Przystępna cenowo biofabrykacja sferoid wielokomórkowych wspomagana mikroskopią tlenową

Nasz protokół pomaga w obrazowaniu natlenienia sferoid wielokomórkowych za pomocą konwencjonalnego mikroskopu fluorescencyjnego. Za pomocą tej metody można wyprodukować tysiące mikrotkanek sferoidalnych barwionych sondą tlenową, a następnie wykorzystać je w zastosowaniach związanych z drukiem 3D. Na przykład unaczynione przeszczepy tkanki kostnej.

sonda tlenowa w bliskiej podczerwieni jest kompatybilna z innymi barwnikami, takimi jak barwienie zieloną fluorescencją Ostatecznie pozwala to na długoterminową analizę na żywo i wieloparametrową. Przenieść stemple PDMS z mikrowzorami z fiolki do przechowywania na sterylną szalkę Petriego i wysuszyć na powietrzu gładką powierzchnią do góry w sterylnych warunkach laminarnego przepływu powietrza przez 10 minut. Umieść każdy stempel na środku dołka 12-dołkowej sterylnej płytki do hodowli tkankowej.

Suszyć na powietrzu przez jedną do dwóch minut z otwartą pokrywką. Przygotować 50 mililitrów 3% jednorodnego roztworu agarozy i natychmiast dodać około dwóch mililitrów gorącego roztworu agarozy do każdego dołka 12-dołkowych płytek, aby przykryć włożony stempel PDMS. Zestalaj agarozę przez 20 minut, inkubując ją pod sterylnym przepływem powietrza.

Za pomocą sterylnej szpatułki odwróć agarozę z osadzonym stemplem PDMS do góry nogami w każdym dołku. Dodaj około 200 mikrolitrów sterylnej wody na gładką górną stronę stempla. Odłącz go od agarozy szpatułką i wyjmij ze studzienki.

Dodać jeden mililitr odpowiedniej sterylnej pożywki do hodowli komórek do stempli agarozy do bezpośredniego użycia. Przykryj płytkę pokrywką i inkubuj przez noc w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Przed użyciem podgrzej płytki z mikrowzorem agarozy przez godzinę w temperaturze 37 stopni Celsjusza w inkubatorze dwutlenku węgla.

Przepłucz od 70% do 90% kultury komórkowej konfluencji wstępnie podgrzanym PBS. Dodać dysocjujący roztwór enzymu i inkubować przez trzy do pięciu minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Później zneutralizuj trypsynę za pomocą kompletnych pożywek do hodowli komórkowych zawierających 10% FBS.

Aby uzyskać zawiesinę pojedynczej komórki, należy zdysocjować agregaty komórkowe za pomocą końcówki pipety o pojemności 1 000 mikrolitrów umieszczonej na górze pipety serologicznej. Korzystając z komory zliczającej, policz liczbę komórek na mililitr zawiesiny komórek. Rozcieńczyć zawiesinę komórek do 500 000 komórek na mililitr i dodać do niej stężony roztwór sondy tlenowej.

Usunąć stare pożywki z mikrowzorzystych studzienek 12-dołkowej płytki do hodowli komórkowej pokrytej agarozą i dodać jeden mililitr przygotowanej zawiesiny komórkowej do studzienek. Hoduj sferoidy w inkubatorze dwutlenku węgla przez dwa do pięciu dni w ciągłej obecności sondy tlenowej, aby upewnić się, że ładuje się podczas tworzenia sferoidów i zagęszczania. Zamknij koniec sterylnego wkładu o pojemności trzech centymetrów sześciennych nasadką z końcówką i napełnij go biotuszem, pipetując.

Włóż tłok do wkładu i przytrzymaj go do góry nogami. Zdejmij nasadkę końcówki i popchnij tłok w kierunku atramentu biologicznego, aż całe powietrze z wkładu zostanie usunięte. Schłodzić atrament biologiczny w płaszczu grzewczym biodrukarki w temperaturze 23 stopni Celsjusza.

Spryskaj biodrukarkę 70% etanolem i osusz ją papierem absorpcyjnym. Wkręć adapter ciśnieniowy na górze wkładu. Zamontuj stożkową igłę polietylenową o rozmiarze 22 na wkładzie.

Zamontuj wkład w płaszczu grzewczym na głowicy drukującej opartej na wytłaczaniu. Podłącz wlot ciśnienia i otwórz zacisk na wlocie. Załaduj plik G-code swojego projektu do oprogramowania do drukowania.

Rozpocznij pomiar długości igły. Reguluj ciśnienie drukowania, dozując trochę biotuszu na sterylnej szalce Petriego. Zainstaluj płytkę sześciodołkową, otwórz płytkę dołka, zamknij pokrywę i wydrukuj.

Po wydrukowaniu pozwól rusztowaniu być fizycznie usieciowane przez 10 minut w temperaturze pięciu stopni Celsjusza. Naświetlaj wydrukowane rusztowania przez 60 sekund ultrafioletową lampą LED. Natychmiast dodaj odpowiednią pożywkę wzrostową zawierającą podwójny roztwór antybiotyku do wszystkich studzienek z siatkami z biodrukiem.

Posadź rusztowania w temperaturze 37 stopni Celsjusza w inkubatorze dwutlenku węgla. W celu obserwacji mikroskopowej przenieś wydrukowaną siatkę waflową do pokrywy naczynia mikroskopowego z nośnikiem obrazowym. Za pomocą pipety o pojemności jednego mililitra delikatnie wypłucz wstępnie wybarwione sferoidy sondy tlenowej z mikrostudzienek agarozy i przenieś je do 15-mililitrowej stożkowej rurki dolnej.

Aby zapewnić zebranie wszystkich sferoid z dołka z mikrowzorem, przepłucz studzienkę od jednego do trzech razy dodatkowym mililitrem pożywki hodowlanej i połącz wszystkie zawiesiny sferoidalne w jednej fiolce. Pozostaw fiolkę pionowo na maksymalnie 10 minut, aby sferoidy osiadły na dnie. Ostrożnie wyjmij pożywkę z rurki, pozostawiając sferoidy w spokoju.

Dodać świeżą pożywkę hodowlaną, która będzie wystarczająca na co najmniej 20 sferoidów na naczynie na próbkę i delikatnie zawiesić sferoidy przez pipetowanie. Natychmiast dodać równą objętość zawiesiny sferoidalnej do każdego wstępnie powlekanego dołka mikroskopowego. Pozostaw sferoidy na godzinę w temperaturze 37 stopni Celsjusza, aby dobrze przymocować się do powierzchni mikroskopu.

Wyjmij pożywkę z mikroskopu i spłucz raz pożywką do obrazowania. Dodaj dokładną ilość nośnika obrazowania do próbki. Dobrze ustaw mikroskopię z barwionymi sferoidami na stoliku mikroskopowym.

Korzystając z obiektywu z 10-krotnym powiększeniem, wyświetl podgląd próbki w świetle transmisyjnym. Wykonaj wstępne ustawienie ostrości na sferoidach, umieść je w centrum obrazu i ustaw obiektyw o wymaganym dużym powiększeniu do pozycji roboczej. Skoncentruj się na trybie światła transmisyjnego w przekroju równikowym sferoidy.

Dostosuj ustawienia zbierania sygnałów fluorescencji lub fosforescencji referencyjnych i czułych kanałów widmowych sondy tlenowej i rozpocznij proces obrazowania. Otwórz plik vsi z danymi o intensywności sondy tlenowej z referencyjnych i czułych kanałów spektralnych w trybie scalonym. Otwórz okno funkcji analizy proporcji z menu pomiaru.

Wybierz intensywność kanału odniesienia jako licznik i intensywność kanału wrażliwego jako mianownik do obliczeń R. W oknie analizy współczynnika zastosuj odpowiednie ustawienia progu intensywności do każdego kanału spektralnego, aby odjąć tło od scalonego obrazu intensywności. Maski ROI zastosowane do obrazów sferoidalnych określają granice sferoidów.

Zwiększaj wartości progowe, aż tło obrazu stanie się jednolicie czarne. W oknie analizy proporcji dostosuj współczynnik skalowania do obrazu współczynnika, aż obraz podglądu zapewni żądaną rozdzielczość gradientu R. Obraz rozkładu współczynnika intensywności jest dodawany jako warstwa do oryginalnego obrazu wielokanałowego.

W oknie obrazu wielokanałowego aktywuj warstwę z paskiem o fałszywym kolorze. Ręcznie określ limity łączenia i rozłączania histogramu rozkładu współczynnika za pomocą opcji stałego skalowania w oknie dostosowywania ekranu. Otwórz odpowiedni obraz sferoid w świetle transmisyjnym.

Wybierz funkcję linijki liniowej i zmierz średnicę sferoid. Eksportuj dane jako plik tabeli arkusza kalkulacyjnego. Wybierz ROI o wymaganym rozmiarze i kształcie i zastosuj go do obwodu i niedotlenionego rdzenia sferoidy.

Przekształć ROI w mierzony obiekt, aby przeanalizować średnie R wewnątrz wybranego ROI. Eksportuj dane w formacie tabeli zgodnym z arkuszem kalkulacyjnym. Zastosuj pomiary do każdej sekcji mikroskopowej sferoid, aby uzyskać zestaw danych o średnicach sferoid RC i RP w celu przeprowadzenia dalszych obliczeń i porównań statystycznych.

Połącz wszystkie dane w jednym pliku arkusza kalkulacyjnego. Sonda MMIR1 ma niską fotobielenie i nadaje się do badania w czasie rzeczywistym szybkiej reakcji oddechowej w sferoidach hDPSC na różne bodźce mitochondrialne. FCCP wykazywał tylko łagodny efekt rozprzęgania w niektórych obszarach, a następnie nieznacznie zmniejszył oddychanie komórek.

Z drugiej strony, rotenon silnie hamował oddychanie, prowadząc do sferoidalnego dotlenienia i rozproszenia gradientów tlenu od obwodu do rdzenia w ciągu około 80 sekund po stymulacji. Korzystając z automatycznego protokołu obliczeń współczynnika intensywności piksel po pikselu dostarczonym przez oprogramowanie do obrazowania, wykrywane w czasie rzeczywistym gradienty tlenu od peryferii do rdzenia we wszystkich typach sferoid są wizualizowane z natlenionymi peryferiami i niedotlenionymi niszami w środku. Przedstawione tu wykresy przedstawiają profile proporcji przekrojów sferoidalnych równika dla różnych typów sferoidów.

W porównaniu z homokomórkowymi sferoidami hDPSC, sferoidy heterokomórkowe hDPSC do HUVEC miały znacznie bardziej strome gradienty. Gradient tlenu od peryferii do rdzenia w sferoidach heterokomórkowych jest prawdopodobnie generowany przez hDPSC w ich składzie zgodnie z natlenieniem sferoid hDPSC o silnej aktywności oddechowej. Wykresy pokazują, że sferoidy hDPSC z nadrukiem biologicznym miały znacznie utlenione peryferium niż sferoidy mierzone przed biodrukowaniem, podczas gdy ich natlenienie rdzenia miało podobne wartości.

Jeśli sporadyczne wytrącanie się sondy zakłóca równomierne tworzenie się sferoid, przed użyciem przefiltruj lub odwiruj roztwór sondy z dużą prędkością. Korekta pomiaru długości igły i regulacja nacisku są niezbędnymi krokami w celu dopasowania szybkości biodruku i średnicy rozpórki oraz mikroagregatów bioprint w porowatym rusztowaniu. Wybierz ustawienia mikroskopii dla obrazowania sondy wrażliwej na tlen, biorąc pod uwagę ich wpływ na fotostabilność sondy.

Obrazowanie tlenu jest kompatybilne z wieloma typami pomiarów mikroskopowych na żywo. Po zobrazowaniu można również wykonać immunofluorescencję, wyekstrahować białka do Western blotting lub przeprowadzić analizę ekspresji genów.