Name: Zastosowania interferencji RNA u karalucha amerykańskiego (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-12-17T15:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 32 s
Description: Poznaj techniki RNAi do badania karalucha amerykańskiego, modelu w genetyce i entomologii. Ta metoda umożliwia wyciszanie genów w organizmach niepodatnych na edycję genów, otwierając nowe możliwości badań nad regulacją genetyczną i zachowaniami.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez Narodową Fundację Nauk Przyrodniczych Chin (granty nr 32070500, 31620103917, 31330072 i 31572325 dla C.R., Sh.L.), przez Fundację Nauk Przyrodniczych prowincji Guangdong (grant nr 2021B1515020044 i 2020A1515011267 dla C.R.), przez Departament Nauki i Technologii w prowincji Guangdong (granty nr 2019B090905003 i 2019A0102006), przez Departament Nauki i Technologii w Kantonie (grant nr 202102020110), przez Shenzhen Science and Technology Program (grant nr. KQTD20180411143628272 do Sh.L.).

Linia P. americana została początkowo dostarczona przez Dr. Huiling Hao. Gatunek ten jest utrzymywany w chowu wsobnym od 30 lat9.
1. Wylęganie się i karmienie P. americana
<ol>
	<li>Zbierz świeże oothecae (natychmiast po złożeniu jaj) P. americana i wysiaduj w ciemnym inkubatorze w temperaturze 25 °C i wilgotności 60% przez ~25 dni. Następnie zwiększ temperaturę i wilgotność do 30 °C i 75% na 3 dni przed wykluciem.</li>
	<li>Użyj sitka z otworem 4 mm, aby oddzielić wyklute nimfy od oothecae.</li>
	<li>Nimfy należy przechowywać w cylindrycznych pojemnikach (o średnicy 12 cm i wysokości 10 cm) w ciemności w temperaturze 28 °C, wilgotności 70%. Posmaruj wewnętrzną krawędź pojemników wazeliną, aby zapobiec ucieczce karaluchów. Zapewnij szczurom karmę, wodę i schronienie (tacki na jajka). Zwracaj uwagę na aktywność nimf i regularnie sprzątaj kał i zanieczyszczenia.</li>
</ol>
2. Wybór nimf w odpowiednim stadium rozwojowym
<ol>
	<li>Użyj szklanej tubki, aby wybrać świeżo wylinienie P. americana (biały kolor ciała). Przechowuj je w nowych pojemnikach i poczekaj na właściwy etap obróbki. 
	UWAGA: Po ~19 dniach w powyższych warunkach karmienia, nimfy w 3. stadium będą dostępne do wstrzyknięcia. Kolor świeżo wyliniałych karaluchów jest biały, a początki są klarowane przez czas linienia.</li>
</ol>
3. Przygotowanie fragmentu docelowego z promotorami T7
<ol>
	<li>Używając cDNA P. americana jako matrycy, zaprojektuj sparowane startery do przeprowadzenia PCR w celu uzyskania fragmentu DNA docelowego genu o długości 300-800 pz 9. Następnie sklonuj fragment PCR do wektora pTOPO (patrz Tabela materiałów) w celu sekwencjonowania.</li>
	<li>Używając docelowego fragmentu DNA jako matrycy, zsyntetyzuj jedną nową parę starterów z sekwencją promotora T7 (5'-GGATCCTAATACGACTACTATAGG-3') na końcach 5' i wykonaj kolejną rundę PCR, aby uzyskać fragment docelowy z promotorami T7 po każdej stronie9.</li>
</ol>
4. Transkrypcja i synteza dsRNA in vitro
<ol>
	<li>Dodać 10 μl buforu T7 2X, 2 μl mieszanki enzymów, T7 Express (patrz tabela materiałów) i 2 μg produktu PCR (otrzymanego w kroku 3.2) do układu reakcyjnego i dodać całkowitą objętość do 20 μL z ddH2O. Delikatnie wymieszać ręcznie do góry nogami i inkubować w temperaturze 37 °C przez 30 min i 70 °C przez 10 min, a następnie powoli schładzać do temperatury pokojowej.</li>
	<li>Rozcieńczyć roztwór RNazy A (4 μg/μL) ddH2O w stosunku 1:200. Następnie dodać 1 μl DNazy wolnej od RNaz RQ1 (1 U/μL) i 1 μL rozcieńczonego roztworu RNazy A do systemu (patrz Tabela Materiałów). 
	UWAGA: Teraz objętość pojedynczego systemu wynosi 22 μL.</li>
	<li>Inkubować w temperaturze 37 °C przez 30 minut. Następnie dodać 10% całkowitej objętości (przy jednoczesnym przeprowadzaniu reakcji N całkowita objętość wynosi N x 22 μL) octanu sodu i trzy objętości całkowitej objętości izopropanolu.</li>
	<li>Delikatnie wymieszać ręcznie do góry nogami, umieścić na lodzie na 5 minut i odwirować przy 13 000 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Usunąć supernatant za pomocą pipety, przemyć pozostałość 75% etanolem (25% wodą uzdatnioną pirowęglanem dietylu (DEPC)), a następnie odwirować przy 13 000 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Ponownie usunąć supernatant. Suszyć granulat na powietrzu przez 15 minut w temperaturze pokojowej. Użyj ~100 μl wody DEPC do rozpuszczenia dsRNA, a następnie rozcieńcz dsRNA do końcowych 2 μg/μL. 
	UWAGA: dsRNA może być przechowywane w temperaturze -80 °C przez 6 miesięcy.</li>
</ol>
5. Ładowanie roztworu dsRNA do strzykawki
<ol>
	<li>Ustaw program w pompie mikrowtryskowej (patrz Tabela materiałów) z wyprzedzeniem, aby upewnić się, że objętość każdego wtrysku jest stała. Przed użyciem strzykawki należy ją oczyścić, napełniając ją wodą DEPC 8-10 razy.</li>
	<li>Zainstalować strzykawkę o pojemności 10 μl na pompie do mikroiniekcji, uruchomić pompę i napełnić strzykawkę 10 μl roztworu dsRNA (przygotowanego w kroku 4.6). Wstrzyknąć 1 μl dsRNA do nimfy w trzecim stadium rozwojowym (patrz krok 2) i upewnić się, że nie wycieka ona do organizmu.</li>
</ol>
6. Wstrzykiwanie dsRNA do P. americana
<ol>
	<li>Znieczulić karaluchy zwiększonym stężeniem CO2 w pojemniku, aż karaluchy przestaną się poruszać, a następnie natychmiast przystąpić do wstrzyknięcia.</li>
	<li>Delikatnie podnieś karalucha pęsetą i poprowadź karalucha w kierunku igły ręką. Następnie wbij igłę przez szczelinę między dwoma somitami brzusznymi poziomo do naskórka. Jeśli chodzi o głębokość wkładki, im płytsza, tym lepiej.</li>
	<li>Następnie wstrzyknij roztwór dsRNA do karalucha. Na koniec wyciągnij końcówkę igły. Upewnij się, że końcówka igły znajduje się jak najbliżej naskórka, aby uniknąć uszkodzenia narządów wewnętrznych. 
	UWAGA: Wstrzyknięcie należy wykonać pod mikroskopem preparacyjnym.</li>
	<li>Umieść wstrzyknięte karaluchy w czystych pojemnikach do testów biologicznych. Odczekaj około 10-20 minut, aby mogły zregenerować się po skutkach CO2 . Oznacz pojemniki datą wstrzyknięcia, rodzajem i dawką dsRNA oraz wiekiem P. americana.</li>
	<li>Umieść wstrzyknięte karaluchy w ciemnym otoczeniu w temperaturze 28 °C, wilgotności 70%, zapewnij wodę, paszę i schronienie oraz regularnie obserwuj możliwe zmiany w fenotypie karaluchów.</li>
</ol>
7. Potwierdzenie knockdownu i analiza fenotypowa
<ol>
	<li>Oceń skuteczność RNAi przy użyciu wszelkich dostępnych technik biologii molekularnej, takich jak ilościowy PCR w czasie rzeczywistym (qRT-PCR) i Western blot. Szczegółowe procedury qRT-PCR i Western blotting można znaleźć w References1,12.</li>
	<li>Aby obserwować i analizować fenotypy związane z RNAi, użyj mikroskopu odpowiedniego dla żywych zwierząt. 
	UWAGA: RNAi może wpływać na morfologię, zachowanie, linienie, regenerację kończyn i inne czynności fizjologiczne karaluchów. Specyficzna częstość fenotypu jest obliczana zgodnie z określonymi warunkami.</li>
</ol>

<ol><li>Miller, S. C., Miyata, K., Brown, S. J., Tomoyasu, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dissecting+systemic+RNA+interference+in+the+red+flour+beetle+Tribolium+castaneum%3A+Parameters+affecting+the+efficiency+of+RNAi%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">Dissecting systemic RNA interference in the red flour beetle Tribolium castaneum: Parameters affecting the efficiency of RNAi.</a> PloS One. 7 (10), 47431(2012).</li>
<li>Fire, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Potent+and+specific+genetic+interference+by+double-stranded+RNA+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans.</a> Nature. 391 (6669), 806-811 (1998).</li>
<li>Ambesajir, A., Kaushik, A., Kaushik, J. J., Petros, S. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA+interference%3A+A+futuristic+tool+and+its+therapeutic+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Saudi+Journal+of+Biological+Sciences%22%5BJournal%5D)">RNA interference: A futuristic tool and its therapeutic applications.</a> Saudi Journal of Biological Sciences. 19 (4), 395-403 (2012).</li>
<li>Younis, A., Siddique, M. I., Kim, C. K., Lim, K. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA+interference+%28RNAi%29+induced+gene+silencing%3A+A+promising+approach+of+hi-tech+plant+breeding%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Biological+Sciences%22%5BJournal%5D)">RNA interference (RNAi) induced gene silencing: A promising approach of hi-tech plant breeding.</a> International Journal of Biological Sciences. 10 (10), 1150-1158 (2014).</li>
<li>Bellés, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Beyond+Drosophila%3A+RNAi+in+vivo+and+functional+genomics+in+insects%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Entomology%22%5BJournal%5D)">Beyond Drosophila: RNAi in vivo and functional genomics in insects.</a> Annual Review of Entomology. 55, 111-128 (2010).</li>
<li>French, A. S., Meisner, S., Liu, H., Weckström, M., Torkkeli, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptome+analysis+and+RNA+interference+of+cockroach+phototransduction+indicate+three+opsins+and+suggest+a+major+role+for+TRPL+channels%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Physiology%22%5BJournal%5D)">Transcriptome analysis and RNA interference of cockroach phototransduction indicate three opsins and suggest a major role for TRPL channels.</a> Frontiers in Physiology. 6, 207(2015).</li>
<li>Hennenfent, A., Liu, H., Torkkeli, P. H., French, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA+interference+supports+a+role+for+Nanchung-Inactive+in+mechanotransduction+by+the+cockroach%2C+Periplaneta+americana%2C+tactile+spine%5BTitle%5D)+AND+%22Invertebrate+Neuroscience%3A+IN%22%5BJournal%5D)">RNA interference supports a role for Nanchung-Inactive in mechanotransduction by the cockroach, Periplaneta americana, tactile spine.</a> Invertebrate Neuroscience: IN. 20 (1), 1(2020).</li>
<li>Immonen, E. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((EAG+channels+expressed+in+microvillar+photoreceptors+are+unsuited+to+diurnal+vision%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">EAG channels expressed in microvillar photoreceptors are unsuited to diurnal vision.</a> The Journal of Physiology. 595 (16), 5465-5479 (2017).</li>
<li>Li, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+genomic+and+functional+landscapes+of+developmental+plasticity+in+the+American+cockroach%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">The genomic and functional landscapes of developmental plasticity in the American cockroach.</a> Nature Communications. 9 (1), 1008(2018).</li>
<li>Zhao, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Grainy+head+signaling+regulates+epithelium+development+and+ecdysis+in+Blattella+germanica%5BTitle%5D)+AND+%22Insect+Science%22%5BJournal%5D)">Grainy head signaling regulates epithelium development and ecdysis in Blattella germanica.</a> Insect Science. 28 (2), 485-494 (2021).</li>
<li>Lozano, J., Belles, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conserved+repressive+function+of+Kr%C3%BCppel+homolog+1+on+insect+metamorphosis+in+hemimetabolous+and+holometabolous+species%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Conserved repressive function of Krüppel homolog 1 on insect metamorphosis in hemimetabolous and holometabolous species.</a> Scientific Reports. 1, 163(2011).</li>
<li>Philip, B. N., Tomoyasu, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+knockdown+analysis+by+double-stranded+RNA+injection%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology+%28Clifton%2C+N.+J%29%22%5BJournal%5D)">Gene knockdown analysis by double-stranded RNA injection.</a> Methods in Molecular Biology (Clifton, N. J). 772, 471-497 (2011).</li>
<li>Zheng, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR+interference-based+specific+and+efficient+gene+inactivation+in+the+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">CRISPR interference-based specific and efficient gene inactivation in the brain.</a> Nature Neuroscience. 21 (3), 447-454 (2018).</li>
<li>Garbutt, J. S., Bellés, X., Richards, E. H., Reynolds, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Persistence+of+double-stranded+RNA+in+insect+hemolymph+as+a+potential+determiner+of+RNA+interference+success%3A+Evidence+from+Manduca+sexta+and+Blattella+germanica%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Insect+Physiology%22%5BJournal%5D)">Persistence of double-stranded RNA in insect hemolymph as a potential determiner of RNA interference success: Evidence from Manduca sexta and Blattella germanica.</a> Journal of Insect Physiology. 59 (2), 171-178 (2013).</li>
<li>Parrish, S., Fleenor, J., Xu, S., Mello, C., Fire, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+anatomy+of+a+dsRNA+trigger%3A+differential+requirement+for+the+two+trigger+strands+in+RNA+interference%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">Functional anatomy of a dsRNA trigger: differential requirement for the two trigger strands in RNA interference.</a> Molecular Cell. 6 (5), 1077-1087 (2000).</li>
<li>Lemonds, T. R., Liu, J., Popadić, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+contribution+of+the+melanin+pathway+to+overall+body+pigmentation+during+ontogenesis+of+Periplaneta+americana%5BTitle%5D)+AND+%22Insect+Science%22%5BJournal%5D)">The contribution of the melanin pathway to overall body pigmentation during ontogenesis of Periplaneta americana.</a> Insect Science. 23 (4), 513-519 (2016).</li>
<li>Jackson, A. L., Linsley, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Noise+amidst+the+silence%3A+Off-target+effects+of+siRNAs%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Genetics%3A+TIG%22%5BJournal%5D)">Noise amidst the silence: Off-target effects of siRNAs.</a> Trends in Genetics: TIG. 20 (11), 521-524 (2004).</li>
<li>Patel, M., Peter, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+DISE-inducing+shRNAs+by+monitoring+cellular+responses%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Cycle+%28Georgetown%2C+Tex%29%22%5BJournal%5D)">Identification of DISE-inducing shRNAs by monitoring cellular responses.</a> Cell Cycle (Georgetown, Tex). 17 (4), 506-514 (2018).</li>
<li>Ventós-Alfonso, A., Ylla, G., Montañes, J. C., Belles, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNMT1+promotes+genome+methylation+and+early+embryo+development+in+cockroaches%5BTitle%5D)+AND+%22iScience%22%5BJournal%5D)">DNMT1 promotes genome methylation and early embryo development in cockroaches.</a> iScience. 23 (12), 101778(2020).</li>
<li>Wang, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Variation+in+RNAi+efficacy+among+insect+species+is+attributable+to+dsRNA+degradation+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Insect+Biochemistry+and+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Variation in RNAi efficacy among insect species is attributable to dsRNA degradation in vivo.</a> Insect Biochemistry and Molecular Biology. 77, 1-9 (2016).</li>
<li>Bi, F., Liu, N., Small Fan, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((interfering+RNA%3A+A+new+tool+for+gene+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Gene+Therapy%22%5BJournal%5D)">interfering RNA: A new tool for gene therapy.</a> Current Gene Therapy. 3 (5), 411-417 (2003).</li>
</ol>

Autorzy oświadczają, że nie pozostają w konflikcie interesów.

W raporcie tym opisano metodologiczną strategię RNAi krok po kroku u P. americana; Warto zauważyć, że można go również stosować do innych karaluchów (na przykład Blattella germanica) i wielu innych owadów z niewielkimi zmianami. Jednak skuteczność wyciszania genów RNAi nie zawsze jest wystarczająco wysoka, co ma oczywistą wadę w porównaniu ze strategią nokautu genów13. Następujący efekt resztkowy poziomu genu może zakłócać rzeczywiste fenotypy. Aby zapewnić skuteczność leczenia R...

Interferencja RNA (RNAi), ewolucyjnie zachowany mechanizm, stopniowo staje się niezbędnym narzędziem odwrotnego genetyki do hamowania ekspresji genów w wielu organizmach1, ponieważ Andrew Fire i Craig Mello2 opracowali strategię wyciszania genów za pośrednictwem dwuniciowego RNA (dsRNA). dsRNA jest rozszczepiane na fragmenty 21-23 nukleotydów, małych interferujących RNA (siRNA), przez enzym Dicer w komórkach, aby aktywować szlak RNAi. Następnie siRNA są włączane do indukowanego RNA kompleksu wyciszającego (RISC), który łączy się z docelowym mRNA, powoduje rozszczepienie mRNA, a ostatecznie powoduje utratę funkcji genu3,4,5. Wśród gatunków owadów do tej pory zgłoszono wiele eksperymentów z układowym RNAi w wielu rzędach owadów, takich jak Orthoptera, Isoptera, Hemiptera, Coleoptera, Neuroptera, Diptera, Hymenoptera, Lepidoptera i Blattodea5,6,7,8.
Karaluchy (Blattaria) są istotną rodziną owadów w badaniach rozwojowych i metamorficznych dzięki swoim szybkim cyklom wzrostu, silnym zdolnościom adaptacyjnym do środowiska i wysokiej plastyczności rozwojowej9. Przed odkryciem, że RNAi jest kompatybilne z karaluchami, wcześniejsze badania koncentrowały się tylko na zapobieganiu i kontroli karaluchów ze względu na niedobór technik manipulacji genetycznej u karaluchów. Unikalna struktura ootheca karalucha sprawiła, że przeprowadzenie nokautu genowego opartego na wstrzyknięciu zarodka za pomocą systemu CRISPR-Cas9 było trudne. Poza tym większość tkanek karaluchów (takich jak P. americana) wykazuje silną odpowiedź układową RNAi, co pozwala na szybkie generowanie dysfunkcyjnych fenotypów poprzez wstrzyknięcie jednego lub więcej ukierunkowanych dsRNAs9,10,11. Cechy te sprawiły, że RNAi stało się nieodzowną techniką w badaniach funkcjonalnych genów u P. americana.
Mimo że zgłoszono użycie RNAi w badaniach funkcjonalnych genów u P. americana, nie było dostępnego szczegółowego ani szczegółowego opisu krok po kroku. Niniejszy raport zawiera krok po kroku wytyczne operacyjne dotyczące RNAi u P. americana, przydatne do badania funkcji genów u innych karaluchów. Co więcej, ten przewodnik nie ogranicza się do Blattodea i może być stosowany do wielu innych owadów z niewielkimi modyfikacjami.

<table><tbody><tr><td>701 N 10 &mikro; L Syr (26S/51/2)</td><td>Hamilton</td><td>PN:80300</td><td>Inkubator iniekcyjny</td></tr><tr><td></td><td>Ningbo Jiangnan Instrument Factory</td><td>RXZ-380A-LED</td><td>Do wylęgu i karmienia karaluchów</td></tr><tr><td>Pompa mikroiniekcyjna</td><td>Alcott Biotechnology</td><td>ALC-IP600</td><td>Zestaw</td></tr><tr><td>do klonowania pTOPO-Blunt</td><td>Aidlab Biotechnology</td><td>CV16</td><td>do</td></tr><tr><td>ilościowych systemów PCR w czasie rzeczywistym do wydłużania genów</td><td>Bio-Rad</td><td>CFX Connect</td><td>Do analizy qRT-PCR</td></tr><tr><td>T7 RiboMAX Express RNAi System</td><td>Promega</td><td>P1700</td><td>Do syntezy dsRNA, który zawiera roztwór Rnazy A (4 &mu; g/&mu; L), Octan sodu, 3,0 M (pH 5,2), Mieszanka enzymów, T7 Express, Woda bez nukleaz, Express T7 2x Bufor , RQ1 Wolne od RNaz Termocyklery DNazy</td></tr><tr><td></td><td>Bio-Rad</td><td>S1000</td><td>do amplifikacji DNA</td></tr></tbody></table>

zastosowania interferencji rna u karalucha amerykańskiego

Applications of RNA Interference in American Cockroach

Karaluchy, szkodniki sanitarne, są niezbędnymi gatunkami w badaniach nad rozwojem owadów i metamorficznych ze względu na ich łatwe żerowanie i cechy hemimetaboliczne. W połączeniu z dobrze opisanymi sekwencjami genomu, te zalety sprawiły, że karaluch amerykański, Periplaneta americana, stał się ważnym modelem owadów hemimetabolicznych. Ograniczony przez niedobór strategii nokautu, skuteczny knockdown genów oparty na interferencji RNA (RNAi) staje się nieodzowną techniką w funkcjonalnych badaniach genów P. americana. Niniejszy protokół opisuje techniki operacyjne RNAi u P. americana. Protokół obejmuje (1) selekcję P. americana w odpowiednich stadiach rozwoju, (2) przygotowanie do iniekcji, (3) wstrzyknięcie dsRNA oraz (4) wykrywanie skuteczności knockdownu genu. RNAi jest potężnym odwrotnym narzędziem genetycznym u P. americana. Większość tkanek P. americana jest wrażliwa na zewnątrzkomórkowe dsRNA. Jego prostota pozwala naukowcom szybko uzyskać dysfunkcyjne fenotypy pod jednym lub wieloma celowanymi wstrzyknięciami dsRNA, umożliwiając naukowcom lepsze wykorzystanie P. americana do badań rozwojowych i metamorficznych.

Rysunek 1 pokazuje prawidłową iniekcję. Strzykawka do mikroiniekcji z igłą o niewielkiej średnicy powinna zostać umieszczona poziomo na manipulatorze (Rycina 1A). Igłę wprowadza się poprzez szczelina między dwoma somytami brzusznymi w przekroju poziomym względem naskórka (Rycina 1B). Upewnij się, że ciecz przedostanie się do *P. americana* brzucha. Zbyt stromy kąt wprowadzenia igły spowoduje uszkodzenie organów wew...

Niniejszy protokół opisuje krok po kroku wytyczne dotyczące technik działania RNAi w P. americana.

Zastosowania interferencji RNA u karalucha amerykańskiego

Cockroaches, a sanitary pest, are essential species in insect developmental and metamorphic studies due to their easy feeding and hemimetabolous ...

Protokół zapewnia prosty sposób badania karaluchów amerykańskich. Powszechny szkodnik sanitarny i pożyteczny owad dla tradycyjnej medycyny chińskiej. Pomoże to w zbadaniu mechanizmów molekularnych wielu czynności życiowych karaluchów amerykańskich poprzez obalanie określonych genów.Główną zaletą tej technologii jest to, że może ona powalić geny u karalucha amerykańskiego lub innych podobnych owadów, które nie nadają się do edycji genów. Technologia ta może być wykorzystana do zbadania różnych dziedzin, takich jak regulacja genetyczna i epigenetyczna, proces rozwoju tkanek, regeneracja przydatków, zachowania godowe i inne interesujące strony karalucha amerykańskiego. Ta technologia jest łatwa w obsłudze i wszechstronna.Sugerujemy, aby zwierzęta były zdrowe podczas leczenia wstrzyknięciem DSRA. Wierzę, że nowicjusze mogą z łatwością opanować tę technikę po kilku sesjach treningowych. Na początek oddziel wyklute nimfy od oothecae za pomocą sitka o aperturze o średnicy czterech milimetrów.Wybierz białą, świeżo słodowaną P.americanę za pomocą szklanej tuby. Umieść P.americana w nowych pojemnikach i poczekaj na właściwy etap leczenia. W układzie reakcyjnym dodać 10 mikrolitrów buforu T7 2X, 2 mikrolitry mieszanki enzymatycznej T7 Express i dwa mikrogramy produktu PCR.Na koniec uzupełnić całkowitą objętość do 20 mikrolitrów wodą podwójnie destylowaną. Delikatnie wymieszaj ręcznie do góry nogami i inkubuj w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 30 minut, a następnie w temperaturze 70 stopni Celsjusza przez 10 minut. Rozcieńczyć 4 mikrogramy na mikrolitr roztworu RNazy A wodą DEPC w stosunku 1 do 200.Następnie dodaj 1 mikrolitr jednej jednostki na mikrolitr RQ1 RNazy Free Dnase i 1 mikrolitr rozcieńczonego roztworu RNazy A do systemu. Inkubować w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 30 minut. Następnie dodać 10% całkowitej objętości octanu sodu i trzy objętości całkowitej objętości izopropanolu.Delikatnie wymieszaj ręcznie do góry nogami, a następnie umieść na lodzie na pięć minut i odwiruj w 13 000 g przez 10 minut w temperaturze 4 stopni Celsjusza. Usunąć supernatant za pomocą pipety. Następnie przemyj pozostałość 75% etanolem, 25% wodą uzdatnioną DEPC, a następnie odwiruj przy 13 000 g przez 5 minut w temperaturze 4 stopni Celsjusza.Ponownie usunąć supernatant, suszyć granulki na powietrzu przez 15 minut w temperaturze pokojowej. Następnie rozpuść dwuniciowy RNA w około 100 mikrolitrach wody DEPC i rozcieńcz go do końcowego stężenia 2 mikrogramów na mikrolitr. Ustaw program w pompie do mikroiniekcji, aby upewnić się, że objętość każdego wstrzyknięcia jest stała.Następnie wyczyść strzykawkę, napełniając ją wodą DEPC od 8 do 10 razy. Zamontować strzykawkę o pojemności 10 mikrolitrów na pompie mikroiniekcyjnej. Następnie uruchom pompę i napełnij strzykawkę 10 mikrolitrami dwuniciowego roztworu RNA.Znieczul karaluchy dwutlenkiem węgla, a następnie delikatnie podnieś je pęsetą i ręcznie poprowadź karalucha w kierunku igły. Następnie wbij igłę przez szczelinę między dwoma somitami brzusznymi poziomo do naskórka. Wstrzyknąć dwuniciowy roztwór RNA do karalucha, upewniając się, że końcówka igły znajduje się jak najbliżej naskórka, aby uniknąć uszkodzenia narządów wewnętrznych.Na koniec wyciągnij końcówkę igły. Umieść wstrzyknięte karaluchy w czystych pojemnikach do testów biologicznych. Odczekaj około 10 do 20 minut, aby mogły zregenerować się po skutkach działania dwutlenku węgla.Oznacz pojemniki datą wstrzyknięcia, rodzajem i dawką dwuniciowego RNA oraz wiekiem P.americana. Dekarboksylaza Ddc lub DOPA i geny Dpp lub dekapentaplegia zostały wybrane jako dwa przykłady do obserwacji fenotypu karaluchów słodowanych po wstrzyknięciu dwuniciowego RNA, a dsMocK, który nie ma celu u zwierząt, został przyjęty jako kontrola negatywna. Wydajność RNAi wykryto za pomocą qRT PCR.Geny zostały znacznie obniżone przy wartości P mniejszej niż 0,01 dla dsDdc i mniejszej niż 0,05 dla dsDpp. P.americana z nokautującymi genami Ddc miała biały naskórek z powodu zablokowanej melanizacji. W eksperymencie z zastrzykami dsDpp RNAi zakłócił regenerację kończyny.Owady powinny być zdrowe i wstrzykiwane bez szkody. Technologia ta zapewnia prosty sposób badania funkcji genów owadów, których nie można edytować genów, takich jak karaluch amerykański.

applications-of-rna-interference-in-american-cockroach

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia rozwojowa

Wykazano, że interferencja RNA jest bardzo skuteczną metodą analizy funkcji genów w rozwoju tchawki Drosophila. Przedstawiono szczegółowy protokół stosowany w laboratorium Jiang do wstrzykiwania dsRNA do embrionów muchy w celu wyciszenia ekspresji genów. Technika ta daje możliwość przesiewania genów niezbędnych do rozwoju tkanek i narządów u Drosophila.

Interferencja RNAi poprzez wstrzykiwanie dsRNA do embrionów Drosophila

Tutaj opisujemy procedurę hamowania funkcji genów u komarów wektorów chorób za pomocą chitozanu/interferujących nanocząsteczek RNA, które są połykane przez larwy.

Wyciszanie genów za pośrednictwem chitozanu/interferujących nanocząstek RNA w larwach komarów wektorów chorób

Interferencja RNA (RNAi) jest niezwykle cennym narzędziem do odkrywania funkcji genów. Jednak zdolność do celowania w geny za pomocą RNAi w stadiach przeddorosłych jest ograniczona w przypadku głównego wektora malarii u ludzi Anopheles gambiae. Opisujemy protokół RNAi w celu zmniejszenia funkcji genu poprzez bezpośrednią iniekcję podczas rozwoju poczwarki.

Dostarczanie RNAi do poczwarek Anopheles gambiae

Tutaj prezentujemy protokoły hodowli chrząszcza pośredniego zarodka, Dermestes maculatus (D. maculatus) w laboratorium. Udostępniamy również protokoły dla embrionalnego i rodzicielskiego RNAi oraz metody analizy fenotypów embrionalnych w celu zbadania funkcji genów u tego gatunku.

Hodowla i knockdown genów za pośrednictwem dwuniciowego RNA u chrząszcza skórnego, Dermestes maculatus

Ten manuskrypt demonstruje wyczerpanie ekspresji genów w jelicie środkowym karalucha niemieckiego poprzez doustne spożycie dwuniciowego RNA zamkniętego w liposomach.

Praktyczne zastosowanie interferencji RNA: doustne dostarczanie dwuniciowego RNA w nośnikach liposomów dla karaluchów

Ten artykuł demonstruje nowe techniki opracowane do doustnego dostarczania dwuniciowego RNA (dsRNA) przez tkanki naczyniowe roślin w celu interferencji RNA (RNAi) u owadów żywiących się sokiem łyka.

Dwuniciowe metody doustnego dostarczania RNA w celu wywołania interferencji RNA u łyka i owadów hemipteran żywiących się sokiem roślinnym

Ten protokół opisuje metodologię mikroiniekcji, którą ustandaryzowaliśmy i stosowaliśmy przez kilka lat, aby dostarczyć określone ilości kwasów nukleinowych bezpośrednio do hemolimfy komarów i much domowych. Protokół ten skutkuje minimalną śmiertelnością po wstrzyknięciach i umożliwia pomiary płodności skorelowane z dawką.

Powtarzalny test biologiczny mikroiniekcji dsRNA i składania jaj u komarów i much domowych

Interferencja RNA jest szeroko stosowaną, potężną techniką manipulowania ekspresją genów na określonych etapach rozwoju. Tutaj opisujemy niezbędne kroki do wdrożenia tej techniki u wodnego chrząszcza nurkującego Thermonectus marmoratus, od nabycia sekwencji genów po knockdown genów wpływających na strukturę lub zachowanie.

Interferencja RNA u chrząszczy wodnych jako potężne narzędzie do manipulowania ekspresją genów w określonych punktach rozwojowych

Doustne podawanie dsRNA wytwarzanego przez bakterie, metoda dostarczania interferencji RNA (RNAi), która jest rutynowo stosowana u Caenorhabditis elegans, została tutaj z powodzeniem zastosowana u dorosłych komarów. Nasza metoda pozwala na rzetelne badania genetyki odwrotnej i badania wektorów blokujących transmisję bez użycia iniekcji.

Skuteczne doustne podawanie RNA interferencji (RNAi) dorosłym komarom z rodzaju Anopheles gambiae

Tutaj przedstawiamy szczegółową metodę moczenia interferencji RNA u Bursaphelenchus xylophilus , aby ułatwić badanie funkcji genów.

Zastosowanie interferencji RNA w nicieni sosnowym, Bursaphelenchus xylophilus

Manipulacja interferencją RNA (RNAi) stanowi ogromne wyzwanie dla wielu gatunków parazytoidów o niewielkich rozmiarach, takich jak osy Trichogramma. W badaniu tym opracowano skuteczną metodę RNAi u Trichogramma denrolimi. Obecna metodologia zapewnia solidny model do badania regulacji genów u os Trichogramma.

Interferencja RNA w parazytoidzie jaja, Trichogramma dendrolimi Matsumura

Poznaj techniki RNAi do badania karalucha amerykańskiego, modelu w genetyce i entomologii. Ta metoda umożliwia wyciszanie genów w organizmach niepodatnych na edycję genów, otwierając nowe możliwości badań nad regulacją genetyczną i zachowaniami.

Zastosowania interferencji RNA u karalucha amerykańskiego

Przeglądaj więcej filmów