Name: Przystępna cenowo biofabrykacja sferoid wielokomórkowych wspomagana mikroskopią tlenową (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-04-06T13:20:00.000+00:00
Duration: 13 min 21 s
Description: Poznaj metodę biofabrykacji sferoid wielokomórkowych z wykorzystaniem mikroskopii fluorescencyjnej do analizy utlenowania i żywotności komórek. Protokół umożliwia wysokoprzepustową produkcję mikrotkanek do zastosowań w bioprintingu 3D i inżynierii tkanek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca została wsparta przez grant Specjalnego Funduszu Badawczego Uniwersytetu w Gandawie (BOF/STA/202009/003) oraz Program ITN 7PR UE "Chebana", umowa grantowa nr 264772 (dla AVK). Dane są dostępne na żądanie. Kod G do biodruku jest dostępny do udostępnienia.

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Znaczenie. Pomiar natlenienia tkanek daje wgląd w metabolizm specyficzny dla komórek i tkanek, wzrost i rozwój tkanek, żywotność, nowotworzenie i migrację komórek oraz interakcje z drobnoustrojami i innymi patogenami. Przedstawiona metoda daje nowe narzędzie do lepszego zrozumienia fizjologii wielokomórkowych kultur sferoidalnych: analizę natlenienia za pomocą ratiometrycznych sond nanocząstekO2 oraz dostarcza środków do oceny niedotlenienia, wizualizacji zależności od określonych szlaków produkcji energii oraz uzupełnia badania modelowe i alternatywne podejścia do obrazowania metabolicznego 43,44 na powszechnie dostępnym, niedrogim mikroskopie fluorescencyjnym. Pomiary ratiometryczne można wykonywać na fluorescencyjnym mikroskopie szerokopolowym (preferowane impulsowe wzbudzenie LED), laserowo-skaningowym mikroskopie konfokalnym, arkuszowym świetlnym i dwufotonowym, idealnie wyposażonym w komory inkubatora Ti O2. Co ważne, prezentowany pomiar mikroskopowyO2 można łatwo połączyć z wieloparametrową analizą na żywo różnych parametrów fizjologicznych i znaczników komórkowych (w przypadku heterokomórkowych kultur sferoidalnych), żywotności (barwienie żywe/martwe), metabolizmu lipidów (sondy fluorescencyjne wykrywające lipidy), dynamiki pH (barwniki, nanocząstki i białka fluorescencyjne) lub [Ca2+] wykonywane w dostępnych kanałach spektralnych fluorescencji lub równolegle, dając rozszerzony wgląd w funkcję komórek w czasie rzeczywistym w sferoidach, biodrukowanych konstruktach i potencjalnych przeszczepach tkanek.
Hodowle sferoidalne znajdują zastosowanie w badaniach komórek nowotworowych, mikrośrodowiska niszowego guza i komórek macierzystych, nowotworów, badań przesiewowych skuteczności leków i toksyczności, a także jako elementy budulcowe tkanek do biofabrykacji tkanek i samoorganizacji45. Mogą one być generowane z wielu typów komórek przy użyciu różnych podejść46. Popularność modelu sferoidalnego wymusza ich standaryzację z punktu widzenia rzetelności badań i poprawy analizy danych, czego ostatnio próbowano poprzez opracowanie pierwszej bazy danych sferoidów8.
Oczekuje się, że nasz protokół pomoże lepiej zrozumieć żywy metabolizm sferoidów, ustandaryzować ten model eksperymentalny, a następnie poprawić ich długoterminową stabilność, odtwarzalność i żywotność w materiałach biodrukowanych i wszczepialnych.
Modyfikacje. Protokół ten opisuje zastosowanie mikrowzorzystej powierzchni agarozy o niskiej przyczepności (tworzenie oparte na mikropleśni29) do wysokowydajnego wytwarzania sferoid obciążonych sondą O2 do analizy natleniania. Alternatywne metody produkcji sferoidów, takie jak wiszące krople, nakładanie ultra niskich płytek mocujących, powlekanie lipidowe lub tworzenie swobodnego pływania, są również zgodne z sugerowanym protokołem ładowania sondyO2. Prezentowany protokół został zoptymalizowany dla sferoid hDPSC i sferoid kokulturowych hDPSC z HUVEC (1:1). Inne linie komórkowe są z pewnością możliwe do zastosowania 15,17,47,48; Jednak może być wymagana pewna optymalizacja protokołu ze względu na różne właściwości adhezji komórek, warunki hodowli, wymagania dotyczące substratu metabolicznego i kompatybilność komórek z barwieniem nanocząstek. Wybór odpowiedniej ratiometrycznej sondy czułej na nanocząstki O2 musi być dokonany w zależności od konkretnego modelu komórki i zgodnie z właściwościami fotowybielania sondy w zastosowanym zestawie mikroskopowym (intensywność i rodzaj źródła światła, czułość spektralna kamery) oraz dostępność odpowiednich filtrów wzbudzenia/emisji dla odpowiednich referencyjnych i czułych kanałów spektralnych O2 sondy.
Niektóre ratiometryczne sondyO2 są dostępne na rynku2. Alternatywnie można je przygotować we własnym zakresie poprzez współwytrącanie barwników referencyjnych i wrażliwych naO2-2 z polimerem, jak opisano w innym miejscu 24,25,49. Dla każdego indywidualnego modelu należy wykonać badania wstępne w celu określenia odpowiedniej sondy i optymalnych warunków mikroskopowych oraz zminimalizowania efektu fotowybielania sondy lub fotoindukowanego zużyciaO2 podczas pomiarów ratiometrycznych. Wcześniejsze badania nanocząstek wykrywającychO2 wykazały ich niską toksyczność komórkową, co pozwala na zastosowanie w szerokim zakresie stężeń barwienia (1-20 μg/ml). Ponieważ niektóre nanocząstki kationowe mogą samoczynnie agregować się podczas przechowywania, zalecamy utrzymywanie ich stężenia obciążenia na jak najniższym poziomie, aby zminimalizować ich potencjalny wpływ na tworzenie sferoidów. Opcjonalnie zawiesina nanocząstek może być filtrowana (0,2 μm) lub oczyszczana przez wirowanie (10 000 x g, 5 min) przed użyciem w celu usunięcia wszystkich agregatów z zawiesiny.
Chociaż oprogramowanie BioCAD i HMI jest specyficzne dla prezentowanej biodrukarki, protokół ten ma zastosowanie do innych biodrukarek, ponieważ zapewnione jest przygotowanie biotuszu, montaż, napełnianie standardowego wkładu oraz konstrukcja porowatego rusztowania hydrożelowego. Ponadto parametry biodruku, takie jak szybkość drukowania i temperatura, powinny być porównywalne dla różnych biodrukarek opartych na wytłaczaniu. Ciśnienie drukowania i średnica rozpórki zależą od rodzaju i średnicy igły, składu biotuszu, temperatury i lepkości wynikowej, ale mogą być punktem wyjścia do optymalizacji parametrów drukowania w celu biodruku biotuszów na bazie GelMA za pomocą różnych biodrukarek, chociaż niektóre biodrukarki używają wrzecion zamiast ciśnienia powietrza do wytłaczania biotuszu50.
Krytyczne kroki i rozwiązywanie problemów. Jednym z krytycznych etapów jest wybór sondyO2 , który opiera się na następujących względach: po pierwsze, dostępna konfiguracja mikroskopu fluorescencyjnego (tj. kompatybilne źródło światła wzbudzenia, filtry wzbudzenia i emisji, czułość kamery i przepuszczalność widmowa oraz apertura numeryczna obiektywu), które mogą ograniczać liczbę dostępnych sond pod względem ich fotostabilności, jasność i potencjalną fototoksyczność. Należy również zauważyć, że niektóre rodzaje olejków immersyjnych (w przypadku obiektywów immersyjnych z olejkiem) mogą zakłócać sygnały fluorescencji w kolorze czerwonym i podczerwonym. Uważamy, że testy fotostabilności są bardzo ważne i że muszą być wykonywane podczas wstępnej konfiguracji i testów wstępnych. Należy wziąć pod uwagę potencjalny przesłuch spektralny między kanałami fluorescencyjnymi a różnymi barwnikami. Rzeczywiście, potencjalna ciemna i fotoindukowana toksyczność sondyO2 i innych wybranych barwników, w odniesieniu do konkretnego modelu komórkowego, musi zostać oceniona podczas optymalizacji protokołu51. Specyficznym problemem dla nanocząstek może być ich samoagregacja, którą można złagodzić poprzez optymalizację ich stężenia roboczego, składu podłoża barwiącego (np. zawartość surowicy), sonikację nanocząstek przed zmieszaniem z pożywką lub użycie wstępnie wybarwionych i przemytych komórek za pomocą sondy O2 do tworzenia sferoid zamiast ładowania sondy podczas procedury tworzenia i kompaktyzacji sferoidy.
Nie zaobserwowaliśmy problemów związanych z głębokością penetracji światła w opisywanych modelach sferoidalnych, ale należy to wziąć pod uwagę przy doborze sygnałów o intensywności ratiometrycznej, wielkości konstruktów sferoidalnych i biofabrykowanych (przeszczepów tkankowych) oraz optymalizacji barwienia komórek odpowiednimi barwnikami. Oczekuje się, że sonda MMIR1 o ściśle dopasowanych długościach fal emisji czerwonej i bliskiej podczerwieni zapewni najniższe tło i najlepszą penetrację światła tkankowego w porównaniu z innymi sondami biosensorów fluorescencyjnych emitujących światło czerwono-niebieskie lub zielone.
Produkcja i obsługa obrazów proporcjowych (i potencjalnie demiksowanie lub dekonwolucja spektralna) może być wykonana w oprogramowaniu dostarczonym przez dostawcę lub w opcjach opensource, takich jak ImageJ, Fiji52,53, napari (https://napari.org), MATLAB i inne. Krytycznym krokiem będzie odjęcie tła i zmierzenie zmian intensywności sygnału w zakresie liniowym.
Kalibracja sondyO2: Rotenon i antymycyna A są inhibitorami kompleksów I i III mitochondrialnego łańcucha transportu elektronów, odpowiednio, blokując oddychanie komórkowe 54,55,15 i indukując rozpraszanie gradientów O 2 w sferoidach i ich równoważenie ze środowiskowymO2. Tak więc zmiana stężenia środowiskowegoO2 (tj. 20%, 15%, 10%, 5%, 2,5%, 1%, 0% O2) pozwoli na ratiometryczną kalibrację intensywności lub żywotności fosforescencji sondy O2 czułej na komórki w komórkach. Zazwyczaj inkubatory sterowaneO2 nie są w stanie osiągnąć bezwzględnego 0%O2 i w niektórych sytuacjach wymagany jest szybki test odpowiedzi sondy na odtlenienie. W takich przypadkach do próbki należy dodać 25-100 μg/ml oksydazy glukozowej lub mieszaniny Na2SO3/K2HPO4 (50 mg/ml na każdy związek na 10-krotny roztwór w wodzie destylowanej). Co ważne, jeśli linia komórkowa ma znaczny stopień niemitochondrialnego zużyciaO2, należy to wziąć pod uwagę podczas wykonywania eksperymentów z hamowaniem oddychania i kalibracją.
Ograniczenia i przyszłe badania. Głównym ograniczeniem proponowanej metody i detekcji ratiometrycznej w ogóle jest kalibracja i konwersja obserwowanych poziomów proporcji na rzeczywiste poziomyO2 , co ze względu na wewnętrzne różnice w sprzęcie i ustawieniach akwizycji obrazu użytkownika sprawiłoby, że kalibracja proporcji byłaby specyficzna dla przyrządu i komórki. Co ważne, w przypadku szerokokątnego mikroskopu fluorescencyjnego i opisanej konfiguracji, obrazy proporcji odzwierciedlają raczej połączone projekcje niż idealne przekroje optyczne, a kalibracjaO2 nie miałaby sensu. Z drugiej strony pokazujemy, że półilościowe pomiary wskaźnikowe dostarczają statystycznie istotnego i łatwego do zmierzenia fenotypowania porównawczego sferoid wytwarzanych z różnych źródeł i mających różnice w natlenieniu.
Przyszłe badania nad stworzeniem bardziej dostępnych i przystępnych cenowo podejść mikroskopowych zaprojektowanych dla żywych obiektów 3D, takich jak SPIM, arkusz świetlny, theta, obrazowanie dwufotonowe i luminescencyjne w połączeniu z uczeniem maszynowym 56,57,58,59,19, pomogą wprowadzić wieloparametryczne obrazowanie O2 do jeszcze większej liczby zastosowań ilościowych.

Tlen cząsteczkowy (O2) jest jednym z kluczowych metabolitów regulujących żywotność, funkcjonowanie i śmierć komórek i tkanek. W warunkach fizjologicznych miejscowe utlenowanie tkanek jest dynamicznie regulowane przez unaczynienie tkanek, przepływ krwi i metabolizm komórkowy, co w niektórych przypadkach prowadzi do powstawania gradientówO2, niedotlenienia mikrośrodowiska i/lub stresu oksydacyjnego1,2. Komórki wyczuwają gradienty O2 poprzez bezpośrednie zaangażowanie molekularnego O2 w funkcję sygnalizacyjną (poprzez sygnalizację za pośrednictwem czynnika indukowanego hipoksją (HIF), demetylazy lizyny histonowej KDM i w inny sposób), zmiany w komórkowym potencjale redoks (reaktywne gatunki O2 wykrywają za pomocą sygnalizacji Nrf2 / Keap1 lub białek regulatorowych żelaza), a następnie mogą dostosować swój metabolizm, Proliferacja, siła działania i zróżnicowanie<klasa SUP="xref">3. Tak więc niejednorodność utlenowania komórek i tkanek, jej gradienty i związane z tym zjawiska są ważnymi graczami w rozwoju tkanek i homeostazie. Różne tkanki i typy komórek często wymagają różnych "normalnych" fizjologicznych poziomówO2, które definiują specjalną architekturę tkanek z komórkami ustawionymi zgodnie z mikrogradientami tkankiO 2 4. Niektóre typy komórek są wrażliwe na spadekO2 (np. neurony, hepatocyty, komórki wysp trzustkowych lub komórki mięśniowe)5,6, podczas gdy inne mogą wytrzymać ekstremalne niedotlenienie i tworzyć strome gradienty O2 (np. w nabłonku jelita grubego)7. Wraz z postępem w bioinżynierii tkankowej i biowytwarzaniu istotna staje się konieczność kwantyfikacjiO2 w mikroagregatach i sferoidalnych konstruktach tkanek 3D. Jednym z problemów jest standaryzacja parametrów fizjologicznych wielokomórkowego modelu sferoidowego, które zależą od metody generowania sferoidów i warunków hodowli8. Ponadto niekontrolowane stosowanie biomateriałów uwalniającychO2 lub perfuzjiO2 w mikrotkankach pozbawionych funkcjonalnego unaczynienia może być toksyczne dla komórek, prowadzić do przeprogramowania ich metabolizmu i zmniejszenia przeżycia w okresie po przeszczepie9,10. Wiarygodność podejścia do pomiaruO2 i optymalizacji środowiska natleniania w celu osiągnięcia wydajnej hodowli fizjologicznie istotnych mikroagregatów została niedawno udowodniona przez modelowanie matematyczne sferoidów wątroby pochodzących z pluripotencjalnych komórek macierzystych użyte jako przykład11. Inną dziedziną, w której uznaje się wiedzę o poziomach O2 w tkankach, jest terapia nowotworów12,13. Heterogeniczne niedotlenienie guza może osłabić skuteczną terapię przeciwnowotworową. Mierzenie i kontrolowanie dokładnych poziomów natlenienia podczas leczenia pacjenta lub modelowania niedotlenienia guza pozwoliłoby na ulepszenie indywidualnych i spersonalizowanych strategii terapeutycznych14. W związku z tym ilościowe monitorowanie dynamicznego natleniania w biofabrykowanych konstruktach i modelach 3D guzów jest znaczącym narzędziem do fizjologicznej analizy ich aktywności oddechowej, metabolizmu i optymalizacji hodowli tkankowej, warunków produkcji lub podstawowych badań odpowiedzi terapeutycznej za pośrednictwem hipoksji.
Szereg metod umożliwia multipleksowaną (lub wieloparametrową) analizę natlenienia komórek w sferoidalnych i mikrozagregowanych konstrukcjach tkankowych. Pionierskie w dziedzinie neurosfer i sferoidów nowotworowych 15,16,17, podejście oparte na mikroskopii obrazowania czasu życia fosforescencji (PLIM) umożliwia bezpośrednie ilościowe określenie natlenienia komórek w żywych mikrotkankach i ustalenie jego korelacji z żywotnością komórek, proliferacją lub dystrybucją funkcjonalnych typów komórek. Pomimo siły tego podejścia, aktualizacja mikroskopii PLIM nadal nie jest powszechnie dostępna nawet wśród popularnych dostawców mikroskopów18,19. Na szczęście duża liczba penetrujących komórki sond nanocząstek O2 może być również używana do pomiaru ratiometrycznego opartego na intensywności fluorescencji15,17,20,21,22,23,24. Zazwyczaj sonda wyświetla dwie długości fal emisyjnych, tj. O2 czułą i niewrażliwą (referencyjną), które można zmierzyć za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego, obrazika przesiewowego o wysokiej zawartości lub czytnika mikropłytek. Takie nanocząstki wykrywająceO2 mogą być wytwarzane techniką wytrącania z biokompatybilnymi polimerami, czujnikiemO2 i barwnikami referencyjnymi obejmującymi widma widzialne i bliskiej podczerwieni, lub można je kupić komercyjnie2,25. Ponieważ analiza grubych mikrotkanek 3D skorzystałaby na zastosowaniu barwników fluorescencyjnych z przesunięciem ku czerwieni, skonstruowano ratiometryczną sondę nanocząstek O2 multimodalną podczerwień numer 1 (MMIR1), składającą się z O2-sensing PtTPTBPF26 i reference aza-BODIPY27 barwników impregnowanych dodatnio naładowanym kopolimerem na bazie polimetakrylanu28. W tej konstrukcji sygnał czuły naO2 (bliska podczerwień, wzbudzenie (exc.) = 635 nm, emisja (em.) = 760 nm; Isens) zależy od stężenia [O2] w procesie hartowania fosforescencyjnego, podczas gdy intensywność czerwonego barwnika referencyjnego (exc. = 580 nm, em. = 650 nm; Iref) pozostaje nienaruszony (<silna klasa="xfig">Rysunek 1A). W ten sposób stosunek Iref / Isens (R) w barwionych komórkach może umożliwić kalibrację O222.
Tutaj opisujemy półilościowe podejście do monitorowania natlenienia żywych komórek w sferoidach i biodrukowanych konstruktach, pomagając oszacować gradienty O2 w punktach końcowych i pomiarach kinetycznych. Takie obrazowanieO2 można wykonać za pomocą innych typów ratiometrycznych sond O2 (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 1B) i, w zależności od liczby dostępnych źródeł światła i filtrów fluorescencyjnych, można je stosować z innymi barwnikami w celu uzyskania informacji o żywych/martwych komórkach, funkcji mitochondriów i śledzeniu innych typów komórek. Można również korzystać z zaawansowanych trybów pomiaru, takich jak mikroskopia obrazowania czasu życia fluorescencji (FLIM)19. Największym wyzwaniem związanym z zastosowaniem barwników barwiących komórki i wrażliwych na O2 nanocząstek jest optymalizacja protokołu barwienia. W przypadku sondy MMIR1 i powiązanych nanocząstek, komórki są albo wstępnie wybarwione, albo współinkubowane podczas procesu tworzenia sferoid. W opisanym protokole sferoidy barwione sondą O2 zostały wygenerowane na mało przylegającej powierzchni agarozy29,30,31,32 (<silna klasa="xfig">Rysunek 1C), co umożliwia późniejsze biodrukowanie w oparciu o sferoidy i wieloparametrową analizę O2 i śmierć komórki. Aby zilustrować możliwość zastosowania tego podejścia, porównano poziomy natlenienia w sferoidach z ludzkich komórek macierzystych miazgi zęba (hDPSC) przed i po biodruku, przy użyciu konwencjonalnego mikroskopu fluorescencyjnego.

<table><tbody><tr><td>0,05% Trypsyna-EDTA</td><td>Gibco</td><td>25300-054</td><td>Dostępne również z</td></tr><tr><td>12-dołkowych płytek do hodowli komórkowych Sigma, sterylne</td><td>Greiner bio-one</td><td>665-180</td><td>Podobne produkty są również dostępne w Sarstedt, Corning i innych firmach.</td></tr><tr><td>Szkiełko z 12 studniami, wyjmowane</td><td>Ibidi</td><td>81201</td><td>Dostępne również w Grace Bio-Labs, ThermoFisher Scientific i innych</td></tr><tr><td>15 ml probówkach wirówkowych</td><td>Nerbe plus</td><td>02-502-3001</td><td>Podobne produkty są również dostępne w Sarstedt, Corning, VWR i innych firmach</td></tr><tr><td>Wkład 3cc, zabezpieczony promieniowaniem UV, luer lock</td><td>RegenHU</td><td>C-033CC-UV</td><td>Dostępne również w CelIink i innych</td></tr><tr><td>Odkrywanie 3D Bioprinter</td><td>RegenHU</td><td>N/A</td><td>Bioprinter wyposażony w głowicę drukującą opartą na wytłaczaniu, płaszcz grzewczy, lampę utwardzającą UV-LED, oprogramowanie 3D Discovery HMI (oprogramowanie CAD/CAM z bezpośrednim sterowaniem maszyną) oraz oprogramowanie BioCAD (wersja 1.1-12)</td></tr><tr><td>6-dołkowe płytki do hodowli komórkowych, sterylne</td><td>Greiner bio-one</td><td>657160</td><td>Podobne produkty są również dostępne w Sarstedt, Corning, VWR i innych firmach</td></tr><tr><td>Antymycyna A firmy Streptomyces sp.</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A8674-25MG</td><td>Stosowany jako inhibitor kompleksu III mitochondrialnego łańcucha transportu elektronów, blokujący oddychanie komórkowe</td></tr><tr><td>Nasadka B-Braun Tip, luer lock</td><td>RegenHU</td><td>TC-BB-B</td><td>Dostępne również w Regemat, Cellink i innych</td></tr><tr><td>Widok komórki Naczynie do hodowli komórkowych, PS, 35/10mm, szklane dno, 1 komora, sterylny</td><td>Greiner bio-one</td><td>627861</td><td>Do mikroskopii sferoid</td></tr> <tr><td>drukowanychKolagen z ludzkiego łożyska, typ IV</td><td>Sigma</td><td>C5533</td><td>Do przygotowania 0,07 mg / ml kolagenu i 0,03 mg / ml naczyń mikroskopowych pokrytych poli-D-lizyną</td></tr><tr><td>D(+)-glukoza</td><td>Merck</td><td>8342</td><td>Przygotuj 1M roztwór podstawowy, 1/100 do przygotowania pożywki obrazowej (końcowe stężenie 10mM)</td></tr><tr><td>Zmodyfikowana pożywka Eagle's Dulbecco (DMEM), bez czerwieni fenolowej, glukozy, pirogronianu i glutaminy</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D5030-10X1L</td><td>Do przygotowania podłoża do obrazowania</td></tr><tr><td>Pożywka do wzrostu komórek śródbłonka 2</td><td>PromoCell</td><td>C-22011</td><td>Dostępne również w Lonza i innych</td></tr><tr><td>Suplement na wzrost śródbłonkaMix</td><td>PromoCell</td><td>C-39216</td><td>Dostępne również w Lonza i innych</td></tr><tr><td>FCCP, 4-(trifluorometoksy)fenylohydrazon cyjanku karbonylu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C2920-10MG</td><td>Stosowany jako rozprzęgacz mitochondrialny</td></tr><tr><td>Surowica bydlęca</td><td>płodu Gibco</td><td>10270-098</td><td>Dostępne również w Sigma</td></tr><tr><td>GelMA</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>GelMA została zsyntetyzowana przez grupę PBM (prof. dr Peter Dubruel i Sandra Van Vlierberghe, Uniwersytet w Gandawie) [https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0142961213011782], ale są również dostępne z Xpect Inx</td></tr><tr><td>Oksydaza glukozowa z Aspergillus nige (10000 u)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G7141</td><td>Służy do badania odpowiedzi sondy na odtlenienie</td></tr><tr><td>GlutaMAX 100x Suplement</td><td>Gibco</td><td>35050-038</td><td>Rozcieńczenie 1/100 do przygotowania podłoża obrazowego (stężenie końcowe 2mM)</td></tr><tr><td>HEPES (1M)</td><td>Gibco</td><td>15630-080</td><td>Rozcieńczenie 1/100 do przygotowania podłoża obrazowego (stężenie końcowe 10mM)</td></tr><tr><td>Hoechst 34580</td><td>Invitrogen (Life Technologies)</td><td>H21486</td><td>Dostępne również w Sigma, BDBiosciences i inne</td></tr><tr><td>Ludzkie komórki macierzyste miazgi zębowej (hDPSC)</td><td>Lonza</td><td>PT-5025</td><td>Dostępne również w ATCC lub u innych dostawców</td></tr><tr><td>Ludzkie komórki śródbłonka żyły pępowinowej (HUVEC)</td><td>Lonza</td><td>CC-2517</td><td>Dostępne również w ATCC lub u innych dostawców</td></tr><tr><td>KH2PO4 (diwodorofosforan potasu)</td><td>Merck</td><td>4873</td><td>Do przygotowania roztworu siarczynu sodu (5 mg / ml Na2SO3 i 5 mg / ml KH2PO4). Przygotuj świeże z 10x stężonego roztworu podstawowego dziennie.</td></tr><tr><td>Li-TPO</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>Li-TPO-L został zsyntetyzowany przez grupę PBM (prof. dr Peter Dubruel i Sandra Van Vlierberghe, Uniwersytet w Gandawie)&nbsp; [https://link.springer.com/referenceworkentry/10.1007%2F97 8-3-319-45444-3_15) , https://asmedigitalcollection.asme.org/nanoengineeringmedical/article/6/2/021001/376814/Hybrid-Tissue-Engineering-Scaffolds-by-Combination] ale porównywalne fotoinicjatory są dostępne w Sigma</td></tr><tr><td>MEM Alpha Medium + Glutamax Minimum essential medium</td><td>Gibco</td><td>32561-029</td><td>Dostępne również w Sigma i innych</td></tr><tr><td>Stemple PDMS z mikrowzorzyskiem drukowane w 3D, studzienki o średnicy 400 &mikro; m, grubość, całkowita liczba odwiertów 1585</td><td>Wytwarzane</td><td></td> samodzielnie <td>Znaczki te zostały samodzielnie wykonane przez Centrum Technologii Mikrosystemów (prof. dr Jan Vanfleteren, Uniwersytet w Gandawie), ale można je również uzyskać komercyjnie od Merck (Z764094, Microtissues 3D Petri Dish micro-mold mixed spheroid kit)</td></tr><tr><td>Na2SO3 (siarczyn sodu)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>239321-500G</td><td>Do przygotowania roztworu siarczynu sodu (5 mg / ml Na2SO3 i 5 mg / ml KH2PO4). Przygotuj świeże z 10x stężonego roztworu podstawowego dziennie.</td></tr><tr><td>Sondy O2: MMIR1, SI-0,2+, SII-0,2+</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>Można przygotować ' we własnym zakresie" przy użyciu dostępnych na rynku barwników, polimerów i metody wytrącania [https://pubs.acs.org/doi/abs/10.1021/nn200807g https://onlinelibrary.wiley.com/doi/abs/10.1002/adfm.201201387 ]. Niektóre nanocząstki są dostępne na rynku, jak omówiono w [https://link.springer.com/article/10.1007/s00018-018-2840-x</td></tr>] <tr><td>Pen Strep :P enicylina (10 000 U/ml) / streptomycyna (10 000 &mu; g / mL) 100x roztwór</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td>Dostępne również w Sigma . Stosować w rozcieńczeniu 1:100</td></tr><tr><td>szalki Petriego, sterylne</td><td>Greiner bio-one</td><td>633181</td><td>Podobne produkty są również dostępne w Sarstedt, Corning, VWR i innych firmach</td></tr><tr><td>Tłok do wkładu 3cc</td><td>RegenHU</td><td>P-03CC-UV</td><td>Dostępne również w Cellink, Regemat i innych</td></tr><tr><td>Poli-D-lizyna</td><td>Sigma</td><td>P6407-5mg</td><td>Do przygotowania 0,07 mg/ml kolagenu i 0,03 mg/ml mikroskopii pokrytej poli-D-lizyną naczynia</td></tr><tr><td>filtr strzykawkowy PVDF 0,22 i mikro; m</td><td>Novolab</td><td>A35149</td><td>Podobne produkty są również dostępne w Sarstedt, Corning, VWR i innych firmach</td></tr><tr><td>Rotenon</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R8875-1G</td><td>Stosowany jako inhibitor kompleksu I mitochondrialnego łańcucha transportu elektronów, blokujący oddychanie komórkowe</td></tr><tr><td>Pirogronian sodu (100 mM)</td><td>Gibco</td><td>11360-070</td><td>Rozcieńczenie 1/100 do przygotowania podłoża obrazowego (stężenie końcowe 1mM)</td></tr><tr><td>SYTOX Green</td><td>Invitrogen (Life Technologies)</td><td>S7559</td><td>Dostępne również w Sigma, Promega i innych</td></tr><tr><td>Końcówka stożkowa o rozmiarze 22 (stożkowa igła PE</td><td>Amada Myachi Europe</td><td>22K622222</td><td>Podobne produkty są również dostępne w RegenHU, Cellink, Regemat i innych</td></tr><tr><td>Kolba do hodowli tkankowych (75 cm2)</td><td>VWR</td><td>734-2313</td><td>Podobne produkty są również dostępne w Sarstedt, Corning, VWR i innych firmach</td></tr><tr><td>Ultrapure Agaroza</td><td>Invitrogen (Life Technologies)</td><td>16500-500</td><td>Inne rodzaje agarozy, takie jak agaroza o niskiej temperaturze topnienia (A-9414, Sigma), Agaroza do rutynowego użytku (A-9539, Sigma)</td></tr><tr><td>Odwrócony mikroskop fluorescencyjny szerokokątny</td><td>Olympus</td><td>N/A</td><td>Odwrócony mikroskop fluorescencyjny IX81, z silnikowym sterowaniem osią Z, CoolLED pE4000 (16 kanałów, 365-770 nm), kamera cMOS ORCA-Flash4.0LT (Hamamatsu), szklana płyta grzewcza Okolab, oprogramowanie CellSens Dimension v.3 i Obiektywy lotnicze 4x/0,13 UPlanFLN i 40x/0,6 LUCPlanFLN. (Opcjonalnie, do obrazowania w wysokiej rozdzielczości) 60x/1,0 LUMPLFLN woda</td></tr></tbody></table>

przystępna cenowo biofabrykacja sferoid wielokomórkowych wspomagana mikroskopią tlenową

Affordable Oxygen Microscopy-Assisted Biofabrication of Multicellular Spheroids

Sferoidy wielokomórkowe są ważnymi narzędziami do badania fizjologii tkanek i nowotworów w 3D i są często używane w inżynierii tkankowej jako jednostki do składania tkanek do biofabrykacji. Podczas gdy główna moc modelu sferoidalnego polega na naśladowaniu gradientów fizyczno-chemicznych w mikroskali tkankowej, rzeczywiste środowisko fizjologiczne (w tym dynamika aktywności metabolicznej, natlenienie, śmierć komórki i proliferacja) wewnątrz sferoid jest na ogół ignorowane. Jednocześnie wpływ składu pożywki wzrostowej i metody tworzenia na uzyskany fenotyp sferoidy jest dobrze udokumentowany. W związku z tym charakterystyka i standaryzacja fenotypu sferoidalnego są niezbędne do zapewnienia odtwarzalności i przejrzystości wyników badań. Analiza średniego natlenienia sferoidowego i wartości gradientówO2 w trzech wymiarach (3D) może być prostym i uniwersalnym sposobem charakterystyki fenotypu sferoidalnego, wskazującym na ich aktywność metaboliczną, ogólną żywotność i potencjał do rekapitulacji mikrośrodowiska tkanek in vivo. Wizualizację natlenienia 3D można łatwo połączyć z wieloparametryczną analizą dodatkowych parametrów fizjologicznych (takich jak śmierć komórki, proliferacja i skład komórki) i zastosować do ciągłego monitorowania natlenienia i/lub pomiarów punktu końcowego. Ładowanie sondyO2 odbywa się na etapie tworzenia sferoid i jest zgodne z różnymi protokołami generowania sferoidów. Protokół zawiera wysokoprzepustową metodę generowania sferoidów z wprowadzonymi ratiometrycznymi nanoczujnikami fluorescencyjnymi O2 emitującymi światło czerwone i bliskiej podczerwieni oraz opis wieloparametrowej oceny natlenienia sferoidów i śmierci komórek przed i po bioprintingu. Przykłady eksperymentalne pokazują porównawczą analizę gradientówO2 w sferoidach homo- i heterokomórkowych, a także w biodrukowanych konstruktach opartych na sferoidach. Protokół jest kompatybilny z konwencjonalnym mikroskopem fluorescencyjnym posiadającym wiele filtrów fluorescencyjnych i diodę elektroluminescencyjną jako źródło światła.

Protokół opisuje wysokoprzepustowe generowanie sferoidów do biodruku przy użyciu wieloparametrycznej analizy ich natlenienia i śmierci komórki pod standardowym mikroskopem fluorescencyjnym. Podejście to można zastosować do kontrolowania żywotności sferoid i przeprowadzania standaryzacji, co jest ważne w modelowaniu tkanki 3D, mikrośrodowiska guza i udanej biofabrykacji (mikro)tkanek.

Przystępna cenowo biofabrykacja sferoid wielokomórkowych wspomagana mikroskopią tlenową

Multicellular spheroids are important tools for studying tissue and cancer physiology in 3D and are frequently used in tissue engineering as tissue ...

Nasz protokół pomaga w obrazowaniu natlenienia sferoid wielokomórkowych za pomocą konwencjonalnego mikroskopu fluorescencyjnego. Za pomocą tej metody można wyprodukować tysiące mikrotkanek sferoidalnych barwionych sondą tlenową, a następnie wykorzystać je w zastosowaniach związanych z drukiem 3D. Na przykład unaczynione przeszczepy tkanki kostnej.sonda tlenowa w bliskiej podczerwieni jest kompatybilna z innymi barwnikami, takimi jak barwienie zieloną fluorescencją Ostatecznie pozwala to na długoterminową analizę na żywo i wieloparametrową. Przenieść stemple PDMS z mikrowzorami z fiolki do przechowywania na sterylną szalkę Petriego i wysuszyć na powietrzu gładką powierzchnią do góry w sterylnych warunkach laminarnego przepływu powietrza przez 10 minut. Umieść każdy stempel na środku dołka 12-dołkowej sterylnej płytki do hodowli tkankowej.Suszyć na powietrzu przez jedną do dwóch minut z otwartą pokrywką. Przygotować 50 mililitrów 3% jednorodnego roztworu agarozy i natychmiast dodać około dwóch mililitrów gorącego roztworu agarozy do każdego dołka 12-dołkowych płytek, aby przykryć włożony stempel PDMS. Zestalaj agarozę przez 20 minut, inkubując ją pod sterylnym przepływem powietrza.Za pomocą sterylnej szpatułki odwróć agarozę z osadzonym stemplem PDMS do góry nogami w każdym dołku. Dodaj około 200 mikrolitrów sterylnej wody na gładką górną stronę stempla. Odłącz go od agarozy szpatułką i wyjmij ze studzienki.Dodać jeden mililitr odpowiedniej sterylnej pożywki do hodowli komórek do stempli agarozy do bezpośredniego użycia. Przykryj płytkę pokrywką i inkubuj przez noc w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Przed użyciem podgrzej płytki z mikrowzorem agarozy przez godzinę w temperaturze 37 stopni Celsjusza w inkubatorze dwutlenku węgla.Przepłucz od 70% do 90% kultury komórkowej konfluencji wstępnie podgrzanym PBS. Dodać dysocjujący roztwór enzymu i inkubować przez trzy do pięciu minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Później zneutralizuj trypsynę za pomocą kompletnych pożywek do hodowli komórkowych zawierających 10% FBS.Aby uzyskać zawiesinę pojedynczej komórki, należy zdysocjować agregaty komórkowe za pomocą końcówki pipety o pojemności 1 000 mikrolitrów umieszczonej na górze pipety serologicznej. Korzystając z komory zliczającej, policz liczbę komórek na mililitr zawiesiny komórek. Rozcieńczyć zawiesinę komórek do 500 000 komórek na mililitr i dodać do niej stężony roztwór sondy tlenowej.Usunąć stare pożywki z mikrowzorzystych studzienek 12-dołkowej płytki do hodowli komórkowej pokrytej agarozą i dodać jeden mililitr przygotowanej zawiesiny komórkowej do studzienek. Hoduj sferoidy w inkubatorze dwutlenku węgla przez dwa do pięciu dni w ciągłej obecności sondy tlenowej, aby upewnić się, że ładuje się podczas tworzenia sferoidów i zagęszczania. Zamknij koniec sterylnego wkładu o pojemności trzech centymetrów sześciennych nasadką z końcówką i napełnij go biotuszem, pipetując.Włóż tłok do wkładu i przytrzymaj go do góry nogami. Zdejmij nasadkę końcówki i popchnij tłok w kierunku atramentu biologicznego, aż całe powietrze z wkładu zostanie usunięte. Schłodzić atrament biologiczny w płaszczu grzewczym biodrukarki w temperaturze 23 stopni Celsjusza.Spryskaj biodrukarkę 70% etanolem i osusz ją papierem absorpcyjnym. Wkręć adapter ciśnieniowy na górze wkładu. Zamontuj stożkową igłę polietylenową o rozmiarze 22 na wkładzie.Zamontuj wkład w płaszczu grzewczym na głowicy drukującej opartej na wytłaczaniu. Podłącz wlot ciśnienia i otwórz zacisk na wlocie. Załaduj plik G-code swojego projektu do oprogramowania do drukowania.Rozpocznij pomiar długości igły. Reguluj ciśnienie drukowania, dozując trochę biotuszu na sterylnej szalce Petriego. Zainstaluj płytkę sześciodołkową, otwórz płytkę dołka, zamknij pokrywę i wydrukuj.Po wydrukowaniu pozwól rusztowaniu być fizycznie usieciowane przez 10 minut w temperaturze pięciu stopni Celsjusza. Naświetlaj wydrukowane rusztowania przez 60 sekund ultrafioletową lampą LED. Natychmiast dodaj odpowiednią pożywkę wzrostową zawierającą podwójny roztwór antybiotyku do wszystkich studzienek z siatkami z biodrukiem.Posadź rusztowania w temperaturze 37 stopni Celsjusza w inkubatorze dwutlenku węgla. W celu obserwacji mikroskopowej przenieś wydrukowaną siatkę waflową do pokrywy naczynia mikroskopowego z nośnikiem obrazowym. Za pomocą pipety o pojemności jednego mililitra delikatnie wypłucz wstępnie wybarwione sferoidy sondy tlenowej z mikrostudzienek agarozy i przenieś je do 15-mililitrowej stożkowej rurki dolnej.Aby zapewnić zebranie wszystkich sferoid z dołka z mikrowzorem, przepłucz studzienkę od jednego do trzech razy dodatkowym mililitrem pożywki hodowlanej i połącz wszystkie zawiesiny sferoidalne w jednej fiolce. Pozostaw fiolkę pionowo na maksymalnie 10 minut, aby sferoidy osiadły na dnie. Ostrożnie wyjmij pożywkę z rurki, pozostawiając sferoidy w spokoju.Dodać świeżą pożywkę hodowlaną, która będzie wystarczająca na co najmniej 20 sferoidów na naczynie na próbkę i delikatnie zawiesić sferoidy przez pipetowanie. Natychmiast dodać równą objętość zawiesiny sferoidalnej do każdego wstępnie powlekanego dołka mikroskopowego. Pozostaw sferoidy na godzinę w temperaturze 37 stopni Celsjusza, aby dobrze przymocować się do powierzchni mikroskopu.Wyjmij pożywkę z mikroskopu i spłucz raz pożywką do obrazowania. Dodaj dokładną ilość nośnika obrazowania do próbki. Dobrze ustaw mikroskopię z barwionymi sferoidami na stoliku mikroskopowym.Korzystając z obiektywu z 10-krotnym powiększeniem, wyświetl podgląd próbki w świetle transmisyjnym. Wykonaj wstępne ustawienie ostrości na sferoidach, umieść je w centrum obrazu i ustaw obiektyw o wymaganym dużym powiększeniu do pozycji roboczej. Skoncentruj się na trybie światła transmisyjnego w przekroju równikowym sferoidy.Dostosuj ustawienia zbierania sygnałów fluorescencji lub fosforescencji referencyjnych i czułych kanałów widmowych sondy tlenowej i rozpocznij proces obrazowania. Otwórz plik vsi z danymi o intensywności sondy tlenowej z referencyjnych i czułych kanałów spektralnych w trybie scalonym. Otwórz okno funkcji analizy proporcji z menu pomiaru.Wybierz intensywność kanału odniesienia jako licznik i intensywność kanału wrażliwego jako mianownik do obliczeń R. W oknie analizy współczynnika zastosuj odpowiednie ustawienia progu intensywności do każdego kanału spektralnego, aby odjąć tło od scalonego obrazu intensywności. Maski ROI zastosowane do obrazów sferoidalnych określają granice sferoidów.Zwiększaj wartości progowe, aż tło obrazu stanie się jednolicie czarne. W oknie analizy proporcji dostosuj współczynnik skalowania do obrazu współczynnika, aż obraz podglądu zapewni żądaną rozdzielczość gradientu R. Obraz rozkładu współczynnika intensywności jest dodawany jako warstwa do oryginalnego obrazu wielokanałowego.W oknie obrazu wielokanałowego aktywuj warstwę z paskiem o fałszywym kolorze. Ręcznie określ limity łączenia i rozłączania histogramu rozkładu współczynnika za pomocą opcji stałego skalowania w oknie dostosowywania ekranu. Otwórz odpowiedni obraz sferoid w świetle transmisyjnym.Wybierz funkcję linijki liniowej i zmierz średnicę sferoid. Eksportuj dane jako plik tabeli arkusza kalkulacyjnego. Wybierz ROI o wymaganym rozmiarze i kształcie i zastosuj go do obwodu i niedotlenionego rdzenia sferoidy.Przekształć ROI w mierzony obiekt, aby przeanalizować średnie R wewnątrz wybranego ROI. Eksportuj dane w formacie tabeli zgodnym z arkuszem kalkulacyjnym. Zastosuj pomiary do każdej sekcji mikroskopowej sferoid, aby uzyskać zestaw danych o średnicach sferoid RC i RP w celu przeprowadzenia dalszych obliczeń i porównań statystycznych.Połącz wszystkie dane w jednym pliku arkusza kalkulacyjnego. Sonda MMIR1 ma niską fotobielenie i nadaje się do badania w czasie rzeczywistym szybkiej reakcji oddechowej w sferoidach hDPSC na różne bodźce mitochondrialne. FCCP wykazywał tylko łagodny efekt rozprzęgania w niektórych obszarach, a następnie nieznacznie zmniejszył oddychanie komórek.Z drugiej strony, rotenon silnie hamował oddychanie, prowadząc do sferoidalnego dotlenienia i rozproszenia gradientów tlenu od obwodu do rdzenia w ciągu około 80 sekund po stymulacji. Korzystając z automatycznego protokołu obliczeń współczynnika intensywności piksel po pikselu dostarczonym przez oprogramowanie do obrazowania, wykrywane w czasie rzeczywistym gradienty tlenu od peryferii do rdzenia we wszystkich typach sferoid są wizualizowane z natlenionymi peryferiami i niedotlenionymi niszami w środku. Przedstawione tu wykresy przedstawiają profile proporcji przekrojów sferoidalnych równika dla różnych typów sferoidów.W porównaniu z homokomórkowymi sferoidami hDPSC, sferoidy heterokomórkowe hDPSC do HUVEC miały znacznie bardziej strome gradienty. Gradient tlenu od peryferii do rdzenia w sferoidach heterokomórkowych jest prawdopodobnie generowany przez hDPSC w ich składzie zgodnie z natlenieniem sferoid hDPSC o silnej aktywności oddechowej. Wykresy pokazują, że sferoidy hDPSC z nadrukiem biologicznym miały znacznie utlenione peryferium niż sferoidy mierzone przed biodrukowaniem, podczas gdy ich natlenienie rdzenia miało podobne wartości.Jeśli sporadyczne wytrącanie się sondy zakłóca równomierne tworzenie się sferoid, przed użyciem przefiltruj lub odwiruj roztwór sondy z dużą prędkością. Korekta pomiaru długości igły i regulacja nacisku są niezbędnymi krokami w celu dopasowania szybkości biodruku i średnicy rozpórki oraz mikroagregatów bioprint w porowatym rusztowaniu. Wybierz ustawienia mikroskopii dla obrazowania sondy wrażliwej na tlen, biorąc pod uwagę ich wpływ na fotostabilność sondy.Obrazowanie tlenu jest kompatybilne z wieloma typami pomiarów mikroskopowych na żywo. Po zobrazowaniu można również wykonać immunofluorescencję, wyekstrahować białka do Western blotting lub przeprowadzić analizę ekspresji genów.

affordable-oxygen-microscopy-assisted-biofabrication-multicellular

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioinżynieria

Tutaj opisujemy szybki i elastyczny protokół tworzenia sferoid 3D komórek poprzez agregację komórek. Można go łatwo dostosować do wielu typów komórek i nadaje się do stosowania w różnych zastosowaniach, w tym w testach migracji komórek, inwazji lub anoikis, a także do obrazowania i ilościowego określania interakcji komórka-macierz.

Wydajna i elastyczna metoda agregacji komórek do produkcji sferoidów 3D

Prezentujemy napędzane silnikiem odśrodkowe urządzenie mikroprzepływowe, które może hodować sferoidy komórek. Za pomocą tego urządzenia sferoidy jednego lub wielu typów komórek mogą być łatwo hodowane w warunkach wysokiej grawitacji.

Platforma lab-on-a-CD do generowania wielokomórkowych trójwymiarowych sferoid

Tutaj opisujemy produkcję na dużą skalę sferoidów zrębu/komórek macierzystych (ASC) pochodzących z tkanki tłuszczowej przy użyciu automatycznego systemu pipetowania do zasiewania zawiesiny komórkowej, zapewniając w ten sposób jednorodność wielkości i kształtu sferoidy. Te sferoidy ASC mogą być używane jako elementy budulcowe dla podejść do biodruku 3D.

Wielkoskalowa, zautomatyzowana produkcja sferoid komórek macierzystych pochodzących z tkanki tłuszczowej do biodruku 3D

Ten protokół szczegółowo opisuje metodę produkcji trzech różnych typów sferoidów w sposób, który czyni je odpowiednimi do badań przesiewowych i analiz na dużą skalę o wysokiej zawartości. Ponadto przedstawiono przykłady pokazujące, w jaki sposób można je analizować na poziomie sferoidalnym i poszczególnych komórek.

Niezawodna metoda produkcji sferoid na dużą skalę do zastosowań związanych z przesiewaniem i analizą o wysokiej zawartości

Obecny protokół opisuje technikę wytwarzania sferoidów tkankowych na dużą skalę przy użyciu wydrukowanego w 3D urządzenia przypominającego stempel.

Generowanie sferoid tkankowych za pomocą wydrukowanego w 3D urządzenia przypominającego stempel

Ten artykuł przedstawia protokół produkcji nowego typu substratu hodowlanego z setkami mikropojemników namm2, w których organoidy mogą być hodowane i obserwowane za pomocą mikroskopii o wysokiej rozdzielczości. Szczegółowo opisano również protokoły wysiewu komórek i barwienia immunologicznego.

Wysokoprzepustowa platforma do hodowli i obrazowania 3D organoidów

Tutaj prezentujemy protokół, który umożliwia szybką, solidną i tanią produkcję sferoid nowotworowych, a następnie enkapsulację hydrożelową. Ma szerokie zastosowanie, ponieważ nie wymaga specjalistycznego sprzętu. Byłoby to szczególnie przydatne do badania interakcji sferoida-matryca oraz budowania modeli fizjologii lub patologii tkanek in vitro.

Wytwarzanie i enkapsulacja sferoidów nowotworowych w hydrożelach glikolu polietylenowego do badania oddziaływań sferoida-matryca

Tutaj opisujemy różne metody tworzenia wielokomórkowych sferoidów, aby przeprowadzić następczą wieloparametrową mikroskopię żywych komórek. Wykorzystując mikroskopię obrazowania czasu życia fluorescencji (FLIM), autofluorescencję komórkową, barwniki barwiące i nanocząstki, przedstawiono podejście do analizy metabolizmu komórkowego, niedotlenienia i śmierci komórki w żywych trójwymiarowych (3D) nowotworach i sferoidach pochodzących z komórek macierzystych.

Produkcja i wieloparametrowa mikroskopia obrazowania czasu życia fluorescencji żywych komórek (FLIM) sferoid wielokomórkowych

To badanie przedstawia opłacalną i efektywną metodologię generowania struktur komórkowych 3D za pomocą systemu opartego na stemplach do tworzenia mikrostudzienek w formach agarozowych. System sprzyja tworzeniu się jednolitych sferoidów/organoidów, poprawiając w ten sposób interakcje komórkowe. Takie podejście zmniejsza zmienność eksperymentalną i wspiera zastosowania w testowaniu leków i inżynierii tkankowej.

Generowanie trójwymiarowych sferoidów/organoidów z dwuwymiarowych kultur komórkowych przy użyciu nowatorskiego urządzenia do stemplowania

Opisujemy prostą i szybką metodę generowania trójwymiarowych sferoid tkankopodobnych oraz ich potencjalne zastosowanie w ilościowym określaniu różnic w oddziaływaniach międzykomórkowych.

Prosty protokół hodowli komórkowej metodą wiszącej kropli do generowania sferoidów 3D

Poznaj metodę biofabrykacji sferoid wielokomórkowych z wykorzystaniem mikroskopii fluorescencyjnej do analizy utlenowania i żywotności komórek. Protokół umożliwia wysokoprzepustową produkcję mikrotkanek do zastosowań w bioprintingu 3D i inżynierii tkanek.

Przystępna cenowo biofabrykacja sferoid wielokomórkowych wspomagana mikroskopią tlenową

Przeglądaj więcej filmów