Mikrofizjologiczny układ wątroby człowieka do oceny toksyczności wątroby indukowanej lekami in vitro

Protokół opisuje, w jaki sposób oceniać uszkodzenie wątroby wywołane lekiem in vitro przy użyciu systemu mikrofizjologicznego, który może utrzymać wysoce funkcjonalne i metabolicznie aktywne mikrotkanki wątroby przez okres do czterech tygodni. Podejście to jest specyficznym dla człowieka modelem hodowli komórkowej w celu dokładnego wykrycia odpowiedzialności za uszkodzenie wątroby wywołane lekami w przypadku nowych związków, co jest bardziej predykcyjne niż prostsze hodowle 2D lub nawet bardziej złożone hodowle 3D. Technika ta może być stosowana jako część zestawu przedklinicznych testów bezpieczeństwa w celu określenia, czy związek jest bezpieczny do rozpoczęcia badań klinicznych.

Można testować wiele różnych modalności. Rozpocznij konfigurację systemu mikrofizjologicznego wątroby, podłączając kontroler do stacji dokującej w inkubatorze do hodowli komórkowych. Upewnij się, że świeży środek osuszający został dodany do słoika ze środkiem osuszającym znajdującego się z tyłu sterownika.

Po włączeniu sterownika poprzez naciśnięcie przełącznika kołyskowego łodzi należy odczekać pięć minut, aż system się ustabilizuje i osiągnie ciśnienie. Wyjmij każdą płytkę z opakowania. Następnie zalej każdą studzienkę, dodając 500 mikrolitrów wstępnie podgrzanego zaawansowanego podłoża wysiewającego DMEM po stronie zbiornika.

Umieść sterownik na stacji dokującej w inkubatorze. Po zakończeniu wybierz program główny na ekranie sterownika, aż płyn przejdzie przez wsporniki filtra. Aby pokryć kanał powierzchniowy, napełnij wszystkie studzienki 1,1 mililitra zaawansowanego podłoża DMEM do wysiewu.

Po umieszczeniu sterowników z płytkami w inkubatorze w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla, podłącz stację dokującą i uruchom program inkubacji. Rozmrozić fiolki z PHH i HJC, trzymając je w łaźni wodnej o temperaturze 37 stopni Celsjusza, aż pozostanie tylko mały kawałek lodu. Po rozmrożeniu delikatnie odpipetować maksymalnie dwie fiolki PHH bezpośrednio do probówki z wstępnie podgrzaną kriokonserwowaną pożywką do odzyskiwania hepatocytów, pożywką CHRM.

Następnie użyj jednego mililitra CHRM, aby umyć pozostałe komórki z krioprobówki. Delikatnie odpipetuj HKC z krioprobówki do 10 mililitrów lodowatego zaawansowanego podłoża DMEM w 50-mililitrowej probówce wirówkowej. Później odwiruj oba typy komórek osobno w temperaturze pokojowej 100 razy G przez 10 minut.

Po odwirowaniu usunąć supernatant i ponownie zawiesić PHH w zaawansowanym pożywce DMEM do wysiewu na ciepło i HKC w zaawansowanej pożywce DMEM do wysiewu na zimno, używając jednego mililitra na fiolkę komórek dodanych do probówki. Ponownie zawieś komórki delikatnie kołysząc, a następnie umieść na lodzie. Po zawieszeniu policz komórki i zapisz żywotność.

Żywotność ogniw musi przekraczać 85%Następnie odłącz sterownik od stacji dokującej i umieść sterownik w szafie bezpieczeństwa mikrobiologicznego lub MBSC. Następnie odessać pożywkę znad rusztowania do punktu zatrzymania, kanału i zbiornika, pozostawiając martwą objętość 0,2 mililitra w dołku hodowlanym, sięgając tuż nad rusztowaniem. Dodaj 400 mikrolitrów zaawansowanej pożywki DMEM do wysiewu do komory studziennej przed powrotem sterownika do stacji dokującej w inkubatorze i uruchomieniem programu wymiany pożywki na trzy minuty.

Po trzech minutach odłącz sterownik od stacji dokującej i umieść go z powrotem w MBSC. Odessać pożywkę z powyższego rusztowania do punktu zatrzymania i na końcu zbiornika każdej studzienki, a następnie ponownie zawiesić PHH, delikatnie kołysząc rurką i dodając wymaganą objętość zawiesiny komórkowej do każdej studzienki hodowlanej. Ostrożnie odpipetować zawiesinę komórek, upewniając się, że komórki są równomiernie rozproszone na rusztowaniu płytki.

Ostrożnie ponownie zawiesić HKC i dobrze dodać zawiesiny komórkowe do każdej hodowli. Gdy wszystkie studzienki zawierają oba typy komórek, umieść system mikrofizjologiczny lub sterownik MPS na stacji dokującej w inkubatorze bez fizycznego podłączania, aby stać przez godzinę. Po upływie godziny podłącz sterownik do stacji dokującej i uruchom program seed.

Gdy program automatycznie zatrzyma się po dwóch minutach, wyjmij sterownik z inkubatora i powoli dodaj 1,000 mikrolitrów zaawansowanej pożywki DMEM do wysiewu do kanału, aby uzyskać całkowitą objętość 1,4 mililitra. Później przenieś płytki do inkubatora i uruchom resztę programu nasiennego na osiem godzin. Czwartego dnia wstrzymaj program na kontrolerze i odłącz sterownik oraz płytkę od stacji dokującej.

Przenieś je do narzędzia MBSC. Użyj pipety, aby ręcznie pobrać około jednego mililitra pożywki z każdej studzienki w celu analizy rozpuszczalnych biomarkerów bez zakłócania hodowli komórkowej poprzez dotykanie rusztowania. Oznacz pobrane podłoża jako próbki z czwartego dnia i przeprowadź testy dehydrogenazy mleczanowej i mocznika jako kontrolę jakości, aby upewnić się, że wysiew zakończył się sukcesem.

Następnie dozuj każdą studzienkę zgodnie z planem płytki, dokonując wymiany pożywki. Po zakończeniu włóż sterownik z powrotem do stacji dokującej w inkubatorze i uruchom program inkubacji. Szóstego dnia odłącz sterownik i tablicę rejestracyjną od stacji dokującej, a następnie przenieś się do MBSC.

Użyj pipety, aby zebrać około jednego mililitra pożywki z każdej studzienki i oznacz próbki jako 48 godzin po podaniu i przechowuj próbki w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza do późniejszych testów. Ósmego dnia usuń rusztowania z płytek za pomocą pęsety i umieść rusztowania na 24-dołkowej płytce zawierającej 500 mikrolitrów DPBS bez wapnia i magnezu w każdej studzience bez naruszania mikrotkanki. Zrób zdjęcia każdego rusztowania pod mikroskopem światła odwróconego przy 10-krotnym powiększeniu.

W czwartym dniu, przed podaniem leku, przeprowadzono kontrolę jakości utworzonych mikrotkanek wątroby z uwalnianiem LDH i syntezą mocznika. W ósmym dniu oceniono wiele wskaźników zdrowotnych i wątrobowych, takich jak albumina, mocznik, CYP, trzy, A, cztery, ATP, aby potwierdzić wysoki poziom funkcjonalności wątroby i odtwarzalności w mikrotkankach. Mikroskopia fazy kontrastowej i barwienie IF w mikrotkankach wątroby wykazały równomierne rozmieszczenie HKC w mikrotkankach PHH.

Ostra ekspozycja mikrotkanek wątroby na troglitazon powodowała toksyczność, którą wykrywano za pomocą aminotransferazy alaninowej lub AlAT, oraz uwalnianie LDH i szybkie zmniejszenie produkcji albuminy i mocznika. Zawartość ATP i aktywność CYP trzy A cztery potwierdziły toksyczność powodowaną przez troglitazon, a wartości EC50 były wysoce porównywalne z innymi punktami końcowymi. Obrazy z mikroskopii w jasnym polu wykonane po ośmiodniowej hodowli w MPS ujawniają zdrową mikrotkankę wątroby, równomiernie rozsianą po całym rusztowaniu w pojeździe kontrolnym.

Śmierć lub degradację tkanek obserwowano u kontrprób poddanych kontroli pozytywnej i troglitazonowi. Ponadto badano również toksyczny wpływ na wątrobę po ekspozycji na pioglitazon. Nie wykryto uwalniania LDH ani ALT, jednak po 48 godzinach zaobserwowano łagodne zmniejszenie produkcji albumin i mocznika.

Obserwowano nieznaczne zmniejszenie zawartości ATP przy dużych stężeniach pioglitazonu. Wartości EC50 uzyskano na podstawie krzywych dawka-odpowiedź. Mikroskopia wykazała niewielkie zmiany w mikrotkankach po 96 godzinach ekspozycji na pioglitazon w dwóch najwyższych badanych stężeniach.

W badaniu wykazano, że wykorzystanie komórek o dobrej jakości i żywotności powyżej 85% jest niezbędne do wytworzenia wysoce funkcjonalnych i zdrowych mikrotkanek 3D w systemie mikrofizjologicznym. Po tej procedurze możemy ocenić interakcje adeniny i lek-lek oraz uszkodzenie wątroby wywołane przez lek na modelach chorobowych, takich jak niealkoholowe zapalenie wątroby typu Delta lub model niealkoholowej stłuszczeniowej choroby wątroby, który wykorzystuje potrójną hodowlę komórek miąższowych i niemiąższowych wątroby.