Name: Grawitacyjna metoda perfuzji przezsercowej do analizy histologicznej ośrodkowego układu nerwowego myszy (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-01-21T14:45:00.000+00:00
Duration: 10 min 37 s
Description: Poznaj grawitacyjną metodę perfuzji przezsercowej myszy do analizy histologicznej ośrodkowego układu nerwowego. Protokół umożliwia wykrywanie fosforylowanego α-synukleiny w modelu choroby Parkinsona.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy dziękują Xiaowen Wang, Liamowi Coyne'owi i Jasonowi Grullonowi za pomoc w rozwijaniu tego protokołu. Prace te były wspierane przez granty NIH AG061204 i AG063499.

<ol><li>Tao-Cheng, J. H., Gallant, P. E., Brightman, M. W., Dosemeci, A., Reese, T. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+changes+at+synapses+after+delayed+perfusion+fixation+in+different+regions+of+the+mouse+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Comparative+Neurology%22%5BJournal%5D)">Structural changes at synapses after delayed perfusion fixation in different regions of the mouse brain.</a> Journal of Comparative Neurology. 501 (5), 731-740 (2007).</li>
<li>Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole+animal+perfusion+fixation+for+rodents%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Whole animal perfusion fixation for rodents.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (65), e3564(2012).</li>
<li>McFadden, W. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Perfusion+fixation+in+brain+banking%3A+a+systematic+review%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Neuropathologica+Communications%22%5BJournal%5D)">Perfusion fixation in brain banking: a systematic review.</a> Acta Neuropathologica Communications. 7 (1), 146(2019).</li>
<li>Lamberts, R., Goldsmith, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fixation%2C+fine+structure%2C+and+immunostaining+for+neuropeptides%3A+perfusion+versus+immersion+of+the+neuroendocrine+hypothalamus%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Histochemistry+and+Cytochemistry%22%5BJournal%5D)">Fixation, fine structure, and immunostaining for neuropeptides: perfusion versus immersion of the neuroendocrine hypothalamus.</a> Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 34 (3), 389-398 (1986).</li>
<li>Adickes, E. D., Folkerth, R. D., Sims, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+perfusion+fixation+for+improved+neuropathologic+examination%5BTitle%5D)+AND+%22Archives+of+Pathology+and+Laboratory+Medicine%22%5BJournal%5D)">Use of perfusion fixation for improved neuropathologic examination.</a> Archives of Pathology and Laboratory Medicine. 121 (11), 1199-1206 (1997).</li>
<li>Giasson, B. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuronal+alpha-synucleinopathy+with+severe+movement+disorder+in+mice+expressing+A53T+human+alpha-synuclein%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Neuronal alpha-synucleinopathy with severe movement disorder in mice expressing A53T human alpha-synuclein.</a> Neuron. 34 (4), 521-533 (2002).</li>
<li>Martin, L. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Parkinson%27s+disease+alpha-synuclein+transgenic+mice+develop+neuronal+mitochondrial+degeneration+and+cell+death%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Parkinson's disease alpha-synuclein transgenic mice develop neuronal mitochondrial degeneration and cell death.</a> Journal of Neuroscience. 26 (1), 41-50 (2006).</li>
<li>Fujiwara, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((alpha-Synuclein+is+phosphorylated+in+synucleinopathy+lesions%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">alpha-Synuclein is phosphorylated in synucleinopathy lesions.</a> Nature Cell Biology. 4 (2), 160-164 (2002).</li>
<li>Kalia, L. V., Lang, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Parkinson%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet%22%5BJournal%5D)">Parkinson's disease.</a> Lancet. 386 (9996), 896-912 (2015).</li>
<li>Anderson, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phosphorylation+of+Ser-129+is+the+dominant+pathological+modification+of+alpha-synuclein+in+familial+and+sporadic+Lewy+body+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Phosphorylation of Ser-129 is the dominant pathological modification of alpha-synuclein in familial and sporadic Lewy body disease.</a> Journal of Biological Chemistry. 281 (40), 29739-29752 (2006).</li>
<li>Kahle, P. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hyperphosphorylation+and+insolubility+of+alpha-synuclein+in+transgenic+mouse+oligodendrocytes%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Reports%22%5BJournal%5D)">Hyperphosphorylation and insolubility of alpha-synuclein in transgenic mouse oligodendrocytes.</a> EMBO Reports. 3 (6), 583-588 (2002).</li>
<li>Mattson, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+arterial+blood+pressure+in+different+strains+of+mice%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Hypertension%22%5BJournal%5D)">Comparison of arterial blood pressure in different strains of mice.</a> American Journal of Hypertension. 14, 405-408 (2001).</li>
</ol>

Autorzy deklarują brak sprzecznych interesów finansowych.

W tej pracy opisano kluczowe etapy wykonywania perfuzji przezsercowej. Podczas konstruowania aparatu perfuzyjnego (sekcja 1 protokołu) ważne jest, aby używać rurek, które są wystarczająco elastyczne, aby można je było całkowicie zasłonić przez hemostat. Niektóre sztywne rurki mogą nie być wystarczająco zasłonięte przez hemostat i mogą nadal pozwalać na wyciek PFA do głównej linii podczas początkowej perfuzji PBS. Podczas przygotowywania 4% roztworu PFA ważne jest, aby upewnić się, że pH jest fizjologiczne (7.4). Ponieważ przygotowanie roztworu PFA wymaga podgrzania go do temperatury 65 °C, roztwór musi zostać schłodzony z powrotem do 25 °C przed pomiarem pH, ponieważ jest to temperatura, w której pH jest kalibrowane na mierniku.
Podczas wykonywania pierwszego nacięcia w jamie brzusznej należy zachować ostrożność, aby uniknąć uszkodzenia narządów jamy brzusznej (punkt 2 protokołu). Podczas preparacji w kierunku przepony ważne jest, aby uniknąć uszkodzenia wątroby, ponieważ często wątroba przylega do przedniej ściany brzucha. Aby temu zaradzić, wątroba jest ostrożnie i tępo wycinana z dala od przedniej ściany przed kontynuowaniem nacięcia w kierunku przepony. Przy wchodzeniu do jamy klatki piersiowej przez przeponę ważne jest, aby uniknąć uszkodzenia serca, dużych naczyń krwionośnych i płuc. Aby tego uniknąć, końcówka nożyczek jest trzymana powierzchownie i pod ostrym kątem z klatką piersiową.
Wstępna sekcja w celu odsłonięcia serca trwa około 2 minut od pierwszego nacięcia. Oczekuje się, że w tym czasie trochę powietrza dostało się do końcówki igły motyla. Wprowadzenie tego powietrza do krążenia myszy spowoduje złą jakość perfuzji. Dlatego bardzo ważne jest, aby główna linia została otwarta, a PBS został przepłukany przez igłę bezpośrednio przed kaniulacją serca w celu usunięcia pęcherzyków powietrza. Idealnie byłoby, gdyby serce było kaniulowane, podczas gdy mała strużka PBS przepływa przez końcówkę igły, aby zapewnić całkowity brak powietrza podczas nakłuwania LV.
Kiedy igła wchodzi do lewej komory, nie może wchodzić tak głęboko, aby wprowadzić końcówkę igły do prawej komory (RV). Umieszczenie igły w RV lub poza zastawką mitralną spowoduje natychmiastowe "napompowanie" płuc po rozpoczęciu perfuzji. Jest to niepożądane i igłę należy lekko wycofać, aby zapewnić umieszczenie lewej dawki prądu. Jeśli igła zostanie prawidłowo umieszczona, płuca pozostaną płaskie przez cały czas trwania perfuzji. Po rozpoczęciu perfuzji czasami obserwuje się, że z otwartego pyska zwierzęcia wyłania się przezroczysty płyn. Jest to zwykle spowodowane zbyt wysokim ciśnieniem perfuzji lub niewłaściwym umieszczeniem igły w sercu. Autorzy spekulują, że podwyższone ciśnienie perfuzji powoduje wynaczynienie perfuzatu z łożyska naczynia włosowatego tętniczki i wsteczny przepływ PBS przez drzewo oskrzelowe do przełyku i jamy ustnej.
Ciśnienie perfuzji musi być obniżone poprzez zmniejszenie poziomu PBS w butelce PBS lub poprzez obniżenie wysokości butelki PBS. Alternatywnie, jeśli igła zostanie umieszczona zbyt głęboko w lewej komorze, może przejść przez zastawkę mitralną i dostarczyć perfuzat do lewego przedsionka. Może to spowodować wsteczny przepływ przez żyły płucne i wynaczynienie perfuzatu do tętniczek, jak opisano powyżej. Dokładne usunięcie krwi z układu krążenia za pomocą PBS jest szczególnie ważne, aby uniknąć indukowanego utrwalaniem elementów krwi, powodującego niedrożność naczyń po późniejszej perfuzji utrwalającej. Klirens jest skutecznie oceniany przez zmianę koloru wątroby i przepływ PBS z nacięcia w brzusznej podstawie ogona. Klirens krwi jest na ogół całkowity po 3 minutach perfuzji z PBS; Jeśli jednak wizualne oznaki oczyszczenia pojawiają się w krótszym czasie, utrwalacz wprowadza się wcześniej niż 3 minuty. Dłuższe czasy klirencji nie są zalecane, ponieważ opóźniona perfuzja utrwalająca prowadzi do artefaktów w drobnej strukturze OUN1.
Podczas podawania PFA ważne jest, aby monitorować poziom roztworu PFA w butelce PFA. Napełnij butelkę PFA, jeśli poziom PFA spadnie poniżej 4 cm powyżej wylotu butelki PFA. Po zakończeniu perfuzji aparat perfuzyjny należy dokładnie przepłukać wodą destylowaną. Jest to ważne, ponieważ resztki PFA w głównej linii zanieczyszczą początkową perfuzję PBS PFA i spowodują perfuzję niskiej jakości. Wreszcie, igły motylkowe 25 G są ogólnie zalecane dla średniej wielkości dorosłych myszy w zakresie 20-30 g. Jednak większe lub mniejsze myszy mogą wymagać nieco większych lub mniejszych igieł oprócz regulacji butelek utrwalających, aby zapewnić optymalne natężenie przepływu.
W przypadku rozwarstwienia OUN i osadzenia OCT (sekcja 3 protokołu) często zdarza się, że tkanki rdzenia kręgowego nie zapadają się całkowicie w 30% sacharozy. Tkanki te pozostawia się zatem w sacharozie na 2 dni, a następnie zatapia w OCT, niezależnie od tego, czy toną, czy nie. Podczas zamrażania tkanek w OCT możliwe jest, że niektóre tkanki mogą pękać po umieszczeniu w schłodzonym 2-metylobutanie. Jest to bardziej powszechne w przypadku mózgu i zwykle występuje, gdy zbyt dużo OCT zostanie umieszczone na tkance. Aby tego uniknąć, umieść tylko tyle OCT, aby pokryć powierzchnie tkanek przed natychmiastowym zamrożeniem. W niektórych protokołach cracking jest mniej powszechny pomimo całkowitego zanurzenia w OCT. Jest to zwykle spowodowane wolniejszą metodą zamrażania, taką jak stosowanie 2-metylobutanu chłodzonego suchym lodem lub bezpośrednie umieszczanie kriofordu na bloku suchego lodu. W tej pracy preferowany jest 2-metylobutan chłodzony ciekłym azotem, ponieważ szybkość zamrażania jest znacznie szybsza i może lepiej zachować morfologię tkanek niż wolniejsze metody zamrażania.
Podczas kriosekcji tkanki (sekcja 4 protokołu) ważne jest, aby unikać wielokrotnych cykli zamrażania i rozmrażania. Dlatego optymalne jest wycięcie wszystkich sekcji z jednego bloku OCT, aby uzyskać określony obszar mózgu do analizy, zamiast rozmrażania i ponownego zamrażania wybranych obszarów. Jeśli nie jest to możliwe, po uzyskaniu kilku sekcji użytkownicy mogą ponownie zamrozić i przechowywać bloki OCT w zamrażarce o temperaturze -80 °C jeszcze 1-2 razy do wykorzystania w przyszłości.
Główne zalety tej metody w porównaniu z bardziej tradycyjnym pompą lub podawaniem perfuzatu pod ciśnieniem powietrza są następujące: (1) niski koszt i dostępność aparatu do perfuzji. (2) Użytkownicy nie muszą ręcznie utrzymywać ciśnienia w aparacie perfuzyjnym przez cały czas trwania perfuzji. (3) Niższe i bardziej stałe ciśnienie perfuzji niż inne tanie alternatywy dla perfuzji, takie jak dostarczanie strzykawką. Korzystając z równania Bernoulliego, oblicza się, że skonstruowany tutaj aparat perfuzyjny zasilany grawitacyjnie utrzyma ciśnienie perfuzyjne około 73 mm Hg, gdy butelki z perfuzatem zostaną umieszczone na wysokości 1 m w stosunku do igły. Biorąc pod uwagę, że jest to znacznie poniżej skurczowego ciśnienia krwi tych zwierząt, to ciśnienie perfuzyjne jest prawdopodobnie wystarczająco niskie, aby uniknąć pęknięcia naczyńkrwionośnych 12.
Autorzy do tej pory z powodzeniem wykorzystali ten system perfuzyjny do wykrycia obecności fosforylowanej α-synukleiny w mysim modelu choroby Parkinsona. W tym czasie nie napotkano znaczących ograniczeń związanych z tą metodą perfuzji, które nie występują w przypadku metody dostarczania perfuzji z pompą. Głównym ograniczeniem tej techniki jest czasochłonny charakter perfuzji w porównaniu z utrwalaniem kropli. Ta technika jest lepsza niż upuszczanie fiksacji, ponieważ perfuzja powoduje głębszą penetrację utrwalacza do struktur OUN. Drugim ograniczeniem tej techniki jest to, że wymaga ona pewnych umiejętności chirurgicznych, ponieważ serce musi zostać kaniulowane szybko po wejściu do jamy klatki piersiowej. Jednak wraz z doświadczeniem przeszkoleni użytkownicy mogą rutynowo kanalizować serce w ciągu 1 minuty od początkowego nacięcia w jamie brzusznej.

Histologiczna charakterystyka patologii w ośrodkowym układzie nerwowym myszy (OUN) jest rutynową techniką stosowaną w badaniach nad neurodegeneracją. Ponieważ tkanki neuronalne szybko ulegają degradacji po śmierci, powszechną praktyką jest dostarczanie chemicznego utrwalacza, takiego jak paraformaldehyd, do tkanek OUN, aby zachować ich morfologię1,2. Utrwalanie chemiczne można przeprowadzić albo poprzez perfuzję całego ciała roztworem utrwalającym, albo poprzez izolację tkanek i zanurzenie ich w roztworze utrwalającym (tzw. utrwalanie kroplą). Perfuzja jest preferowaną metodą dostarczania utrwalającego, ponieważ utrwalanie kropli może nie pozwolić na szybką penetrację roztworu utrwalającego do głębokich struktur OUN3,4,5. Ponadto, ponieważ trudno jest usunąć nieutrwalony rdzeń kręgowy z kręgosłupa, podanie roztworu utrwalającego przez perfuzję pozwala na zachowanie in situ mikroskopijnej i ogólnej anatomii rdzenia kręgowego oraz usztywnia tkankę, aby zminimalizować uszkodzenia podczas usuwania.
Dostarczanie roztworów buforowych i utrwalających niezbędnych do utrwalenia jest zwykle wykonywane przy użyciu dostępnych na rynku pomp lub ciśnienia powietrza. Grawitacyjne dostarczanie perfuzatu może służyć jako alternatywa dla dostarczania pompy z następujących powodów: (1) Dostarczanie pompy lub ciśnienia powietrza może w niektórych przypadkach wymagać od użytkownika ręcznego utrzymywania ciśnienia w systemie przez cały czas perfuzji. Grawitacyjne dostarczanie perfuzatu może być utrzymane bez interwencji użytkownika. (2) Aparat do perfuzacji dostarczany grawitacyjnie może być skonstruowany przy niskich kosztach dla użytkownika, uzyskując materiały dostępne od standardowych dostawców naukowych. W tej pracy opisano, jak skonstruować proste urządzenie do perfuzji grawitacyjnej przy użyciu butelek do mycia i rurek winylowych. Wykorzystując mysi model choroby Parkinsona, praca ta demonstruje skuteczność tego systemu w perfuzji tkanek mózgu i rdzenia kręgowego przed ich izolacją w celu zamrożonego cięcia. Praca ta kompleksowo opisuje wszystkie kroki, techniki i materiały potrzebne do wypreparowania utrwalonej tkanki ze zwierzęcia, szybkiego zamrożenia/osadzenia i kriosekcji tkanki oraz wykrycia obecności fosforylowanej α-synukleiny zarówno w mózgu, jak i rdzeniu kręgowym za pomocą pośredniej mikroskopii immunofluorescencyjnej.

<table><tbody><tr><td>2-metylobutan (certyfikowany ACS), Fisher Chemical</td><td>Fisher Scientific</td><td>03551-4</td><td></td></tr><tr><td>Andwin Scientific Tissue-Tek OCT Compound</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC1029572</td><td></td></tr><tr><td>Artman Instruments 4,5-calowe proste nożyczki sprężynowe Castroveijo</td><td>Amazon</td><td>B0752XHK2X</td><td>"cienkie nożyczki"</td></tr><tr><td>BD ogólnego zastosowania i igły podskórne PrecisionGlide, 18 g</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-826-5D</td><td></td></tr><tr><td>BD Ogólnego zastosowania i igły podskórne PrecisionGlide, 22 g</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-826B</td><td></td></tr><tr><td>Filtry strzykawkowe Corning PES</td><td>Fisher Scientific</td><td>09-754-29</td><td></td></tr><tr><td>Cytiva Hyclone Fosforan buforowany solą fizjologiczną (PBS), 10x</td><td>Fisher Scientific</td><td>SH30258</td><td></td></tr><tr><td>Falcon 50 ml stożkowe probówki wirówkowe</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-432-22</td><td></td></tr><tr><td>Fisher BioReagents Albumina surowicy bydlęcej (BSA) Proszek bez proteaz</td><td>Fisher Scientific BP9703100</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fisherbrand Zakrzywione średniopunktowe kleszcze ogólnego przeznaczenia</td><td>Fisher Scientific</td><td>16-100-110</td> <td>"zakrzywione kleszcze z okienkiem"</td></tr><tr><td>Fisherbrand Zakrzywione bardzo cienkie precyzyjne kleszcze</td><td>Fisher Scientific</td><td>16-100-123</td><td>" zakrzywione drobne kleszcze"</td></tr><tr><td>Jednorazowe pipety transferowe z podziałką Fisherbrand</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-711-9AM</td><td></td></tr><tr><td>Fisherbrand Wysokoprecyzyjna, prosta, stożkowa, ultra cienka pęseta/kleszcze</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-000-122</td><td>"proste kleszcze drobnoziarniste"</td></tr><tr><td>Mikroszpatułki Fisherbrand z zaokrąglonymi końcami</td><td>Fisher Scientific</td><td>21-401-5</td><td></td></tr><tr><td>Lejki porcelanowe Fisherbrand Buchner ze stałymi perforowanymi płytkami</td><td>Fisher Scientific</td><td>FB966J</td><td></td></tr><tr><td>Szkło osłonowe Fisherbrand Premium, 24 x 50</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-548-5M</td><td></td></tr><tr><td>Kleszczyki do tkanek Fisherbrand Premium 1X2 zęby 5 w. Niemiecka stal</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-820-074</td> <td>"kleszcze do skóry"</td></tr><tr><td>Fisherbrand Wielorazowe grubościenne kolby filtracyjne</td><td>Fisher Scientific</td><td>FB3002000</td><td></td></tr><tr><td>Fisherbrand Standardowe nożyczki preparacyjne</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-951-20</td> <td>"nożyczki preparacyjne"</td></tr><tr><td>Fisherbrand Sterylne strzykawki do jednorazowego użytku</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-955-464</td><td></td></tr><tr><td>Hemostatyki z prostym blokowaniem Fisherbrand</td><td>Fisher Scientific</td><td>16-100-115</td><td></td></tr><tr><td>Szkiełka mikroskopowe Fisherbrand Superfrost Plus</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-550-15</td><td></td></tr><tr><td>Zestawy rurek i złączy winylowych Fisherbrand, 1/4 cala.</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-174-1C</td><td></td></tr><tr><td>Fisherbrand Wzmocnione na mokro jakościowe koła z bibuły filtracyjnej</td><td>Fisher Scientific</td><td>09-790-12F</td><td></td></tr><tr><td>Fisherbrand Y Złącze z 1/4 cala. ID - Polipropylen - QC</td><td>Fisher Scientific</td><td>01-000-686</td><td></td></tr><tr><td>Garvey Economy Ostrze tnące z pojedynczą krawędzią Amazon</td><td></td><td>B001GXFAEQ</td><td></td></tr><tr><td>Koza anty-królicza IgG (H + L) Wtórne przeciwciało, DyLight 488</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>35552</td><td></td></tr><tr><td>Idealny zacisk Stant Zaciski wysokociśnieniowe</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-198-5A</td><td>"opaski zaciskowe"</td></tr><tr><td>IMEB, Inc Sakura Accu-Edge Niskoprofilowe ostrza mikrotomowe, jednorazowe</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC9822467</td><td></td></tr><tr><td>Kawasumi 25 Gauge Standardowy skrzydlaty zestaw do pobierania krwi</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-010-137</td> <td>"igła motylkowa"</td></tr><tr><td>Kimberly-Clark Professional Kimtech Science Kimwipes Delikatne wycieraczki do zadań, 1-warstwowe</td><td>Fisher Scientific</td><td>06-666</td><td></td></tr><tr><td>Sondy molekularne ProLong Diamond Anti Blaknięcie z DAPI</td><td>Fisher Scientific</td><td>P36962</td><td></td></tr><tr><td>Butelki do mycia LDPE z wąskimi ustami ThermoFisher</td><td>Scientific</td><td>2425-0506</td> <td>"butelki buforowe"</td></tr> <tr><td>Długopis PAP</td><td>abcam</td><td>ab2601</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyd Granulowane</td><td>systemy mikroskopii elektronowej</td><td>19210</td><td></td></tr><tr><td>Suszenie szkła Pyrex Naczynia, 34,9 x 24,9 x 6 cm</td><td>Rekombinowane</td> przeciwciało anty-alfa-synukleinowe (fosfo S129) Fisher Scientific <td>15-242D</td><td></td></tr><tr><td>[EP1536Y]</td><td>abcam</td><td>ab51253</td><td></td></tr><tr><td>Wodorotlenek sodu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>221465-2,5 kg</td><td></td></tr><tr><td>Kubek do picia ze stali nierdzewnej 18 uncji</td><td>amazon</td><td>B0039PPO9U</td><td></td></tr><tr><td>sacharozy do biologii molekularnej CAS: 57-50-1</td><td>Biologiczny</td> <td>USAS8010</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Us Biologiczny</td><td>T8655</td><td></td></tr><tr><td>Vetone Fluriso Isoflurane USP</td><td>MWI Zdrowie zwierząt</td><td>502017</td><td></td></tr></tbody></table>

grawitacyjna metoda perfuzji przezsercowej do analizy histologicznej ośrodkowego układu nerwowego myszy

A Gravity-Fed Transcardial Perfusion Method for Histologic Analysis of the Mouse Central Nervous System

Analiza histologiczna próbek mózgu i rdzenia kręgowego wyizolowanych od myszy jest powszechną praktyką oceny patologii w tym systemie modelowym. Aby utrzymać morfologię tych delikatnych tkanek, rutynowo podaje się chemiczny utrwalacz, taki jak paraformaldehyd, poprzez kaniulację serca u znieczulonych zwierząt (perfuzja przezsercowa). Perfuzja przezsercowa serca myszy tradycyjnie opierała się na użyciu pomp perystaltycznych lub ciśnienia powietrza w celu dostarczenia zarówno roztworów soli fizjologicznej, jak i utrwalaczy niezbędnych w tym procesie. Jako łatwo dostępną alternatywę dla tych metod, praca ta demonstruje zastosowanie grawitacyjnej metody dostarczania perfuzatu, która wykorzystuje materiały dostępne w większości sklepów ze sprzętem. 
Aby potwierdzić tę nową metodę perfuzji, ta praca demonstruje wszystkie kolejne kroki niezbędne do czułego wykrywania fosforylowanej α-synukleiny zarówno w mózgu, jak i rdzeniu kręgowym. Etapy te obejmują preparację nieruchomych tkanek mózgu i rdzenia kręgowego, szybkie zamrażanie/osadzanie i kriosekcję tkanek oraz barwienie immunofluorescencyjne. Ponieważ metoda ta skutkuje dostarczeniem utrwalacza do całego ciała, może być również wykorzystana do przygotowania innych tkanek nieneuronalnych do analizy histologicznej.

Wskaźnikiem wysokiej jakości perfuzji jest brak krwi w wątrobie, rdzeniu kręgowym i głębokich strukturach OUN (Rysunek 4C oraz Rysunek 5G,H). Pozostałości krwi pod oponą twardą (na przykład w zatokach żylnych) lub między oponą twardą a czaszką nie stanowią problemu, ponieważ krew ta nie znajduje się w miąższu mózgu. Krew widoczna na Rysunku 4A znajduje się między czaszką a oponą twardą, w związku z czym nie jest problematyczna ani nie sugeruje niskiej jakości perfuzji. Świeży mózg i rdzeń kręgowy są dość miękkie i łatwo ulegają uszkodzeniu podczas manipulacji. W porównaniu z nimi tkanki odpowiednio utrwalone są twarde. Aby ocenić jakość tkanki i zachowanie morfologii tkanek przy zastosowaniu tej metody perfuzji, w niniejszej pracy zaprezentowano detekcję fosforylowanej α-synukleiny w śródmózgowiu i lędźwiowym odcinku rdzenia kręgowego 15-miesięcznej myszy oraz 7-miesięcznej myszy wykazującej ekspresję ludzkiej α-synukleiny A53T (Rysunek 6).
Mutacja A53T występuje z nadreprezentacją u pacjentów z autosomalną dominującą postacią choroby Parkinsona (PD). Ponadto ludzka α-synukleina z mutacją A53T, po ekspresji u myszy, może odtwarzać wiele cech ludzkiej PD6,7. Wykazano in vivo oraz in vitro, że fosforylacja α-synukleiny w pozostałości seryny 129 indukuje agregację α-synukleiny8. Ciałka Lewy’ego są klasycznym znaleziskiem histologicznym występującym u pacjentów z PD lub otępieniem z ciałkami Lewy’ego9. Większość α-synukleiny obecnej w ciałkach Lewy’ego jest fosforylowana w serynie 12910,11. W związku z tym akumulacja fosforylowanej α-synukleiny jest wykorzystywana jako marker histologicznego stopnia nasilenia patologii PD. Niniejsze badanie wykazuje, że fosforylowana α-synukleina akumuluje się na znacznie wyższym poziomie u 15,5-miesięcznych myszy objawowych w porównaniu do 7-miesięcznych myszy bezobjawowych wykazujących ekspresję ludzkiej A53T α-synukleiny. Jest to zgodne z doniesieniami opisującymi nasilenie cytopatologii w rogach przednich rdzenia kręgowego oraz w śródmózgowiu tych myszy.6 Na tej podstawie wyciągnięto wniosek, że opisana tutaj uproszczona metoda perfuzji zapewnia wysokiej jakości utrwalenie tkanek OUN do dalszej charakterystyki histologicznej.
<img alt="Mikroskopia fluorescencyjna śródmózgowia i odcinka lędźwiowego kręgosłupa dla α syn-A53T; marker PS129, schemat porównania wieku." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63386/63386fig06.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rycina 6"> 
Rycina 6: Wyznakowanie fosforylowanej α-synukleiny w tkankach śródmózgowia i rdzenia kręgowego w odcinku lędźwiowym u mysiego modelu choroby Parkinsona. Mysz w zaawansowanym stadium choroby z paraliżem (w wieku 15,5 miesiąca) została porównana z zdrową myszą w wieku 7 miesięcy. Obie myszy wykazują ekspresję podatnego na błędne fałdowanie wariantu mutantowego (A53T) ludzkiej α-synukleiny, który indukuje patologię przypominającą chorobę Parkinsona. Paski skali = 100 µm (panele górne) i 50 µm (panele dolne). Skróty: α syn-A53T = mutant A53T α-synukleiny; DAPI = 4',6-diamidyno-2-fenyloindol; PS129 = fosforylowana seryna 129 α-synukleiny. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63386/63386fig06large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>

Prezentowana jest wygodna metoda perfuzji grawitacyjnej do analizy histologicznej ośrodkowego układu nerwowego myszy. Immunofluorescencyjne wykrywanie fosforylowanej α-synukleiny wykazano w mysim modelu choroby Parkinsona. Praca ta kompleksowo opisuje również etapy perfuzji przezsercowej, rozwarstwienia, zamrażania/osadzania tkanek i zamrażania sekcji.

Grawitacyjna metoda perfuzji przezsercowej do analizy histologicznej ośrodkowego układu nerwowego myszy

The histologic analysis of brain and spinal cord specimens isolated from mice is common practice for the assessment of pathology in this model system. To ...

Protokół ten zapewnia prostą metodę perfuzji utrwalającej u myszy, która pozwoli na badanie histologiczne tkanek OUN bez znacznych inwestycji. Główną zaletą przedstawionej tutaj metody perfuzji grawitacyjnej jest to, że aparat profuzyjny może być zbudowany z łatwo dostępnych komponentów. Procedurę zademonstruje Arnav Rana, doktorant medycyny z laboratorium dr Xin Jie Chena.Na początek za pomocą ostrej żyletki przytnij wewnętrzne słomki z dwóch 500-mililitrowych butelek do mycia, przecinając je równo z wewnętrzną stroną na nakrętce. Wytnij kwadratowy otwór o wymiarach cztery na cztery centymetry na dnie każdej butelki buforowej, a następnie wytnij kolejny mały otwór w dnie każdej butelki, aby umożliwić przejście wygiętej mikroszpatułki ze stali nierdzewnej. Następnie utwórz zagięcie w kształcie litery S w mikroszpatułkach, aby można je było wykorzystać jako haczyki do zawieszenia butelek buforowych.Włóż wygięte mikroszpatułki do odpowiednich otworów w butelkach buforowych. Następnie szczelnie połącz dwie rurki o długości 25 centymetrów z zewnętrznymi wylotami słomki do butelek i połącz końce tych rurek razem ze złączem Y, a następnie połącz rurkę o długości 2 metrów z wolnym końcem łącznika Y. Po wyjęciu tłoka ze strzykawki o pojemności 1 mililitra, odetnij strzykawkę w odległości około 6 centymetrów od końcówki, najpierw nacinając plastik żyletką, a następnie ostro trzaskając plastikową strzykawką.Włożyć odciętą powierzchnię strzykawki do wolnego końca plastikowej rurki na wystarczającą głębokość i upewnić się, że jest szczelnie zamknięta. Następnie oznacz jedną butelkę buforową jako PFA, a drugą jako PBS. Odmierz około 1/3 długości od otworu butelki i narysuj linię wokół obwodu butelki w tym miejscu, aby oznaczyć odpowiedni poziom napełnienia roztworami perfuzatu.Po wyprostowaniu dużego spinacza do papieru utwórz pętlę, która może zmieścić się na obwodzie rurki i umieść tę pętlę wokół rurki, tuż obok strzykawki, a następnie umieść blok styropianowy o odpowiedniej wielkości w szklanej tacy, umieść końce spinacza w bloku styropianowym, aby przymocować rurkę i za pomocą ręcznika papierowego, Podnieś przedni koniec szklanej tacy o około 2 centymetry. Po przepłukaniu 1-litrowej zlewki wodą destylowaną napełnij ją około 800 mililitrami 18 miliomów wody klasy biologii molekularnej. Podgrzej zlewkę w kuchence mikrofalowej przez trzy minuty lub do momentu, gdy temperatura wody osiągnie 65 stopni Celsjusza, a następnie umieść ją na płycie grzewczej lub mieszadle umieszczonej w dygestorium.Następnie opłucz mieszadło wodą destylowaną i umieść je w zlewce. Uruchom mieszadło i przekręć płytę grzejną na średni ogień, upewniając się, że temperatura wody nie przekroczy 70 stopni Celsjusza. Po założeniu maski chirurgicznej, rękawiczek i fartucha laboratoryjnego odmierz 40 gramów proszku PFA i dodaj go do podgrzanej wody, a następnie za pomocą pipety transferowej dodaj kilka kropli 5-molowego wodorotlenku sodu do roztworu.Poczekaj, aż proszek całkowicie się rozpuści. Jeśli proszek nie rozpuścił się całkowicie, w razie potrzeby dodaj więcej wodorotlenku sodu. Gdy cały PFA prawie się rozpuści, przerwij mieszanie i podgrzewanie i natychmiast dodaj 100 mililitrów 10x PBS, a następnie użyj 18 miliomów wody klasy biologii molekularnej, aby uzupełnić zlewkę do znaku 1 litra.Przykryj zlewkę folią spożywczą i umieść ją w zamrażarce o temperaturze minus 20 stopni Celsjusza, aż roztwór osiągnie temperaturę pokojową. Po skalibrowaniu pH-metru przy użyciu odpowiednich wzorców, zmierz pH roztworu, gdy zlewka znajduje się na płytce mieszającej. Dodawać kwas solny, aż pH osiągnie 7,4.Jeśli pH jest zbyt niskie, dodaj 5-molowy wodorotlenek sodu, aby zwiększyć pH. Następnie podłączyć kolbę próżniową do odkurzania i umieścić w kolbie czysty ceramiczny lejek Buchnera z bibułą filtracyjną. Po włączeniu próżni zwilż bibułę filtracyjną za pomocą pipety transferowej wypełnionej 4% roztworem PFA, a następnie powoli wylej roztwór na bibułę filtracyjną, aż cały roztwór zostanie przefiltrowany.Po przefiltrowaniu roztwór przechowywać w zabezpieczonym przed światłem pojemniku w temperaturze 4 stopni Celsjusza do czasu użycia. W dygestorii umieść styropianowy klocek preparacyjny w szklanej tacy. Upewnij się, że blok preparacyjny ma od pięciu do sześciu krótkich igieł do przytrzymywania myszy podczas operacji i dwóch długich igieł do podtrzymywania rurki perfuzyjnej.Następnie przepłucz aparat perfuzyjny wodą destylowaną. Po spuszczeniu całej wody zawieś butelki z obfitością jeden metr nad zwierzęciem, które ma być poddane perfuzji, a następnie przygotuj niesterylny 1x PBS przy użyciu 10x PBS rozcieńczonego wodą klasy biologii molekularnej. Zacisnąć główną linię aparatu perfuzyjnego za pomocą hemostatu, a następnie zacisnąć linię PFA innym hemostatem.Po napełnieniu pojemnika buforowego PBS, umieścić końcówkę strzykawki aparatu perfuzyjnego w zlewce w celu zebrania buforu odpadowego i usunięcia hemostatu zamykającego linię główną. Podczas gdy PBS przepływa przez linię, energicznie postukaj w ścianki rury, aby usunąć uwięzione powietrze. Gdy całe powietrze zostanie usunięte z bufora i linii głównych, należy zatkać przepływ, umieszczając hemostat na linii głównej.Następnie usuń hemostat z linii PFA, pozwalając PBS płynąć w sposób wsteczny do butelki PFA, jednocześnie wystukując wszelkie pęcherzyki w linii PFA. Kontynuuj wpuszczanie PBS do linii PFA, aż będzie widoczny tuż nad otworem butelki, a następnie zatkaj linię PFA hemostatem, aby zatrzymać przepływ PBS do butelki PFA. Następnie podłączyć igłę do infuzji motylkowej do strzykawki perfuzyjnej i otworzyć hemostat z głównej linii, aby przepłukać PBS przez linię i usunąć pęcherzyki ze strzykawki perfuzyjnej.Po usunięciu pęcherzyków zamknij hemostat linii głównej. Upewnij się, że butelka PBS jest teraz wypełniona w około 1/3 PBS. W razie potrzeby przepłukać PBS przez główną linię lub wlać więcej PBS do butelki buforowej do 1/3 pełnej pojemności.Po usunięciu wszystkich pęcherzyków z PBS, PFA i głównych linii, napełnij butelkę PFA 4% roztworem PFA o temperaturze pokojowej do czarnego znaku na butelce. Następnie należy przygotować się do operacji, która nie daje szans na przeżycie, czyszcząc niezbędne narzędzia najpierw wodą, a następnie 70% etanolem. Po przymocowaniu znieczulonej myszy C57 black 6J do bloku styropianowego, należy rozpocząć operację od uniesienia skóry brzucha za pomocą kleszczyków skórnych i przecięcia ściany brzucha dużymi nożyczkami.Kontynuuj cięcie brzucha wyżej w kierunku wątroby, a następnie odłącz wątrobę od przedniej ściany brzucha i kontynuuj początkowe nacięcie wyżej w kierunku przepony. Gdy nacięcie dotrze do przepony, za pomocą drobno preparowanych nożyczek wykonaj otwór w przeponie i przetnij żebra po prawej stronie myszy mniej więcej w połowie drogi do prawej pachy, a następnie wykonaj podobne, ale dłuższe nacięcie po lewej stronie przepony prawie aż do lewej pachy. Odbij ścianę klatki piersiowej i przypnij ją do bloku styropianowego.Po zidentyfikowaniu lewej komory, za pomocą drobno zakrzywionych kleszczy, przytrzymaj serce stabilnie przy lekkim nacisku, a następnie otwórz hemostat głównej linii, aby umożliwić PBS przepływ przez igłę i natychmiast przebij igłą lewą komorę. Upewnij się, że igła jest włożona nie więcej niż 0,5 centymetra do komory. Następnie oprzyj rurkę motylkową na osi X wykonanej ze styropianu za pomocą dwóch dużych igieł o rozmiarze 18.Zidentyfikuj żyłę główną dolną, gdy wychodzi z wątroby i przeciąć ją za pomocą precyzyjnych nożyczek preparacyjnych. Kontynuuj perfuzję PBS, aż płyn wypływający z żyły głównej dolnej będzie wolny od krwi, a następnie działając szybko, zamknij linię PBS hemostatem i otwórz linię PFA. Pozwól PFA perfować przez kilka minut, aż ogon zacznie się zwijać.Gdy ogon zacznie się zwijać, rozpocznij 50-minutowy minutnik. Po 50 minutach zatkać główną linię hemostatem i wycofać igłę z lewej komory. Następnie umieść mysz w oznaczonym pojemniku z roztworem PFA w temperaturze 4 stopni Celsjusza przez noc.Na wysoką jakość perfuzji wskazuje brak krwi w wątrobie, rdzeniu kręgowym i głębokich strukturach ośrodkowego układu nerwowego. Krew obserwowana w mózgu znajduje się między czaszką a oponą twardą i dlatego nie jest problematyczna ani nie sugeruje złej jakości perfuzji. Wykrycie alfa-synukleiny po tej metodzie perfuzji pokazuje, że ufosforylowana alfa-synukleina gromadzi się znacznie wyżej u 15,5-miesięcznych myszy z objawami w porównaniu z siedmiomiesięcznymi bezobjawowymi myszami wykazującymi ekspresję ludzkiej alfa-synukleiny A53T.Wynik ten jest zgodny z doniesieniami opisującymi wzbogacenie cytopatologii w przednich rogach rdzenia kręgowego i śródmózgowiu tych myszy. Ważne jest, aby podczas uzyskiwania dostępu do klatki piersiowej nie przecinać narządów jamy brzusznej. Ponadto igła perfuzyjna nie może być umieszczona zbyt głęboko w lewej komorze.

a-gravity-fed-transcardial-perfusion-method-for-histologic-analysis

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Opisujemy protokół perfuzji transkardiakalnej u myszy, usuwania i sekcjonowania mózgu, a także barwienia immunoperoksydazowego, zatapiania w żywicy i przygotowywania ultracienkich przekrojów z sekcji mózgu. Po zakończeniu tych procedur materiał poddany immunobarwieniu jest gotowy do badania za pomocą transmisyjnej mikroskopii elektronowej.

Przygotowanie tkanki mózgu myszy do immunoelektromikroskopii

Źródło: Schönherr, S., et. al. Połączono znakowanie immunologiczne replik optogenetycznych i zamrażalniczo-łamliwych w celu zbadania specyficznego dla danych wejściowych rozmieszczenia receptorów glutaminianu w ciele migdałowatym myszy. J. Vis. Exp. (2016)Ten film demonstruje znakowanie immunologiczne pękniętych przez zamrożenie replik tkanki mózgowej myszy do mikroskopii elektronowej. Pęknięte i pokryte repliki są trawione w celu odsłonięcia receptorów. Przeciwciała pierwszorzędowe i...

Znakowanie immunologiczne białek błony neuronalnej w pękniętej przez lód próbce tkanki mózgowej myszy

Aktywność pojedynczych neuronów u myszy w wieku dorosłym może być badana poprzez dysocjację neuronów z określonych regionów mózgu i użycie obrazowania barwnika potencjału błony fluorescencyjnej. Testując reakcje na zmiany poziomu glukozy, technika ta może być wykorzystana do badania wrażliwości na glukozę dorosłych brzuszno-przyśrodkowych neuronów podwzgórza.

Obrazowanie potencjału błonowego barwnika brzuszno-przyśrodkowego neuronów podwzgórza od dorosłych myszy w celu zbadania wykrywania glukozy

Przedstawiona tutaj jest prosta metoda izolacji i analizy metodą cytometrii przepływowej komórek jednojądrzastych krwi obwodowej naciekającej glejak, która dostarcza zależnych od czasu danych ilościowych na temat liczby i statusu aktywacji komórek odpornościowych wchodzących do wczesnego mikrośrodowiska guza mózgu.

Izolacja i analiza cytometryczna przepływowa jednojądrzastych komórek krwi obwodowej naciekających glejaka

Ten protokół zapewnia analizę subpopulacji makrofagów w ośrodkowym układzie nerwowym dorosłej myszy za pomocą cytometrii przepływowej i jest pomocny w badaniu wielu markerów wyrażanych przez te komórki.

Analiza makrofagów pochodzących z mikrogleju i monocytów z ośrodkowego układu nerwowego za pomocą cytometrii przepływowej

Połączenie transmisyjnej mikroskopii elektronowej i transdukcji in utero jest potężnym podejściem do badania zmian morfologicznych w ultrastrukturze układu nerwowego podczas rozwoju. Ta połączona metoda pozwala na dogłębny wgląd w zmiany w szczegółach strukturalnych leżących u podstaw neuroplastyczności w odniesieniu do ich reprezentacji topograficznej.

Ocena ultrastrukturalnych parametrów neuroplastyczności po transdukcji in utero rozwijającego się mózgu myszy i rdzenia kręgowego

Prezentujemy metodę cytometrii przepływowej do jednoczesnej identyfikacji różnych typów komórek pobranych z mózgu myszy lub rdzenia kręgowego. Metoda ta może być wykorzystana do wyizolowania lub scharakteryzowania czystych populacji komórek w chorobach neurodegeneracyjnych lub do ilościowego określenia zakresu celowania w komórki po podaniu in vivo wektorów wirusowych lub nanocząstek.

Jednoczesna charakterystyka cytometryczna przepływowa wielu typów komórek pobranych z mózgu / rdzenia kręgowego myszy za pomocą różnych metod homogenizacji

Protokół jest opisany dla perfuzji in situ dolnej części ciała myszy, w tym pęcherza, prostaty, narządów płciowych, kości, mięśni i skóry stóp.

Ustalanie in situ perfuzji w obiegu zamkniętym dolnych narządów jamy brzusznej i kończyn tylnych u myszy

Opracowaliśmy prostąmetodę izolowania wysokiej jakości pojedynczych komórek serca myszy za pomocą techniki perfuzji antegrade. Metoda ta nie zawiera metody Langendorffa i jest przydatna do izolowania miocytów komorowych i przedsionkowych lub komórek śródmiąższowych, takich jak fibroblasty serca lub komórki progenitorowe.

Metoda perfuzji antegrade do izolacji kardiomiocytów od myszy

Ten protokół opisuje skuteczne i powtarzalne podejście do badań histologicznych mózgu myszy, w tym perfuzję, sekcję mózgu, swobodne barwienie immunologiczne, montowanie tkanek i obrazowanie.

Swobodne barwienie immunologiczne mózgów myszy

Ta praca opisuje protokół do kwantyfikacji globalnych modyfikacji histonów za pomocą wewnątrzjądrowej cytometrii przepływowej w izolowanym mikrogleju mózgu. Praca zawiera również protokół izolacji mikrogleju, który został wykorzystany do zebrania danych.

Kwantyfikacja globalnych modyfikacji potranslacyjnych histonów za pomocą wewnątrzjądrowej cytometrii przepływowej w izolowanym mikrogleju mózgu myszy

Poznaj grawitacyjną metodę perfuzji przezsercowej myszy do analizy histologicznej ośrodkowego układu nerwowego. Protokół umożliwia wykrywanie fosforylowanego α-synukleiny w modelu choroby Parkinsona.

Grawitacyjna metoda perfuzji przezsercowej do analizy histologicznej ośrodkowego układu nerwowego myszy

Przeglądaj więcej filmów