Name: Mikrofizjologiczny układ wątroby człowieka do oceny toksyczności wątroby indukowanej lekami in vitro (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-01-31T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 6 s
Description: Poznaj mikrofizjologiczny układ wątroby do oceny toksyczności indukowanej lekami in vitro. Ta metoda utrzymuje funkcjonalne mikrotkanki wątrobowe przez cztery tygodnie, oferując przewidywalniejszy model niż tradycyjne kultury 2D i 3D.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

CN Bio Innovations Ltd. sfinansowało to badanie.

<ol><li>Lisi, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drug-induced+liver+injury%3A+An+overview%5BTitle%5D)+AND+%22US+Pharmacist%22%5BJournal%5D)">Drug-induced liver injury: An overview.</a> US Pharmacist. 41 (12), 30-34 (2016).</li>
<li>Kuna, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Models+of+drug+induced+liver+injury+%28DILI%29-current+issues+and+future+perspectives%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Drug+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Models of drug induced liver injury (DILI)-current issues and future perspectives.</a> Current Drug Metabolism. 19 (10), 830-838 (2018).</li>
<li>Katarey, D., Verma, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drug-induced+liver+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Medicine%22%5BJournal%5D)">Drug-induced liver injury.</a> Clinical Medicine. 16 (6), London, England. 104-109 (2016).</li>
<li>Kullak-Ublick, G. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drug-induced+liver+injury%3A+recent+advances+in+diagnosis+and+risk+assessment+Recent+advances+in+clinical+practice%5BTitle%5D)+AND+%22Gut%22%5BJournal%5D)">Drug-induced liver injury: recent advances in diagnosis and risk assessment Recent advances in clinical practice.</a> Gut. 66, 1154-1164 (2017).</li>
<li>Dirven, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Performance+of+pre-clinical+models+in+predicting+drug-induced+liver+injury+in+humans%3A+a+systematic+review%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Performance of pre-clinical models in predicting drug-induced liver injury in humans: a systematic review.</a> Scientific Reports. 11 (1), 6403(2021).</li>
<li>Donato, M. T., Lahoz, A., Castell, J. V., Gomez-Lechon, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+lines%3A+a+tool+for+in+vitro+drug+metabolism+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Drug+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Cell lines: a tool for in vitro drug metabolism studies.</a> Current Drug Metabolism. 9 (1), 1-11 (2008).</li>
<li>Wilkening, S., Stahl, F., Bader, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+primary+human+hepatocytes+and+hepatoma+cell+line+HepG2+with+regard+to+their+biotransformation+properties%5BTitle%5D)+AND+%22Drug+Metabolism+and+Disposition%22%5BJournal%5D)">Comparison of primary human hepatocytes and hepatoma cell line HepG2 with regard to their biotransformation properties.</a> Drug Metabolism and Disposition. 31 (8), 1035-1042 (2003).</li>
<li>Gerets, H. H. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+primary+human+hepatocytes%2C+HepG2+cells%2C+and+HepaRG+cells+at+the+mRNA+level+and+CYP+activity+in+response+to+inducers+and+their+predictivity+for+the+detection+of+human+hepatotoxins%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Biology+and+Toxicology%22%5BJournal%5D)">Characterization of primary human hepatocytes, HepG2 cells, and HepaRG cells at the mRNA level and CYP activity in response to inducers and their predictivity for the detection of human hepatotoxins.</a> Cell Biology and Toxicology. 28 (2), 69-87 (2012).</li>
<li>Grainger, C. I., Greenwell, L. L., Lockley, D. J., Martin, G. P., Forbes, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Culture+of+Calu-3+cells+at+the+air+interface+provides+a+representative+model+of+the+airway+epithelial+barrier%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmaceutical+Research%22%5BJournal%5D)">Culture of Calu-3 cells at the air interface provides a representative model of the airway epithelial barrier.</a> Pharmaceutical Research. 23 (7), 1482-1490 (2006).</li>
<li>Li, F., Cao, L., Parikh, S., Zuo, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+spheroids+with+primary+human+liver+cells+and+differential+roles+of+kupffer+cells+in+drug-induced+liver+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Pharmaceutical+Sciences%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional spheroids with primary human liver cells and differential roles of kupffer cells in drug-induced liver injury.</a> Journal of Pharmaceutical Sciences. 109 (6), 1912-1923 (2020).</li>
<li>Proctor, W. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Utility+of+spherical+human+liver+microtissues+for+prediction+of+clinical+drug-induced+liver+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Archives+of+Toxicology%22%5BJournal%5D)">Utility of spherical human liver microtissues for prediction of clinical drug-induced liver injury.</a> Archives of Toxicology. 91 (8), 2849-2863 (2017).</li>
<li>Lin, C., Khetani, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advances+in+engineered+liver+models+for+investigating+drug-induced+liver+injury%5BTitle%5D)+AND+%22BioMed+Research+International%22%5BJournal%5D)">Advances in engineered liver models for investigating drug-induced liver injury.</a> BioMed Research International. 2016, 1829148(2016).</li>
<li>Olson, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Concordance+of+the+toxicity+of+pharmaceuticals+in+humans+and+in+animals%5BTitle%5D)+AND+%22Regulatory+Toxicology+and+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">Concordance of the toxicity of pharmaceuticals in humans and in animals.</a> Regulatory Toxicology and Pharmacology. 32 (1), 56-67 (2000).</li>
<li>Bell, C. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+hepatic+2D+sandwich+cultures+and+3D+spheroids+for+long-term+toxicity+applications%3A+A+multicenter+study%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicological+Sciences%22%5BJournal%5D)">Comparison of hepatic 2D sandwich cultures and 3D spheroids for long-term toxicity applications: A multicenter study.</a> Toxicological Sciences. 162 (2), 655-666 (2018).</li>
<li>Bell, C. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+primary+human+hepatocyte+spheroids+as+a+model+system+for+drug-induced+liver+injury%2C+liver+function+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Characterization of primary human hepatocyte spheroids as a model system for drug-induced liver injury, liver function and disease.</a> Scientific Reports. 6, 25187(2016).</li>
<li>Khetani, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+micropatterned+co-cultures+to+detect+compounds+that+cause+drug-induced+liver+injury+in+humans%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicological+Sciences%22%5BJournal%5D)">Use of micropatterned co-cultures to detect compounds that cause drug-induced liver injury in humans.</a> Toxicological Sciences. 132 (1), 107-117 (2013).</li>
<li>Ma, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deterministically+patterned+biomimetic+human+iPSC-derived+hepatic+model+via+rapid+3D+bioprinting%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+united+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Deterministically patterned biomimetic human iPSC-derived hepatic model via rapid 3D bioprinting.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the united States of America. 113 (8), 2206-2211 (2016).</li>
<li>Dieterle, P. Y. M., Dieterle, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue-specific%2C+non-invasive+toxicity+biomarkers%3A+translation+from+pre-clinical+safety+assessment+to+clinical+safety+monitoring%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Opinion+on+Drug+Metabolism+%26+Toxicology%22%5BJournal%5D)">Tissue-specific, non-invasive toxicity biomarkers: translation from pre-clinical safety assessment to clinical safety monitoring.</a> Expert Opinion on Drug Metabolism & Toxicology. 5 (9), 1023-1038 (2009).</li>
<li>Rowe, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Perfused+human+hepatocyte+microtissues+identify+reactive+metabolite-forming+and+mitochondria-perturbing+hepatotoxins%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicology+in+Vitro%22%5BJournal%5D)">Perfused human hepatocyte microtissues identify reactive metabolite-forming and mitochondria-perturbing hepatotoxins.</a> Toxicology in Vitro. 46, 29-38 (2018).</li>
<li>Rubiano, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterizing+the+reproducibility+in+using+a+liver+microphysiological+system+for+assaying+drug+toxicity%2C+metabolism%2C+and+accumulation%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+and+Translational+Science%22%5BJournal%5D)">Characterizing the reproducibility in using a liver microphysiological system for assaying drug toxicity, metabolism, and accumulation.</a> Clinical and Translational Science. 14 (3), 1049-1061 (2021).</li>
<li>Tsamandouras, N., Kostrzewski, T., Stokes, C. L., Griffith, L. G., Hughes, D. J., Cirit, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+assessment+of+population+variability+in+hepatic+drug+metabolism+using+a+perfused+three-dimensional+human+liver+microphysiological+system%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Pharmacology+and+Experimental+Therapeutics%22%5BJournal%5D)">Quantitative assessment of population variability in hepatic drug metabolism using a perfused three-dimensional human liver microphysiological system.</a> Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 360 (1), 95-105 (2017).</li>
<li>Ortega-Prieto, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((3D+microfluidic+liver+cultures+as+a+physiological+pre-clinical+tool+for+hepatitis+B+virus+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">3D microfluidic liver cultures as a physiological pre-clinical tool for hepatitis B virus infection.</a> Nature Communications. 9 (1), 682(2018).</li>
<li>Kostrzewski, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+perfused+human+in+vitro+model+of+non-alcoholic+fatty+liver+disease%5BTitle%5D)+AND+%22World+Journal+of+Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional perfused human in vitro model of non-alcoholic fatty liver disease.</a> World Journal of Gastroenterology. 23 (2), 204-215 (2017).</li>
<li>Kostrzewski, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+microphysiological+system+for+studying+nonalcoholic+steatohepatitis%5BTitle%5D)+AND+%22Hepatology+Communications%22%5BJournal%5D)">A microphysiological system for studying nonalcoholic steatohepatitis.</a> Hepatology Communications. 4 (1), 77-91 (2020).</li>
<li>Vacca, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bone+morphogenetic+protein+8B+promotes+the+progression+of+non-alcoholic+steatohepatitis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Bone morphogenetic protein 8B promotes the progression of non-alcoholic steatohepatitis.</a> Nature Metabolism. 2 (6), 514-531 (2020).</li>
<li>Long, T. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modeling+therapeutic+antibody-small+molecule+drug-drug+interactions+using+a+three-dimensional+perfusable+human+liver+co-culture+platforms%5BTitle%5D)+AND+%22Drug+Metabolism+and+Disposition%22%5BJournal%5D)">Modeling therapeutic antibody-small molecule drug-drug interactions using a three-dimensional perfusable human liver co-culture platforms.</a> Drug Metabolism and Disposition. 44, 1940-1948 (2016).</li>
<li>Bai, J., Wang, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organoids+and+microphysiological+systems%3A+New+tools+for+ophthalmic+drug+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">Organoids and microphysiological systems: New tools for ophthalmic drug discovery.</a> Frontiers in Pharmacology. 11, 407(2020).</li>
<li>Ribeiro, A. J. S., Yang, X., Patel, V., Madabushi, R., Strauss, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Liver+microphysiological+systems+for+predicting+and+evaluating+drug+effects%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Pharmacology+%26+Therapeutics%22%5BJournal%5D)">Liver microphysiological systems for predicting and evaluating drug effects.</a> Clinical Pharmacology & Therapeutics. 106 (1), 139-147 (2019).</li>
<li>Clark, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+microphysiological+system+model+of+therapy+for+liver+micrometastases+hhs+public+access%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Biology+and+Medicine+%28Maywood%29%22%5BJournal%5D)">A microphysiological system model of therapy for liver micrometastases hhs public access.</a> Experimental Biology and Medicine (Maywood). 239 (9), 1170-1179 (2014).</li>
<li>Qosa, H., Ribeiro, A. J. S., Hartman, N. R., Volpe, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+a+commercially+available+line+of+iPSC+hepatocytes+as+models+of+hepatocyte+function+and+toxicity+for+regulatory+purposes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Pharmacological+and+Toxicological+Methods%22%5BJournal%5D)">Characterization of a commercially available line of iPSC hepatocytes as models of hepatocyte function and toxicity for regulatory purposes.</a> Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. 110, 107083(2021).</li>
</ol>

Wszyscy autorzy są pracownikami CN Bio Innovations Limited.

Systemy mikrofizjologiczne (MPS) zostały zaprojektowane w celu odtworzenia funkcjonalnych jednostek ludzkich organów in vitro i opracowano je, aby wyeliminować ograniczenia konwencjonalnych modeli 3D hodowli komórkowych27. Wątroba jest jednym z organów najczęściej modelowanych przy użyciu MPS i opracowano dla niej szeroką gamę systemów. Ludzka wątroba odpowiada za metabolizm leków oraz generowanie toksycznych metabolitów leków, a jej funkcja jest kluczowym elementem modelowania w procesie rozwoju leków, w tym w ocenie ryzyka wystąpienia DILI dla badanych związków28. W niniejszej pracy przedstawiliśmy nową metodę oceny DILI z wykorzystaniem MPS wątroby; protokół ten stanowi wysoce czuły i stabilny test, który umożliwia poszukiwanie wglądu w mechanizmy działania każdego badanego związku w celu ustalenia, w jaki sposób może on wywoływać DILI. Mikrotkanki wątroby są tworzone na płytkach MPS jako kokultura PHH i HKCs; charakteryzują się one wysoką funkcjonalnością, przejawiającą się wysokim poziomem produkcji albumin i mocznika, a także wysoką aktywnością CYP3A4 w porównaniu do standardowych modeli wątroby in vitro20.
Choć opisany tutaj model DILI może służyć jako użyteczne narzędzie w późniejszych etapach testów przedklinicznych w procesie opracowywania leków, posiada on również kilka ograniczeń. Podobnie jak większość systemów MPS obecnie dostępnych na rynku, jest to platforma o niskiej przepustowości, a zatem trudniejsza do zastosowania w wielkoskalowych badaniach przesiewowych leków. Składając się z mikrotkanek utworzonych poprzez kokulturę PHH i HKC, model DILI nie jest również w stanie w pełni oddać złożoności ludzkiej wątroby; dalsza optymalizacja poprzez włączenie różnych typów komórek (np. komórek odpornościowych) byłaby korzystna dla zwiększenia wartości istniejącego modelu. Ten jednorządowy MPS mógłby zostać połączony z platformami innych organów, które mogą dzielić wspólne medium i umożliwiać interakcje międzyorganowe na poziomie komórkowym lub endokrynnym, co pomogłoby w lepszym zrozumieniu mechanizmów toksyczności nieograniczonych tylko do samej wątroby. Ponadto, jak każda stosunkowo nowa technologia, może być ona uznana za kosztowną, a tym samym o ograniczonej dostępności.
MPS to platforma wykorzystywana do opracowywania organotypowych modeli pojedynczych lub wielu ludzkich tkanek. System składa się z kontrolera, kabla pępowinowego oraz sterownika MPS, do którego wkłada się płytkę (Rysunek 5A). Każda płytka MPS dla wątroby posiada 12 niezależnych otwartych dołków do hodowli pierwotnych komórek wątroby w 3D na zaprojektowanych rusztowaniach. Podsumowując, system przechodzi kontrolę jakości, a płytki są przygotowywane w dniu -1; w dniu zero PHH i HKC są wysiewane na płytki (Rysunek 5B, patrz 1). Wbudowane mikropompy umożliwiają cyrkulację pożywki hodowlanej przez rusztowania, co ułatwia formowanie się trójwymiarowych mikrotkanek (Rysunek 5B, patrz 2). Uformowane mikrotkanki są poddawane kontroli jakości w dniu 4, poddawane działaniu różnych stężeń każdego związku co 48 h przez 4 dni, a w dniu 8 analizowane są pod kątem biomarkerów końcowych (Rysunek 5C). Harmonogram eksperymentalny testu DILI na płytce MPS przedstawiono na Rysunku 5D.
<img alt="Schemat układu mikroprzepływowego do stabilizacji hodowli komórkowych; konfiguracja do analizy stanu zdrowia i funkcji komórek." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63389/63389fig05.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rysunek 5"> 
Rysunek 5: Układ mikrofizjologiczny oraz harmonogram eksperymentalny standardowego testu DILI. (A) Układ mikrofizjologiczny wraz z jego komponentami: sterownik (1), kabel pępowinowy (2), stacja dokująca (3), sterownik MPS (4) i płytka LC12 (5). (B) Wysiew PHH i HKC na płytkę LC12 w dniu 1 (1); wbudowane mikropompy umożliwiają cyrkulację pożywek hodowlanych z regulowanymi prędkościami przepływu przez 3D mikro-tkanki wysiane na rusztowaniach (2). (C) Wyjmowanie rusztowań po zakończeniu badania. (D) Harmonogram eksperymentalny. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63389/63389fig05large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
Podczas wykonywania protokołu ważne jest przeprowadzenie rzetelnej kontroli jakości (QC) systemu przed rozpoczęciem pracy, aby sprawdzić, czy system funkcjonuje prawidłowo pod względem pneumatycznym, oraz wizualna inspekcja i wydajne przygotowanie płytek z materiałami eksploatacyjnymi, co zapewni równomierną funkcjonalność we wszystkich dołkach. Posiadanie wysokiej jakości pierwotnych ludzkich komórek jest niezbędne do realizacji tego protokołu, przy czym hepatocyty są znane z tego, że przylegają konsekwentnie w eksperymentach z kulturami komórkowymi i tworzą interakcje 3D. Rozmrażanie tych komórek jest również krytycznym etapem, ponieważ pierwotnych hepatocytów nie należy resuspenderować poprzez pipetowanie, gdyż może to szybko doprowadzić do śmierci komórek. Żywotność komórek powyżej 85% jest kluczowa dla udanego wysiewu, ponieważ duże ilości debris komórkowego będą zakłócać tworzenie się 3D mikrotkanek. Kontrola jakości uformowanych mikrotkanek wątroby w dniu 4. jest również istotna; użytkownik musi upewnić się, że zmierzone poziomy LDH i mocznika są akceptowalne, ponieważ parametry poza zakresem mogą wskazywać na tworzenie tkanek słabej jakości i umożliwiają bezpośrednie rozwiązywanie problemów. Na koniec, hydrokortyzon stosowany w pożywce do hodowli komórkowej musi zostać przygotowany na świeżo w dniu użycia, aby zapobiec niepożądanym procesom degradacji, które mogłyby wpłynąć na funkcjonalność hodowli komórkowej, ponieważ jest on niezbędny do utrzymania funkcjonalności metabolicznej hepatocytów.
Mimo znacznej złożoności, system MPS wątroby nie zawiera wszystkich typów komórek występujących w ludzkiej wątrobie. W celu zwiększenia istotności fizjologicznej możliwe jest dodanie do modelu dalszych typów komórek24,29, jednak powinno się to robić wyłącznie przy wyraźnym uzasadnieniu w kontekście zastosowania. W badaniach nad DILI kluczowym typem komórek są PHH, a włączenie HKC do tego modelu pozwala na określenie niektórych odpowiedzi immunologicznych. Należy również zauważyć, że PHH izolowane z ludzkich wątrób oraz dostępne komercyjnie krio konserwowane PHH wykazują tendencję do pewnych różnic między partiami. Wykazaliśmy tutaj, że niniejszy protokół daje powtarzalne wyniki przy zastosowaniu wysokiej jakości preparatów komórek. Można jednak spodziewać się pewnej zmienności między partiami, co można by zniwelować poprzez stosowanie partii pochodzących z puli wielu dawców. Ograniczenia te można pokonać, wykorzystując komórki hepatocytopodobne zróżnicowane z iPSC, które odtwarzają wiele właściwości funkcjonalnych PHH i były stosowane w procesie opracowywania leków30. Komórki HKC również wykazują zmienność między partiami oraz wysoki poziom aktywacji po rozmrożeniu; dlatego dawcy HKC są wstępnie walidowani wewnętrznie przed użyciem w eksperymentalnych hodowlach komórkowych (kokultura z walidowanymi PHH) i muszą wykazywać niski poziom aktywacji po rozmrożeniu; jest to oceniane poprzez pomiar biomarkerów IL-6 oraz TNF-alpha (patrz Supplementary Material).
Przedstawione tutaj dane potwierdzają, że test ten może dokładnie wykrywać DILI, pomagając w identyfikacji hepatotoksyn, które mogłyby nie zostać wykryte przez modele 2D10,11 a nawet niektóre modele 3D. Dane generowane z MPS nie są jeszcze stosowane jako standard w przemyśle farmaceutycznym do zgłoszeń regulacyjnych lub w celach przesiewania leków ze względu na brak standaryzacji i harmonizacji procesów, w tym powtarzalności między ośrodkami20. Przedstawione tutaj dane i podejścia eksperymentalne odpowiadają na ten problem, wykazując, że model wątroby może być rutynowo i niezawodnie stosowany w testach DILI w celu dokładnego przewidywania potencjalnej toksyczności nowych związków.
Poprzez pomiar szeregu punktów końcowych w celu uzyskania „sygnatury hepatotoksyczności”, metoda ta pomaga zidentyfikować związki o różnym stopniu ryzyka wystąpienia DILI (w tym związki niewykrywalne za pomocą innych metod in vitro) oraz ujawnić ich mechanizmy toksyczności. Technologia ta może wypełnić lukę między tradycyjnymi kulturami komórkowymi i modelami zwierzęcymi z jednej strony a badaniami klinicznymi z udziałem ludzi z drugiej, zmierzając w stronę symulacji ludzkich warunków biologicznych w celu przedklinicznej oceny toksyczności wątroby w ramach procesu opracowywania leków.

DILI pozostaje najczęstszą przyczyną ostrej niewydolności wątroby w USA i Europie i jest główną przyczyną zaniku związków w procesie opracowywania leków1. Prawie wszystkie klasy leków mogą powodować hepatotoksyczność, przy czym leki na ośrodkowy układ nerwowy i antybiotyki są zdecydowanie najczęstszymi metodami leczenia, które powodują DILI u pacjentów2. Hepatotoksyczność wywołana lekiem jest spowodowana złożoną interakcją czynników genetycznych, niegenetycznych i środowiskowych, prowadzącą do śmierci hepatocytów i innych typów komórek wątroby, w tym cholangiocytów i komórek śródbłonka1,3.
Czynniki wywołujące DILI można sklasyfikować na dwa sposoby: te, które powodują przewidywalne, zależne od dawki uszkodzenie wątroby lub te, które powodują idiosynkratyczne DILI, które jest rzadkie i rozwija się niezależnie od dawki leku, drogi lub czasu podania, ale jest odpowiedzialne za do jednej szóstej wszystkich ostrych niewydolności wątroby tylko w USA4. Niestety, DILI często nie jest wykrywany, dopóki leki nie osiągną klinicznych etapów procesu opracowywania leku. Ranga leczenia lekami w przypadku uszkodzenia wątroby (lub DILIrank) składa się z ponad tysiąca leków zatwierdzonych przez FDA, które są podzielone na cztery klasy w zależności od ich potencjału do wywoływania DILI, a ich stosowanie u pacjentów musi być ściśle monitorowane5.
Badanie mechanizmów hepatotoksyczności leków pozostaje bardzo trudne, dlatego też opracowano wiele modeli przedklinicznych w celu zbadania mechanizmów DILI. Obecne modele in vitro i in vivo wykorzystywane do przewidywania DILI w badaniach przedklinicznych mają kilka ograniczeń w dostarczaniu wglądu w złożone, wieloaspektowe interakcje w żywym ciele ludzkim. Nowotworowe linie komórek wątroby (tj. HepG2, HepaRG) hodowane w 2D są nadal używane we wczesnych stadiach rozwoju leku do oceny toksyczności związków kandydujących6. Mimo to te linie komórkowe pochodzą od pojedynczych dawców i wykazują nieprawidłowy poziom czynności wątroby i nie zawsze wykazują wysoką czułość w wykrywaniu DILI7,8. Jako alternatywa dla nowotworowych linii komórkowych wątroby, PHH lepiej reprezentują fizjologię ludzkiej wątroby, jeśli są odpowiednio hodowane in vitro, chociaż istnieje kilka ograniczeń związanych z ich hodowlą, takich jak krótki czas inkubacji z lekami, stosunkowo krótka długość życia, utrata ekspresji genów wątrobowych i zmiany funkcji metabolicznych leków9,10,11. PHH mogą być hodowane na białkach macierzy zewnątrzkomórkowej na standardowych płytkach do hodowli komórkowych 2D, ale wadą jest szybki spadek ich funkcji, co oznacza, że mają niską czułość (<50%) na przewidywanie DILI12.
Z drugiej strony, testowanie na modelach zwierzęcych jest powolne, kosztowne i wymaga translacji międzygatunkowej, aby ekstrapolować przewidywania na ludzi. Większość nowo opracowanych leków nie uzyskuje aprobaty, co czyni ten proces kosztownym i ryzykownym5. Ponadto, do testowania nowych modalności specyficznych dla człowieka, modele zwierzęce są mniej odpowiednie ze względu na różnice w sekwencji genów lub odpowiedzi immunologicznej w porównaniu z ludźmi13.
W związku z tym, zainteresowanie bardziej zaawansowanymi trójwymiarowymi (3D) modelami wątroby in vitro gwałtownie wzrosło. Hodowla PHH jako sferoidalnych struktur generowanych przez agregację grawitacyjną w wiszących kroplach lub na bardzo niskich powierzchniach mocowania stanowi wysokoprzepustową metodę oceny zobowiązań złożonych14. Sferoidy PHH zostały użyte do oceny DILI w tle chorobowym (np. stłuszczenie i cholestaza)15. Opracowano szeroką gamę modeli, aby uwzględnić platerowane mikrowzorzyste kokultury hepatocytów z fibroblastami zrębu 16, 3D bio-printed liver tissues17, 3D sferoidalne kultury z komórkami niemiąższowymi wątroby lub bez nich15. Jednak wszystkie te metody nadal mają wady, a hodowla PHH w bardziej fizjologicznie istotnym mikrośrodowisku może zapewnić im wyższy poziom funkcjonalności przez dłuższy czas, aby umożliwić badanie długotrwałego narażenia na potencjalne hepatotoksyczne. Dodatkowo, aby poprawić znaczenie translacyjne każdej zaawansowanej hodowli PHH in vitro, należy wykorzystać klinicznie istotne funkcjonalne punkty końcowe lub biomarkery wyjściowe toksyczności, aby umożliwić porównanie danych in vivo lub scenariuszach klinicznych18.
W tym badaniu oceniliśmy, czy model wątroby in vitro MPS, znany również jako Organ-on-a-Chip (OOC), może być użyty do zrozumienia szczegółowych mechanistycznych aspektów toksyczności wątroby. Wcześniej wykazano, że MPS utrzymuje wysoce funkcjonalne mikrotkanki wątroby 3D, pod przepływem, przez okres do 4 tygodni19. System został niedawno przetestowany przez FDA i wykazano, że ma wysoką odtwarzalność podczas wykonywania testów toksyczności leków, metabolizmu i akumulacji wewnątrzkomórkowej20. Co więcej, w porównaniu ze sferoidami i kulturami kanapkowymi, system miał bardziej stabilną funkcję i wyższą czułość w wykrywaniu toksyczności kilku leków20. Do tej pory MPS był używany w szerokim zakresie zastosowań, które obejmują ADME21, modelowanie chorób (HBV22, NAFLD23,24,25) oraz interakcje lek-lek26, co potencjalnie czyni go wysoce odpowiednim do oceny ostrego i przewlekłego DILI. Przedstawiona tu technologia stanowi alternatywę pozwalającą wypełnić lukę między bardziej tradycyjnymi hodowlami komórkowymi i modelami zwierzęcymi a badaniami klinicznymi na ludziach, posuwając się w kierunku symulacji warunków biologicznych człowieka w celu wsparcia oceny toksyczności substancji kandydujących dla wątroby na przedklinicznych etapach procesu opracowywania leku.

<table><tbody><tr><td>24-dołkowe płytki klastrowe do hodowli komórkowych z płaskim dnem</td><td>Corning</td><td>3524</td><td></td></tr><tr><td>96-dołkowe przezroczyste płytki testowe, płaskie dno przezroczyste tworzywo sztuczne</td><td>Greiner</td><td>655101</td><td></td></tr><tr><td>96-dołkowe czarne płaskie dno</td><td>Corning</td><td>3915</td><td></td></tr><tr><td>96 Well Biała/przezroczysta płyta dolna, powierzchnia TC</td><td>ThermoScientific</td><td>165306</td><td></td></tr><tr><td>Advanced DMEM (1x)</td><td>Gibco</td><td>12491015</td><td>Pożywki do hodowli komórkowych.</td></tr><tr><td>AssayMax Albumina Zestaw ELISA</td><td>AssayPro</td><td>EA3201-1</td><td>Rozcieńczenie 1:250. Punkt czasowy Dzień 4, 6 i 8.</td></tr><tr><td>Koktajl utrzymania komórek B, (Pierwotne suplementy podtrzymujące hepatocyty)</td><td>Gibco</td><td>CM4000</td><td></td></tr><tr><td>CellTiter-Glo 3D Test żywotności komórek</td><td>Promega</td><td>G9682</td><td>Rozcieńczenie 1:1. Punkt czasowy Dzień 8.</td></tr><tr><td>Chlorpromazyna HCl</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C8138</td><td></td></tr><tr><td>Chromacol niebieskie pokrywki, 9 mm Autosampler Nasadki gwintowane na fiolki</td><td>ThermoScientific</td><td>9-SCK(B)-ST1</td><td>Fiolki szklane</td></tr><tr><td>Fiolki Chromacol, 9 mm fiolki z przezroczystym szkłem</td><td>Komory</td> bezpieczeństwa mikrobiologicznego ThermoScientific <td>2-SVW</td><td></td></tr><tr><td>klasy 2 - Trimat2 1500 wydech</td><td>Roztwory</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>powietrza zamkniętegoProbówki stożkowe 50 ml</td><td>Greiner</td><td>227261</td><td></td></tr><tr><td>Kriokonserwowane pożywki do odzyskiwania hepatocytów (CHRM)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>Gibco CM7000</td><td></td></tr><tr><td>Kriokonserwowane pierwotne hepatocyty ludzkie</td><td>BioIVT Europe</td><td>Lot. RAS</td><td></td></tr><tr><td>CytoTox 96 Zestaw do oznaczania cytotoksyczności (LDH) Promega</td><td></td><td>G1781</td><td>Rozcieńczenie - brak. Punkt czasowy Dzień 4, 6 i 8</td></tr><tr><td>>Model analizy danych wykorzystany do wygenerowania wykresu i krzywych EC:50 to regresja nieliniowa (dopasowanie krzywej) asymetryczna sigmoidalna, 5PL, gdzie X jest logarytmem (stężenie</td><td>GraphPad Prism 9</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Jednorazowe jednostki filtrujące PES 500 ml</td><td>Fisher Scientific</td><td>15913307</td><td></td></tr><tr><td>Jednorazowe miski na pipety 50 ml</td><td>Fisher Scientific</td><td>12369175</td><td></td></tr><tr><td>DMSO (dimetylosulfotlenek)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Sigma D2650</td><td></td></tr><tr><td>Dulbeco' s Sól fizjologiczna buforowana fosforanami bez Ca2+ i Mg2+ (D-PBS)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>14190-144</td><td></td></tr><tr><td>Easy Reader Stożkowe probówki wirówkowe z polipropylenu 15 ml</td><td>Fisher Scientific 11889640</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Surowica bydlęca</td><td>płodu Gibco</td><td>10500064</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw ELISA ludzkiego ALT Abcam</td><td></td><td>&nbsp; ab 234578</td><td>Rozcieńczenie 1:5. Punkt czasowy: Dzień 6 i 8.</td></tr><tr><td>Ludzkie kriokonserwowane komórki Kupffera</td><td>Lonza Europe Lot</td><td>. 190088KC</td><td></td></tr><tr><td>hydrokortyzon</td><td>Merck</td><td>H0888-1G</td><td></td></tr><tr><td>Modele inkubatorów: Nowy Brunszwik&nbsp; Galaxy 170 S, Nowy Brunszwik&nbsp; Galaxy 170 R oraz CellXpert&reg; Silnik C170.</td><td>Eppendorf</td><td></td><td>Wszystkie serwisowane rocznie; dokumenty dostępne na życzenie.</td></tr><tr><td>Mikroskop odwrócony</td><td>Leica DMIL LED</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MPS znany jako Organ-on-a-Chip (OOC)</td><td>CN Bio Innovations Ltd.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Płyta MPS LC-12</td><td>CN Bio Innovations Sp. z o.o.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Neubauer Ulepszony jednorazowy hemocytometr C-Chip (2 kanały)</td><td>Cambridge Bioscience</td><td>DHC-N01-50</td><td></td></tr><tr><td>P450-Glo CYP3A4 System oznaczania i badań przesiewowych Rozcieńczanie</td><td>Promega</td><td>V9002</td><td>- brak. Punkt czasowy, Dzień 8</td></tr>: <tr><td>Platforma MPS PhysioMimix</td>, <td>CN Bio Innovations Ltd.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pioglitazone</td><td>MedChemExpress Tocris</td><td>HY-13956/CS-1700</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw do oznaczania mocznika Quantichrom &ndash; Systemy testów biologicznych</td><td>Systemy testów biologicznych</td><td>DY970-05</td><td>Rozcieńczenie 1:2, jeśli początkowy odczyt jest zbyt wysoki. Punkt czasowy Dzień 4, 6 i 8.</td></tr><tr><td>Żel krzemionkowy</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7625</td><td></td></tr><tr><td>Oprogramowanie używane do analizy i generowania wszystkich wykresów to</td><td>GraphPad Prism 9</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Stripettes 10 mL</td><td>Fisher Scientific</td><td>11839660</td><td></td></tr><tr><td>Stripettes 25 mL</td><td>Fisher Scientific</td><td>11839181</td><td></td></tr><tr><td>Płytka do rozmrażania Cocktail A, (Primary Hepatocyte Thawing and Plating Supplements)</td><td>Gibco</td><td>CM3000</td><td></td></tr><tr><td>Troglitazone</td><td>MedChemExpress Tocris</td><td>97322-87-7</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór błękitu trypanowego, 0,4%</td> <td>15250061</td><td></td> <td>Gibco</td></tr><tr><td>Probówki 1,5 ml</td><td>Greiner</td><td>616201</td><td></td></tr><tr><td>Waga wagowa - model PA214C i AV213C</td><td>Ohaus Corp</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

mikrofizjologiczny układ wątroby człowieka do oceny toksyczności wątroby indukowanej lekami in vitro

Human Liver Microphysiological System for Assessing Drug-Induced Liver Toxicity In Vitro

DILI jest główną przyczyną wyczerpania w rozwoju leków, z ponad 1000 zatwierdzonych przez FDA leków, o których wiadomo, że potencjalnie powodują DILI u ludzi. Niestety, DILI często nie jest wykrywany, dopóki leki nie osiągną stadium klinicznego, co zagraża bezpieczeństwu pacjentów i prowadzi do znacznych strat dla przemysłu farmaceutycznego. Biorąc pod uwagę, że standardowe modele 2D mają ograniczenia w wykrywaniu DILI, konieczne jest opracowanie modeli in vitro, które są bardziej predykcyjne, aby poprawić translatywalność danych. Aby szczegółowo zrozumieć przyczynowość i mechanistyczne aspekty DILI, opracowano MPS ludzkiej wątroby składający się z ludzkich pierwotnych komórek miąższowych i niemiąższowych wątroby (NPC) i hodowanych w mikrotkankach 3D na zmodyfikowanym rusztowaniu pod perfuzją. Kriokonserwowane pierwotne ludzkie hepatocyty (PHH) i komórki Kupffera (HKC) hodowano wspólnie jako mikrotkanki na platformie MPS przez okres do dwóch tygodni, a każdy związek będący przedmiotem zainteresowania był wielokrotnie dawkowany na mikrotkanki wątroby w siedmiu stężeniach testowych przez okres do czterech dni. Przeanalizowano funkcjonalne punkty końcowe specyficzne dla wątroby (w tym biomarkery kliniczne, takie jak aminotransferaza alaninowa, AlAT) w celu oceny czynności wątroby. Ostre i przewlekłe narażenie na związki o różnym nasileniu DILI można ocenić, porównując odpowiedzi na mikrotkanki podawane w pojedynczej i wielokrotnej dawce. Metodologia ta została zwalidowana z szerokim zestawem ciężkich i łagodnie hepatotoksycznych związków. Poniżej przedstawiamy dane dotyczące pioglitazonu i troglitazonu, dobrze znanych związków hepatotoksycznych wycofywanych z rynku w celu powodowania niewydolności wątroby. Ogólnie rzecz biorąc, wykazano, że model MPS wątroby może być użytecznym narzędziem do oceny DILI i jego związku ze zmianami czynności wątroby. Model może być dodatkowo wykorzystany do oceny, jak nowe związki zachowują się w różnych podgrupach pacjentów oraz jak na profile toksyczności mogą wpływać stany chorobowe wątroby (np. wirusowe zapalenie wątroby, stłuszczenie wątroby).

Niniejszy artykuł opisuje model MPS wątroby wykorzystywany do oceny DILI. System MPS umożliwia generowanie trójwymiarowych mikrotkanek wątroby, które zachowują wysoką funkcjonalność w warunkach przepływu przez okres do 4 tygodni. Komórki PHHs/HKCs są wysiewane na rusztowania pokryte kolagenem w celu utworzenia mikrotkanek wątroby, które są perfundowane pożywką wzrostową, a po przejściu kontroli jakości (QC) poddawane działaniu badanych związków. W pracy przedstawiono dane dla troglitazonu i pioglitazonu — dwóch strukturalnie podobnych związków, które wykazują różny stopień nasilenia DILI.
W 4. dniu, przed podaniem leku, przeprowadza się kontrolę jakości (QC) uformowanych mikrotekanek wątrobowych, która polega na ocenie uwalniania LDH oraz syntezy mocznika (Rysunek 1A). Kontrola QC ma na celu potwierdzenie, że system MPS wątroby wytwarza wysoce spójne i funkcjonujące mikrotkanki wątrobowe. Przedstawione tutaj dane zostały wygenerowane z trzech eksperymentów i wykazują dobry poziom powtarzalności przy niskiej zmienności wewnątrz- i międzybadaniowej. Po 8-dniowej hodowli oceniano wiele wskaźników zdrowotnych i wątrobowych (albuminy, mocznika, CYP3A4, ATP), a mikrotkanki kontrolne wykazały wysoki poziom funkcjonalności wątrobowej i powtarzalności (Rysunek 1B,C). Mikroskopia fazowo-kontrastowa i barwienie IF mikrotekanek wątrobowych (patrz Materiały uzupełniające) wykazują wysoką spójność wysiewu w mikrokanałach rusztowania oraz ujawniają rozkład HKC w mikrotkankach PHH (Rysunek 1D)
<img alt="Analiza hodowli komórkowej; wykresy i mikrografie aktywności enzymatycznej, białek i metabolizmu leków." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63389/63389fig01.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1: Wątróbny system mikrofizjologiczny (MPS) generuje wysoce powtarzalne dane i spójne mikrotkanki. (A) Wskaźniki kontroli jakości (QC) 3D mikrotkanki wątroby w dniu 4 oraz ocena funkcjonalności na koniec badania w dniu 8 -(B) albuminy i mocznika, (C) CYP3A4 i ATP). Dane zostały zebrane z 3 eksperymentów; w każdym eksperymencie zastosowano 3 powtórzenia kontroli nośnikiem. Przedstawione dane to średnia ± SD, N = 9. (D) Mikroskopia w kontraście fazowym (10x i 20x) oraz immunofluorescencja (IF) 3D mikrotkanek wątroby wytworzonych poprzez kokulturę PHH i HKC na platformie wątrobnego MPS w celu oceny DILI. Aby zwizualizować HKC, przed wysianiem komórki HKC zostały przetransdukowane wektorem adenowirusowym ekspresującym eGFP (patrz Materiały uzupełniające). Przedstawiono reprezentatywne mikrofotografie. Transdukcja i obrazowanie zostały przeprowadzone jako oddzielny eksperyment w celu zademonstrowania lokalizacji komórek i nie były częścią opisanego protokołu DILI. Komórki HKC są wstępnie walidowane wewnętrznie przed użyciem w eksperymentalnej hodowli komórkowej i muszą wykazywać niski poziom aktywacji po rozmrożeniu; ocenia się to poprzez pomiar biomarkerów IL-6 i TNF-alpha. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63389/63389fig01large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
 wiadomo, że troglitazon wywołuje ciężkie DILI; po dopuszczeniu go do obrotu w leczeniu cukrzycy typu 2, został on wycofany przez FDA po 3 latach obecności na rynku ze względu na częstotliwość występowania uszkodzeń wątroby związanych z jego stosowaniem. Do tej pory opublikowane badania na zwierzętach nie pozwoliły przewidzieć potencjału troglitazonu do wywoływania ciężkiego uszkodzenia wątroby. Toksyczność tego związku nie została również wykryta w standardowych testach wątrobowych 2D in vitro14.
Mikrotkanki wątroby w systemie MPS poddano działaniu troglitazonu przez 96 h, co wywołało ostrą odpowiedź toksyczną zależną od Cmax, którą wykryto poprzez uwalnianie ALT i LDH oraz gwałtowny spadek produkcji albumin i mocznika przy stężeniu około 15 x Cmax po ostrej ekspozycji na troglitazon (Rysunek 2A). Punkt końcowy na poziomie komórkowym (zawartość ATP) oraz aktywność CYP3A4 (do oceny biotransformacji metabolicznej), zmierzone po 96 h ekspozycji, dodatkowo potwierdziły toksyczność wywołaną przez troglitazon, a wartości EC:50 były wysoce porównywalne z innymi punktami końcowymi (Rysunek 2B). Obrazy z mikroskopii w świetle przechodzącym wykonane po 8-dniowej hodowli w systemie MPS ukazują zdrową mikrotkankę wątroby, równomiernie zasiedloną w całym rusztowaniu (kontrola nośnika), w przeciwieństwie do uogólnionej śmierci/degeneracji tkanki widocznej w powtórzeniach traktowanych kontrolą pozytywną oraz troglitazonem w dwóch najwyższych stężeniach testowych (Rysunek 2C).
<img alt="Analiza żywotności komórek; wykresy LDH, ALT, mocznika, albuminy; obrazy mikroskopowe efektów troglitazonu." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63389/63389fig02.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rycina 2"> 
Rycina 2: Określanie ryzyka DILI troglitazonu przy użyciu wielu punktów końcowych hepatotoksyczności. Mikrotkanki wątroby poddano działaniu siedmiu stężeń testowych troglitazonu przez 96 h i porównano pod kątem (A) uwalniania LDH, uwalniania ALT, produkcji albuminy, syntezy mocznika, aktywności CYP3A4 oraz zawartości ATP. Linie niebieskie – ekspozycja przez 48 h (tylko punkty końcowe w medium), linie czerwone – ekspozycja przez 96 h. Kontrolą pozytywną była chlorpromazyna 100 μM. Wszystkie punkty końcowe zmierzono w tych samych kulturach MPS wątroby. Przedstawione dane to średnia ± SD, N = 3. (B) Podsumowanie wartości E:50 wygenerowanych z danych. N.D. = dane niemożliwe do naniesienia na wykres. Linia = brak analizy. (C) Reprezentatywny obraz mikroskopii w świetle przechodzącym mikrotkanek wątroby po 8-dniowej hodowli (powiększenie 10x). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63389/63389fig02large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
Zbadano również toksyczność dla wątroby po ekspozycji na pioglitazon. Pioglitazon jest związkiem znanym z niskiego ryzyka wywołania DILI4 i nie wykazywał hepatotoksyczności w klasycznych 2D kulturach pierwotnych hepatocytów, a nawet w niektórych bardziej zaawansowanych modelach 3D10, 11. Łagodne efekty hepatotoksyczne zaobserwowano w obu badanych punktach czasowych (Rycina 3). Nie wykryto uwalniania LDH ani ALT; jednak po 48 h zaobserwowano łagodny spadek produkcji albuminy i mocznika przy stężeniu ok. 25x Cmax (Rycina 3A). Przy wysokich stężeniach pioglitazonu odnotowano również niewielki spadek zawartości ATP, lecz nie był on istotny. Wartości EC:50 wyznaczone z krzywych zależnych od dawki przedstawiono na Rycynie 3B). Badanie mikroskopowe wykazało niewielkie zmiany w mikrotkance po 96-godzinnej ekspozycji na pioglitazon w dwóch najwyższych badanych stężeniach (Rycina 3C). Wyniki te demonstrują zdolność systemu MPS wątroby do wykrywania toksyczności związków o łagodnym ryzyku DILI.
<img alt="Wyniki testu hepatotoksyczności: wykresy LDH i ALT (A); tabela wyników (B); obrazy kropli (C); pioglitazon." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63389/63389fig03.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rycina 3"> 
Rycina 3: Określanie ryzyka DILI dla pioglitazonu z wykorzystaniem wielu parametrów hepatotoksyczności. Mikrotkanki wątroby eksponowano na siedem stężeń testowych pioglitazonu przez 96 h i porównywano pod kątem (A) uwalniania LDH, uwalniania ALT, produkcji albuminy, syntezy mocznika, aktywności CYP3A4 oraz zawartości ATP. Linie niebieskie – ekspozycja przez 48 h (tylko parametry medium), linie czerwone – ekspozycja przez 96 h. Kontrolą dodatnią była chlorpromazyna 100 μM. Wszystkie parametry zmierzono w tych samych kulturach MPS wątroby. Przedstawione dane to średnia ± SD, N = 3. (B) Podsumowanie wartości EC:50 wyznaczonych na podstawie danych. N.D. = dane niemożliwe do przedstawienia na wykresie. Linia = brak analizy. (C) Reprezentatywne zdjęcia mikroskopii w polu jasnym mikrotkanek wątroby po 8-dniowej hodowli (powiększenie 10x). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63389/63389fig03large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
Poprzez ocenę wszystkich funkcjonalnych punktów końcowych oraz biomarkerów toksyczności, które mogą reprezentować scenariusze in vivo lub kliniczne (uwalnianie LDH, synteza mocznika, produkcja albumin, aktywność CYP3A4, zawartość ATP, uwalnianie ALT) oraz potwierdzenie danych uzyskanych dla obu badanych związków podanych w siedmiostopniowym zakresie dawek przez 48 h i 96 h, wygenerowano mapę ciepła w celu uzyskania „sygnatury hepatotoksyczności”, co pomaga zidentyfikować związki o różnym stopniu ryzyka wystąpienia DILI (Rycina 4).
<img alt="Mapa ciepła markerów biochemicznych; poziomy enzymów LDH i ALT; analiza wpływu stężenia leku." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63389/63389fig04.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rysunek 4"> 
Rysunek 4: Określanie „sygnatury toksyczności” za pomocą MPS wątroby. Mapa ciepła przedstawiająca wpływ troglitazonu i pioglitazonu na sześć funkcjonalnych punktów końcowych specyficznych dla wątroby (uwalnianie LDH, synteza mocznika, produkcja albumin, uwalnianie ALT, aktywność CYP3A4 i zawartość ATP) po 48 h i 96 h ekspozycji na siedmiopunktowy zakres dawek. Każda wartość została wyznaczona jako średnia dla N = 3 i znormalizowana względem próbek kontrolnych. Wartości na paskach kolorów reprezentują krotność wzrostu w stosunku do kontroli bazowych. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63389/63389fig04large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
Materiały uzupełniające: Obrazowanie mikrotkanek za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego i ocena wstępnej kwalifikacji komórek. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63389/Supplementary%20Material-63389R1.docx" target="_blank">Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.</a>

Indukowane lekami uszkodzenie wątroby (DILI) jest główną przyczyną niepowodzenia leku. Opracowano protokół umożliwiający dokładne przewidywanie odpowiedzialności związku za DILI za pomocą systemu mikrofizjologicznego wątroby (MPS). Model wątroby wykorzystuje kokulturę pierwotnych komórek wątroby i punktów końcowych istotnych translacyjnie do oceny odpowiedzi komórkowych na leczenie.

Mikrofizjologiczny układ wątroby człowieka do oceny toksyczności wątroby indukowanej lekami in vitro

DILI is a major cause of attrition in drug development with over 1000 FDA-approved drugs known to potentially cause DILI in humans. Unfortunately, DILI is ...

Protokół opisuje, w jaki sposób oceniać uszkodzenie wątroby wywołane lekiem in vitro przy użyciu systemu mikrofizjologicznego, który może utrzymać wysoce funkcjonalne i metabolicznie aktywne mikrotkanki wątroby przez okres do czterech tygodni. Podejście to jest specyficznym dla człowieka modelem hodowli komórkowej w celu dokładnego wykrycia odpowiedzialności za uszkodzenie wątroby wywołane lekami w przypadku nowych związków, co jest bardziej predykcyjne niż prostsze hodowle 2D lub nawet bardziej złożone hodowle 3D. Technika ta może być stosowana jako część zestawu przedklinicznych testów bezpieczeństwa w celu określenia, czy związek jest bezpieczny do rozpoczęcia badań klinicznych.Można testować wiele różnych modalności. Rozpocznij konfigurację systemu mikrofizjologicznego wątroby, podłączając kontroler do stacji dokującej w inkubatorze do hodowli komórkowych. Upewnij się, że świeży środek osuszający został dodany do słoika ze środkiem osuszającym znajdującego się z tyłu sterownika.Po włączeniu sterownika poprzez naciśnięcie przełącznika kołyskowego łodzi należy odczekać pięć minut, aż system się ustabilizuje i osiągnie ciśnienie. Wyjmij każdą płytkę z opakowania. Następnie zalej każdą studzienkę, dodając 500 mikrolitrów wstępnie podgrzanego zaawansowanego podłoża wysiewającego DMEM po stronie zbiornika.Umieść sterownik na stacji dokującej w inkubatorze. Po zakończeniu wybierz program główny na ekranie sterownika, aż płyn przejdzie przez wsporniki filtra. Aby pokryć kanał powierzchniowy, napełnij wszystkie studzienki 1,1 mililitra zaawansowanego podłoża DMEM do wysiewu.Po umieszczeniu sterowników z płytkami w inkubatorze w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla, podłącz stację dokującą i uruchom program inkubacji. Rozmrozić fiolki z PHH i HJC, trzymając je w łaźni wodnej o temperaturze 37 stopni Celsjusza, aż pozostanie tylko mały kawałek lodu. Po rozmrożeniu delikatnie odpipetować maksymalnie dwie fiolki PHH bezpośrednio do probówki z wstępnie podgrzaną kriokonserwowaną pożywką do odzyskiwania hepatocytów, pożywką CHRM.Następnie użyj jednego mililitra CHRM, aby umyć pozostałe komórki z krioprobówki. Delikatnie odpipetuj HKC z krioprobówki do 10 mililitrów lodowatego zaawansowanego podłoża DMEM w 50-mililitrowej probówce wirówkowej. Później odwiruj oba typy komórek osobno w temperaturze pokojowej 100 razy G przez 10 minut.Po odwirowaniu usunąć supernatant i ponownie zawiesić PHH w zaawansowanym pożywce DMEM do wysiewu na ciepło i HKC w zaawansowanej pożywce DMEM do wysiewu na zimno, używając jednego mililitra na fiolkę komórek dodanych do probówki. Ponownie zawieś komórki delikatnie kołysząc, a następnie umieść na lodzie. Po zawieszeniu policz komórki i zapisz żywotność.Żywotność ogniw musi przekraczać 85%Następnie odłącz sterownik od stacji dokującej i umieść sterownik w szafie bezpieczeństwa mikrobiologicznego lub MBSC. Następnie odessać pożywkę znad rusztowania do punktu zatrzymania, kanału i zbiornika, pozostawiając martwą objętość 0,2 mililitra w dołku hodowlanym, sięgając tuż nad rusztowaniem. Dodaj 400 mikrolitrów zaawansowanej pożywki DMEM do wysiewu do komory studziennej przed powrotem sterownika do stacji dokującej w inkubatorze i uruchomieniem programu wymiany pożywki na trzy minuty.Po trzech minutach odłącz sterownik od stacji dokującej i umieść go z powrotem w MBSC. Odessać pożywkę z powyższego rusztowania do punktu zatrzymania i na końcu zbiornika każdej studzienki, a następnie ponownie zawiesić PHH, delikatnie kołysząc rurką i dodając wymaganą objętość zawiesiny komórkowej do każdej studzienki hodowlanej. Ostrożnie odpipetować zawiesinę komórek, upewniając się, że komórki są równomiernie rozproszone na rusztowaniu płytki.Ostrożnie ponownie zawiesić HKC i dobrze dodać zawiesiny komórkowe do każdej hodowli. Gdy wszystkie studzienki zawierają oba typy komórek, umieść system mikrofizjologiczny lub sterownik MPS na stacji dokującej w inkubatorze bez fizycznego podłączania, aby stać przez godzinę. Po upływie godziny podłącz sterownik do stacji dokującej i uruchom program seed.Gdy program automatycznie zatrzyma się po dwóch minutach, wyjmij sterownik z inkubatora i powoli dodaj 1,000 mikrolitrów zaawansowanej pożywki DMEM do wysiewu do kanału, aby uzyskać całkowitą objętość 1,4 mililitra. Później przenieś płytki do inkubatora i uruchom resztę programu nasiennego na osiem godzin. Czwartego dnia wstrzymaj program na kontrolerze i odłącz sterownik oraz płytkę od stacji dokującej.Przenieś je do narzędzia MBSC. Użyj pipety, aby ręcznie pobrać około jednego mililitra pożywki z każdej studzienki w celu analizy rozpuszczalnych biomarkerów bez zakłócania hodowli komórkowej poprzez dotykanie rusztowania. Oznacz pobrane podłoża jako próbki z czwartego dnia i przeprowadź testy dehydrogenazy mleczanowej i mocznika jako kontrolę jakości, aby upewnić się, że wysiew zakończył się sukcesem.Następnie dozuj każdą studzienkę zgodnie z planem płytki, dokonując wymiany pożywki. Po zakończeniu włóż sterownik z powrotem do stacji dokującej w inkubatorze i uruchom program inkubacji. Szóstego dnia odłącz sterownik i tablicę rejestracyjną od stacji dokującej, a następnie przenieś się do MBSC.Użyj pipety, aby zebrać około jednego mililitra pożywki z każdej studzienki i oznacz próbki jako 48 godzin po podaniu i przechowuj próbki w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza do późniejszych testów. Ósmego dnia usuń rusztowania z płytek za pomocą pęsety i umieść rusztowania na 24-dołkowej płytce zawierającej 500 mikrolitrów DPBS bez wapnia i magnezu w każdej studzience bez naruszania mikrotkanki. Zrób zdjęcia każdego rusztowania pod mikroskopem światła odwróconego przy 10-krotnym powiększeniu.W czwartym dniu, przed podaniem leku, przeprowadzono kontrolę jakości utworzonych mikrotkanek wątroby z uwalnianiem LDH i syntezą mocznika. W ósmym dniu oceniono wiele wskaźników zdrowotnych i wątrobowych, takich jak albumina, mocznik, CYP, trzy, A, cztery, ATP, aby potwierdzić wysoki poziom funkcjonalności wątroby i odtwarzalności w mikrotkankach. Mikroskopia fazy kontrastowej i barwienie IF w mikrotkankach wątroby wykazały równomierne rozmieszczenie HKC w mikrotkankach PHH.Ostra ekspozycja mikrotkanek wątroby na troglitazon powodowała toksyczność, którą wykrywano za pomocą aminotransferazy alaninowej lub AlAT, oraz uwalnianie LDH i szybkie zmniejszenie produkcji albuminy i mocznika. Zawartość ATP i aktywność CYP trzy A cztery potwierdziły toksyczność powodowaną przez troglitazon, a wartości EC50 były wysoce porównywalne z innymi punktami końcowymi. Obrazy z mikroskopii w jasnym polu wykonane po ośmiodniowej hodowli w MPS ujawniają zdrową mikrotkankę wątroby, równomiernie rozsianą po całym rusztowaniu w pojeździe kontrolnym.Śmierć lub degradację tkanek obserwowano u kontrprób poddanych kontroli pozytywnej i troglitazonowi. Ponadto badano również toksyczny wpływ na wątrobę po ekspozycji na pioglitazon. Nie wykryto uwalniania LDH ani ALT, jednak po 48 godzinach zaobserwowano łagodne zmniejszenie produkcji albumin i mocznika.Obserwowano nieznaczne zmniejszenie zawartości ATP przy dużych stężeniach pioglitazonu. Wartości EC50 uzyskano na podstawie krzywych dawka-odpowiedź. Mikroskopia wykazała niewielkie zmiany w mikrotkankach po 96 godzinach ekspozycji na pioglitazon w dwóch najwyższych badanych stężeniach.W badaniu wykazano, że wykorzystanie komórek o dobrej jakości i żywotności powyżej 85% jest niezbędne do wytworzenia wysoce funkcjonalnych i zdrowych mikrotkanek 3D w systemie mikrofizjologicznym. Po tej procedurze możemy ocenić interakcje adeniny i lek-lek oraz uszkodzenie wątroby wywołane przez lek na modelach chorobowych, takich jak niealkoholowe zapalenie wątroby typu Delta lub model niealkoholowej stłuszczeniowej choroby wątroby, który wykorzystuje potrójną hodowlę komórek miąższowych i niemiąższowych wątroby.

human-liver-microphysiological-system-for-assessing-drug-induced

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Opisano technikę izolowania ludzkich hepatocytów i niemiąższowych komórek wątroby od tego samego dawcy. Różne typy komórek wątroby stanowią podstawę funkcjonalnych modeli wątroby i inżynierii tkankowej. Ta nowa metoda ma na celu wyizolowanie komórek wątroby w celu uzyskania wysokiej wydajności i żywotności.

Protokół izolacji pierwotnych ludzkich hepatocytów i odpowiadających im głównych populacji niemiąższowych komórek wątroby

Tutaj pokazujemy enzymatyczne podejście do izolacji pierwotnych hepatocytów od dorosłych myszy i opisujemy kwantyfikację odpowiedzi zapalnej za pomocą ELISA i PCR w czasie rzeczywistym.

Indukcja odpowiedzi zapalnej w pierwotnych kulturach hepatocytów od myszy

Celem tego protokołu jest dostarczenie przewodnika krok po kroku do przeprowadzenia eksperymentów 3-D z wirusem zapalenia wątroby typu B.

Hodowle "wątroby na chipie" pierwotnych hepatocytów i komórek Kupffera w leczeniu zakażenia wirusem zapalenia wątroby typu B

Opisujemy model immunizacji in vivo, translacyjnego zapalenia wątroby u myszy BALB/c, który może być wykorzystany do badania patogenezy indukowanego lekami autoimmunologicznego zapalenia wątroby, w tym różnic płci obserwowanych w tej chorobie. Opiszemy, w jaki sposób model ten demonstruje powtarzalne analizy przy użyciu technik eksperymentalnych in vivo i in vitro.

Indukcja indukowanego przez leki, autoimmunologicznego zapalenia wątroby u myszy BALB/c w celu zbadania jego mechanizmów patogennych

Wystawiliśmy system mikrofizjologiczny (MPS) z organoidami jelitowymi i wątrobowymi na działanie paracetamolu (APAP). W artykule opisano metody produkcji organoidów oraz oceny właściwości farmakokinetycznych i toksykologicznych APAP w MPS. Opisano w nim również analizy funkcjonalności tkanek niezbędne do walidacji wyników.

Układ mikrofizjologiczny jelita/wątroby do oceny farmakokinetyki i toksykologicznej leku

Ta procedura została ustanowiona do wykorzystania do rozwoju zaawansowanych hodowli wątroby 3D in vitro, które mogą dostarczyć bardziej fizjologicznie istotną ocenę zagrożeń genotoksycznych związanych z ekspozycją na nanomateriały zarówno w ostrym, jak i długotrwałym, powtarzanym dawce.

Zaawansowane modele 3D wątroby do badań genotoksyczności in vitro po długotrwałym narażeniu na nanomateriały

Tutaj prezentujemy niegenetyczną metodę generowania ludzkich autologicznych sferoid wątroby przy użyciu komórek jednojądrzastych wyizolowanych z krwi obwodowej w stanie ustalonym.

Sferoidy ludzkiej wątroby z krwi obwodowej w badaniach nad chorobami wątroby

Protokół ten opisuje wytwarzanie szybkich i powtarzalnych endodermalnych organoidów wątrobowych (eHEPO). Dzięki temu protokołowi eHEPO mogą być produkowane w ciągu 2 tygodni i rozwijać się w dłuższej perspektywie (ponad 1 rok) bez utraty swojego zróżnicowania i funkcjonalności.

Wytwarzanie funkcjonalnych endodermalnych organoidów wątroby

Tutaj prezentujemy solidną metodę perfuzji in situ wątroby myszy do badania ostrej i bezpośredniej regulacji metabolizmu wątroby bez naruszania architektury wątroby, ale przy braku czynników pozawątrobowych.

Produkcja glukozy w wątrobie, mocznicozna, i lipoliza oznaczone ilościowo przy użyciu perfundowanego modelu wątroby myszy

Ostatnie osiągnięcia techniczne umożliwiły skalowaną produkcję platformy in vitro do zastosowań związanych z metabolizmem leków i toksycznością. Całkowicie ludzki układ wątrobowy 2D+ (TV2D+) zapewnia fizjologicznie istotne wyniki przy użyciu tradycyjnych metod hodowli dwuwymiarowej. Protokół ten będzie wspierał użytkowników końcowych w konfiguracji, konserwacji i stosowaniu systemu.

Całkowicie ludzki system hodowli wątroby do zastosowań związanych z opracowywaniem leków

Poznaj mikrofizjologiczny układ wątroby do oceny toksyczności indukowanej lekami in vitro. Ta metoda utrzymuje funkcjonalne mikrotkanki wątrobowe przez cztery tygodnie, oferując przewidywalniejszy model niż tradycyjne kultury 2D i 3D.

Mikrofizjologiczny układ wątroby człowieka do oceny toksyczności wątroby indukowanej lekami in vitro

Przeglądaj więcej filmów