komórki konidiogenne z rozszerzoną częścią podstawną rozciągającą się wierzchołkowo w kierunku zygzakowatym. Konidiofory Beauveria tworzą gęste skupiska konidiów w kształcie kuli. Analizy molekularne są potrzebne do identyfikacji EPF na poziomie gatunku.</li>
	<li>Przeprowadzanie analiz molekularnych izolatów w celu identyfikacji taksonomicznej na poziomie gatunku. Dla szczepów EPF wyizolowanych w tym badaniu, a mianowicie Metarhizium spp. i Beauveria spp., należy przeprowadzić analizy molekularne w oparciu o raporty Bischoffa i wsp.17 oraz Rehnera i wsp.18.</li>
	<li>Po potwierdzeniu, że izolaty są EPF, należy je zdeponować w kolekcji kultur grzybów. W niniejszym badaniu izolaty zdeponowano w kolekcji entomopatogenicznych kultur grzybów z Laboratorium Kontroli Mikrobiologicznej (LCM) na Federalnym Uniwersytecie Wiejskim w Rio de Janeiro.</li>
</ol>

<ol><li>Roberts, D. W., St. Leger, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metarhizium+spp.%2C+cosmopolitan+insect-pathogenic+fungi%3A+Mycological+aspects%5BTitle%5D)+AND+%22Advances+in+Applied+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Metarhizium spp., cosmopolitan insect-pathogenic fungi: Mycological aspects.</a> Advances in Applied Microbiology. 54, 1-70 (2004).</li>
<li>do Nascimento Silva, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+cost-effective+bioconversion+process+of+palm+kernel+cake+into+bioinsecticides+based+on+Beauveria+bassiana+and+Isaria+javanica%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+Microbiology+and+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">New cost-effective bioconversion process of palm kernel cake into bioinsecticides based on Beauveria bassiana and Isaria javanica.</a> Applied Microbiology and Biotechnology. 102 (6), 2595-2606 (2018).</li>
<li>Faria, M. R., Wraight, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mycoinsecticides+and+Mycoacaricides%3A+A+comprehensive+list+with+worldwide+coverage+and+international+classification+of+formulation+types%5BTitle%5D)+AND+%22Biological+Control%22%5BJournal%5D)">Mycoinsecticides and Mycoacaricides: A comprehensive list with worldwide coverage and international classification of formulation types.</a> Biological Control. 43 (3), 237-256 (2007).</li>
<li>Vega, F. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+use+of+fungal+entomopathogens+as+endophytes+in+biological+control%3A+a+review%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+Mycology%22%5BJournal%5D)">The use of fungal entomopathogens as endophytes in biological control: a review.</a> Applied Mycology. 110 (1), 4-30 (2018).</li>
<li>Sharma, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advances+in+entomopathogen+isolation%3A+A+case+of+bacteria+and+fungi%5BTitle%5D)+AND+%22Microorganisms%22%5BJournal%5D)">Advances in entomopathogen isolation: A case of bacteria and fungi.</a> Microorganisms. 9 (1), 1-28 (2021).</li>
<li>Litwin, A., Nowak, M., Różalska, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Entomopathogenic+fungi%3A+unconventional+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Reviews+in+Environmental+Science+and+Bio%2FTechnology%22%5BJournal%5D)">Entomopathogenic fungi: unconventional applications.</a> Reviews in Environmental Science and Bio/Technology. 19, 23-42 (2020).</li>
<li>Kim, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tenebrio+molitor-mediated+entomopathogenic+fungal+library+construction+for+pest+management%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Asia-Pacific+Entomology%22%5BJournal%5D)">Tenebrio molitor-mediated entomopathogenic fungal library construction for pest management.</a> Journal of Asia-Pacific Entomology. 21 (1), 196-204 (2018).</li>
<li>Meyling, N., Eilenberg, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ocurrence+and+distribution+of+soil+borne+entomopathogenic+fungi+within+a+single+organic+agroecosystem%5BTitle%5D)+AND+%22Agriculture%2C+Ecosystems+and+Environment%22%5BJournal%5D)">Ocurrence and distribution of soil borne entomopathogenic fungi within a single organic agroecosystem.</a> Agriculture, Ecosystems and Environment. 113 (1), 336-341 (2006).</li>
<li>Fernandes, E. K. K., Keyser, C. A., Rangel, D. E. N., Foster, R. N., Roberts, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CTC+medium%3A+A+novel+dodine-free+selective+medium+for+isolating+entomopathogenic+fungi%2C+especially+Metarhizium+acridum%2C+from+soil%5BTitle%5D)+AND+%22Biological+Control%22%5BJournal%5D)">CTC medium: A novel dodine-free selective medium for isolating entomopathogenic fungi, especially Metarhizium acridum, from soil.</a> Biological Control. 54 (3), 197-205 (2010).</li>
<li>Ortiz-Urquiza, A., Keyhani, N. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+genetics+of+Beuveria+bassiana+infection+of+insects%5BTitle%5D)+AND+%22Advantages+in+Genetics%22%5BJournal%5D)">Molecular genetics of Beuveria bassiana infection of insects.</a> Advantages in Genetics. 94, 165-249 (2016).</li>
<li>Pereira, M. F., Rossi, C. C., Silva, G. C., Rosa, J. N., Bazzolli, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Galleria+mellonella+as+infection+model%3A+an+in+depth+look+at+why+it+works+and+practical+considerations+for+successful+application%5BTitle%5D)+AND+%22Pathogens+and+Disease%22%5BJournal%5D)">Galleria mellonella as infection model: an in depth look at why it works and practical considerations for successful application.</a> Pathogens and Disease. 78 (8), (2020).</li>
<li>Souza, P. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tenebrio+molitor+%28Coleoptera%3A+Tenebrionidae%29+as+an+alternative+host+to+study+fungal+infections%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Microbiological+Methods%22%5BJournal%5D)">Tenebrio molitor (Coleoptera: Tenebrionidae) as an alternative host to study fungal infections.</a> Journal of Microbiological Methods. 118, 182-186 (2015).</li>
<li>Canfora, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+method+for+detection+and+quantification+of+B.+brongniartii+and+B.+bassiana+in+soil%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Development of a method for detection and quantification of B. brongniartii and B. bassiana in soil.</a> Scientific Reports. 6, 22933(2016).</li>
<li>Garrido-Jurado, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transient+endophytic+colonization+of+melon+plants+by+entomopathogenic+fungi+after+foliar+application+for+the+control+of+Bemisia+tabaci+Gennadius+%28Hemiptera%3A+Aleyrodidae%29%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Pest+Science%22%5BJournal%5D)">Transient endophytic colonization of melon plants by entomopathogenic fungi after foliar application for the control of Bemisia tabaci Gennadius (Hemiptera: Aleyrodidae).</a> Journal of Pest Science. 90, 319-330 (2016).</li>
<li>Sharma, L., Oliveira, I., Torres, L., Marques, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Entomopathogenic+fungi+in+Portuguese+vineyards+soils%3A+suggesting+a+%27Galleria-Tenebrio-bait+method%27+as+bait-insects+Galleria+and+Tenebrio+significantly+underestimate+the+respective+recoveries+of+Metarhizium+%28robertsii%29+and+Beauveria+%28bassiana%29%5BTitle%5D)+AND+%22MycoKeys%22%5BJournal%5D)">Entomopathogenic fungi in Portuguese vineyards soils: suggesting a 'Galleria-Tenebrio-bait method' as bait-insects Galleria and Tenebrio significantly underestimate the respective recoveries of Metarhizium (robertsii) and Beauveria (bassiana).</a> MycoKeys. 38, 1-23 (2018).</li>
<li>Riddell, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Permanent+stained+mycological+preparations+obtained+by+slide+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Mycologia%22%5BJournal%5D)">Permanent stained mycological preparations obtained by slide culture.</a> Mycologia. 42 (2), 265-270 (1950).</li>
<li>Bischoff, J., Rehner, S. A., Humber, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+multilocus+phylogeny+of+the+Metarhizium+anisopliae+lineage%5BTitle%5D)+AND+%22Mycologia%22%5BJournal%5D)">A multilocus phylogeny of the Metarhizium anisopliae lineage.</a> Mycologia. 101 (4), 512-530 (2009).</li>
<li>Rehner, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phylogeny+and+systematics+of+the+anamorphic%2C+entomopathogenic+genus+Beauveria%5BTitle%5D)+AND+%22Mycologia%22%5BJournal%5D)">Phylogeny and systematics of the anamorphic, entomopathogenic genus Beauveria.</a> Mycologia. 103 (5), 1055-1073 (2011).</li>
<li>Seifert, K. A., Gams, W. Anamorphs of Clavicipitaceae, Cordycipitaceae and Ophiocordycipitaceae. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSeifert%2C+KA+%22The+Genera+of+Hyphomycetes.+CBS+Biodiversity+Series.+CBS-KNAW+Fungal+Biodiversity+Centre%22">The Genera of Hyphomycetes. CBS Biodiversity Series. CBS-KNAW Fungal Biodiversity Centre</a>. Seifert, K. A., Morgan-Jones, G., Gams, W., Kendrick, B. 9, 903-906 (2011).</li>
<li>Humber, R. A. Identification of entomopathogenic fungi. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aHumber%2C+RA+%22Manual+of+Techniques+in+Invertebrate+Pathology.%2C+2nd+ed%22">Manual of Techniques in Invertebrate Pathology., 2nd ed</a>. Lacey, L. A. , Academic Press. Washington. 151-187 (2012).</li>
<li>Mesquita, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficacy+of+a+native+isolate+of+the+entomopathogenic+fungus+Metarhizium+anisopliae+against+larval+tick+outbreaks+under+semifield+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22BioControl%22%5BJournal%5D)">Efficacy of a native isolate of the entomopathogenic fungus Metarhizium anisopliae against larval tick outbreaks under semifield conditions.</a> BioControl. 65 (3), 353-362 (2020).</li>
<li>St Leger, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Studies+on+adaptations+of+Metarhizium+anisopliae+to+life+in+the+soil%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Invertebrate+Pathology%22%5BJournal%5D)">Studies on adaptations of Metarhizium anisopliae to life in the soil.</a> Journal of Invertebrate Pathology. 98 (3), 271-276 (2008).</li>
<li>Mar, T. T., Suwannarach, N., Lumyong, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+entomopathogenic+fungi+from+Nortern+Thailand+and+their+production+in+cereal+grains%5BTitle%5D)+AND+%22World+Journal+of+Microbiology+and+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Isolation of entomopathogenic fungi from Nortern Thailand and their production in cereal grains.</a> World Journal of Microbiology and Biotechnology. 28 (12), 3281-3291 (2012).</li>
<li>Rocha, L. F. N., Inglis, P. W., Humber, R. A., Kipnis, A., Luz, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Occurrence+of+Metarhizium+spp.+in+central+Brazilian+soils%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Basic+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Occurrence of Metarhizium spp. in central Brazilian soils.</a> Journal of Basic Microbiology. 53 (3), 251-259 (2013).</li>
<li>Quesada-Moraga, E., Navas-Cortés, J. A., Maranhao, E. A. A., Ortiz-Urquiza, A., Santiago-Álvarez, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Factors+affecting+the+occurrence+and+distribution+of+entomopathogenic+fungi+in+natural+and+cultivated+soils%5BTitle%5D)+AND+%22Mycological+Research%22%5BJournal%5D)">Factors affecting the occurrence and distribution of entomopathogenic fungi in natural and cultivated soils.</a> Mycological Research. 111 (8), 947-966 (2007).</li>
<li>Mora, M. A. E., Rouws, J. R. C., Fraga, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Occurrence+of+entomopathogenic+fungi+in+atlantic+forest+soils%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiology+Discovery%22%5BJournal%5D)">Occurrence of entomopathogenic fungi in atlantic forest soils.</a> Microbiology Discovery. 4 (1), 1-7 (2016).</li>
<li>Goble, T. A., Dames, J. F., Hill, M. P., Moore, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((D.The+effects+of+farming+system%2C+habitat+type+and+bait+type+on+the+isolation+of+entomopathogenic+fungi+from+citrus+soils+in+the+Eastern+Cape+Province%2C+South+Africa%5BTitle%5D)+AND+%22BioControl%22%5BJournal%5D)">D.The effects of farming system, habitat type and bait type on the isolation of entomopathogenic fungi from citrus soils in the Eastern Cape Province, South Africa.</a> BioControl. 55 (3), 399-412 (2010).</li>
<li>Medo, J., Cagáň, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Factors+affecting+the+occurrence+of+entomopathogenic+fungi+in+soils+of+Slovakia+as+revealed+using+two+methods%5BTitle%5D)+AND+%22Biological+Control%22%5BJournal%5D)">Factors affecting the occurrence of entomopathogenic fungi in soils of Slovakia as revealed using two methods.</a> Biological Control. 59 (2), 200-208 (2011).</li>
<li>Chase, A. R., Osborne, L. S., Ferguson, V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+isolation+of+the+entomopathogenic+fungi+Beauveria+bassiana+and+Metarhizium+anisopliae+from+an+artificial+potting+medium%5BTitle%5D)+AND+%22Florida+Entomologist%22%5BJournal%5D)">Selective isolation of the entomopathogenic fungi Beauveria bassiana and Metarhizium anisopliae from an artificial potting medium.</a> Florida Entomologist. 69, 285-292 (1986).</li>
<li>Liu, Z. Y., Milner, R. J., McRae, C. F., Lutton, G. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+use+of+dodine+in+selective+media+for+the+isolation+of+Metarhizium+spp.+from+soil%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Invertebrate+Pathology%22%5BJournal%5D)">The use of dodine in selective media for the isolation of Metarhizium spp. from soil.</a> Journal of Invertebrate Pathology. 62, 248-251 (1993).</li>
<li>Rangel, D. E. N., Dettenmaier, S. J., Fernandes, E. K. K., Roberts, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Susceptibility+of+Metarhizium+spp.+and+other+entomopathogenic+fungi+to+dodine-based+selective+media%5BTitle%5D)+AND+%22Biocontrol+Science+and+Technology%22%5BJournal%5D)">Susceptibility of Metarhizium spp. and other entomopathogenic fungi to dodine-based selective media.</a> Biocontrol Science and Technology. 20 (4), 375-389 (2010).</li>
<li>Keller, S., Kessler, P., Schweizer, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distribution+of+insect+pathogenic+soil+fungi+in+Switzerland+with+special+reference+to+Beauveria+brongniartii+and+Metharhizium+anisopliae%5BTitle%5D)+AND+%22BioControl%22%5BJournal%5D)">Distribution of insect pathogenic soil fungi in Switzerland with special reference to Beauveria brongniartii and Metharhizium anisopliae.</a> BioControl. 48 (3), 307-319 (2003).</li>
<li>Enkerli, J., Widmer, F., Keller, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+field+persistence+of+Beauveria+brongniartii+strains+applied+as+biocontrol+agents+against+European+cockchafer+larvae+in+Switzerland%5BTitle%5D)+AND+%22Biological+Control%22%5BJournal%5D)">Long-term field persistence of Beauveria brongniartii strains applied as biocontrol agents against European cockchafer larvae in Switzerland.</a> Biological Control. 29 (1), 115-123 (2004).</li>
<li>Imoulan, A., Alaoui, A., El Meziane, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Natural+occurrence+of+soil-borne+entomopathogenic+fungi+in+the+Moroccan+endemic+forest+of+Argania+spinosa+and+their+pathogenicity+to+Ceratitis+capitata%5BTitle%5D)+AND+%22World+Journal+of+Microbiology+and+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Natural occurrence of soil-borne entomopathogenic fungi in the Moroccan endemic forest of Argania spinosa and their pathogenicity to Ceratitis capitata.</a> World Journal of Microbiology and Biotechnology. 27 (11), 2619-2628 (2011).</li>
<li>Keyser, C. A., De Fine Licht, H. H., Steinwender, B. M., Meyling, N. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diversity+within+the+entomopathogenic+fungal+species+Metarhizium+flavoviride+associated+with+agricultural+crops+in+Denmark%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Diversity within the entomopathogenic fungal species Metarhizium flavoviride associated with agricultural crops in Denmark.</a> BMC Microbiology. 15 (1), 1-11 (2015).</li>
</ol>

Autorzy nie pozostają w konflikcie interesów.

Naturalne i rolnicze siedliska glebowe są typowymi środowiskami dla EPF22 i doskonałym naturalnym zbiornikiem. W niniejszym badaniu omówiono dwie metody izolacji EPF przy użyciu przynęt na owady w porównaniu z pożywką selektywną. Pierwszym krokiem do izolacji jest pobranie próbek gleby. Kluczowe znaczenie ma właściwe przechowywanie i identyfikacja próbek gleby. Informacje o szerokości i długości geograficznej, typie gleby i biomie są niezbędne do badań z udziałem podmiotów epidemiologicznych, mode...

Gleba jest źródłem wielu mikroorganizmów, w tym grzybów entomopatogenicznych (EPF). Ta szczególna grupa grzybów jest rozpoznawana po ich zdolności do kolonizacji i często zabijania stawonogów gospodarzy, zwłaszcza owadów1. Po izolacji, charakterystyce, selekcji zjadliwych szczepów i rejestracji, EPF jest masowo produkowany do zwalczania stawonogów i szkodników, co potwierdza ich znaczenie ekonomiczne2. W związku z tym izolacja EPF jest uważana za pierwszy krok do opracowania biopestycydu. Beauveria spp. (Hypocreales: Cordycipitaceae) i Metarhizium spp. (Hypocreales: Clavicipitaceae) są najpowszechniejszymi grzybami stosowanymi do zwalczania szkodników stawonogów 3. EPF udało się wyizolować z gleby, stawonogów z widoczną grzybicą, skolonizowanych roślin i roślinnej ryzosfery4,5.
Izolacja EPF może być również przydatna do badania różnorodności, rozmieszczenia i ekologii tej konkretnej grupy. Najnowsza literatura donosiła, że stosowanie EPF jest niedoceniane, powołując się na kilka niekonwencjonalnych zastosowań EPF, takich jak ich zdolność do poprawy wzrostu roślin4, do usuwania toksycznych zanieczyszczeń z gleby i do stosowania w medycynie6. Niniejsze badanie ma na celu porównanie skuteczności izolacji EPF z gleby za pomocą przynęt na owady w porównaniu ze sztucznym podłożem hodowlanym7,8,9. Stosowanie Galleria mellonella L. (Lepidoptera: Phyralidae) jako przynęty na owady w kontekście izolacji EPF zostało dobrze zaakceptowane. Larwy te są używane na całym świecie przez społeczność naukową jako model eksperymentalny do badania interakcji gospodarz-patogen10,11. Larwa Tenebrio molitor L. (Coleoptera: Tenebrionidae) jest uważana za kolejny model owada do badań nad wirulencją i izolacją EPF, ponieważ owad ten jest łatwy do rzadkiego w laboratorium przy niskich kosztach7,12.
Metody niezależne od hodowli, takie jak użycie różnych technik PCR, mogą być stosowane do wykrywania i ilościowego oznaczania EPF na ich podłożach, w tym soil13,14. Niemniej jednak, aby prawidłowo wyizolować te kolonie grzybów, ich podłoże powinno być hodowane na selektywnym sztucznym podłożu 9, lub grzyby obecne w próbkach mogą być przynętowane za pomocą wrażliwych owadów15. Z jednej strony CTC jest sztuczną pożywką wolną od odyny, która składa się z agatora z dekstrozą ziemniaczaną wzbogaconego ekstraktem drożdżowym uzupełnionym chloramfenikolem, tiabendazolem i cykloheksymidem. To podłoże zostało opracowane przez Fernandesa i wsp.9, aby zmaksymalizować odzysk naturalnie występujących Beauveria spp. i Metarhizium spp. z gleby. Z drugiej strony, larwy G. mellonella i T. molitor mogą być również z powodzeniem stosowane jako przynęty do pozyskiwania izolatów EPF z gleby. Niemniej jednak, według Sharma et al.15, mniej badań donosiło o jednoczesnym stosowaniu i porównywaniu tych dwóch owadów-przynęt. Gleby portugalskich winnic wykazały znaczny odzysk Metarhizium robertsii (Metscn.) Sorokin za pomocą T. larwy molitora w porównaniu z larwami G. mellonella; natomiast Beauveria bassiana (Bals. -Criv.) Izolacja Vuilla była związana z użyciem G. mellonella baits15. W związku z tym decyzja o tym, którą metodę izolacji EPF zastosować (tj. G. mellonella-bait, T. molitor-bait lub pożywkę CTC) powinna być rozważona zgodnie z celem badania i infrastrukturą laboratoryjną. Celem niniejszego badania jest porównanie skuteczności stosowania przynęt na owady w porównaniu ze sztucznym selektywnym podłożem do izolowania EPF od próbek gleby.

<table><tbody><tr><td>Autoklaw</td><td>Phoenix Luferco</td><td>9451</td><td></td></tr><tr><td>Szafa bezpieczeństwa biologicznego</td><td>Airstream ESCO</td><td>AC2-4E3</td><td></td></tr><tr><td>Chloramfenikol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C0378</td><td></td></tr><tr><td>Komory klimatyczne</td><td>Eletrolab</td><td>EL212/3</td><td></td></tr><tr><td>Szkiełko nakrywkowe</td><td>RBR</td><td>3871</td><td></td></tr><tr><td>Cykloheksymid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C7698</td><td></td></tr><tr><td>Szpatułka Drigalskiego</td><td>Marienfeld</td><td>1800024</td><td></td></tr><tr><td>Aplikacja GPS</td><td>Aplikacja geolokalizacyjna</td><td>2.1.2005</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór niebieskiego laktofenolu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>61335</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Mikroskop Zeiss Axio star plus</td><td>1169 149</td><td></td></tr><tr><td>Kamera mikroskopowa</td><td>Zeiss Axiocam 105 kolor</td><td>426555-0000-000</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop softwere</td><td>Zen lite Zeiss 3.0</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Szkiełko mikroskopowe</td><td>Olen</td><td>k5-7105-1</td><td></td></tr><tr><td>Mikroprobówka</td><td>BRAND</td><td>Z336769-1PAK</td><td></td></tr><tr><td>Płytki Petriego</td><td>Kasvi</td><td>K30-6015</td><td></td></tr><tr><td>Końcówka do pipet</td><td>Vatten</td><td>VT-230-200C/VT-230-1000C</td><td></td></tr><tr><td>Pippette</td><td>HTL - Labmatepro</td><td>LMP 200 / LMP 1000</td><td></td></tr><tr><td>Doniczki plastikowe</td><td>Prafesta descart&aacute; veis</td><td>8314</td><td></td></tr><tr><td>Worki polipropylenowe</td><td>Extrusa</td><td>38034273/5561</td><td></td></tr><tr><td>Agar z dekstrozą ziemniaczaną</td><td>Kasvi</td><td>K25-1022</td><td></td></tr><tr><td>Oprogramowanie Prism 9.1.2</td><td>Łopata do grafiki</td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>Tramontina</td><td>77907009</td><td></td></tr><tr><td>Tenebrio mollitor</td><td>Safari</td><td>QP98DLZ36</td><td></td></tr><tr><td>Tiabendazol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8904</td><td></td></tr><tr><td>Tween 80</td><td>Vetec</td><td>60REAVET003662</td><td></td></tr><tr><td>Vortex</td><td>Biomixer</td><td>QL-901</td><td></td></tr><tr><td>Ekstrakt</td><td>drożdżowy Kasvi</td><td>K25-1702</td><td></td></tr></tbody></table>

porównanie metod izolowania grzybów entomopatogenicznych z próbek gleby

Comparison of Methods for Isolating Entomopathogenic Fungi from Soil Samples

Celem niniejszego badania jest porównanie skuteczności stosowania przynęt na owady w porównaniu ze sztucznym selektywnym podłożem do izolowania grzybów entomopatogenicznych (EPF) z próbek gleby. Gleba jest bogatym siedliskiem dla mikroorganizmów, w tym EPF, szczególnie należących do rodzajów Metarhizium i Beauveria, które mogą regulować szkodniki stawonogów. Na rynku dostępne są produkty biologiczne na bazie grzybów, głównie do zwalczania szkodników stawonogów w rolnictwie. Niemniej jednak, pomimo wysokiej endemicznej różnorodności biologicznej, tylko kilka szczepów jest stosowanych w komercyjnych bioproduktach na całym świecie. W niniejszym badaniu 524 próbki gleby hodowano na agarze z dekstrozą ziemniaczaną wzbogaconym ekstraktem drożdżowym uzupełnionym chloramfenikolem, tiabendazolem i cykloheksymidem (pożywka CTC). Wzrost kolonii grzybów obserwowano przez 3 tygodnie. Wszystkie Metarhizium i Beauveria EPF zostały morfologicznie zidentyfikowane na poziomie rodzaju. Ponadto niektóre izolaty zostały zidentyfikowane molekularnie na poziomie gatunku. Dwadzieścia cztery z tych 524 próbek gleby zostały również przebadane pod kątem występowania EPF przy użyciu metody przynęty na owady (Galleria mellonella i Tenebrio molitor). Z 524 próbek gleby wyizolowano łącznie 51 szczepów EPF (41 Metarhizium spp. i 10 Beauveria spp.). Wszystkie szczepy grzybów wyizolowano albo z pól uprawnych, albo z łąk. Spośród 24 próbek wybranych do porównania, 91,7% było dodatnich na EPF przy użyciu przynęty Galleria, 62,5% przy użyciu przynęty Tenebrio, a 41,7% przy użyciu CTC. Nasze wyniki sugerują, że stosowanie przynęt na owady do izolowania EPF od gleby jest bardziej efektywne niż stosowanie pożywki CTC. Porównanie metod izolacji wraz z identyfikacją i ochroną EPF ma pozytywny wpływ na wiedzę o różnorodności biologicznej. Udoskonalanie kolekcji EPF wspiera rozwój naukowy i innowacje technologiczne.

Łącznie pobrano 524 próbki gleby z terenów trawiastych: pastwisk dla zwierząt gospodarskich (165 próbek), rodzimego lasu tropikalnego (90 próbek), obszarów nadbrzeżnych (42 próbki) oraz gruntów uprawnych (227 próbek) w latach 2015–2018 w stanie Rio de Janeiro w Brazylii. Szczegóły dotyczące współrzędnych geograficznych próbek dodatnich pod kątem EPF podano w Tabeli uzupełniającej 1.
Z 524 próbek gleby 500 analizowano wyłącznie z użyciem pożywki CTC, a 24 próbki analizowano jed...

Entomopatogeniczne kolonie grzybów są izolowane z próbek gleby tropikalnej za pomocą przynęty Tenebrio, przynęty Galleria, a także selektywnego sztucznego podłoża, tj. agaru z dekstrozą ziemniaczaną wzbogaconego ekstraktem drożdżowym uzupełnionym chloramfenikolem, tiabendazolem i cykloheksymidem (pożywka CTC).

Porównanie metod izolowania grzybów entomopatogenicznych z próbek gleby

The goal of the present study is to compare the effectiveness of using insect baits versus artificial selective medium for isolating entomopathogenic ...

Izolacja grzybów entomopatogenicznych jest istotna dla opracowania biopestycydu i może być pomocna w badaniu różnorodności, rozmieszczenia i ekologii tej konkretnej grupy. Stosowanie przynęt na owady do izolowania grzybów entomopatogenicznych jest uważane za tanią i wysoce wydajną metodę. Chloramfenikol, tiabendazol, cykloheksymid, sztuczne podłoża nie wykorzystują dodyny i wymagają mniej miejsca w procesie pobierania próbek gleby.Krytyczne kroki obejmują badanie płytek CTC po jednym i dwóch tygodniach, aby zapobiec zwężeniu się innych grzybów i rozwojowi grzybów entomopatogenicznych, a następnie identyfikacja kolonii grzybów entomopatogenicznych na podstawie ich makromorfologii i mikromorfologii. Zacznij od zebrania 800 gramów gleby na głębokość 10 centymetrów za pomocą małej łopaty. Próbki należy przechowywać w workach polipropylenowych w temperaturze pokojowej do czasu rozpoczęcia eksperymentu.Można również zbierać małe korzenie, ponieważ wiadomo, że grzyby entomopatogeniczne mają kompetencję ryzosfery. W celu wyizolowania grzybów przy użyciu chloramfenikolu, tiabendazolu, cykloheksymidu lub sztucznego podłoża selektywnego CTC, należy zważyć 0,35 grama próbki gleby z korzeniami lub bez. Umieść tę próbkę w mikroprobówce o pojemności 1,5 mililitra.Podczas pracy w komorze bezpieczeństwa biologicznego dodaj jeden mililitr sterylnej zawiesiny wodnej monooleinianu polioksyetylenosorbitanu o procentach objętościowych 0,01 do mikroprobówki zawierającej glebę i wiruj probówkę przez 30 sekund. Po zakończeniu wyjąć i odpipetować 50 mikrolitrów supernatantu na środek płytki Petriego za pomocą pożywki CTC. Następnie użyj sterylnej szpatułki Drigalskiego o średnicy sześciu milimetrów, aby równomiernie rozprowadzić zawiesiny na powierzchni pożywki.Inkubuj płytki w komorach klimatycznych w temperaturze 25 stopni Celsjusza i wilgotności względnej co najmniej 80% w ciemności. Po siedmiu, 14 i 21 dniach inkubacji obserwuj płytki pod kątem wzrostu kolonii grzybów. Do izolacji grzybów używa się zdezynfekowanych powierzchniowo larw Galleria mellonella i Tenebrio molitor w późnym stadium jako przynęty na owady.Zanurz larwę w 0,5% podchlorynie sodu na jedną minutę w celu sterylizacji. Następnie umyj larwy dwukrotnie sterylną wodą. Złóż przynęty w plastikowych doniczkach z 10 małymi otworami o średnicy 10 milimetrów w pokrywie zawierającej 250 gramów zebranej gleby.Homogenizuj glebę co drugi dzień, aby umożliwić maksymalny kontakt larw z glebą i codziennie analizuj doniczki, szukając martwych owadów. Po wyjęciu martwych owadów z doniczki należy powierzchownie sterylizować owady 0,5% podchlorynem sodu przez jedną minutę. Aby sprzyjać grzybicy, umieść sterylne owady w wilgotnej komorze o wilgotności względnej 80% i temperaturze 25 stopni Celsjusza na siedem dni.W przypadku grzybicy zbierz konidia z powierzchni owadów i za pomocą pętli mikrobiologicznej umieść konidia na pożywce z agardą ziemniaczaną z dekstrozą zawierającą 0,05% chloramfenikolu lub pożywce PDAC pod mikroskopem stereoskopowym. Alternatywnie należy umieścić całe zainfekowane larwy na pożywce PDAC. I inkubuj płytki hodowlane w komorze klimatycznej, jak wyjaśniono wcześniej.Po 14 dniach inkubacji należy zidentyfikować gatunki EPF, analizując makromorfologiczne cechy kultur grzybów na płytkach, jak opisano w manuskrypcie. Następnie przenieś konidia powietrzne do kultur szkiełkowych na trzy dni w temperaturze 80% wilgotności względnej i 25 stopni Celsjusza. Po trzech dniach zabarwić szkiełko błękitem laktofenolowym, aby zaobserwować mikroskopijne cechy.Pod mikroskopem optycznym obserwuj struktury grzybów, takie jak rozmieszczenie, konidiofory, kształt i rozmiar konidiów 400 razy i potwierdź identyfikację EPF. W badaniach wyizolowano 51 szczepów EPF z gatunków Metarhizium i Beaveria z 524 próbek gleby. Reprezentatywna analiza przedstawia charakterystykę mikromorfologiczną kilku izolatów z gatunków Metarhizium i Beaveria.Występowanie EPF w 24 próbkach gleby badano przy użyciu trzech różnych metod izolacji. Przynęta Galleria mellonella okazała się bardziej skuteczna w izolacji, a następnie przynęta Tenebrio molitor i podłoże CTC. Te same 24 próbki gleby nie wykazały odtworzenia gatunku Beaveria, a jedynie Metarhizium.Najważniejsze rzeczy, o których należy pamiętać, to przeniesienie konidiów powietrznych na płaszcz szkiełkowy, obserwacja cech mikroskopu i potwierdzenie identyfikacji grzybów entomopatogenicznych za pomocą kluczy morfologicznych. Dodatkowe metody obejmują stosowanie innych selektywnych sztucznych pożywek ze specyficznymi substancjami chemicznymi w celu ograniczenia wzrostu zanieczyszczeń, takich jak dod. Poszukiwanie nowych izolatów grzybów o wyjątkowych cechach kontroli biologicznej ma kluczowe znaczenie dla zwiększenia skuteczności grzybów w zwalczaniu stawonogów i szkodników oraz zbadania dalszych pytań w dziedzinie patologii bezkręgowców.

comparison-methods-for-isolating-entomopathogenic-fungi-from-soil

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Nicienie entomopatogeniczne to glisty zamieszkujące glebę, które pasożytują na szerokiej gamie owadów.  Pokazujemy metody pobierania próbek stosowane do izolacji tych nicieni z gleby przy użyciu dwóch technik: przynęty na owady i zmodyfikowanej białej pułapki, do odzyskiwania nicieni odpowiednio z próbek gleby i zakażonych zwłok owadów.

Pobieranie próbek z gleby i izolacja nicieni entomopatogenicznych (Steinernematidae, Heterorhabditidae)

Tutaj opisujemy różne etapy związane z opartym na wiedzy rozwojem skutecznego środka mykosektycydowego, w tym izolację, identyfikację, badania przesiewowe i wybór "najlepiej dopasowanego" grzyba entomopatogenicznego, Metarhizium anisopliae, do zwalczania szkodników owadzich w rolnictwie.

Rozwój Metarhizium anisopliae jako mykosektycydu: od izolacji do wydajności polowej

Tutaj prezentujemy protokół oparty na systemie przynęty na mącznika mącznika (Tenebrio molitor), który był używany do izolowania i selekcji grzybów entomopatogenicznych (EPF) z próbek gleby. Skuteczna formuła liczby konidiów (ECN) jest stosowana do wyboru EPF o wysokiej tolerancji na stres w oparciu o cechy fizjologiczne do zwalczania mikrobiologicznego szkodników na polu.

Izolacja i selekcja grzybów entomopatogenicznych z próbek glebowych oraz ocena zjadliwości grzybów wobec szkodników owadzich

Ten protokół jest skuteczną, szybką metodą hodowli drożdży i pleśni Aspergillus fumigatus z dużych zestawów próbek gleby w ciągu zaledwie 7 dni. Metody te można łatwo modyfikować w celu dostosowania do różnych pożywek inkubacyjnych i temperatur w zależności od potrzeb eksperymentów.

Izolacja drożdży i pleśni nadających się do hodowli z gleb w celu zbadania struktury populacji grzybów

Tutaj prezentujemy protokół badania różnorodności biologicznej gleby w poszukiwaniu szczepów grzybów biorących udział w degradacji opornych materiałów. Najpierw izoluje się szczepy grzybów, które mogą rosnąć na kwasach humusowych lub lignocelulozie. Ich aktywność jest następnie testowana zarówno w testach enzymatycznych, jak i na zanieczyszczeniach, takich jak węglowodory i tworzywa sztuczne.

Izolacja i badania przesiewowe pod kątem różnorodności biologicznej gleby pod kątem grzybów biorących udział w degradacji opornych materiałów

Obecny artykuł ma na celu dostarczenie szczegółowych i adekwatnych protokołów do izolacji grzybów endofitycznych związanych z roślinami, długoterminowego przechowywania izolatów, charakterystyki morfologicznej i całkowitej ekstrakcji DNA w celu późniejszej identyfikacji molekularnej i analiz metagenomicznych.

Izolacja, charakterystyka i całkowita ekstrakcja DNA w celu identyfikacji grzybów endofitycznych w roślinach mykoheterotroficznych

Tutaj prezentujemy protokół pozyskiwania entomopatogenicznych grzybów z omacnicy leśnej oraz zastępczy sposób oceny ich entomopatogenicznej aktywności za pomocą modelowego owada Coleoptera. Ta metoda jest skuteczna i wygodna w badaniu entomopatogenicznych zasobów grzybów ze szkodników owadzich drążących drewno w lasach naturalnych.

Izolacja, identyfikacja behawioralna i ocena chorobotwórczości grzybów entomopatogenicznych z omacnicy leśnej

Prezentujemy podstawowe techniki rejestracji metodą patch clamp z błony presynaptycznej w kielichu Held (calyx of Held), który jest zakończeniem nerwowym w centralnym układzie nerwowym ssaków.

Metody pomiarów pojemności metodą patch-clamp w kaliksie

W niniejszym filmie przedstawiono procedurę izolacji nienaruszonych protoplastów z tkanek 14-dniowych siewek Arabidopsis. Biorąc pod uwagę, że wyizolowane protoplasty pozostają nienaruszone przez co najmniej 96h i są izolowane z siewek zamiast z miesięcznych, dojrzałych roślin, procedura ta przyspiesza analizy wymagające zastosowania nienaruszonych protoplastów.

Izolacja protoplastów z tkanek 14-dniowych siewek Arabidopsis thaliana

Izolacja dorosłych komórek macierzystych z miękkich tkanek układu mięśniowo-szkieletowego na podstawie szybkości przylegania komórek do kolby.

Izolowanie komórek macierzystych z miękkich tkanek mięśniowo-szkieletowych

Poznaj metody izolacji grzybów entomopatogenicznych z gleby przy użyciu przynęt owadzich Galleria mellonella i Tenebrio molitor. Technika ta wspiera rozwój biopestycydów i badania nad bioróżnorodnością grzybów.

Porównanie metod izolowania grzybów entomopatogenicznych z próbek gleby

Przeglądaj więcej filmów