Name: Rejestrowanie prądu złącza szczelinowego z oocytów Xenopus (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-01-21T14:15:00.000+00:00
Duration: 9 min 4 s
Description: Naucz się rejestrować prądy złącza szczelinowego w oocytach Xenopus laevis przy użyciu dwustronnego klamrowania napięciowego. Ta metoda pozwala badać właściwości biofizyczne koneksyn i inneksyn.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy Haiying Zhan, Qian Ge za ich zaangażowanie w początkowy etap rozwoju technicznego, Kiranmayi Vedantham za pomoc przy tworzeniu figur, oraz dr Camillo Peracchia za porady dotyczące komory parowania oocytów.

<ol><li>Oshima, A., Matsuzawa, T., Murata, K., Tani, K., Fujiyoshi, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hexadecameric+structure+of+an+invertebrate+gap+junction+channel%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Hexadecameric structure of an invertebrate gap junction channel.</a> Journal of Molecular Biology. 428 (6), 1227-1236 (2016).</li>
<li>Maeda, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+of+the+connexin+26+gap+junction+channel+at+3.5+A+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Structure of the connexin 26 gap junction channel at 3.5 A resolution.</a> Nature. 458 (7238), 597-602 (2009).</li>
<li>Flores, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Connexin-46%2F50+in+a+dynamic+lipid+environment+resolved+by+CryoEM+at+1.9+A%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Connexin-46/50 in a dynamic lipid environment resolved by CryoEM at 1.9 A.</a> Nature Communications. 11 (1), 4331(2020).</li>
<li>Sohl, G., Willecke, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gap+junctions+and+the+connexin+protein+family%5BTitle%5D)+AND+%22Cardiovascular+Research%22%5BJournal%5D)">Gap junctions and the connexin protein family.</a> Cardiovascular Research. 62 (2), 228-232 (2004).</li>
<li>Starich, T., Sheehan, M., Jadrich, J., Shaw, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Innexins+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Communication+%26+Adhesion%22%5BJournal%5D)">Innexins in C. elegans.</a> Cell Communication & Adhesion. 8 (4-6), 311-314 (2001).</li>
<li>Phelan, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Innexins%3A+members+of+an+evolutionarily+conserved+family+of+gap-junction+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta%22%5BJournal%5D)">Innexins: members of an evolutionarily conserved family of gap-junction proteins.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1711 (2), 225-245 (2005).</li>
<li>Shui, Y., Liu, P., Zhan, H., Chen, B., Wang, Z. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+basis+of+junctional+current+rectification+at+an+electrical+synapse%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Advances%22%5BJournal%5D)">Molecular basis of junctional current rectification at an electrical synapse.</a> Science Advances. 6 (27), (2020).</li>
<li>Starich, T. A., Xu, J., Skerrett, I. M., Nicholson, B. J., Shaw, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interactions+between+innexins+UNC-7+and+UNC-9+mediate+electrical+synapse+specificity+in+the+Caenorhabditis+elegans+locomotory+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Neural+Development%22%5BJournal%5D)">Interactions between innexins UNC-7 and UNC-9 mediate electrical synapse specificity in the Caenorhabditis elegans locomotory nervous system.</a> Neural Development. 4, 16(2009).</li>
<li>Chen, B., Liu, Q., Ge, Q., Xie, J., Wang, Z. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((UNC-1+regulates+gap+junctions+important+to+locomotion+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%22%5BJournal%5D)">UNC-1 regulates gap junctions important to locomotion in C. elegans.</a> Current Biology. 17 (15), 1334-1339 (2007).</li>
<li>Jang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dissection+of+neuronal+gap+junction+circuits+that+regulate+social+behavior+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Dissection of neuronal gap junction circuits that regulate social behavior in Caenorhabditis elegans.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (7), 1263-1272 (2017).</li>
<li>Ebihara, L., Beyer, E. C., Swenson, K. I., Paul, D. L., Goodenough, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cloning+and+expression+of+a+Xenopus+embryonic+gap+junction+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Cloning and expression of a Xenopus embryonic gap junction protein.</a> Science. 243 (4895), 1194-1195 (1989).</li>
<li>Barrio, L. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gap+junctions+formed+by+connexins+26+and+32+alone+and+in+combination+are+differently+affected+by+applied+voltage%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Gap junctions formed by connexins 26 and 32 alone and in combination are differently affected by applied voltage.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 88 (19), 8410-8414 (1991).</li>
<li>Spray, D. C., Harris, A. L., Bennett, M. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Voltage+dependence+of+junctional+conductance+in+early+amphibian+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Voltage dependence of junctional conductance in early amphibian embryos.</a> Science. 204 (4391), 432-434 (1979).</li>
<li>Spray, D. C., Harris, A. L., Bennett, M. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Equilibrium+properties+of+a+voltage-dependent+junctional+conductance%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+General+Physiology%22%5BJournal%5D)">Equilibrium properties of a voltage-dependent junctional conductance.</a> The Journal of General Physiology. 77 (1), 77-93 (1981).</li>
<li>Qu, Y., Dahl, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Function+of+the+voltage+gate+of+gap+junction+channels%3A+selective+exclusion+of+molecules%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Function of the voltage gate of gap junction channels: selective exclusion of molecules.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (2), 697-702 (2002).</li>
<li>Swenson, K. I., Jordan, J. R., Beyer, E. C., Paul, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Formation+of+gap+junctions+by+expression+of+connexins+in+Xenopus+oocyte+pairs%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Formation of gap junctions by expression of connexins in Xenopus oocyte pairs.</a> Cell. 57 (1), 145-155 (1989).</li>
<li>Tong, J. J., Liu, X., Dong, L., Ebihara, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exchange+of+gating+properties+between+rat+cx46+and+chicken+cx45.6%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Exchange of gating properties between rat cx46 and chicken cx45.6.</a> Biophysical Journal. 87 (4), 2397-2406 (2004).</li>
<li>Landesman, Y., White, T. W., Starich, T. A., Shaw, J. E., Goodenough, D. A., Paul, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Innexin-3+forms+connexin-like+intercellular+channels%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Science%22%5BJournal%5D)">Innexin-3 forms connexin-like intercellular channels.</a> Journal of Cell Science. 112, 2391-2396 (1999).</li>
<li>Skerrett, I. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Applying+the+Xenopus+oocyte+expression+system+to+the+analysis+of+gap+junction+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Applying the Xenopus oocyte expression system to the analysis of gap junction proteins.</a> Methods in Molecular Biology. 154, 225-249 (2001).</li>
<li>Nielsen, P. A., Beahm, D. L., Giepmans, B. N., Baruch, A., Hall, J. E., Kumar, N. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+cloning%2C+functional+expression%2C+and+tissue+distribution+of+a+novel+human+gap+junction-forming+protein%2C+connexin-31.9.+Interaction+with+zona+occludens+protein-1%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Molecular cloning, functional expression, and tissue distribution of a novel human gap junction-forming protein, connexin-31.9. Interaction with zona occludens protein-1.</a> Journal of Biological Chemistry. 277 (41), 38272-38283 (2002).</li>
<li>Kotsias, B. A., Salim, M., Peracchia, L. L., Peracchia, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interplay+between+cystic+fibrosis+transmembrane+regulator+and+gap+junction+channels+made+of+connexins+45%2C+40%2C+32+and+50+expressed+in+oocytes%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Membrane+Biology%22%5BJournal%5D)">Interplay between cystic fibrosis transmembrane regulator and gap junction channels made of connexins 45, 40, 32 and 50 expressed in oocytes.</a> The Journal of Membrane Biology. 214 (1), 1-8 (2006).</li>
<li>Peracchia, C., Peracchia, L. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inversion+of+both+gating+polarity+and+CO2+sensitivity+of+voltage+gating+with+D3N+mutation+of+Cx50%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Inversion of both gating polarity and CO2 sensitivity of voltage gating with D3N mutation of Cx50.</a> American Journal of Physiology. 288 (6), 1381-1389 (2005).</li>
<li>del Corsso, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transfection+of+mammalian+cells+with+connexins+and+measurement+of+voltage+sensitivity+of+their+gap+junctions%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Transfection of mammalian cells with connexins and measurement of voltage sensitivity of their gap junctions.</a> Nature Protocols. 1 (4), 1799-1809 (2006).</li>
<li>Peracchia, C., Wang, X. G., Peracchia, L. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemical+gating+of+gap+junction+channels%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Chemical gating of gap junction channels.</a> Methods. 20 (2), 188-195 (2000).</li>
<li>Levine, E., Werner, R., Neuhaus, I., Dahl, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Asymmetry+of+gap+junction+formation+along+the+animal-vegetal+axis+of+Xenopus+oocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Asymmetry of gap junction formation along the animal-vegetal axis of Xenopus oocytes.</a> Developmental Biology. 156 (2), 490-499 (1993).</li>
</ol>

Autorzy nie pozostają w konflikcie interesów.

Optymalizacja systemu wydaje się być konieczna w przypadku eksperymentów z podwójnym zaciskiem napięcia oocytów. Bez niego nagrania mogą być bardzo niestabilne, a wzmacniacze mogą być zmuszone do wstrzyknięcia nadmiernej ilości prądu, aby dotrzeć do docelowej Vm, co skutkuje uszkodzeniem oocytów i awariami nagrywania. Kilka czynników ma kluczowe znaczenie dla uzyskania stabilnych zapisów podwójnych oocytów za pomocą metody pomiaru prądu po stronie wysokiej. Po pierwsze, elektrody prądowe i napięciowe muszą mieć ...

GJ to kanały międzykomórkowe, które mogą umożliwiać przepływ prądu i wymianę małych cząsteczek cytozolowych między sąsiednimi komórkami. Występują w wielu typach komórek i pełnią różne funkcje fizjologiczne. GJ u kręgowców są tworzone przez koneksyny, podczas gdy te u bezkręgowców są tworzone przez inneksyny. Każdy GJ składa się z dwóch zestawionych ze sobą półkanałów z 6 lub 8 podjednostkami na półkanał, w zależności od tego, czy są to koneksyny, czy innexins1,2,3. Ludzie mają 21 genów koneksyny4, podczas gdy powszechnie używane modele bezkręgowców C. elegans i Drosophila melanogaster mają odpowiednio 25 i 8 genów inneksyny5,6. Alternatywny splicing transkryptów genów może jeszcze bardziej zwiększyć różnorodność białek GJ, przynajmniej dla innexins7,8.
GJ można podzielić na trzy kategorie w zależności od składu molekularnego: homotypowe, heterotypowe i heteromeryczne. Homotypowy GJ ma wszystkie swoje podjednostki identyczne. Heterotypowy GJ ma dwie półkanały homomeryczne, ale te dwie półkanały są utworzone przez dwa różne białka GJ. Heteromeryczny GJ zawiera co najmniej jeden heteromeryczny półkanał. Różnorodność molekularna GJ może nadawać odrębne właściwości biofizyczne, które są ważne dla ich funkcji fizjologicznych. Właściwości biofizyczne GJ są również modulowane przez białka regulatorowe9. Aby zrozumieć, w jaki sposób GJ pełnią swoje funkcje fizjologiczne, ważne jest, aby znać ich skład molekularny, właściwości biofizyczne i rolę białek regulatorowych w ich funkcjach.
Heterologiczne systemy ekspresji są często używane do badania biofizycznych właściwości kanałów jonowych, w tym GJ, oraz wpływu białek regulatorowych na nie. Ponieważ heterologiczne systemy ekspresji umożliwiają ekspresję określonych białek, są one na ogół bardziej podatne na analizowanie funkcji białek niż tkanki natywne, w których białka o nadmiarowych funkcjach mogą komplikować analizę, a rejestracja Ij może być nieosiągalna. Niestety, większość powszechnie stosowanych linii komórkowych, z wyjątkiem komórki Neuro-2A, jest nieodpowiednia do badania właściwości biofizycznych GJ z powodu powikłań związanych z endogennymi połączeniami. Nawet komórki Neuro-2A nie zawsze nadają się do tego rodzaju analizy. Na przykład, nie mogliśmy wykryć żadnego Ij w komórkach Neuro-2A transfekowanych inneksynami UNC-7 i UNC-9 ani pod nieobecność, ani w obecności UNC-1 (nieopublikowane), co jest wymagane do funkcji UNC-9 GJ w C. elegans9,10. Z drugiej strony, oocyty Xenopus są użytecznym alternatywnym systemem do analiz elektrofizjologicznych GJ. Chociaż wyrażają endogenne białko GJ, koneksynę 38 (Cx38)11, potencjalnych powikłań można łatwo uniknąć, wstrzykując specyficzny oligonukleotyd antysensowny12. Jednak analizy GJ z oocytami Xenopus wymagają zacisku różnicowego napięcia dwóch zestawionych komórek, co jest wyzwaniem technicznym. Najwcześniejsze sukcesy dwunapięciowego zacisku blastomerów żaba zostały odnotowane około 40 lat temu13,14. Od tego czasu w wielu badaniach wykorzystano tę technikę do rejestrowania Ij w sparowanych oocytach Xenopus. Jednak zasadniczo wszystkie poprzednie badania zostały przeprowadzone na domowych wzmacniaczach12,15,16 lub komercyjnych wzmacniaczach przeznaczonych do nagrań na pojedynczych oocytach (GeneClamp 500, AxoClamp 2A lub AxoClamp 2B, Axon Instruments, Union City, CA)8,17,18,19,20. Ponieważ nawet komercyjne wzmacniacze nie dostarczają instrukcji dotyczących podwójnego zacisku napięcia oocytów, wdrożenie tej techniki jest często wyzwaniem dla nowych lub mniej wyrafinowanych laboratoriów elektrofizjologicznych.
Tylko jeden komercyjny wzmacniacz został opracowany dla podwójnej objętości napięcia oocytów, OC-725C od Warner Instruments (Tabela materiałów, <silna klasa="xfig">Rysunek 1A). Wzmacniacz ten może być używany zarówno w trybie standardowym (dla pojedynczych oocytów), jak i w trybie pomiaru prądu po stronie wysokiej (dla pojedynczych lub podwójnych oocytów), w zależności od tego, czy podłączone są dwa gniazda w sondzie napięcia (<silna klasa = "xfig">Rysunek 1B, C). Jednak aż do naszego ostatniego badania7, nie było ani jednej publikacji opisującej zastosowanie tego wzmacniacza w trybie pomiaru prądu po stronie wysokiej. Chociaż wzmacniacz był używany przez inne laboratorium do zapisów podwójnych oocytów, był używany w trybie standardowym, a nie w trybie high side21,22. Ten brak raportów z wykorzystaniem wzmacniacza w trybie pomiaru prądu po stronie wysokiej może wynikać z problemów technicznych. Nie byliśmy w stanie uzyskać stabilnych zapisów podwójnych oocytów w trybie high side, postępując zgodnie z instrukcjami producenta. Na przestrzeni lat wypróbowaliśmy trzy różne podejścia do zapisów z dwoma oocytami, w tym użycie dwóch wzmacniaczy OC-725C w trybie pomiaru prądu po stronie wysokiej, dwóch wzmacniaczy OC-725C w trybie standardowym oraz dwóch wzmacniaczy innego producenta. Ostatecznie udało nam się uzyskać stabilne nagrania tylko za pierwszym podejściem, po wielu próbach i błędach. Niniejsza publikacja opisuje i demonstruje stosowane przez nas procedury ekspresji białek GJ w oocytach Xenopus, rejestrowania Ij w trybie pomiaru prądu po stronie wysokiej oraz analizy danych elektrofizjologicznych za pomocą popularnego oprogramowania komercyjnego. Dodatkowe informacje na temat techniki podwójnej objętości napięciowej można znaleźć w innych publikacjach19,23.

<table><tbody><tr><td>Uchwyt magnetyczny Agar Bridge</td><td>ALA Scientific Instruments</td><td>MPSALT-H</td><td>Bardziej stabilny niż zacisk rurki Narishige ze względu na większą podstawę magnetyczną, ale wymaga modyfikacji w celu dostosowania do gniazda żeńskiego 2 mm.</td></tr><tr><td>Auto Nanolitr Injector</td><td>Drummond Scientific Company, Broomall, PA, USA</td><td>Nanoject II</td><td>Automatyczny wstrzykiwacz nanolitrów</td></tr><tr><td>Kolagenaza, typ II</td><td>Gibco-USA, Langley, OK, USA</td><td>17101-015</td><td></td></tr><tr><td>Diamond Scriber</td><td>Electron Microscopy Sciences, Hatfield, PA, USA</td><td>62108-ST</td><td></td></tr><tr><td>Sonda różnicowa napięcia</td><td>Warner Instruments, Hamden, CT, USA</td><td>7255DI</td><td></td></tr><tr><td>Przetwornik sygnału analogowo-cyfrowego</td><td>Urządzenia molekularne, San Jose, CA, USA</td><td>Pęseta Digidata 1440A</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #5</td><td>World Precision Instruments, Sarasota, FL, USA</td><td>500341</td><td></td></tr><tr><td>Szklane kapilary</td><td>Drummond Scientific Company, Broomall, PA, USA</td><td>3-000-203-G/X</td><td></td></tr><tr><td>Przecinak do gorącego drutu</td><td>Amazon.com</td><td>Proxxon 37080</td><td>Alternatywą jest Hercules 8500 CWUT, który posiada pedał nożny.</td></tr><tr><td>Hialuronidaza, typ I-S</td><td>MilliporeSigma, Burlington, MA, USA</td><td>H3506</td><td></td></tr><tr><td>Magnetyczna podstawa uchwytu</td><td>Kanetec USA Corp., Bensenville, IL, USA</td><td>MB-L-45</td><td></td></tr><tr><td>Mikroelektroda Beveler</td><td>Sutter Instrument, Novato, CA, USA</td><td>BV-10</td><td></td></tr><tr><td>Uchwyt mikroelektrody</td><td>World Precision Instruments, , Sarasota, FL, USA</td><td>MEH1S15</td><td></td></tr><tr><td>Ściągacz do mikropipet</td><td>Sutter Instrument, , Novato, Kalifornia, USA</td><td>P-97</td><td></td></tr><tr><td>mMESSAGE mMACHINETM T3</td><td>Invitrogen-FisherScientific</td><td>AM1348</td><td></td></tr><tr><td>Nunc MicroWell MiniTray</td><td>Nalge Nunc International, Rochester, NY, USA</td><td>438733</td><td>Microwell Minitray</td></tr><tr><td>Nylon Mesh</td><td>Component Supply Company, Sparta, TN, USA</td><td>U-CMN-1000</td><td></td></tr><tr><td>Wzmacniacz cęgowy oocytów</td><td>Warner Instrumenty, , Hamden, CT, USA</td><td>OC-725C</td><td></td></tr><tr><td>OriginPro</td><td>OriginLab Corporation, Northampton, MA, USA</td><td>2020b</td><td></td></tr><tr><td>pClamp</td><td>Molecular Devices, , San Jose, CA, USA</td><td>Wersja 10</td><td></td></tr><tr><td>Elektroda referencyjna</td><td>World Precision Instruments, Sarasota, FL, USA</td><td>DRIREF-2SH</td><td>Dane techniczne: https://www.wpiinc.com/blog/post/compare-dri-ref-reference-electrodes</td></tr><tr><td>RNaseOUT (inhibitor rybonukleazy)</td><td>Invitrogen-FisherScientific</td><td>10777-019</td><td></td></tr><tr><td>Jedwabny szew 5-0</td><td>Covidien, North Haven, CT, USA</td> Spektrofotometr <td>VS890</td><td></td></tr><tr><td>NanoDrop Lite</td><td>Thermo Scientific</td><td>ND-LITE-PR</td><td></td></tr><tr><td>Cienkościenne szklane kapiszony</td> World <td>Precision Instruments, Sarasota, FL, USA</td><td>Zacisk</td> do rur TW150F-4 <td></td></tr><tr><td></td><td>Narishige International USA, Amityville, NY, USA</td><td>CAT-1</td><td>Gotowy do użycia, ale jego pozycja jest podatna na zmiany ze względu na małą podstawę magnetyczną.</td></tr><tr><td>Xenopus laevis</td><td>Xenopus Express, Brooksville, Floryda, Stany Zjednoczone</td><td>IMP-XL-FM</td><td></td></tr></tbody></table>

rejestrowanie prądu złącza szczelinowego z oocytów xenopus

Recording Gap Junction Current from Xenopus Oocytes

Heterologiczna ekspresja koneksyn i inneksyn w oocytach Xenopus to potężne podejście do badania biofizycznych właściwości połączeń szczelinowych (GJ). Jednak takie podejście jest technicznie trudne, ponieważ wymaga zacisku różnicowego napięcia dwóch przeciwstawnych oocytów mających wspólną masę. Chociaż niewielkiej liczbie laboratoriów udało się wykonać tę technikę, zasadniczo wszystkie z nich używały albo wzmacniaczy domowej roboty, albo wzmacniaczy komercyjnych, które zostały zaprojektowane do nagrań z pojedynczymi oocytami. Wdrożenie tej techniki jest często wyzwaniem dla innych laboratoriów. Chociaż tryb pomiaru prądu po stronie wysokiej został włączony do komercyjnego wzmacniacza do zapisów z podwójnym cęgowaniem napięcia oocytów, nie było raportu na temat jego zastosowania aż do naszego ostatniego badania. Sprawiliśmy, że podejście do pomiaru prądu po stronie wysokiej jest bardziej praktyczne i wygodne, wprowadzając kilka modyfikacji technicznych, w tym budowę magnetycznej platformy rejestrującej, która umożliwia precyzyjne umieszczanie oocytów i różnych elektrod, zastosowanie roztworu kąpieli jako przewodnika w elektrodach różnicowych napięć, przyjęcie komercyjnej elektrody KCl o niskim wycieku jako elektrody odniesienia, Wytwarzanie elektrod prądowych i napięciowych z cienkościennych kapilar szklanych oraz pozycjonowanie wszystkich elektrod za pomocą urządzeń magnetycznych. Opisana tutaj metoda pozwala na wygodne i solidne zapisy prądu połączeniowego (Ij) między dwoma przeciwstawnymi oocytami Xenopus.

UNC-7 i UNC-9 to inneksyny z C. elegansPodczas gdy UNC-9 posiada tylko jedną izoformę, UNC-7 występuje w wielu izoformach, które różnią się głównie długością i sekwencją aminokwasową swoich końców aminowych.7,8Ineksyny te mogą tworzyć szczelne połączenia (GJ) homotypowe, jak i heterotypowe (z UNC-7 i UNC-9), gdy są ekspresowane w Xenopus oocyty7,8Reprezentatywny Ij śl...

Tutaj prezentujemy protokół do wyrażania białek połączeniowych w oocytach Xenopus i rejestrowania prądu połączeniowego między dwoma przypisanymi oocytami za pomocą komercyjnego wzmacniacza zaprojektowanego do zapisów napięcia z dwoma oocytami w trybie pomiaru wysokiego prądu bocznego.

Rejestrowanie prądu złącza szczelinowego z oocytów Xenopus

Heterologous expression of connexins and innexins in Xenopus oocytes is a powerful approach for studying the biophysical properties of gap junctions ...

Heterologiczna ekspresja koneksyn i inneksyn w oocytach Xenopus jest skutecznym podejściem do analizy właściwości biofizycznych połączeń szczelinowych. Główną zaletą naszej techniki jest zastosowanie metody pomiaru prądu po stronie wysokiej, która jest odpowiednia dla podwójnych zacisków napięciowych. Procedura zostanie zademonstrowana przez Yuan Shui, doktora habilitowanego z mojego laboratorium.Gdy tylko 70 do 80% oocytów zostanie zdefoliowanych, zdekantuj roztwór enzymu, delikatnie przechylając probówkę. Umyj oocyty pięć razy, napełniając probówkę roztworem ND96, a następnie dekantując roztwór. Po ostatnim płukaniu przenieś oocyty na 60-milimetrową szalkę Petriego zawierającą roztwór ND96.Użyj czystej szklanej pipety Pasteura, aby pobrać i przenieść duże, zdrowo wyglądające oocyty na 60-milimetrową szalkę Petriego zawierającą roztwór ND96 uzupełniony pirogronianem sodu i streptomycyną penicyliny. Przygotuj naczynie do wstrzykiwania oocytów, przyklejając mały kawałek nylonowej siatki do dna 35-milimetrowej szalki Petriego. Napełnij naczynie do wstrzykiwań oocytów mniej więcej do połowy roztworem ND96 uzupełnionym pirogronianem i penicyliną streptomycyną.Następnie umieść od 25 do 30 oocytów w rzędach wewnątrz szalki Petriego. Napełnij z powrotem mikropipetę iniekcyjną lekkim olejem mineralnym i włóż ją do uchwytu mikropipety wtryskiwacza. Przenieść cRNA z jednej z przechowywanych podwielokrotności na wewnętrzną powierzchnię pokrywy lub dna szalki Petriego za pomocą pipetowania.Naciśnij przycisk napełniania w sterowniku wtryskiwacza, aby zassać kroplę cRNA do końcówki mikropipety. Następnie naciśnij przycisk wstrzykiwania, aby wstrzyknąć cRNA. Przenieść wstrzyknięte oocyty na nową szalkę Petriego zawierającą roztwór ND96 uzupełniony pirogronianem i penicyliną streptomycyną.Przechowuj je w komorze środowiskowej w temperaturze od 15 do 18 stopni Celsjusza przez jeden do trzech dni. Roztwór należy wymieniać codziennie, przenosząc oocyty na nową szalkę Petriego. Użyj dwóch cienkich pęset, aby delikatnie odkleić przezroczystą błonę villin, która owija oocyt.Następnie umieść dwa oocyty na studzienkę w komorze parowania oocytów zawierającej roztwór ND96. Podłącz sondę napięcia różnicowego i prądowe do ogniwa modelowego. Następnie podłącz czerwone i czarne gniazda do sondy napięcia różnicowego za pomocą dołączonej zworki i podłącz dowolną nogę zworki do dowolnego pinu w ogniwie modelu.Podłącz przewód uziemiający w komórce modelu do z gniazda obwodu uziemiającego amplifier. Obróć pokrętła przesunięcia VM i przesunięcia VE, aby wyzerować mierniki napięcia membrany i prądu membranowego. Przełącz clamp z wyłączonego na szybki lub wolny i przekręć pokrętło wzmocnienia zgodnie z ruchem wskazówek zegara do poziomu, który pozwala na prawidłowe napięcie clamp do zerowania elektrody napięcia i elektrody kąpielowej mierników amplifier.Uruchom prosty protokół akwizycji zawierający kilka kroków napięcia, aby potwierdzić, że napięcie wyświetlane w membranowym mierniku napięcia zmienia się zgodnie z protokołem akwizycji oraz że ślady napięcia i prądu są prawidłowo wyświetlane w Clampex. Umieścić szalkę Petriego zawierającą sparowane oocyty w pojemniku na szalkę Petriego na platformie rejestrującej. Wybierz parę oocytów i w razie potrzeby obróć szalkę Petriego, tak aby obie oocyty były w lewo i w prawo.Zablokuj stolik w odpowiedniej pozycji za pomocą podstawy magnetycznej. Umieść elektrodę odniesienia w pobliżu krawędzi szalki Petriego w kierunku strony użytkownika. Następnie podłącz elektrodę odniesienia do czarnego gniazda tylko w jednej z dwóch sond napięcia różnicowego.Weź parę szklanych mikropipet, odłam kawałek końcówki rysikiem diamentowym i wygładź krawędź końcówki przez polerowanie ogniowe. Trzymaj mikropipetę nad płomieniem palnika alkoholowego i zegnij ją pod gładkim kątem w odległości około jednego centymetra od końcówki. Ponownie napełnij szklaną pipetę roztworem ND96, a następnie włóż ją do wstępnie napełnionego uchwytu na mikroelektrodę.Upewnij się, że w systemie nie ma pęcherzyków powietrza. Włóż dwumilimetrowy bolec uchwytu mikroelektrody do dwumilimetrowego gniazda przewodu połączeniowego elektrody różnicowego napięcia. Zacisnąć dwumilimetrowe gniazdo na zacisku magnetycznym i skierować końcówkę elektrody napięcia różnicowego w stronę jednego z dwóch oocytów.Włóż jednomilimetrowy wtyk przewodu połączeniowego elektrody napięcia różnicowego do czerwonego gniazda sondy napięcia różnicowego po tej samej stronie. Przygotuj elektrody napięcia i prądu ze szklanych kapilar i napełnij je roztworem chlorku potasu. Następnie włóż elektrody do uchwytów elektrod dostarczonych ze wzmacniaczami.Opuść elektrody do roztworu kąpieli i przekręć pokrętła przesunięcia VM i przesunięcia VE, aby wyzerować mierniki napięcia membrany i prądu membranowego. Sprawdź rezystancję elektrody, naciskając test elektrody VM i test elektrody VE. Włóż elektrody prądowe i napięciowe do oocytów i obserwuj ujemne potencjały błonowe.Następnie w sekcji zaciskowej amplifier upewnij się, że wzmocnienie DC jest w pozycji in. Przekręć pokrętło wzmocnienia zgodnie z ruchem wskazówek zegara do poziomu, który pozwala na prawidłowe napięcie clamp i przekręć clamp przełącznik z wyłączonego na szybki. Na koniec uruchom protokół pozyskiwania.Schemat eksperymentu z oocytami jest pokazany tutaj. Ujemne i dodatnie stopnie napięcia błony są przykładane do oocytu 1 z napięcia membrany podtrzymującej minus 30 miliwoltów, podczas gdy oocyt 2 jest utrzymywany przy stałym napięciu błony minus 30 miliwoltów. Napięcie transzłączowe lub Vj definiuje się jako napięcie błony oocytu 2 minus napięcie błony oocytu 1.Reprezentatywne obrazy pokazują ślady Lj próbki i wynikową znormalizowaną zależność napięcia trans-złączowego przewodności połączeniowej homotypowych złączy szczelinowych UNC-9. Poniżej przedstawiono przykładowe ślady Lj i wynikającą z nich znormalizowaną zależność Gj-Vj homotypowych złączy szczelinowych UNC-7b. Wyniki pokazują, że te dwa typy Gj różnią się zależną od Vj szybkością inaktywacji Ij, zależnością Vj i ilością resztkowego Gj.Podczas próby wykonania procedury bardzo ważne jest, aby upewnić się, że system elektrod napięcia różnicowego nie ma żadnych pęcherzyków powietrza, a jego końcówka jest skierowana bardzo blisko oocytu, a elektrody napięcia i prądu mają rezystancję około jednego mikrooma.Nasza technika jest łatwa do wdrożenia. Może to być szczególnie interesujące dla tych laboratoriów, które są od niedawna zainteresowane wykorzystaniem oocytów Xenopus do badania połączeń szczelinowych.

recording-gap-junction-current-from-xenopus-oocytes

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Niniejszy materiał stanowi wprowadzenie do rejestracji metodą patch clamp z oocytów Xenopus laevis. Obejmuje on usuwanie błony witelinowej, tworzenie uszczelnienia gigaomowego (gigaseal) oraz opcjonalną konwersję patcha do topologii outside-out.

Rejestracja metodą patch clamp kanałów jonowych ekspresowanych w oocytach Xenopus

Rejestracje elektrofizjologiczne z embrionów Drosophila umożliwiają analizę właściwości elektrycznych rozwijających się mięśni i neuronów, a także charakterystykę funkcjonalnej synaptogenezy w glutaminergicznych złączach neuromięśniowych oraz w centralnych synapsach cholinergicznych i GABAergicznych.

Rejestracja elektrofizjologiczna w zarodku Drosophila

Prąd jonowy kanałów BK rejestruje się przy użyciu technik patch clamp. Kanały BK są eksprymowane w oocytach Xenopus poprzez wstrzykiwanie mRNA. Roztwór wewnątrzkomórkowy podczas pomiarów patch clamp jest kontrolowany przez system perfuzyjny.

Techniki patch clamp i perfuzji do badania kanałów jonowych ekspresowanych w oocytach Xenopus

Ten film demonstruje technikę rejestrowania prądów synaptycznych z synaptycznego połączenia nerwowo-mięśniowego larwy Drosophila. Technika ta umożliwia monitorowanie aktywności pojedynczego bulionu synaptycznego, co jest ważne dla badania zmutowanych linii much o zwiększonej spontanicznej lub asynchronicznej aktywności synaptycznej.

Rejestrowanie prądów synaptycznych w połączeniu nerwowo-mięśniowym larw Drosophila

Ten film demonstruje procedury używane do hodowli pierwotnych kultur embrionalnych komórek nerwowych i mięśniowych Xenopus oraz przydatność tego preparatu do jednoczesnego wykonywania nagrań pre- i post-synaptycznych klamerów.

Jednoczesny pre- i postsynaptyczny zapis elektrofizjologiczny z kokultur nerwowo-mięśniowych Xenopus

Opracowaliśmy nienaruszony preparat mózgowo-rdzeniowy do rejestrowania i monitorowania aktywności elektrycznej za pomocą zapisu za pomocą zacisku punktowego z neuronów Mauthnera i innych komórek siateczkowo-rdzeniowych w zarodkach danio pręgowanego. W ten sposób jesteśmy w stanie rejestrować pobudzające i hamujące prądy synaptyczne, aktywność kanałów bramkowanych napięciem oraz potencjały czynnościowe z kluczowych neuronów w rozwijającym się zarodku.

Nagrania patch clamp z embrionalnych komórek Mauthnera danio pręgowanego

Aby uzupełnić powszechnie stosowane metody badania TRPV4, opisano dwie metody: Jego mechanowrażliwość może być badana za pomocą luminometrii Ca2+-aequorin w transgenicznych drożdżach po prowokacji hypo-osmotycznej.  Można go również badać w oocytach Xenopus z wstrzyknięciem TRPV4-RNA za pomocą dwuelektrodowego zacisku napięciowego całej komórki lub zacisku krosowego w trybie on-cell lub wyciętym.

Luminometryczne badania elektrofizjologiczne oocytów drożdży i oocytów Xenopus molekularnej mechanowrażliwości TRPV4

Metoda "cut-open Vaseline gap" służy do uzyskiwania niskoszumowych zapisów prądów jonowych i bramkujących z zależnych od napięcia kanałów jonowych wyrażonych w oocytach Xenopus z wysoką rozdzielczością kinetyki szybkich kanałów. Przy niewielkich modyfikacjach fluorometria cęgów napięciowych może być sprzężona z protokołem rozcięcia oocytów.

Technika zacisku napięciowego z otwartą szczeliną wazelinową Xenopus z fluorometrią

Ten artykuł opisuje ulepszenie konwencjonalnej fluorometrii zaciskowej (VCF), gdzie zamiast barwników maleimidowych stosuje się fluorescencyjne nienaturalne aminokwasy (fUAA), aby badać strukturalne przegrupowania w kanałach jonowych. Procedura obejmuje iniekcję DNA oocytów Xenopus, koiniekcję RNA/fUAA oraz jednoczesne pomiary prądu i fluorescencji.

Fluorometria zaciskowa napięcia w oocytach Xenopus przy użyciu fluorescencyjnych nienaturalnych aminokwasów

Prądy synaptyczne mogą być rejestrowane ogniskowo z wizualizowanych bulionów synaptycznych w trzecim stadium rozwojowym połączenia nerwowo-mięśniowego larw Drosophila. Technika ta umożliwia monitorowanie aktywności pojedynczego bulionu synaptycznego.

Ogniskowe zapisy makroplastów prądów synaptycznych z połączenia nerwowo-mięśniowego larw Drosophila

W tym artykule omawiamy trzy preparaty mózgowe używane do rejestracji klamer z całych komórek w celu zbadania obwodu siatkówkowego kijanek Xenopus laevis. Każdy preparat, z własnymi specyficznymi zaletami, przyczynia się do eksperymentalnej wykonalności kijanki Xenopus jako modelu do badania funkcji obwodów neuronalnych.

Preparaty i protokoły do rejestracji całych komórek w postaci klamry krosowej neuronów tektalnych Xenopus laevis

Naucz się rejestrować prądy złącza szczelinowego w oocytach Xenopus laevis przy użyciu dwustronnego klamrowania napięciowego. Ta metoda pozwala badać właściwości biofizyczne koneksyn i inneksyn.

Rejestrowanie prądu złącza szczelinowego z oocytów Xenopus

Przeglądaj więcej filmów