Grawitacyjna metoda perfuzji przezsercowej do analizy histologicznej ośrodkowego układu nerwowego myszy

Protokół ten zapewnia prostą metodę perfuzji utrwalającej u myszy, która pozwoli na badanie histologiczne tkanek OUN bez znacznych inwestycji. Główną zaletą przedstawionej tutaj metody perfuzji grawitacyjnej jest to, że aparat profuzyjny może być zbudowany z łatwo dostępnych komponentów. Procedurę zademonstruje Arnav Rana, doktorant medycyny z laboratorium dr Xin Jie Chena.

Na początek za pomocą ostrej żyletki przytnij wewnętrzne słomki z dwóch 500-mililitrowych butelek do mycia, przecinając je równo z wewnętrzną stroną na nakrętce. Wytnij kwadratowy otwór o wymiarach cztery na cztery centymetry na dnie każdej butelki buforowej, a następnie wytnij kolejny mały otwór w dnie każdej butelki, aby umożliwić przejście wygiętej mikroszpatułki ze stali nierdzewnej. Następnie utwórz zagięcie w kształcie litery S w mikroszpatułkach, aby można je było wykorzystać jako haczyki do zawieszenia butelek buforowych.

Włóż wygięte mikroszpatułki do odpowiednich otworów w butelkach buforowych. Następnie szczelnie połącz dwie rurki o długości 25 centymetrów z zewnętrznymi wylotami słomki do butelek i połącz końce tych rurek razem ze złączem Y, a następnie połącz rurkę o długości 2 metrów z wolnym końcem łącznika Y. Po wyjęciu tłoka ze strzykawki o pojemności 1 mililitra, odetnij strzykawkę w odległości około 6 centymetrów od końcówki, najpierw nacinając plastik żyletką, a następnie ostro trzaskając plastikową strzykawką.

Włożyć odciętą powierzchnię strzykawki do wolnego końca plastikowej rurki na wystarczającą głębokość i upewnić się, że jest szczelnie zamknięta. Następnie oznacz jedną butelkę buforową jako PFA, a drugą jako PBS. Odmierz około 1/3 długości od otworu butelki i narysuj linię wokół obwodu butelki w tym miejscu, aby oznaczyć odpowiedni poziom napełnienia roztworami perfuzatu.

Po wyprostowaniu dużego spinacza do papieru utwórz pętlę, która może zmieścić się na obwodzie rurki i umieść tę pętlę wokół rurki, tuż obok strzykawki, a następnie umieść blok styropianowy o odpowiedniej wielkości w szklanej tacy, umieść końce spinacza w bloku styropianowym, aby przymocować rurkę i za pomocą ręcznika papierowego, Podnieś przedni koniec szklanej tacy o około 2 centymetry. Po przepłukaniu 1-litrowej zlewki wodą destylowaną napełnij ją około 800 mililitrami 18 miliomów wody klasy biologii molekularnej. Podgrzej zlewkę w kuchence mikrofalowej przez trzy minuty lub do momentu, gdy temperatura wody osiągnie 65 stopni Celsjusza, a następnie umieść ją na płycie grzewczej lub mieszadle umieszczonej w dygestorium.

Następnie opłucz mieszadło wodą destylowaną i umieść je w zlewce. Uruchom mieszadło i przekręć płytę grzejną na średni ogień, upewniając się, że temperatura wody nie przekroczy 70 stopni Celsjusza. Po założeniu maski chirurgicznej, rękawiczek i fartucha laboratoryjnego odmierz 40 gramów proszku PFA i dodaj go do podgrzanej wody, a następnie za pomocą pipety transferowej dodaj kilka kropli 5-molowego wodorotlenku sodu do roztworu.

Poczekaj, aż proszek całkowicie się rozpuści. Jeśli proszek nie rozpuścił się całkowicie, w razie potrzeby dodaj więcej wodorotlenku sodu. Gdy cały PFA prawie się rozpuści, przerwij mieszanie i podgrzewanie i natychmiast dodaj 100 mililitrów 10x PBS, a następnie użyj 18 miliomów wody klasy biologii molekularnej, aby uzupełnić zlewkę do znaku 1 litra.

Przykryj zlewkę folią spożywczą i umieść ją w zamrażarce o temperaturze minus 20 stopni Celsjusza, aż roztwór osiągnie temperaturę pokojową. Po skalibrowaniu pH-metru przy użyciu odpowiednich wzorców, zmierz pH roztworu, gdy zlewka znajduje się na płytce mieszającej. Dodawać kwas solny, aż pH osiągnie 7,4.

Jeśli pH jest zbyt niskie, dodaj 5-molowy wodorotlenek sodu, aby zwiększyć pH. Następnie podłączyć kolbę próżniową do odkurzania i umieścić w kolbie czysty ceramiczny lejek Buchnera z bibułą filtracyjną. Po włączeniu próżni zwilż bibułę filtracyjną za pomocą pipety transferowej wypełnionej 4% roztworem PFA, a następnie powoli wylej roztwór na bibułę filtracyjną, aż cały roztwór zostanie przefiltrowany.

Po przefiltrowaniu roztwór przechowywać w zabezpieczonym przed światłem pojemniku w temperaturze 4 stopni Celsjusza do czasu użycia. W dygestorii umieść styropianowy klocek preparacyjny w szklanej tacy. Upewnij się, że blok preparacyjny ma od pięciu do sześciu krótkich igieł do przytrzymywania myszy podczas operacji i dwóch długich igieł do podtrzymywania rurki perfuzyjnej.

Następnie przepłucz aparat perfuzyjny wodą destylowaną. Po spuszczeniu całej wody zawieś butelki z obfitością jeden metr nad zwierzęciem, które ma być poddane perfuzji, a następnie przygotuj niesterylny 1x PBS przy użyciu 10x PBS rozcieńczonego wodą klasy biologii molekularnej. Zacisnąć główną linię aparatu perfuzyjnego za pomocą hemostatu, a następnie zacisnąć linię PFA innym hemostatem.

Po napełnieniu pojemnika buforowego PBS, umieścić końcówkę strzykawki aparatu perfuzyjnego w zlewce w celu zebrania buforu odpadowego i usunięcia hemostatu zamykającego linię główną. Podczas gdy PBS przepływa przez linię, energicznie postukaj w ścianki rury, aby usunąć uwięzione powietrze. Gdy całe powietrze zostanie usunięte z bufora i linii głównych, należy zatkać przepływ, umieszczając hemostat na linii głównej.

Następnie usuń hemostat z linii PFA, pozwalając PBS płynąć w sposób wsteczny do butelki PFA, jednocześnie wystukując wszelkie pęcherzyki w linii PFA. Kontynuuj wpuszczanie PBS do linii PFA, aż będzie widoczny tuż nad otworem butelki, a następnie zatkaj linię PFA hemostatem, aby zatrzymać przepływ PBS do butelki PFA. Następnie podłączyć igłę do infuzji motylkowej do strzykawki perfuzyjnej i otworzyć hemostat z głównej linii, aby przepłukać PBS przez linię i usunąć pęcherzyki ze strzykawki perfuzyjnej.

Po usunięciu pęcherzyków zamknij hemostat linii głównej. Upewnij się, że butelka PBS jest teraz wypełniona w około 1/3 PBS. W razie potrzeby przepłukać PBS przez główną linię lub wlać więcej PBS do butelki buforowej do 1/3 pełnej pojemności.

Po usunięciu wszystkich pęcherzyków z PBS, PFA i głównych linii, napełnij butelkę PFA 4% roztworem PFA o temperaturze pokojowej do czarnego znaku na butelce. Następnie należy przygotować się do operacji, która nie daje szans na przeżycie, czyszcząc niezbędne narzędzia najpierw wodą, a następnie 70% etanolem. Po przymocowaniu znieczulonej myszy C57 black 6J do bloku styropianowego, należy rozpocząć operację od uniesienia skóry brzucha za pomocą kleszczyków skórnych i przecięcia ściany brzucha dużymi nożyczkami.

Kontynuuj cięcie brzucha wyżej w kierunku wątroby, a następnie odłącz wątrobę od przedniej ściany brzucha i kontynuuj początkowe nacięcie wyżej w kierunku przepony. Gdy nacięcie dotrze do przepony, za pomocą drobno preparowanych nożyczek wykonaj otwór w przeponie i przetnij żebra po prawej stronie myszy mniej więcej w połowie drogi do prawej pachy, a następnie wykonaj podobne, ale dłuższe nacięcie po lewej stronie przepony prawie aż do lewej pachy. Odbij ścianę klatki piersiowej i przypnij ją do bloku styropianowego.

Po zidentyfikowaniu lewej komory, za pomocą drobno zakrzywionych kleszczy, przytrzymaj serce stabilnie przy lekkim nacisku, a następnie otwórz hemostat głównej linii, aby umożliwić PBS przepływ przez igłę i natychmiast przebij igłą lewą komorę. Upewnij się, że igła jest włożona nie więcej niż 0,5 centymetra do komory. Następnie oprzyj rurkę motylkową na osi X wykonanej ze styropianu za pomocą dwóch dużych igieł o rozmiarze 18.

Zidentyfikuj żyłę główną dolną, gdy wychodzi z wątroby i przeciąć ją za pomocą precyzyjnych nożyczek preparacyjnych. Kontynuuj perfuzję PBS, aż płyn wypływający z żyły głównej dolnej będzie wolny od krwi, a następnie działając szybko, zamknij linię PBS hemostatem i otwórz linię PFA. Pozwól PFA perfować przez kilka minut, aż ogon zacznie się zwijać.

Gdy ogon zacznie się zwijać, rozpocznij 50-minutowy minutnik. Po 50 minutach zatkać główną linię hemostatem i wycofać igłę z lewej komory. Następnie umieść mysz w oznaczonym pojemniku z roztworem PFA w temperaturze 4 stopni Celsjusza przez noc.

Na wysoką jakość perfuzji wskazuje brak krwi w wątrobie, rdzeniu kręgowym i głębokich strukturach ośrodkowego układu nerwowego. Krew obserwowana w mózgu znajduje się między czaszką a oponą twardą i dlatego nie jest problematyczna ani nie sugeruje złej jakości perfuzji. Wykrycie alfa-synukleiny po tej metodzie perfuzji pokazuje, że ufosforylowana alfa-synukleina gromadzi się znacznie wyżej u 15,5-miesięcznych myszy z objawami w porównaniu z siedmiomiesięcznymi bezobjawowymi myszami wykazującymi ekspresję ludzkiej alfa-synukleiny A53T.

Wynik ten jest zgodny z doniesieniami opisującymi wzbogacenie cytopatologii w przednich rogach rdzenia kręgowego i śródmózgowiu tych myszy. Ważne jest, aby podczas uzyskiwania dostępu do klatki piersiowej nie przecinać narządów jamy brzusznej. Ponadto igła perfuzyjna nie może być umieszczona zbyt głęboko w lewej komorze.