Rejestrowanie prądu złącza szczelinowego z oocytów Xenopus
21 stycznia 2022
Tutaj prezentujemy protokół do wyrażania białek połączeniowych w oocytach Xenopus i rejestrowania prądu połączeniowego między dwoma przypisanymi oocytami za pomocą komercyjnego wzmacniacza zaprojektowanego do zapisów napięcia z dwoma oocytami w trybie pomiaru wysokiego prądu bocznego.
Heterologiczna ekspresja koneksyn i inneksyn w oocytach Xenopus jest skutecznym podejściem do analizy właściwości biofizycznych połączeń szczelinowych. Główną zaletą naszej techniki jest zastosowanie metody pomiaru prądu po stronie wysokiej, która jest odpowiednia dla podwójnych zacisków napięciowych. Procedura zostanie zademonstrowana przez Yuan Shui, doktora habilitowanego z mojego laboratorium.
Gdy tylko 70 do 80% oocytów zostanie zdefoliowanych, zdekantuj roztwór enzymu, delikatnie przechylając probówkę. Umyj oocyty pięć razy, napełniając probówkę roztworem ND96, a następnie dekantując roztwór. Po ostatnim płukaniu przenieś oocyty na 60-milimetrową szalkę Petriego zawierającą roztwór ND96.
Użyj czystej szklanej pipety Pasteura, aby pobrać i przenieść duże, zdrowo wyglądające oocyty na 60-milimetrową szalkę Petriego zawierającą roztwór ND96 uzupełniony pirogronianem sodu i streptomycyną penicyliny. Przygotuj naczynie do wstrzykiwania oocytów, przyklejając mały kawałek nylonowej siatki do dna 35-milimetrowej szalki Petriego. Napełnij naczynie do wstrzykiwań oocytów mniej więcej do połowy roztworem ND96 uzupełnionym pirogronianem i penicyliną streptomycyną.
Następnie umieść od 25 do 30 oocytów w rzędach wewnątrz szalki Petriego. Napełnij z powrotem mikropipetę iniekcyjną lekkim olejem mineralnym i włóż ją do uchwytu mikropipety wtryskiwacza. Przenieść cRNA z jednej z przechowywanych podwielokrotności na wewnętrzną powierzchnię pokrywy lub dna szalki Petriego za pomocą pipetowania.
Naciśnij przycisk napełniania w sterowniku wtryskiwacza, aby zassać kroplę cRNA do końcówki mikropipety. Następnie naciśnij przycisk wstrzykiwania, aby wstrzyknąć cRNA. Przenieść wstrzyknięte oocyty na nową szalkę Petriego zawierającą roztwór ND96 uzupełniony pirogronianem i penicyliną streptomycyną.
Przechowuj je w komorze środowiskowej w temperaturze od 15 do 18 stopni Celsjusza przez jeden do trzech dni. Roztwór należy wymieniać codziennie, przenosząc oocyty na nową szalkę Petriego. Użyj dwóch cienkich pęset, aby delikatnie odkleić przezroczystą błonę villin, która owija oocyt.
Następnie umieść dwa oocyty na studzienkę w komorze parowania oocytów zawierającej roztwór ND96. Podłącz sondę napięcia różnicowego i prądowe do ogniwa modelowego. Następnie podłącz czerwone i czarne gniazda do sondy napięcia różnicowego za pomocą dołączonej zworki i podłącz dowolną nogę zworki do dowolnego pinu w ogniwie modelu.
Podłącz przewód uziemiający w komórce modelu do z gniazda obwodu uziemiającego amplifier. Obróć pokrętła przesunięcia VM i przesunięcia VE, aby wyzerować mierniki napięcia membrany i prądu membranowego. Przełącz clamp z wyłączonego na szybki lub wolny i przekręć pokrętło wzmocnienia zgodnie z ruchem wskazówek zegara do poziomu, który pozwala na prawidłowe napięcie clamp do zerowania elektrody napięcia i elektrody kąpielowej mierników amplifier.
Uruchom prosty protokół akwizycji zawierający kilka kroków napięcia, aby potwierdzić, że napięcie wyświetlane w membranowym mierniku napięcia zmienia się zgodnie z protokołem akwizycji oraz że ślady napięcia i prądu są prawidłowo wyświetlane w Clampex. Umieścić szalkę Petriego zawierającą sparowane oocyty w pojemniku na szalkę Petriego na platformie rejestrującej. Wybierz parę oocytów i w razie potrzeby obróć szalkę Petriego, tak aby obie oocyty były w lewo i w prawo.
Zablokuj stolik w odpowiedniej pozycji za pomocą podstawy magnetycznej. Umieść elektrodę odniesienia w pobliżu krawędzi szalki Petriego w kierunku strony użytkownika. Następnie podłącz elektrodę odniesienia do czarnego gniazda tylko w jednej z dwóch sond napięcia różnicowego.
Weź parę szklanych mikropipet, odłam kawałek końcówki rysikiem diamentowym i wygładź krawędź końcówki przez polerowanie ogniowe. Trzymaj mikropipetę nad płomieniem palnika alkoholowego i zegnij ją pod gładkim kątem w odległości około jednego centymetra od końcówki. Ponownie napełnij szklaną pipetę roztworem ND96, a następnie włóż ją do wstępnie napełnionego uchwytu na mikroelektrodę.
Upewnij się, że w systemie nie ma pęcherzyków powietrza. Włóż dwumilimetrowy bolec uchwytu mikroelektrody do dwumilimetrowego gniazda przewodu połączeniowego elektrody różnicowego napięcia. Zacisnąć dwumilimetrowe gniazdo na zacisku magnetycznym i skierować końcówkę elektrody napięcia różnicowego w stronę jednego z dwóch oocytów.
Włóż jednomilimetrowy wtyk przewodu połączeniowego elektrody napięcia różnicowego do czerwonego gniazda sondy napięcia różnicowego po tej samej stronie. Przygotuj elektrody napięcia i prądu ze szklanych kapilar i napełnij je roztworem chlorku potasu. Następnie włóż elektrody do uchwytów elektrod dostarczonych ze wzmacniaczami.
Opuść elektrody do roztworu kąpieli i przekręć pokrętła przesunięcia VM i przesunięcia VE, aby wyzerować mierniki napięcia membrany i prądu membranowego. Sprawdź rezystancję elektrody, naciskając test elektrody VM i test elektrody VE. Włóż elektrody prądowe i napięciowe do oocytów i obserwuj ujemne potencjały błonowe.
Następnie w sekcji zaciskowej amplifier upewnij się, że wzmocnienie DC jest w pozycji in. Przekręć pokrętło wzmocnienia zgodnie z ruchem wskazówek zegara do poziomu, który pozwala na prawidłowe napięcie clamp i przekręć clamp przełącznik z wyłączonego na szybki. Na koniec uruchom protokół pozyskiwania.
Schemat eksperymentu z oocytami jest pokazany tutaj. Ujemne i dodatnie stopnie napięcia błony są przykładane do oocytu 1 z napięcia membrany podtrzymującej minus 30 miliwoltów, podczas gdy oocyt 2 jest utrzymywany przy stałym napięciu błony minus 30 miliwoltów. Napięcie transzłączowe lub Vj definiuje się jako napięcie błony oocytu 2 minus napięcie błony oocytu 1.
Reprezentatywne obrazy pokazują ślady Lj próbki i wynikową znormalizowaną zależność napięcia trans-złączowego przewodności połączeniowej homotypowych złączy szczelinowych UNC-9. Poniżej przedstawiono przykładowe ślady Lj i wynikającą z nich znormalizowaną zależność Gj-Vj homotypowych złączy szczelinowych UNC-7b. Wyniki pokazują, że te dwa typy Gj różnią się zależną od Vj szybkością inaktywacji Ij, zależnością Vj i ilością resztkowego Gj.Podczas próby wykonania procedury bardzo ważne jest, aby upewnić się, że system elektrod napięcia różnicowego nie ma żadnych pęcherzyków powietrza, a jego końcówka jest skierowana bardzo blisko oocytu, a elektrody napięcia i prądu mają rezystancję około jednego mikrooma.
Nasza technika jest łatwa do wdrożenia. Może to być szczególnie interesujące dla tych laboratoriów, które są od niedawna zainteresowane wykorzystaniem oocytów Xenopus do badania połączeń szczelinowych.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejsze badanie przedstawia protokół dotyczący heterologicznej ekspresji białek złącza szczelinowego (koneksyn i inneksyn) w komórkach jajowych ropuchy, koncentrując się na rejestrowaniu prądów złączeniowych między sparowanymi komórkami jajowymi. Głównym rezultatem jest pomyślne przedstawienie podejścia do pomiaru prądów bocznych przy użyciu dwukomórkowego systemu otoczenia napięciowego komórek jajowych.
Kluczowe elementy badania
Obszar badań
- Biologia złączy szczelinowych
- Elektrofizjologia
- Biologia molekularna
Tło
- Zrozumienie biofizycznych właściwości złączy szczelinowych jest kluczowe dla różnych procesów biologicznych.
- Komórki jajowe ropuchy są przydatnym modelem do badania tych właściwości.
- To badanie przyczynia się do metodologii efektywnego rejestrowania prądów złączeniowych.
Stosowane metody
- Protokół obejmuje odrywanie komórek jajowych z pęcherzyków, wstrzykiwanie cRNA i utrzymywanie zdrowia komórek jajowych.
- Jako system biologiczny używane są komórki jajowe Xenopus laevis.
- Kluczowymi technologiami w tym badaniu są dwukomórkowe techniki otoczenia napięciowego z użyciem komercyjnego wzmacniacza.
Główne wyniki
- Metodologia z powodzeniem mierzy przewodność złączeniową i stosunki napięciowe transzłączeniowe.
- Zadokumentowano różne zachowania homotypowych złączy szczelinowych poprzez wskaźniki inaktywacji Ij i zależności Vj.
- Wyniki dostarczają istotnych informacji na temat funkcjonalnej dynamiki złączy szczelinowych.
Wnioski
- To badanie przedstawia solidne podejście do badania właściwości złączy szczelinowych w kontrolowanym środowisku.
- Wyniki mają zastosowanie do zrozumienia komunikacji komórkowej i szlaków sygnałowych w badaniach biologicznych.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
Reliable measurement of gap junction currents in Xenopus oocytes enables mechanistic de-risking and target validation for ion channel and cell-cell communication research. The dual voltage-clamp platform with high-side current measurement supports quantitative, reproducible assessment of junctional conductance, informing early-stage discovery and screening. This capability is critical for portfolio teams evaluating novel modulators of intercellular signaling pathways.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables direct interrogation of gap junction protein function in a controlled system.
- Supports mechanistic de-risking by quantifying junctional current and conductance changes.
- Facilitates functional target validation for connexins and innexins relevant to disease models.
Screening & Assay Development
- Provides a validated electrophysiological platform for compound screening against gap junction activity.
- Delivers quantitative, reproducible readouts of junctional current for assay standardization.
- Enables scalability and platform reuse for diverse gap junction protein subtypes.
Translational & Preclinical Research
- Aligns with disease-relevant systems where gap junction modulation is implicated.
- Supports continuity from discovery through preclinical validation of intercellular communication targets.
- Reduces translational risk by providing predictive functional data on candidate modulators.
Pipeline & Workflow Integration
This dual oocyte voltage-clamp method integrates into the discovery continuum from early mechanistic studies to lead identification and preclinical evaluation of gap junction modulators.
- Discovery Biology: Enables hypothesis testing and pathway clarification for gap junction-mediated signaling.
- Screening: Provides assay readiness and reproducibility for compound evaluation.
- Analytics: Generates quantitative measurements of junctional current and conductance for comparative analysis.
- Translational Research: Supports biomarker alignment and preclinical continuity for cell-cell communication targets.
- Enterprise Reuse: Offers a robust, reusable platform for ongoing gap junction research across programs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in gap junction research.
- Operational Value: Standardizes and streamlines electrophysiological workflows for reproducibility and scalability.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions and capital efficiency by providing robust functional data.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of gap junction targets and modulators.
Implementation Considerations
- Requires expertise in electrophysiology and oocyte handling.
- Needs specialized amplifiers, magnetically-based platforms, and low-leakage electrodes.
- Demands rigorous cross-team standardization of electrode preparation and placement.
- Adaptation may be needed for different gap junction protein subtypes or model systems.
- Careful attention to air bubble elimination and electrode resistance is critical for data quality.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:04
Introduction
0:42
Preparation of Defolliculated Oocytes
1:27
GJ Protein Expression
3:03
Testing the Acquisition System with the Model Cell Supplied with the Amplifier
4:09
Set Up the Recording Stage and the Reference Electrode
4:48
Set Up the VDIFF Electrodes
5:51
Set Up the Current, Voltage Electrodes, Data Acquisition
6:57
Results: Representative Recording Traces
8:05
Conclusion
