Name: Szybkie barwienie Golgiego do wizualizacji dendrytycznego kręgosłupa w hipokampie i korze przedczołowej (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-12-03T14:00:00.000+00:00
Duration: 4 min 58 s
Description: Poznaj zmodyfikowaną metodę Golgiego do szybkiego barwienia neuronów w hipokampie i korze przedczołowej szczurów. Technika umożliwia analizę gęstości kolców dendrytycznych i plastyczności neuronalnej.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez Inicjatywę Badań Licencjackich Uniwersytetu Najświętszego Serca.

Wszystkie procedury eksperymentalne są zatwierdzone przez Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt Uniwersytetu Sacred Heart i są zgodne z Przewodnikiem NIH dotyczącym opieki i użytkowania zwierząt.
1. Izolacja i infiltracja tkanki mózgowej
<ol>
	<li>Roztwory premiksów A i B zestawu do barwienia Golgiego na 24 godziny przed użyciem i przechowywać w ciemnych butelkach i/lub w ciemności. Przygotować około 80 ml mieszaniny roztworu A i B, która jest wystarczająca do wymiany roztworu po 24 godzinach. Przechowywać w hermetycznych butelkach. 
	UWAGA: Perfuzja z solą fizjologiczną lub paraformaldehydem nie jest konieczna.</li>
	<li>Składaj szczury w ofierze za pomocą gilotyny po eutanazji dwutlenkiem węgla i usuwaj mózgi w ciągu kilku sekund. W razie potrzeby opłucz mózgi w soli fizjologicznej, ale nie jest to konieczne.
	<ol>
		<li>Umieść mózg, korę w dół, tak aby podwzgórze było widoczne, ponieważ nacięcia są wykonane z przodu i z tyłu, na nieporowatej powierzchni. Pokrój na przedni (zawiera korę przedczołową) i tylną (zawiera hipokamp), jak pokazano na <silna klasa="xfig">Rysunek 1.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Umieść bloki we wstępnie zmieszanych roztworach A i B, upewniając się, że są dobrze zanurzone w roztworze. Upewnij się, że objętość roztworów A i B jest wystarczająca do zanurzenia bloków. Przechowuj bloki w brązowych butelkach lub przezroczystych butelkach przykrytych folią (aby nie przepuszczać światła) w ciemności w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Roztwór należy wymienić po 24 godzinach i przechowywać w ciemności przez kolejne 13 dni w temperaturze pokojowej. 
	UWAGA: W przypadku stosowania z mózgami myszy nie ma potrzeby blokowania, a cały mózg można umieścić w roztworze. W przypadku barwienia obszarów mózgu, które różnią się wielkością, może być konieczne określenie czasu w roztworach A i B metodą prób i błędów.</li>
	<li>Po dwóch tygodniach tkanka jest dobrze naciekana roztworami A i B, przenieść bloki do roztworu krioprotektantu (roztwór C w zestawie do barwienia Golgiego) i pozostawić na 48-72 godziny w temperaturze 4 °C. 
	UWAGA: Po krioprotekcji bloki można zamrozić do czasu dalszej obróbki. Należy również pamiętać, że wszystkie roztwory z zestawu są zbierane i utylizowane jako odpady niebezpieczne.</li>
	<li>Zamroź mózg, korą mózgową w dół, na szklanym szkiełku na suchym lodzie. Po zamrożeniu pokroić na kriostacie lub przechowywać w temperaturze -80 °C do momentu podziału na sekcje za pomocą kriostatu. 
	UWAGA: Nie zamrażaj w ciekłym azocie, ponieważ powoduje to pęknięcia tkanki.</li>
</ol>
2. Cięcie tkanek mózgowych
<ol>
	<li>Umieść niewielką ilość podłoża tkankowego na wstępnie schłodzonym uchwycie kriostatu. Zamontuj bloki na uchwytach kriostatowych, rozmrażając jedną stronę bloku lekko w dłoni (w rękawiczce) i umieszczając go na podłożu tkankowym. 
	UWAGA: Nie jest konieczne osadzanie tkanki. Blok zawierający hipokamp jest nieco łatwiejszy do przecięcia niż blok z korą przedczołową, ponieważ ten ostatni jest przed ciałem modzelowatym, a dwie połówki są oddzielone.</li>
	<li>Wyciąć odcinki 100 μm na kriostacie w temperaturze -22 °C i zamontować na prowadnicach z łożem. Można stosować sekcje o grubości do 150 μm. Spróbuj zamontować 3-4 sekcje koronalne na slajd, ponieważ zmniejsza to liczbę slajdów wymagających obróbki. Użyj jednej z poniższych technik, aby utrzymać sekcje zamrożone, dopóki nie znajdą się na zjeżdżalni. 
	UWAGA: Te sekcje nie są mocowane w zwykły sposób i dlatego mają tendencję do szybkiego topnienia. Poczekaj, aż sekcje stopią się na szkiełku. Jeśli zaczną się topić przed umieszczeniem na szkiełku, nie można ich ustawić płasko na szkiełku. Można to zrobić za pomocą kilku technik.
	<ol>
		<li>Użyj sprayu zamrażającego na nóż i blok. W zależności od temperatury i wilgotności w pomieszczeniu może to być konieczne dla każdej sekcji. Użyj płytki zabezpieczającej lub szczotki, aby utrzymać sekcję płasko podczas cięcia. 
		UWAGA: Upewnij się, że masz wystarczającą ilość sprayu zamrażającego. Podczas cięcia 20 bloków można użyć kilku puszek.</li>
		<li>Rozmrozić moc, jeśli to możliwe, za pomocą suwaka o temperaturze pokojowej i szybko przymocuj go do sekcji. Przy nabraniu wprawy można zamontować kilka sekcji jednocześnie. Jeśli to nie zadziała, trzymaj szkiełka w kriostacie, aby były bardzo zimne i przenieś sekcję za pomocą zimnych kleszczy lub zimnego pędzla, a następnie rozmroź.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wyczyść nóż papierowymi chusteczkami między plasterkami. Jeśli nóż wymaga więcej czyszczenia, użyj 100% etanolu (EtOH) i pozostaw do wyschnięcia przed pokrojeniem następnego plasterka.</li>
	<li>Po zamontowaniu na szkiełku umieść szkiełko płasko na tekturowych tackach do slajdów i pozostaw sekcje do wyschnięcia w temperaturze pokojowej (przez kilka godzin do maksymalnie 48 godzin) w ciemności. Nie zakrywaj tacki na prowadnice. Upewnij się, że sekcje są całkowicie suche przed impregnacją Golgiego. Przechowywać na płasko, w ciemności, na tackach na suwaki do momentu impregnacji metodą Golgiego. 
	UWAGA: Suszenie sekcji nie powoduje żadnych uszkodzeń.</li>
</ol>
3. Barwienie i odwodnienie tkanki mózgowej
<ol>
	<li>Wykonaj barwienie w szklanych naczyniach do barwienia. Wymieszać roztwory D i E bezpośrednio przed barwieniem. Zgodnie z protokołem dodaj jedną część roztworu D, jedną część roztworu E i dwie części wody destylowanej. W przypadku naczyń do barwienia szkła przygotuj 200 ml roztworu, aby całkowicie zanurzyć sekcje. W przypadku słoików z kopeliny wymaga to mniejszej objętości.</li>
	<li>Umieść szkiełka w stojakach oddalonych od siebie na tyle daleko, aby umożliwić dostęp do sekcji rozwiązania.</li>
	<li>Umieść skrawki w wodzie destylowanej na 4 minuty (2x) przed umieszczeniem ich w roztworze barwiącym do impregnacji Golgiego na 10 minut. Zmieniaj roztwór barwiący co 70 sekcji. Zmień wodę destylowaną, gdy zmieni kolor na żółty. 
	UWAGA: Czas etapu barwienia ma kluczowe znaczenie. Zbyt krótki nie pozwala na wystarczające barwienie, a zbyt długi powoduje nadmierne barwienie, co utrudnia oddzielenie dendrytów podczas przeprowadzania analizy. Po wyjęciu z roztworu barwiącego czas jest mniej krytyczny.</li>
	<li>Odwodnić skrawki w następujący sposób: 70% EtOH (5 min), 95% EtOH (5 min; 2x), 100% EtOH (5 min; 2x), środek czyszczący (5 min; 3x). Często zmieniaj wszystkie roztwory, zwłaszcza 100% EtOH i środek czyszczący, aby zapewnić, że sekcje pozostaną bezwodne. 
	UWAGA: Nie jest konieczne przechodzenie przez etap 50% EtOH. Barwienie przeciwstawne nie jest potrzebne do wizualizacji komórek, ponieważ impregnacja Golgiego zapewnia wystarczający kontrast. Stosowanie innych środków czyszczących nie zadziałało tak dobrze, jak ten zastosowany tutaj (patrz tabela materiałów).</li>
	<li>Szkiełko nakrywkowe ze szklanymi szkiełkami nakrywkowymi o długości 60 mm z dużą ilością środka montażowego. Upewnij się, że jest jak najmniej pęcherzyków powietrza. W razie potrzeby ostrożnie usuń i ponownie wykonaj szkiełko nakrywkowe (można to zrobić nawet kilka tygodni później). Rób to bardzo powoli, aby nie uszkodzić sekcji (można to zrobić ze względu na dużą ilość medium montażowego). 
	UWAGA: Duża ilość medium montażowego jest nieco kłopotliwa, ale nadal konieczna, ponieważ do pokrycia grubych odcinków 100 μm należy użyć wystarczającej ilości medium montażowego.</li>
	<li>Aby upewnić się, że na sekcjach umieszczono tylko jedno szkiełko nakrywkowe, należy je oddzielić przed rozpoczęciem procesu.</li>
	<li>Po zsunięciu się okładki suche ślizga się płasko na dowolnym nieporowatym papierze przez 3-5 dni, lekko je przesuwając, zwłaszcza po pierwszym dniu, aby uniknąć przywierania. Po 3-5 dniach przenieś szkiełka do uchwytów na szkiełka i najlepiej wysusz je przez co najmniej 3 tygodnie przed ich zbadaniem. Utrzymuj szkiełka płasko, aby zmniejszyć możliwość tworzenia się pęcherzyków powietrza.</li>
</ol>
4. Wyznaczanie gęstości kolców dendrytycznych
<ol>
	<li>W celu analizy gęstości kolców dendrytycznych w neuronach piramidowych zarówno regionu mPFC, jak i CA1 hipokampa, należy zbadać najbardziej boczne drugorzędowe dendryty podstawne i najbardziej boczne dendryty wierzchołkowe trzeciorzędowe, jak opisano w kroku 4.1.1 (<silna klasa = "xfig">Rysunek 2).
	<ol>
		<li>Wybierz dendryt, zmierz długość dendrytu za pomocą programu do analizy obrazu, policz kolce dendrytów za pomocą licznika ręcznego i zapisz zarówno długość, jak i liczbę kolców.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Badaj i analizuj sześć komórek na region (mPFC, CA1) na mózg. Określ ilościowo co najmniej sześć mózgów na grupę, jak opisano wcześniej7,8. Wybierz neurony, które spełniają następujące kryteria analizy: ciała komórkowe i dendryty są dobrze zaimpregnowane; Dendryty można odróżnić od sąsiednich komórek i są ciągłe.</li>
	<li>Policz kolce z prędkością 1000x (zanurzenie w oleju), licząc ręcznie za pomocą mikroskopu świetlnego i zmierz długość dendrytyczną za pomocą programu do analizy obrazu. Oblicz gęstość grzbietu, dzieląc liczbę grzbietów przez długość dendrytu i wyraź dane jako liczbę kolców/ dendryt 10 μm. 
	UWAGA: Istnieją znacznie bardziej wyrafinowane metody różnicowania podtypów kręgosłupa i architektury dendrytycznej, które można zastosować, ale liczenie ręczne za pomocą mikroskopu świetlnego z prędkością 1000x może dać szybki wynik, który może następnie określić, czy konieczne są dalsze badania. Chociaż dokłada się wszelkich starań, aby konsekwentnie pobierać próbki podobnych dendrytów, istnieją różnice w grubości, które mogą mieć wpływ na liczenie.</li>
</ol>

<ol><li>Pannese, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Golgi+Stain%3A+invention%2C+diffusion+and+impact+on+neurosciences%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+History+of+the+Neurosciences%22%5BJournal%5D)">The Golgi Stain: invention, diffusion and impact on neurosciences.</a> Journal of the History of the Neurosciences. 8 (2), 132-140 (1999).</li>
<li>Bentivoglio, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Original+Histological+Slides+of+Camillo+Golgi+and+His+Discoveries+on+Neuronal+Structure%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Neuroanatomy%22%5BJournal%5D)">The Original Histological Slides of Camillo Golgi and His Discoveries on Neuronal Structure.</a> Frontiers in Neuroanatomy. 13, 3(2019).</li>
<li>Swanson, L. W., Newman, E., Araque, A., Dubinsky, J. M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSwanson%2C+LW+%22The+Beautiful+Brain%3A+The+Drawings+of+Santiago+Ramon+y+Cajal%22">The Beautiful Brain: The Drawings of Santiago Ramon y Cajal</a>. , Abrams. 208(2017).</li>
<li>Dall'Oglio, A., Ferme, D., Brusco, J., Moreira, J. E., Rasia-Filho, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+%26%2334%3Bsingle-section%26%2334%3B+Golgi+method+adapted+for+formalin-fixed+human+brain+and+light+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+Methods%22%5BJournal%5D)">The &#34;single-section&#34; Golgi method adapted for formalin-fixed human brain and light microscopy.</a> Journal of Neuroscience Methods. 189 (1), 51-55 (2010).</li>
<li>Gabbott, P. L., Somogyi, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+%27single%27+section+Golgi-impregnation+procedure%3A+methodological+description%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+Methods%22%5BJournal%5D)">The 'single' section Golgi-impregnation procedure: methodological description.</a> Journal of Neuroscience Methods. 11 (4), 221-230 (1984).</li>
<li>Gould, E., Frankfurt, M., Westlind-Danielsson, A., McEwen, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Developing+forebrain+astrocytes+are+sensitive+to+thyroid+hormone%5BTitle%5D)+AND+%22Glia%22%5BJournal%5D)">Developing forebrain astrocytes are sensitive to thyroid hormone.</a> Glia. 3 (4), 283-292 (1990).</li>
<li>Gould, E., Woolley, C. S., Frankfurt, M., McEwen, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gonadal+steroids+regulate+dendritic+spine+density+in+hippocampal+pyramidal+cells+in+adulthood%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Gonadal steroids regulate dendritic spine density in hippocampal pyramidal cells in adulthood.</a> Journal of Neuroscience. 10 (4), 1286-1291 (1990).</li>
<li>Woolley, C. S., Gould, E., Frankfurt, M., McEwen, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Naturally+occurring+fluctuation+in+dendritic+spine+density+on+adult+hippocampal+pyramidal+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Naturally occurring fluctuation in dendritic spine density on adult hippocampal pyramidal neurons.</a> Journal of Neuroscience. 10 (12), 4035-4039 (1990).</li>
<li>Frankfurt, M., Salas-Ramirez, K., Friedman, E., Luine, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cocaine+alters+dendritic+spine+density+in+cortical+and+subcortical+brain+regions+of+the+postpartum+and+virgin+female+rat%5BTitle%5D)+AND+%22Synapse%22%5BJournal%5D)">Cocaine alters dendritic spine density in cortical and subcortical brain regions of the postpartum and virgin female rat.</a> Synapse. 65 (9), 955-961 (2011).</li>
<li>Frankfurt, M., Luine, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+evolving+role+of+dendritic+spines+and+memory%3A+Interaction%28s%29+with+estradiol%5BTitle%5D)+AND+%22Hormones+Behavior%22%5BJournal%5D)">The evolving role of dendritic spines and memory: Interaction(s) with estradiol.</a> Hormones Behavior. 74, 28-36 (2015).</li>
<li>Bowman, R. E., Luine, V., Khandaker, H., Villafane, J. J., Frankfurt, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adolescent+bisphenol-A+exposure+decreases+dendritic+spine+density%3A+role+of+sex+and+age%5BTitle%5D)+AND+%22Synapse%22%5BJournal%5D)">Adolescent bisphenol-A exposure decreases dendritic spine density: role of sex and age.</a> Synapse. 68 (11), 498-507 (2014).</li>
<li>Bowman, R. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bisphenol-A+exposure+during+adolescence+leads+to+enduring+alterations+in+cognition+and+dendritic+spine+density+in+adult+male+and+female+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Hormones+Behavior%22%5BJournal%5D)">Bisphenol-A exposure during adolescence leads to enduring alterations in cognition and dendritic spine density in adult male and female rats.</a> Hormones Behavior. 69, 89-97 (2015).</li>
<li>Eilam-Stock, T., Serrano, P., Frankfurt, M., Luine, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bisphenol-A+impairs+memory+and+reduces+dendritic+spine+density+in+adult+male+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Behavioral+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Bisphenol-A impairs memory and reduces dendritic spine density in adult male rats.</a> Behavioral Neuroscience. 126 (1), 175-185 (2012).</li>
<li>Inagaki, T., Frankfurt, M., Luine, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Estrogen-induced+memory+enhancements+are+blocked+by+acute+bisphenol+A+in+adult+female+rats%3A+role+of+dendritic+spines%5BTitle%5D)+AND+%22Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Estrogen-induced memory enhancements are blocked by acute bisphenol A in adult female rats: role of dendritic spines.</a> Endocrinology. 153 (7), 3357-3367 (2012).</li>
<li>Jacome, L. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gonadal+Hormones+Rapidly+Enhance+Spatial+Memory+and+Increase+Hippocampal+Spine+Density+in+Male+Rats%5BTitle%5D)+AND+%22Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Gonadal Hormones Rapidly Enhance Spatial Memory and Increase Hippocampal Spine Density in Male Rats.</a> Endocrinology. 157 (4), 1357-1362 (2016).</li>
<li>Frankfurt, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bisphenol-A%3A+a+plastic+manufacturing+compound+disrupts+critical+brain+structures+and+impairs+memory%5BTitle%5D)+AND+%22Research+Features%22%5BJournal%5D)">Bisphenol-A: a plastic manufacturing compound disrupts critical brain structures and impairs memory.</a> Research Features. , https://researchfeatures.com/wp-content/uploads/2021/05/Maya-Frankfurt.pdf (2021).</li>
<li>Wallace, M., Luine, V., Arellanos, A., Frankfurt, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ovariectomized+rats+show+decreased+recognition+memory+and+spine+density+in+the+hippocampus+and+prefrontal+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Research%22%5BJournal%5D)">Ovariectomized rats show decreased recognition memory and spine density in the hippocampus and prefrontal cortex.</a> Brain Research. 1126 (1), 176-182 (2006).</li>
<li>Wallace, M., Frankfurt, M., Arellanos, A., Inagaki, T., Luine, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impaired+recognition+memory+and+decreased+prefrontal+cortex+spine+density+in+aged+female+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+the+New+York+Academy+of+Science%22%5BJournal%5D)">Impaired recognition memory and decreased prefrontal cortex spine density in aged female rats.</a> Annals of the New York Academy of Science. 1097, 54-57 (2007).</li>
<li>Bowman, R. E., Hagedorn, J., Madden, E., Frankfurt, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+adolescent+Bisphenol-A+exposure+on+memory+and+spine+density+in+ovariectomized+female+rats%3A+Adolescence+vs+adulthood%5BTitle%5D)+AND+%22Hormones+Behavior%22%5BJournal%5D)">Effects of adolescent Bisphenol-A exposure on memory and spine density in ovariectomized female rats: Adolescence vs adulthood.</a> Hormones Behavior. 107, 26-34 (2019).</li>
<li>Novaes, L. S., Dos Santos, N. B., Perfetto, J. G., Goosens, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Environmental+enrichment+prevents+acute+restraint+stress-induced+anxiety-related+behavior+but+not+changes+in+basolateral+amygdala+spine+density%5BTitle%5D)+AND+%22Psychoneuroendocrinology%22%5BJournal%5D)">Environmental enrichment prevents acute restraint stress-induced anxiety-related behavior but not changes in basolateral amygdala spine density.</a> Psychoneuroendocrinology. 98, 6-10 (2018).</li>
<li>Trzesniewski, J., Altmann, S., Jäger, L., Kapfhammer, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reduced+Purkinje+cell+size+is+compatible+with+near+normal+morphology+and+function+of+the+cerebellar+cortex+in+a+mouse+model+of+spinocerebellar+ataxia%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Neurology%22%5BJournal%5D)">Reduced Purkinje cell size is compatible with near normal morphology and function of the cerebellar cortex in a mouse model of spinocerebellar ataxia.</a> Experimental Neurology. 311, 205-212 (2019).</li>
<li>Zemmar, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oligodendrocyte-+and+Neuron-Specific+Nogo-A+Restrict+Dendritic+Branching+and+Spine+Density+in+the+Adult+Mouse+Motor+Cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Cerebral+Cortex%22%5BJournal%5D)">Oligodendrocyte- and Neuron-Specific Nogo-A Restrict Dendritic Branching and Spine Density in the Adult Mouse Motor Cortex.</a> Cerebral Cortex. 28 (6), 2109-2117 (2018).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Niniejszy protokół opisuje metodę impregnacji metodą Golgiego, która pozwala na szybką jednoczesną obróbkę wielu skrawków. Jest to ulepszenie w stosunku do wcześniej opisanych5 bardziej pracochłonnych metod i konsekwentnie daje zapłodnione neurony do analizy. Ponadto istnieje mniejsze narażenie na toksyczne chemikalia stosowane w impregnacji Golgiego. Najtrudniejszą częścią procesu jest ustawienie sekcji płasko na zjeżdżalniach, co wymaga sporej praktyki. Niezbędne jest utrzymanie wszystkiego w ja...

Metoda użycia dwuchromianu potasu i azotanu srebra do oznaczania neuronów została po raz pierwszy opisana przez Camillo Golgi1,2, a następnie wykorzystana przez Santiago Ramona y Cajala do stworzenia ogromnego dzieła różnicującego podtypy neuronów i gleju. Niedawno wydana książka z jego ilustracjami jest już dostępna3. Zgodnie z badaniami Ramona y Cajala, które zostały opublikowane ponad 100 lat temu, użyto bardzo mało impregnacji Golgiego. Impregnacja metodą Golgiego to pracochłonny proces, który pozwala na trójwymiarową wizualizację neuronów za pomocą mikroskopu świetlnego. Na przestrzeni lat dokonano licznych modyfikacji metody Golgiego, aby metoda była łatwiejsza, a barwienie bardziej spójne4. W 1984 roku Gabbott i Somogyi5 opisali jednosekcyjną procedurę impregnacji Golgiego, która pozwoliła na szybszą obróbkę. Ta metoda impregnacji Golgiego wymaga perfuzji z 4% paraformaldehydem i 1,5% kwasem pikrynowym, po utrwaleniu, a następnie podziału wibratomu do kąpieli z 3% dwuchromianem potasu. Sekcje są montowane na szkiełkach podstawowych, cztery rogi szkiełek nakrywkowych są klejone tak, aby po zanurzeniu w azotanie srebra dyfuzja była stopniowa. Szkiełka nakrywkowe są następnie odłupywane, sekcje są odwadniane, a ostatecznie pokrywane pokrywane na stałe nasuwane medium montażowym. Technika ta została z powodzeniem wykorzystana do oznaczania neuronów i gleju6,7,8 w hipokampie. Opisana tutaj szybka metoda Golgiego jest ulepszeniem, ponieważ jest znacznie mniejsza ekspozycja zarówno na dichromian potasu, jak i azotan srebra i nie stosuje się paraformaldehydu i kwasu pikrynowego. Ponadto, mimo że można było analizować komórki, które zostały zaimpregnowane przy użyciu modyfikacji metody Gabbott i Somogyi5, często skrawki były prześwietlone lub niedoświetlone lub odpadały ze szkiełek podczas etapu odwodnienia i ogólnie rzecz biorąc, kilka eksperymentów musiało zostać połączonych, aby mieć wystarczającą liczbę komórek do analizy.
Obecny protokół opisuje użycie zestawu do barwienia Golgiego (patrz Tabela materiałów) do oznaczania dendrytów i kolców dendrytycznych w hipokampie i przyśrodkowej korze przedczołowej (mPFC) szczura. Zaletą tej metody w porównaniu z poprzednimi jest to, że jest szybka, badacz jest mniej narażony na szkodliwe chemikalia i następuje konsekwentne barwienie neuronów. Opisany poniżej protokół został wykorzystany z niewielkimi modyfikacjami do oceny gęstości kolców dendrytycznych w hipokampie i mPFC szczura w wielu badaniach9,10,11,12,13,14,15.

<table><tbody><tr><td>Tacki na szkiełka kartonowe</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-587-10</td><td></td></tr><tr><td>Szkiełka nakrywkowe 24 x 60 mm</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-545-M</td><td></td></tr><tr><td>FD Zestaw Rapid GolgiStain</td><td>FD Neurotechnologies</td><td>PK 401</td><td>Stabilny w RT w ciemności przez miesiące; Zestaw do barwienia Golgiego</td></tr><tr><td>Spray do zamrażania</td><td>Fisher Scientific</td><td>23-022524</td><td></td></tr><tr><td>HISTO-CLEAR</td><td>Fisher Scientific</td><td>50-899-90147</td><td>środek czyszczący</td></tr><tr><td>NCSS Software</td><td>Kaysville, UT, Stany Zjednoczone</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Podłoże montażowe</td><td>Permount</td><td>Fisher Scientific</td><td>SP-15-100</td></tr><tr><td>Szkiełka mikroskopowe Superfrost Plus Fisher</td><td>Scientific</td><td>12-550-15</td><td></td></tr><tr><td>Tissue Tek CTYO OCT Compound</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-373-65</td><td>Służy do montażu mózgów na uchwycie kriostatowym</td></tr></tbody></table>

szybkie barwienie golgiego do wizualizacji dendrytycznego kręgosłupa w hipokampie i korze przedczołowej

Rapid Golgi Stain for Dendritic Spine Visualization in Hippocampus and Prefrontal Cortex

Impregnacja metodą Golgiego, przy użyciu zestawu do barwienia Golgiego z niewielkimi adaptacjami, służy do impregnacji kolców dendrytycznych w hipokampie szczura i przyśrodkowej korze przedczołowej. Technika ta jest wyraźnym postępem w stosunku do poprzednich metod impregnacji metodą Golgiego, ponieważ wstępnie zmieszane chemikalia są bezpieczniejsze w użyciu, neurony są konsekwentnie dobrze zapłodnione, jest znacznie mniej resztek tła, a dla danego regionu występują niezwykle małe odchylenia w gęstości kręgosłupa między eksperymentami. Co więcej, mózgi mogą być gromadzone po pewnym momencie i przechowywane w stanie zamrożonym do czasu dalszego przetwarzania. Za pomocą tej metody można badać dowolny obszar mózgu, który Cię interesuje. Po zabarwieniu i zsunięciu pokrywy gęstość kolców dendrytycznych określa się, zliczając liczbę kolców na długość dendrytu i wyrażając ją jako gęstość grzbietu na 10 μm dendrytu.

Dzięki zastosowaniu szybkiej metody Golgiego komórki są konsekwentnie dobrze impregnowane, co zapewnia odpowiednią liczbę komórek do analizy. Jest to znaczna poprawa w stosunku do wcześniejszych metod, w których eksperymenty musiały być łączone, aby uzyskać wystarczającą ilość danych do analizy. W związku z tym można jednocześnie przetwarzać więcej próbek, a mózgi mogą być przechowywane w zamrożeniu do czasu opracowania. Przykłady komórek impregnowanych metodą Golgiego w obszarze CA1 hipokampa przedstawiono przy małym i ...

Protokół opisuje modyfikację szybkiej metody Golgiego, która może być dostosowana do dowolnej części układu nerwowego, do barwienia neuronów w hipokampie i przyśrodkowej korze przedczołowej szczura.

Szybkie barwienie Golgiego do wizualizacji dendrytycznego kręgosłupa w hipokampie i korze przedczołowej

Golgi impregnation, using the Golgi staining kit with minor adaptations, is used to impregnate dendritic spines in the rat hippocampus and medial ...

Chociaż technika impregnacji Golgiego jest stosunkowo prosta, ma kilka trudnych etapów, a niewykonanie ich prawidłowo powoduje, że komórki nie nadają się do analizy. Technika ta zapewnia szybkie, powtarzalne znakowanie neuronów zaimpregnowanych metodą Golgiego. Ponadto mały błąd standardowy średniej pozwala na porównanie między eksperymentami.Najtrudniejszą częścią tej techniki jest cięcie sekcji kriostatu, ponieważ mają one niezwykłą konsystencję i utrwalenie, a zatem ułożenie ich na szkiełku na płasko jest pewnym wyzwaniem, wymaga praktyki. Najpierw umieść niewielką ilość podłoża tkankowego na wstępnie schłodzonym uchwycie kriostatu. Zamontuj bloki mózgowe na uchwytach kriostatu, lekko rozmrażając jedną stronę bloku w dłoni w rękawiczce i umieszczając go na podłożu tkankowym.Użyj sprayu zamrażającego na nóż i blok. Użyj płytki zapobiegającej przetaczaniu się lub szczotki, aby utrzymać sekcję płasko podczas cięcia. Wytnij 100 mikrometrowych skrawków na kriostacie w temperaturze minus 22 stopni Celsjusza.Rozmrozić moc, jeśli to możliwe, za pomocą suwaka o temperaturze pokojowej i szybko przyłożyć go do sekcji. Alternatywnie trzymaj szkiełka w kriostacie, aby zamarzały. Przenieś sekcję zimnymi kleszczami lub zimnym pędzlem, a następnie rozmrozić mocowanie.Zamontuj trzy do czterech sekcji koronalnych na subsydach. Wyczyść nóż papierowymi chusteczkami między plasterkami. Jeśli nóż wymaga dalszego czyszczenia, użyj 100% etanolu i wysusz przed pokrojeniem kolejnego plasterka.Umieść szkiełka w stojakach, rozmieszczone wystarczająco daleko, aby umożliwić dostęp roztworu do sekcji. Umieść skrawki w wodzie destylowanej dwa razy na cztery minuty przed umieszczeniem ich w roztworze impregnacyjnym Golgiego na 10 minut. Oddziel szkiełka nakrywkowe, aby upewnić się, że na sekcjach znajduje się tylko jedna szkiełko nakrywkowe.Przykryj szkiełka dużą ilością medium montażowego przed umieszczeniem szklanego szkiełka nakrywkowego na szkiełku. Po zsunięciu się okładki suche szkiełka oflagowywały się na dowolnym nieporowatym papierze przez trzy do pięciu dni, lekko je przesuwając, zwłaszcza po pierwszym dniu, aby uniknąć przywierania. Później przenieś szkiełka do uchwytów na szkiełka i najlepiej susz je przez co najmniej trzy tygodnie przed ich zbadaniem.Aby przeanalizować gęstość kolców dendrytycznych w neuronach piramidowych zarówno przyśrodkowej kory przedczołowej, jak i regionu CA1 hipokampa, zmierz długość dendrytyczną za pomocą programu do analizy obrazu. Policz kolce na dendrytach za pomocą licznika ręcznego i zapisz zarówno długość, jak i liczbę kolców. Do analizy wybierz neurony z ciałami komórkowymi i dendrytami po zapłodnieniu oraz dendryty, które są ciągłe i odróżniają się od sąsiednich komórek.Rysunek przedstawia przykłady komórek zaimpregnowanych Golgiego w regionie CA1 hipokampa przy niskiej i dużej mocy. Rysunek ilustruje eksperyment, w którym podstawowa gęstość kolców dendrytycznych została zwiększona na komórkach piramidowych u dorastających samców i samic szczurów po wzbogaceniu środowiska w CA1 i przyśrodkowej korze przedczołowej. Utrzymanie sekcji w odpowiedniej temperaturze podczas cięcia jest wyzwaniem i w tym celu używamy dużej ilości sprayu zamrażającego.A następnie trudno jest umieścić sekcje na szkiełkach i wyschnąć na płasko. Technika ta służy do badania cech neuroanatomicznych. Może być stosowany samodzielnie lub w połączeniu z innymi metodami śledzenia neuroanatomicznego.

rapid-golgi-stain-for-dendritic-spine-visualization-hippocampus

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Metoda FRAP była wykorzystywana do ilościowego określania mobilności białek znakowanych zieloną białko fluorescencyjnym (GFP) w hodowlach komórkowych. Zbadaliśmy frakcje mobilne i niemobilne GFP, analizując procent odzysku fluorescencji po fotowybielaniu. W niniejszym badaniu FRAP przeprowadzono w kolcach dendrytycznych neuronów hipokampa.

Odzyskiwanie fluorescencji po fotowybielaniu (FRAP) białek znakowanych fluorescencyjnie w kolcach dendrytycznych hodowanych neuronów hipokampa

Liczne niedawne badania zidentyfikowały mutacje w białkach synaptycznych powiązanych z patologiami mózgu. Pierwotne hodowle neuronów korowych zapewniają dużą elastyczność w badaniu wpływu tych białek związanych z chorobami na morfologię i ruchliwość kolców dendrytycznych.

Analiza morfologii kolców dendrytycznych w hodowlanych neuronach OUN

Źródło: McLeod, F., et al. Ocena gęstości synaps w wycinkach mózgu gryzoni w hipokampie. J. Vis. Exp. (2017). Ten film przedstawia metodę wizualizacji markerów synaptycznych w wycinkach mózgu hipokampa za pomocą konfokalnej analizy immunofluorescencyjnej. Plastry są barwione immunologicznie przeciwciałami pierwszorzędowymi skierowanymi przeciwko markerom presynaptycznym i postsynaptycznym, a następnie przeciwciałami drugorzędowymi sprzężonymi z fluoroforem. Oznaczone markery są następnie...

Analiza mikroskopowa synaps w mysich wycinkach hipokampa przy użyciu immunofluorescencji

Lokalizacja i dystrybucja białek dostarcza ważnych informacji dla zrozumienia ich funkcji komórkowych. Doskonała rozdzielczość przestrzenna mikroskopii elektronowej (EM) może być wykorzystana do określenia subkomórkowej lokalizacji danego antygenu po immunohistochemii. W przypadku tkanek ośrodkowego układu nerwowego (OUN) zachowanie integralności strukturalnej przy jednoczesnym zachowaniu antygenowości było szczególnie trudne w badaniach EM. Tutaj przyjmujemy procedurę, która została...

Znakowanie białek synaptycznych po zatopieniu Immunogold w kulturach warstw hipokampa

Ten artykuł opisuje procedury stymulacji dotykowej szczeniąt szczurów i późniejszego barwienia morfologii neuronów metodą Golgiego-Coxa. Stymulacja dotykowa to pozytywne doświadczenie, które podaje się w okresie okołoporodowym poprzez głaskanie szczeniąt domowym miotełkiem do kurzu. Barwienie metodą Golgiego-Coxa jest niezawodną procedurą pozwalającą na wizualizację całych neuronów.

Wizualizacja wpływu pozytywnego wczesnego doświadczenia, stymulacji dotykowej, na morfologię dendrytyczną i łączność synaptyczną za pomocą barwienia Golgiego-Coxa

Ten artykuł opisuje działający protokół obrazowania kolców dendrytycznych z neuronów hipokampa in vitro za pomocą Mikroskopii Iluminacji Strukturalnej (SIM). Mikroskopia superrozdzielcza wykorzystująca SIM zapewnia rozdzielczość obrazu znacznie wykraczającą poza granicę dyfrakcji światła we wszystkich trzech wymiarach przestrzennych, umożliwiając obrazowanie pojedynczych kolców dendrytycznych z większą szczegółowością.

Obrazowanie kolców dendrytycznych pierwotnych neuronów hipokampa szczura za pomocą mikroskopii oświetlenia strukturalnego

Opisujemy dwie metody wizualizacji i kwantyfikacji arboryzacji dendrytycznej w hipokampie modeli mysich: obrazowanie w czasie rzeczywistym i rozszerzoną głębię ostrości. Podczas gdy pierwsza metoda pozwala na zaawansowane śledzenie topograficzne i ilościowe określenie zakresu rozgałęzień, druga pozwala na szybką wizualizację drzewa dendrytycznego.

Ocena arboryzacji dendrytycznej w zakręcie zębatym okolicy hipokampa u myszy

Przedstawiamy protokół do użycia metody barwienia Golgiego-Coxa w grubych fragmentach mózgu, w celu wizualizacji neuronów z długimi drzewami dendrytycznymi zawartymi w pojedynczych próbkach tkanek. Przedstawiono również dwa warianty tego protokołu, które obejmują barwienie przeciwstawne fioletem krezylowym i zamrażanie nieprzetworzonych mózgów w celu długotrwałego przechowywania.

Obrazowanie neuronów w grubych sekcjach mózgu metodą Golgiego-Coxa

Tutaj prezentujemy szczegółowo protokół Golgi-Cox. Ta niezawodna metoda barwienia tkanek pozwala na wysokiej jakości ocenę cytoarchitektury w hipokampie i w całym mózgu, przy minimalnym rozwiązywaniu problemów.

Ocena złożoności dendrytycznej hipokampa u starszych myszy przy użyciu metody Golgiego-Coxa

Seryjna skaningowa mikroskopia elektronowa (SBEM) jest stosowana do obrazowania i analizy kolców dendrytycznych w mysim hipokampie.

Seryjna skaningowa mikroskopia elektronowa typu block-face (SBEM) do badania kolców dendrytycznych

Poznaj zmodyfikowaną metodę Golgiego do szybkiego barwienia neuronów w hipokampie i korze przedczołowej szczurów. Technika umożliwia analizę gęstości kolców dendrytycznych i plastyczności neuronalnej.

Szybkie barwienie Golgiego do wizualizacji dendrytycznego kręgosłupa w hipokampie i korze przedczołowej

Przeglądaj więcej filmów