Name: In vivo (in vivo) Obrazowanie tkanek biologicznych za pomocą połączonej mikroskopii fluorescencji dwufotonowej i wymuszonego rozpraszania Ramana (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-12-20T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 6 s
Description: Poznaj metodę obrazowania in vivo tkanek biologicznych za pomocą połączonej mikroskopii fluorescencji dwufotonowej i wymuszonego rozpraszania Ramana. Technika ta umożliwia badanie dynamiki komórkowej w rdzeniu kręgowym myszy.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez Radę Grantów Badawczych Hongkongu poprzez granty 16103215, 16148816, 16102518, 16102920, T13-607/12R, T13-706/11-1, T13-605/18W, C6002-17GF, C6001-19E, N_HKUST603/19, Komisję ds. Innowacji i Technologii (ITCPD/17-9), Program Obszaru Doskonałości Komitetu ds. Grantów Uniwersyteckich (AoE/M-604/16, AOE/M-09/12) oraz Uniwersytet Nauki i Technologii w Hongkongu (HKUST) poprzez RPC10EG33 grantów.

Autorzy nie mają nic do ujawnienia i nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

W tym protokole szczegółowo opisano podstawową konfigurację mikroskopu TPEF-SRS. W przypadku obrazowania SRS pompa i wiązki Stokesa nakładają się czasowo i przestrzennie na siebie wewnątrz OPO. Jednak to nakładanie się może zostać zakłócone po przejściu przez system mikroskopowy. Dlatego zarówno przestrzenna, jak i czasowa optymalizacja kolokalizacji pompy i wiązek Stokesa jest konieczna i krytyczna dla uzyskania optymalnego obrazowania SRS. Opóźnienie czasowe między pompą a wiązką Stokesa jest związane z różnicą drogi o...

Mikroskopia Ramanowska1,2 jawi się jako potężna metoda obrazowania tkanek biologicznych bez znaczników na podstawie charakterystycznych częstotliwości różnych wiązań chemicznych w biomolekułach. Ze względu na nieinwazyjne i dobrze adaptacyjne możliwości obrazowania, mikroskopia Ramana jest szeroko stosowana do obrazowania składników wzbogaconych w lipidy w tkankach biologicznych, takich jak osłonka mielinowa3,4,5, adipocytes6,7 i krople lipidów8,9,10. Sygnał wymuszonego rozpraszania Ramanowskiego (SRS) uzyskany jako wymuszone wzmocnienie Ramana (SRG) lub wymuszona utrata Ramana (SRL) jest wolny od tła, wykazując idealne podobieństwo widmowe do spontanicznego rozpraszania Ramanowskiego11,12. Ponadto SRL i SRG są liniowo zależne od stężenia analitu, co pozwala na ilościową analizę składników biochemicznych9,11,13. Mikroskopia fluorescencyjna wzbudzona dwoma fotonami (TPEF) jest szeroko stosowana do obrazowania biologicznego in vivo ze względu na swoją wrodzoną zdolność do sekcji optycznej, głęboką głębokość penetracji i niską fototoksyczność14,15,16. Jednak wydajność obrazowania TPEF zależy od charakterystyki znaczników fluorescencyjnych, a liczba rozdzielczych kolorów jest ograniczona ze względu na szerokopasmowe widma fluorescencji8,17,18,19. Bezznacznikowe obrazowanie SRS i obrazowanie TPEF oparte na fluorescencji to dwie uzupełniające się metody obrazowania, a ich połączenie może dostarczyć obfitych informacji biofizycznych i biochemicznych tkanek. Te dwie metody obrazowania opierają się na nieliniowych procesach optycznych (NLO), co umożliwia łatwą integrację w jednym systemie mikroskopowym. Połączenie obrazowania SRS i TPEF, tzw. obrazowania dualmodalnego, umożliwia wysokowymiarowe obrazowanie i profilowanie komórek i tkanek, ułatwiając kompleksowe zrozumienie złożonych systemów biologicznych. W szczególności pikosekundowa (ps) mikroskopia SRS może osiągnąć obrazowanie wiązań chemicznych z wysoką rozdzielczością spektralną w porównaniu z techniką femtosekundową (fs) SRS11, co pozwala na różnicowanie wielu składników biochemicznych w tkance biologicznej, zwłaszcza w zatłoczonym obszarze odcisków palców20,21. Ponadto, w porównaniu z innym powszechnie stosowanym dwumodalnym systemem mikroskopowym NLO z integracją koherentnego mikroskopu rozpraszania anty-Stokesa (CARS), SRS wykazuje lepsze wyniki niż CARS pod względem interpretacji widma i obrazu, a także czułości wykrywania11. Mikroskop SRS-TPEF był używany jako potężne narzędzie do badania różnych układów biologicznych, takich jak Caenorhabditis elegans9,22, Xenopus laevis kijanka brain5, mouse brain23,24, rdzeń kręgowy25,26, nerw obwodowy27 i tkanka tłuszczowa7, itd.
Rdzeń kręgowy wraz z mózgiem tworzy centralny układ nerwowy (OUN). Wizualizacja aktywności komórkowej w OUN in vivo w warunkach fizjologicznych i patologicznych ma kluczowe znaczenie dla zrozumienia mechanizmów zaburzeń OUN28,29,30 oraz dla opracowania odpowiednich terapii31,32,33. Osłonka mielinowa, która owija i izoluje aksony w celu szybkiego przewodzenia potencjału czynnościowego, odgrywa znaczącą rolę w rozwoju OUN. Demielinizacja jest uważana za cechę charakterystyczną w zaburzeniach istoty białej, takich jak stwardnienie rozsiane34. Ponadto, po urazie rdzenia kręgowego35, resztki mieliny mogą modulować aktywację makrofagów, przyczyniając się do przewlekłego stanu zapalnego i wtórnego urazu36. Dlatego obrazowanie in vivo osłonki mielinowej wraz z neuronami i komórkami glejowymi w żywych modelach mysich jest bardzo pomocne w zrozumieniu dynamicznych procesów w zaburzeniach OUN.
W tym protokole opisano podstawowe procedury konfiguracji domowego mikroskopu TPEF-SRS oraz przedstawiono dwumodalne metody obrazowania in vivo dla rdzenia kręgowego myszy.

<table><tbody><tr><td>#2 Kleszcze</td><td>Dumont</td><td>11223-20</td><td>Do laminektomii</td></tr><tr><td>10X obiektyw</td><td>Nikon</td><td>CFI Plan Apo Lambda 10X</td><td></td></tr><tr><td>25X obiektyw</td><td>Olympus</td><td>XLPLN25XSVMP2</td><td></td></tr><tr><td>Burn krem</td><td>Betadine</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Camera</td><td>Sony</td><td>&alpha; 6300</td><td></td></tr><tr><td>Wzmacniacz prądowy</td><td>Stanford research</td><td>SR570</td><td></td></tr><tr><td>Moduły fotopowielacza prądu</td><td>Hamamatsu</td><td>H11461-01</td><td></td></tr><tr><td>D2 665 nm długoprzepustowe zwierciadło dichroiczne</td><td>Semrock</td><td>FF665-Di02-25x36</td><td>Do kierowania sygnału epi-fluorescencji do modułu detekcyjnego</td></tr><tr><td>D3 700 nm krótkoprzepustowe zwierciadło dichroiczne</td><td>Edmund</td><td>69-206</td><td>Do oddzielania SRS od Ścieżka detekcji TPEF</td></tr><tr><td>Krem do depilacji Filtr</td><td></td> krótkoprzepustowy Veet <td></td><td></td></tr><tr><td>FS1 975 nm</td><td>Edmund</td><td>86-108</td><td>Do blokowania wiązki stokes</td></tr><tr><td>FS1 Filtr pasmowo-przepustowy</td><td>Semrock</td><td>FF01-850/310</td><td>Do blokowania wiązki stokes</td></tr><tr><td>Fs2 Filtr pasmowo-przepustowy</td><td>Semrock</td><td>FF01-525/50</td><td>Do wyboru sygnału YFP</td></tr><tr><td>Fs2 Filtr krótkoprzepustowy</td><td>Semrock</td><td>FF01-715/SP-25</td><td>Do blokowania wiązki laserowej wzbudzenia fs</td></tr><tr><td>Płyta półfalowa</td><td>Thorlabs</td><td>SAHWP05M-1700</td><td></td></tr><tr><td>Szybki fotodetektor</td><td>MenloSystems</td><td>FPD 310-F</td><td>Do sprawdzania modulacji wiązki Stokesa</td></tr><tr><td>Jod</td><td>Betadyna</td><td></td><td></td></tr><tr><td>IR Scope</td><td>FJW</td><td>FIND-R-SCOPE Przeglądarka podczerwieni 2X Zestaw Model 84499C2X</td><td></td></tr><tr><td>Iris</td><td>Thorlabs</td><td>CPA1</td><td></td></tr><tr><td>L1</td><td>Thorlabs</td><td>AC254-060-B-ML</td><td></td></tr><tr><td>L10</td><td>Thorlabs</td><td>LA4052-A</td><td></td></tr><tr><td>L2</td><td>Thorlabs</td><td>LA1422-B</td><td></td></tr><tr><td>L3</td><td>Thorlabs</td><td>AC254-050-B</td><td></td></tr><tr><td>L4</td><td>Thorlabs</td><td>AC254-060-B-ML</td><td></td></tr><tr><td>L7</td><td></td><td></td><td>f=100 mm, powłoka AB</td></tr><tr><td>L8</td><td>Thorlabs</td><td>LA4874-A</td><td></td></tr><tr><td>L9</td><td>Thorlabs</td><td>AC254-035-B-ML</td><td></td></tr><tr><td>Wzmacniacz blokujący</td><td>Lustro APE</td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>Thorlabs</td><td>PF10-03-P01</td><td></td></tr><tr><td>Zmotoryzowana płetwa</td> Wielofunkcyjna karta akwizycyjna <td>Thorlabs</td><td>MFF101/M</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Oscyloskop National Instrument</td><td>PCIe-6363</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Tektronix</td><td>TDS2012C</td><td></td></tr><tr><td>Fotodioda</td><td>APE</td><td></td><td>Do wykrywania sygnału SRS</td></tr><tr><td>Picosecond źródło lasera</td><td>APE</td><td>picoEmerald</td><td></td></tr><tr><td>Rozdzielacz wiązki polaryzacyjnej</td><td>Thorlabs</td><td>CCM1-PBS252/M</td><td></td></tr><tr><td>Miernik mocy</td><td>Newport</td><td>843-R</td><td></td></tr><tr><td>Saline</td><td>Braun</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Scan lens L5</td><td>Lustro skanujące Thorlabs</td><td>SL50-CLS2</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Cambridge Technology</td><td>6215H</td><td></td></tr><tr><td>Żel silikonowy</td><td>World Precision Inc.</td><td>KWIK-SIL</td><td></td></tr><tr><td>Ti:szafirowy laser fs</td><td>Koherent</td><td>Chameleon Ultra II</td><td></td></tr><tr><td>Soczewka tubusu L6</td><td>Thorlabs</td><td>TTL200-S8</td><td></td></tr></tbody></table>

in vivo (in vivo) obrazowanie tkanek biologicznych za pomocą połączonej mikroskopii fluorescencji dwufotonowej i wymuszonego rozpraszania ramana

In vivo Imaging of Biological Tissues with Combined Two-Photon Fluorescence and Stimulated Raman Scattering Microscopy

Mikroskopia stymulowanego rozpraszania Ramana (SRS) umożliwia bezznacznikowe obrazowanie tkanek biologicznych w ich naturalnym mikrośrodowisku w oparciu o wewnętrzne wibracje molekularne, dostarczając tym samym doskonałe narzędzie do badania in vivo procesów biologicznych w rozdzielczości subkomórkowej. Dzięki zintegrowaniu obrazowania fluorescencji wzbudzonej dwufotonem (TPEF) z mikroskopem SRS, dwumodalne obrazowanie in vivo tkanek może pozyskiwać krytyczne informacje biochemiczne i biofizyczne z wielu perspektyw, co pomaga zrozumieć dynamiczne procesy związane z metabolizmem komórkowym, odpowiedzią immunologiczną i przebudową tkanek itp. W tym protokole wideo przedstawiono konfigurację systemu mikroskopowego TPEF-SRS, a także metodę obrazowania in vivo rdzenia kręgowego zwierzęcia. Rdzeń kręgowy, jako część ośrodkowego układu nerwowego, odgrywa kluczową rolę w komunikacji między mózgiem a obwodowym układem nerwowym. Osłonka mielinowa, bogata w fosfolipidy, otacza i izoluje akson, umożliwiając przewodzenie solne potencjałów czynnościowych. Obrazowanie in vivo osłonek mielinowych w rdzeniu kręgowym jest ważne dla badania postępu chorób neurodegeneracyjnych i uszkodzeń rdzenia kręgowego. W protokole opisano również przygotowanie zwierząt i metody obrazowania in vivo TPEF-SRS w celu uzyskania obrazów biologicznych o wysokiej rozdzielczości.

In vivo obrazowanie dualmodalne aksonów rdzeniowych oraz osłonek mielinowych przeprowadzono z wykorzystaniem myszy transgenicznych Thy1-YFP, które wykazują ekspresję EYFP w neuronach aferentnych zwojów korzeni grzbietowych (Rysunek 3). Te znakowane neurony aferentne przekazują informacje sensoryczne z nerwu obwodowego do rdzenia kręgowego, przy czym gałąź centralna znajduje się w tylnym sznurze rdzenia kręgowego. Przy użyciu mikroskopu TPEF-SRS, gęsto rozmieszczone osłonki mielinowe...

Mikroskopia stymulowanego rozpraszania Ramana (SRS) umożliwia bezznacznikowe obrazowanie biomolekuł na podstawie ich wewnętrznej wibracji określonych wiązań chemicznych. W tym protokole opisano instrumentalną konfigurację zintegrowanego mikroskopu SRS i dwufotonowego mikroskopu fluorescencyjnego w celu wizualizacji struktur komórkowych w rdzeniu kręgowym żywych myszy.

In vivo (in vivo) Obrazowanie tkanek biologicznych za pomocą połączonej mikroskopii fluorescencji dwufotonowej i wymuszonego rozpraszania Ramana

Stimulated Raman scattering (SRS) microscopy enables label-free imaging of the biological tissues in its natural microenvironment based on intrinsic ...

Obrazowanie in vivo tkanek biologicznych z rozdzielczością subkomórkową i swoistością chemiczną jest potężnym narzędziem do zrozumienia dynamicznych procesów związanych z metabolizmem komórkowym, odpowiedzią immunologiczną i przebudową tkanek. Dzięki połączonej fluorescencji dwufotonowej i stymulowanej mikroskopii rozpraszania Ramana, krytyczne informacje biochemiczne i biofizyczne o tkankach biologicznych można uzyskać z wielu perspektyw z rozdzielczością subkomórkową. W szczególności ta dwumodalna mikroskopia może być wykorzystana do obrazowania dynamiki komórkowej i interakcji w rdzeniu kręgowym myszy w celu zbadania postępu chorób neurodegeneracyjnych i uszkodzeń rdzenia kręgowego.Aby rozpocząć, włącz laser z szafirem tytanowym, przełączając przełącznik kluczykowy z pozycji czuwania na pozycję włączoną i poczekaj 30 minut, aż laser się rozgrzeje. Następnie włącz OPO, klikając przycisk start na panelu sterowania OPO i poczekaj 20 minut, aż laser się rozgrzeje. Po rozgrzaniu lasera pikosekundowego sprawdź głębokość modulacji wiązki Stokesa, obniżając moc wiązki Stokesa do około 20 miliwatów, otwierając migawkę laserową dla wiązki Stokesa i umieszczając szybki fotodetektor na wyjściu OPO w celu wykrycia wiązki.Następnie podłącz port wyjściowy fotodetektora do portu wejściowego oscyloskopu za pomocą koncentrycznego ze złączem BNC w celu monitorowania impulsu laserowego. Następnie otwórz okno sterowania EOM w oprogramowaniu sterującym OPO i dostosuj moc i fazę EOM zgodnie z wykresem intensywności impulsów pokazanym na oscyloskopie, aby osiągnąć maksymalną głębokość modulacji przy 20 megahercach. W oprogramowaniu sterującym OPO otwórz migawkę lasera pompy, zatrzymując wyjście Stokesa.Następnie kliknij ustaw skrzynkę sygnałową, aby ustawić długość fali wiązki pompy na 796 nanometrów, a następnie kliknij ustaw skrzynkę zasilania OPO i wprowadź 20, aby ustawić jej moc na minimum w celu wyrównania optycznego. Następnie umieść płytkę wyrównującą P1 za rozdzielaczem wiązki polaryzacyjnej na około 10 centymetrach i umieść płytkę P2 za P1 na około 30 centymetrach na ścieżce optycznej. Po otwarciu migawki mikroskopu dla pikosekundowej wiązki laserowej, wyreguluj lustro M1, aby zlokalizować środek pikosekundowej wiązki laserowej w otworze przelotowym P1. Użyj lunety na podczerwień, aby obserwować położenie plamki wiązki w P1 podczas regulacji lustra M1. Podobnie wyreguluj lustro M2, aby zlokalizować środek pikosekundowej wiązki laserowej w otworze przelotowym P2. Użyj lunety na podczerwień, aby obserwować położenie plamki wiązki w P2 podczas regulacji lustra M2. Po ustawieniu lusterek do momentu, gdy środek wiązki pikosekundowej znajdzie się w otworze przelotowym obu płytek wyrównujących, zamknij migawkę wiązki pikosekundowej w oprogramowaniu sterującym mikroskopem.Następnie otwórz migawkę mikroskopu dla wiązki lasera femtosekundowego. Wyreguluj lustro M3, aby zlokalizować środek plamki wiązki lasera femtosekundowego w otworze przelotowym P1, a następnie wyreguluj lustro M4, aby zlokalizować środek plamki wiązki lasera femtosekundowego w otworze przelotowym P2. Po ustawieniu zwierciadeł do momentu, gdy środek wiązki lasera femtosekundowego znajdzie się w otworach przelotowych dwóch płytek wyrównujących, zamknij migawkę mikroskopu dla wiązki femtosekundowej. Następnie umieść kamerę w pozycji obiektywu, aby zwizualizować położenie dwóch punktów wiązki i zaznacz pozycję belki pompy na ekranie kamery jako odniesienie.Następnie umieść płytkę wyrównującą P0 przed soczewką L3 i wyreguluj zwierciadło optyczne za pomocą klucza imbusowego tak, aby środek wiązki Stokesa przechodził przez otwór przelotowy płytki wyrównującej w porcie wyjściowym lasera. Użyj lunety na podczerwień, aby potwierdzić położenie plamki wiązki w P0 podczas regulacji. Następnie zdejmij płytkę wyrównującą P0 i użyj klucza imbusowego, aby wyregulować zwierciadło optyczne dwa, tak aby środek wiązki Stokesa współlokalizował się ze znakiem odniesienia wiązki pompy w kamerze.Kontynuuj regulację lusterek, aż wiązka Stokesa dokładnie zachodzi na belkę pompy zarówno w P0, jak i w płaszczyznach kamery. Otwórz oprogramowanie sterujące wzmacniaczem typu lock-in i ustaw długość fali lasera pompy na 796 nanometrów, a moc pompy i wiązki Stokesa na 50 i 70 miliwatów, co odpowiada odpowiednio 15 i 25 miliwatom na próbce. Następnie użyj oliwy z oliwek do optymalizacji fazy wzmacniacza lock-in.Oliwa z oliwek jest zamykana w szkiełku z bibułką przymocowaną do dna, aby zwiększyć rozpraszanie zwrotne sygnału lub wykrywanie EPI-SRS. Umieść próbkę oliwy z oliwek na stoliku i ustaw ostrość obiektywu 25X na próbce. Za pomocą oprogramowania sterującego mikroskopem ustaw parametry obrazowania zgodnie z opisem w rękopisie tekstowym.Następnie za pomocą oprogramowania sterującego wzmacniaczem lock-in ustaw wartość stałej czasowej na 10 mikrosekund. Następnie zeskanuj wiązkę laserową nad próbką, dostrajając fazę z krokiem 22,5 stopnia, aż intensywność sygnału SRS osiągnie maksimum. Następnie zeskanuj próbkę z zamkniętą migawką laserową, dostrajając wartość przesunięcia z krokiem o rozmiar jednego miliwolta, aż średni sygnał SRS będzie bliski zeru.Następnie otwórz okno dialogowe menedżera opóźnień w oprogramowaniu sterującym OPO i zeskanuj oliwę z oliwek, dostrajając stopień opóźnienia, aż sygnał SRS oliwy z oliwek osiągnie maksimum. Następnie przerwij skanowanie i kliknij przycisk dodawania danych w oknie dialogowym menedżera opóźnień, aby zarejestrować bieżące dane dotyczące opóźnień. Po podobnym uzyskaniu danych o opóźnieniach przy różnych przesunięciach Ramana poprzez obrazowanie różnych próbek chemicznych, wybierz dopasowanie danych w kolejności piątej w oknie dialogowym menedżera opóźnień, aby dopasować bieżące punkty danych do funkcji wielomianowej piątego rzędu.Następnie zastosuj dopasowane dane, klikając przycisk Użyj jako niestandardowego i zaznaczając pole wyboru. Stopień opóźnienia jest automatycznie regulowany przy różnych długościach fal zgodnie z dopasowaną krzywą opóźnienia. W przypadku obrazowania in vivo należy ustawić mysz na etapie stabilizacji z odsłoniętym rdzeniem kręgowym i zanurzonym w soli fizjologicznej.Teraz zamontuj stopień stabilizacyjny na pięcioosiowym stoliku pod mikroskopem TPEF-SRS. Następnie zabezpiecz głowę myszy dwoma prętami na głowę i opuść płytkę mocującą, aby zapewnić wystarczająco dużo miejsca na ruch klatki piersiowej podczas oddychania, łagodząc artefakty ruchu. Następnie dostosuj etap translacji Z, aby dostroić ostrość, aż obraz w jasnym polu unaczynienia rdzenia kręgowego będzie można obserwować pod obiektywem 10X.Zlokalizuj żyłę grzbietową rdzenia kręgowego w środku pola widzenia, dostrajając dwuosiowy etap translacyjny etapu pięcioosiowego. Następnie dostosuj kąty przechyłu i pochylenia pięcioosiowego stolika, aby dostosować powierzchnię grzbietową rdzenia kręgowego prostopadłą do osi obiektywu na podstawie obrazu Brightfield. Następnie zastąp 10X obiektywem z 25-krotnym zanurzeniem w wodzie do obrazowania TPEF-SRS.W przypadku obrazowania SRS wybierz rozdzielacz wiązki polaryzacyjnej nad obiektywem, naciskając przycisk przełącznika podłączony do zmotoryzowanej płetwy. W przypadku obrazowania TPEF wybierz zwierciadło dichroiczne D2 nad obiektywem, naciskając przycisk przełącznika podłączony do zmotoryzowanej płetwy. Na koniec ustaw parametry obrazowania zgodnie z opisem w rękopisie tekstowym i rozpocznij skanowanie próbki.Dwumodalne obrazowanie in vivo słabo znakowanych aksonów YFP i osłonek mielinowych w rdzeniu kręgowym myszy ujawniło, że aksony są ściśle owinięte grubą warstwą osłonek mielinowych. Jak widać na obrazie rdzenia kręgowego TPEF-SRS, węzły Ranviera mają zmniejszoną średnicę aksonów, a osilemma jest bezpośrednio wystawiona na działanie macierzy zewnątrzkomórkowej. W połączeniu z nowymi sondami do obrazowania fluorescencji i SRS, mikroskopia SRS wzbudzona fluorescencją dwufotonową może zapewnić jednoczesne obrazowanie strukturalne i funkcjonalne różnych biomolekuł, ułatwiając nam zrozumienie złożonych procesów biologicznych.

in-vivo-imaging-biological-tissues-with-combined-two-photon

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioinżynieria

Źródło: Espinoza, R., et al. Dwukolorowe, stymulowane w czasie rzeczywistym obrazowanie rozpraszania Ramana mózgu myszy w celu diagnozowania tkanek. J. Vis. exp. (2022).  Film przedstawia dwukolorowe, stymulowane rozpraszanie Ramana (SRS) wycinków tkanki mózgowej myszy. Dwie zsynchronizowane wiązki laserowe są kierowane na przekrój tkanki w celu wzbudzenia drgań molekularnych, co powoduje względną zmianę intensywności wiązek. Lipidy i białka w tkance są wykrywane za pomocą różnych par...

Dwukolorowe, stymulowane obrazowanie rozpraszania Ramana tkanki mózgowej myszy

Mikroskopia koherentnego rozpraszania Ramanowskiego (CARS) oparta na naturalnej wibracji wiązań molekułowych pozwala na chemicznie selektywne obrazowanie żywych komórek bez znaczników. W pracy przedstawiono implementację komplementarnej techniki mikroskopowej na standardowym wielofotonowym laserowym mikroskopie skaningowym opartym na laserze femtosekundowym Ti:sapphire i laserze OPO.

Implementacja koherentnego systemu rozpraszania Ramana (CARS) na standardowym laserowym mikroskopie skaningowym Ti:Sapphire i OPO

W tym manuskrypcie opisana jest implementacja mikroskopu z wymuszonym rozpraszaniem Ramana (SRS), uzyskanego przez integrację eksperymentalnego zestawu SRS z laserowym mikroskopem skaningowym. Mikroskop SRS oparty jest na dwóch femtosekundowych (fs) źródłach laserowych, Ti-Sapphire (Ti:Sa) i zsynchronizowanym optycznym oscylatorze parametrycznym (OPO).

Wdrożenie mikroskopu nieliniowego opartego na wymuszonym rozpraszaniu Ramana

Zmiany morfologiczne występują w komórkach fibroblastów reagujących immunologicznie po aktywacji i sprzyjają zmianom w rekrutacji komórek. Wykorzystanie obrazowania 2-fotonowego w połączeniu z genetycznie modyfikowanym białkiem 1 specyficznym dla fibroblastów (FSP1)-cre; Linia myszy tdTomato floxed-stop-floxed (TB / TB) i zielony fluorescencyjnie oznaczony lipopolisacharyd-FITC, możemy zilustrować wysoce specyficzny wychwyt lipopolisacharydu w fibroblastach skóry i zmiany morfologiczne in vivo.

Dwukolorowe obrazowanie 2-fotonowe in vivo genetycznie znakowanych komórek reporterowych w skórze

Mikroskopia stymulowanego rozpraszania Ramana (SRS) umożliwia selektywne, bezznacznikowe obrazowanie określonych cząsteczek chemicznych i została skutecznie wykorzystana do obrazowania cząsteczek lipidów in vivo. W tym miejscu przedstawiamy krótkie wprowadzenie do zasady działania mikroskopii SRS i opisujemy metody jej wykorzystania w obrazowaniu magazynowania lipidów w Caenorhabditis elegans.

Bezznacznikowe obrazowanie dynamiki magazynowania lipidów u Caenorhabditis elegans przy użyciu mikroskopii wymuszonego rozpraszania Ramana

Mikroskopia stymulowanego rozpraszania Ramana (SRS) jest potężną, nieniszczącą i bezznacznikową techniką obrazowania. Jednym z pojawiających się zastosowań jest stymulowana histologia Ramana, w której dwukolorowe obrazowanie SRS w przejściach Ramana białek i lipidów jest wykorzystywane do generowania obrazów pseudo-hematoksyliny i eozyny. W tym miejscu demonstrujemy protokół dwukolorowego obrazowania SRS w czasie rzeczywistym w diagnostyce tkanek.

Dwukolorowe, stymulowane rozpraszaniem Ramana w czasie rzeczywistym mózgu myszy w celu diagnozowania tkanek

Elektroniczne obrazowanie rozpraszania Ramana stymulowanego przed rezonansem (epr-SRS) tęczowych barwników Ramana to nowa platforma do wysoce multipleksowanego obrazowania białek opartych na epitopach. W tym miejscu przedstawiamy praktyczny przewodnik obejmujący przygotowanie przeciwciał, barwienie próbki tkanki, montaż mikroskopu SRS i obrazowanie tkanek epr-SRS.

Wysoce zmultipleksowane obrazowanie tkanek za pomocą barwników Ramana

Ten artykuł bezpośrednio porównuje rozdzielczość, czułość i kontrasty obrazowania stymulowanego rozpraszania Ramana (SRS) i spójnego rozpraszania anty-Stokesa Ramana (CARS) zintegrowanych w tej samej platformie mikroskopowej. Wyniki pokazują, że CARS ma lepszą rozdzielczość przestrzenną, SRS daje lepsze kontrasty i rozdzielczość spektralną, a obie metody mają podobną czułość.

Bezpośrednie porównanie hiperspektralnie stymulowanego rozpraszania Ramana i koherentnej mikroskopii rozpraszania Ramana antystokesa do obrazowania chemicznego

Przedstawiamy protokół do pozyskiwania obrazów chemicznych za pomocą mikroskopii SRS (ang. broadband stimulated Raman scattering). Opierając się na mikroskopie SRS, który działa z różnicową detekcją wielokanałową typu lock-in, protokół opisuje przygotowanie próbki, regulację aparatury SRS i chemometrię w celu rozplątania różnych składników chemicznie niejednorodnych próbek.

Multipleksowe obrazowanie chemiczne oparte na szerokopasmowej mikroskopii rozpraszania Ramana stymulowanego

Korzystając z platformy multimodalnej łączącej metody obrazowania optycznego bez znaczników, opracowaliśmy protokół do wizualizacji i ilościowego określania dynamiki komórkowej i metabolizmu. Dzięki obrazowaniu za pomocą fluorescencji wielofotonowej, generowania drugiej harmonicznej i wymuszonej mikroskopii rozpraszania Ramana możemy uzyskać całościowy przegląd środowiska komórkowego i molekularnego.

Multimodalna platforma obrazowania optycznego do badania metabolizmu komórkowego

Poznaj metodę obrazowania in vivo tkanek biologicznych za pomocą połączonej mikroskopii fluorescencji dwufotonowej i wymuszonego rozpraszania Ramana. Technika ta umożliwia badanie dynamiki komórkowej w rdzeniu kręgowym myszy.

In vivo (in vivo) Obrazowanie tkanek biologicznych za pomocą połączonej mikroskopii fluorescencji dwufotonowej i wymuszonego rozpraszania Ramana (Wideo) | JoVE Journal

In vivo (in vivo) Obrazowanie tkanek biologicznych za pomocą połączonej mikroskopii fluorescencji dwufotonowej i wymuszonego rozpraszania Ramana

Przeglądaj więcej filmów