Grawitacyjna metoda perfuzji przezsercowej do analizy histologicznej ośrodkowego układu nerwowego myszy
January 21st, 2022
Prezentowana jest wygodna metoda perfuzji grawitacyjnej do analizy histologicznej ośrodkowego układu nerwowego myszy. Immunofluorescencyjne wykrywanie fosforylowanej α-synukleiny wykazano w mysim modelu choroby Parkinsona. Praca ta kompleksowo opisuje również etapy perfuzji przezsercowej, rozwarstwienia, zamrażania/osadzania tkanek i zamrażania sekcji.
Protokół ten zapewnia prostą metodę perfuzji utrwalającej u myszy, która pozwoli na badanie histologiczne tkanek OUN bez znacznych inwestycji. Główną zaletą przedstawionej tutaj metody perfuzji grawitacyjnej jest to, że aparat profuzyjny może być zbudowany z łatwo dostępnych komponentów. Procedurę zademonstruje Arnav Rana, doktorant medycyny z laboratorium dr Xin Jie Chena.
Na początek za pomocą ostrej żyletki przytnij wewnętrzne słomki z dwóch 500-mililitrowych butelek do mycia, przecinając je równo z wewnętrzną stroną na nakrętce. Wytnij kwadratowy otwór o wymiarach cztery na cztery centymetry na dnie każdej butelki buforowej, a następnie wytnij kolejny mały otwór w dnie każdej butelki, aby umożliwić przejście wygiętej mikroszpatułki ze stali nierdzewnej. Następnie utwórz zagięcie w kształcie litery S w mikroszpatułkach, aby można je było wykorzystać jako haczyki do zawieszenia butelek buforowych.
Włóż wygięte mikroszpatułki do odpowiednich otworów w butelkach buforowych. Następnie szczelnie połącz dwie rurki o długości 25 centymetrów z zewnętrznymi wylotami słomki do butelek i połącz końce tych rurek razem ze złączem Y, a następnie połącz rurkę o długości 2 metrów z wolnym końcem łącznika Y. Po wyjęciu tłoka ze strzykawki o pojemności 1 mililitra, odetnij strzykawkę w odległości około 6 centymetrów od końcówki, najpierw nacinając plastik żyletką, a następnie ostro trzaskając plastikową strzykawką.
Włożyć odciętą powierzchnię strzykawki do wolnego końca plastikowej rurki na wystarczającą głębokość i upewnić się, że jest szczelnie zamknięta. Następnie oznacz jedną butelkę buforową jako PFA, a drugą jako PBS. Odmierz około 1/3 długości od otworu butelki i narysuj linię wokół obwodu butelki w tym miejscu, aby oznaczyć odpowiedni poziom napełnienia roztworami perfuzatu.
Po wyprostowaniu dużego spinacza do papieru utwórz pętlę, która może zmieścić się na obwodzie rurki i umieść tę pętlę wokół rurki, tuż obok strzykawki, a następnie umieść blok styropianowy o odpowiedniej wielkości w szklanej tacy, umieść końce spinacza w bloku styropianowym, aby przymocować rurkę i za pomocą ręcznika papierowego, Podnieś przedni koniec szklanej tacy o około 2 centymetry. Po przepłukaniu 1-litrowej zlewki wodą destylowaną napełnij ją około 800 mililitrami 18 miliomów wody klasy biologii molekularnej. Podgrzej zlewkę w kuchence mikrofalowej przez trzy minuty lub do momentu, gdy temperatura wody osiągnie 65 stopni Celsjusza, a następnie umieść ją na płycie grzewczej lub mieszadle umieszczonej w dygestorium.
Następnie opłucz mieszadło wodą destylowaną i umieść je w zlewce. Uruchom mieszadło i przekręć płytę grzejną na średni ogień, upewniając się, że temperatura wody nie przekroczy 70 stopni Celsjusza. Po założeniu maski chirurgicznej, rękawiczek i fartucha laboratoryjnego odmierz 40 gramów proszku PFA i dodaj go do podgrzanej wody, a następnie za pomocą pipety transferowej dodaj kilka kropli 5-molowego wodorotlenku sodu do roztworu.
Poczekaj, aż proszek całkowicie się rozpuści. Jeśli proszek nie rozpuścił się całkowicie, w razie potrzeby dodaj więcej wodorotlenku sodu. Gdy cały PFA prawie się rozpuści, przerwij mieszanie i podgrzewanie i natychmiast dodaj 100 mililitrów 10x PBS, a następnie użyj 18 miliomów wody klasy biologii molekularnej, aby uzupełnić zlewkę do znaku 1 litra.
Przykryj zlewkę folią spożywczą i umieść ją w zamrażarce o temperaturze minus 20 stopni Celsjusza, aż roztwór osiągnie temperaturę pokojową. Po skalibrowaniu pH-metru przy użyciu odpowiednich wzorców, zmierz pH roztworu, gdy zlewka znajduje się na płytce mieszającej. Dodawać kwas solny, aż pH osiągnie 7,4.
Jeśli pH jest zbyt niskie, dodaj 5-molowy wodorotlenek sodu, aby zwiększyć pH. Następnie podłączyć kolbę próżniową do odkurzania i umieścić w kolbie czysty ceramiczny lejek Buchnera z bibułą filtracyjną. Po włączeniu próżni zwilż bibułę filtracyjną za pomocą pipety transferowej wypełnionej 4% roztworem PFA, a następnie powoli wylej roztwór na bibułę filtracyjną, aż cały roztwór zostanie przefiltrowany.
Po przefiltrowaniu roztwór przechowywać w zabezpieczonym przed światłem pojemniku w temperaturze 4 stopni Celsjusza do czasu użycia. W dygestorii umieść styropianowy klocek preparacyjny w szklanej tacy. Upewnij się, że blok preparacyjny ma od pięciu do sześciu krótkich igieł do przytrzymywania myszy podczas operacji i dwóch długich igieł do podtrzymywania rurki perfuzyjnej.
Następnie przepłucz aparat perfuzyjny wodą destylowaną. Po spuszczeniu całej wody zawieś butelki z obfitością jeden metr nad zwierzęciem, które ma być poddane perfuzji, a następnie przygotuj niesterylny 1x PBS przy użyciu 10x PBS rozcieńczonego wodą klasy biologii molekularnej. Zacisnąć główną linię aparatu perfuzyjnego za pomocą hemostatu, a następnie zacisnąć linię PFA innym hemostatem.
Po napełnieniu pojemnika buforowego PBS, umieścić końcówkę strzykawki aparatu perfuzyjnego w zlewce w celu zebrania buforu odpadowego i usunięcia hemostatu zamykającego linię główną. Podczas gdy PBS przepływa przez linię, energicznie postukaj w ścianki rury, aby usunąć uwięzione powietrze. Gdy całe powietrze zostanie usunięte z bufora i linii głównych, należy zatkać przepływ, umieszczając hemostat na linii głównej.
Następnie usuń hemostat z linii PFA, pozwalając PBS płynąć w sposób wsteczny do butelki PFA, jednocześnie wystukując wszelkie pęcherzyki w linii PFA. Kontynuuj wpuszczanie PBS do linii PFA, aż będzie widoczny tuż nad otworem butelki, a następnie zatkaj linię PFA hemostatem, aby zatrzymać przepływ PBS do butelki PFA. Następnie podłączyć igłę do infuzji motylkowej do strzykawki perfuzyjnej i otworzyć hemostat z głównej linii, aby przepłukać PBS przez linię i usunąć pęcherzyki ze strzykawki perfuzyjnej.
Po usunięciu pęcherzyków zamknij hemostat linii głównej. Upewnij się, że butelka PBS jest teraz wypełniona w około 1/3 PBS. W razie potrzeby przepłukać PBS przez główną linię lub wlać więcej PBS do butelki buforowej do 1/3 pełnej pojemności.
Po usunięciu wszystkich pęcherzyków z PBS, PFA i głównych linii, napełnij butelkę PFA 4% roztworem PFA o temperaturze pokojowej do czarnego znaku na butelce. Następnie należy przygotować się do operacji, która nie daje szans na przeżycie, czyszcząc niezbędne narzędzia najpierw wodą, a następnie 70% etanolem. Po przymocowaniu znieczulonej myszy C57 black 6J do bloku styropianowego, należy rozpocząć operację od uniesienia skóry brzucha za pomocą kleszczyków skórnych i przecięcia ściany brzucha dużymi nożyczkami.
Kontynuuj cięcie brzucha wyżej w kierunku wątroby, a następnie odłącz wątrobę od przedniej ściany brzucha i kontynuuj początkowe nacięcie wyżej w kierunku przepony. Gdy nacięcie dotrze do przepony, za pomocą drobno preparowanych nożyczek wykonaj otwór w przeponie i przetnij żebra po prawej stronie myszy mniej więcej w połowie drogi do prawej pachy, a następnie wykonaj podobne, ale dłuższe nacięcie po lewej stronie przepony prawie aż do lewej pachy. Odbij ścianę klatki piersiowej i przypnij ją do bloku styropianowego.
Po zidentyfikowaniu lewej komory, za pomocą drobno zakrzywionych kleszczy, przytrzymaj serce stabilnie przy lekkim nacisku, a następnie otwórz hemostat głównej linii, aby umożliwić PBS przepływ przez igłę i natychmiast przebij igłą lewą komorę. Upewnij się, że igła jest włożona nie więcej niż 0,5 centymetra do komory. Następnie oprzyj rurkę motylkową na osi X wykonanej ze styropianu za pomocą dwóch dużych igieł o rozmiarze 18.
Zidentyfikuj żyłę główną dolną, gdy wychodzi z wątroby i przeciąć ją za pomocą precyzyjnych nożyczek preparacyjnych. Kontynuuj perfuzję PBS, aż płyn wypływający z żyły głównej dolnej będzie wolny od krwi, a następnie działając szybko, zamknij linię PBS hemostatem i otwórz linię PFA. Pozwól PFA perfować przez kilka minut, aż ogon zacznie się zwijać.
Gdy ogon zacznie się zwijać, rozpocznij 50-minutowy minutnik. Po 50 minutach zatkać główną linię hemostatem i wycofać igłę z lewej komory. Następnie umieść mysz w oznaczonym pojemniku z roztworem PFA w temperaturze 4 stopni Celsjusza przez noc.
Na wysoką jakość perfuzji wskazuje brak krwi w wątrobie, rdzeniu kręgowym i głębokich strukturach ośrodkowego układu nerwowego. Krew obserwowana w mózgu znajduje się między czaszką a oponą twardą i dlatego nie jest problematyczna ani nie sugeruje złej jakości perfuzji. Wykrycie alfa-synukleiny po tej metodzie perfuzji pokazuje, że ufosforylowana alfa-synukleina gromadzi się znacznie wyżej u 15,5-miesięcznych myszy z objawami w porównaniu z siedmiomiesięcznymi bezobjawowymi myszami wykazującymi ekspresję ludzkiej alfa-synukleiny A53T.
Wynik ten jest zgodny z doniesieniami opisującymi wzbogacenie cytopatologii w przednich rogach rdzenia kręgowego i śródmózgowiu tych myszy. Ważne jest, aby podczas uzyskiwania dostępu do klatki piersiowej nie przecinać narządów jamy brzusznej. Ponadto igła perfuzyjna nie może być umieszczona zbyt głęboko w lewej komorze.
Przegląd
To badanie przedstawia wygodną metodę perfuzji grawitacyjnej do analizy histologicznej ośrodkowego układu nerwowego myszy. Protokół pokazuje immunofluorescencyjne wykrywanie fosforylowanej α-synucleiny w myszym modelu choroby Parkinsona i szczegółowo opisuje kroki perfuzji przez tętnicę, sekcji tkankowej, zamrażania, wkomponowywania i przekrój.
Kluczowe elementy badania
Obszar nauki
- Neuronauki
- Histologia
- Badania nad chorobą Parkinsona
Tło
- Badania histologiczne są kluczowe dla zrozumienia chorób OUN.
- Skuteczna technika konserwacji tkanek poprawia wykrywanie immunofluorescencyjne.
- Metody perfuzji grawitacyjnej mogą zmniejszyć koszty sprzętu.
Cel badania
- Zaprezentowanie prostego, niedrogiego sposobu perfuzji dla myszy.
- Umożliwienie analizy histologicznej tkanek OUN.
- Wykazanie barwienia immunofluorescencyjnego w modelu choroby Parkinsona.
Stosowane metody
- Badanie szczegółowo opisuje metodę perfuzji grawitacyjnej przy użyciu powszechnych materiałów laboratoryjnych.
- Do protokołu wykorzystywany jest mysi model choroby Parkinsona.
- Kluczowe kroki obejmują przygotowanie perfuzatu, montaż urządzenia i manipulację tkankami.
- Ważne terminy dotyczą określonych procesów przygotowania roztworu PFA i wykonywania perfuzji.
Główne wyniki
- Metoda umożliwia skuteczne unieruchomienie tkanek OUN do analizy immunofluorescencyjnej.
- Wykrycie fosforylowanej α-synucleiny zostało pomyślnie zademonstrowane.
- Wyniki podkreślają wykonalność użycia tej metody do badania mechanizmów chorób neurodegeneracyjnych.
Wnioski
- To badanie dostarcza niezawodnego protokołu dla badań histologicznych tkanek OUN.
- Wyniki poprawiają naszą zdolność do analizowania kluczowych biomarkerów w chorobie Parkinsona.
- Implikacje dla zrozumienia mechanizmów neuronowych w kontekście chorobowym są istotne.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
This gravity-fed perfusion method provides a cost-effective, accessible approach for preparing mouse CNS tissues for histologic analysis, supporting target validation and biomarker detection in neurodegenerative disease models. By enabling reliable fixation and subsequent immunofluorescent staining of phosphorylated α-synuclein, the method enhances predictive confidence in preclinical studies of Parkinson's disease pathology. The technique supports early discovery workflows by reducing equipment barriers while maintaining tissue integrity for downstream analysis.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses through sensitive detection of phosphorylated α-synuclein as a disease biomarker.
- Operational Value: Supports biological de-risking by providing consistent tissue fixation for reproducible immunohistochemical analysis.
- Predictive Value: Facilitates target confidence by allowing comparison of pathology between symptomatic and asymptomatic disease models.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Prepares validated biological systems for downstream immunofluorescent screening applications.
- Reproducibility: Delivers standardized tissue fixation enabling quantitative and comparable readouts across experiments.
- Platform Utility: Uses accessible components to support scalable and reusable perfusion setups in discovery laboratories.
Translational & Preclinical Research
- Disease Relevance: Aligns with Parkinson's disease models by enabling detection of cytopathology in spinal cord and midbrain regions.
- Translational Continuity: Supports progression from discovery to preclinical validation through consistent histologic preparation.
- Risk-Adjusted Decisions: Provides histologic evidence to inform go/no-go decisions in target validation cascades.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into the discovery continuum by supporting histologic preparation for target validation, assay development, and preclinical evaluation of neurodegenerative disease mechanisms.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification through reliable CNS tissue preservation.
- Screening: Enables assay readiness by delivering fixed tissues suitable for immunofluorescent staining and imaging.
- Analytics: Generates quantitative histologic outputs that allow comparison of biomarker expression across experimental conditions.
- Translational Research: Connects discovery findings to preclinical continuity via consistent tissue preparation for biomarker analysis.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable perfusion capability using low-cost, widely available materials.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Enhances predictive confidence in target validation by enabling sensitive detection of disease-associated biomarkers.
- Operational Value: Improves standardization and reproducibility through a simple, gravity-driven perfusion system.
- Strategic Value: Reduces late-stage biological risk by supporting early, mechanistically informative histologic analysis.
- Portfolio Impact: Informs risk-adjusted prioritization by providing histologic evidence of target engagement and pathology progression.
Implementation Considerations
- Requires basic laboratory skills in solution preparation, tubing assembly, and animal handling.
- Needs standard lab equipment including glass trays, tubing, connectors, syringes, and temperature control for PFA preparation.
- Demands cross-team standardization of perfusion timing, fixative volume, and needle placement for consistent results.
- Involves adaptation considerations for different mouse strains, ages, and fixation durations based on target antigen stability.
- Includes practical limitations such as the need to avoid excessive needle depth in the left ventricle and prevent abdominal organ damage during thoracic access.
