Rozmieszczenie naukowców w celu przeprowadzenia nieniszczących próbek genetycznych rzadkich populacji motyli

W protokole tym zastosowano nowatorskie podejście polegające na pobieraniu próbek kosmówki z wyklutych jaj motyli do analizy genetycznej. Może to być szczególnie przydatne, gdy inne techniki pobierania próbek tkanek są niepraktyczne, niedostępne lub niedozwolone. Protokół ten ma stosunkowo niski całkowity koszt przy użyciu łatwych do zdobycia materiałów eksploatacyjnych i jest ukierunkowany na resztkowy materiał organiczny, co eliminuje potrzebę tymczasowego chwytania lub manipulowania żywymi organizmami oraz potencjalnego szkodzenia im w celu pozyskania próbek genetycznych.

Ogólny protokół jest prosty i łatwy do nauczenia, ale wymaga zręczności i ścisłej dbałości o szczegóły, w szczególności w celu skutecznego zlokalizowania, zidentyfikowania i usunięcia bardzo małych próbek docelowych, aby uniknąć zanieczyszczenia krzyżowego między zdarzeniami pobierania próbek. Zacznij od dokładnego przejrzenia i zebrania pełnej listy potrzebnych materiałów związanych ze zbiórką. Jeśli pobieranie próbek odbywa się w wielu lokalizacjach lub przez wiele osób lub zespołów, zbierz i zorganizuj wszystkie potrzebne zapasy w oddzielnych jednostkach, które można rozmieścić.

Zaopatrzenie transportowe dla naukowców społecznych lub innego personelu odpowiedzialnego za zbieranie danych w terenie. Jeśli personel nie jest lokalny, ostrożnie zapakuj zapasy do osobnego kartonowego pudełka wysyłkowego z kompletną etykietą wysyłkową i wyślij je. Po otrzymaniu materiałów do zbiórki, w tym pudełka na sprzęt do zbiórki, dokładnie przejrzyj laminowaną listę dostaw i przeprowadź pełną inwentaryzację.

Powiadom lidera projektu, jeśli brakuje jakichkolwiek zapasów. Napełnij 1,5 mililitra mikroprobówek wirówkowych 180 mikrolitrami buforu do lizy. Naklej wstępnie wydrukowaną unikalną etykietę identyfikacyjną na każdą probówkę do mikrowirówki i umieść wszystkie probówki w 64-dołkowym pudełku do przechowywania probówek do mikrowirówek.

Po załadowaniu mocno zabezpiecz pokrywę. Upewnij się, że wszystkie urządzenia cyfrowe są w pełni naładowane, a zapasowe baterie są zapakowane. Częściowo napełnij małą lodówkę lodem do przechowywania w terenie i lokalnego transportu pobranych próbek.

Zapakuj wszystkie materiały do zbiórki do pudełka na sprzęt do zbierania lub podobnego solidnego, odpornego na warunki atmosferyczne pojemnika, aby zapewnić bezpieczny transport i skonsolidowane przechowywanie. Zapoznaj się z nieniszczącym protokołem pobierania próbek genetycznych i szczegółami przed wyruszeniem w teren. Po przybyciu na teren pola użyj ołówka lub długopisu na każdą pogodę, aby zapisać porę dnia, datę, ogólną nazwę nieruchomości, nazwę lub opis konkretnej lokalizacji terenu, odczyt GPS, jeśli jest dostępny, oraz pełne imię i nazwisko oraz role wszystkich osób obecnych w odpornym na warunki atmosferyczne notatniku terenowym.

Zlokalizować siedlisko odpowiednie do występowania larw rośliny żywicielskiej dla docelowego motyla specyficznego dla danego gatunku. Za pomocą smartfona lub aparatu fotograficznego rób szczegółowe zdjęcia wszystkich miejsc polowych, miejsc pobierania próbek, roślin żywicielskich i innych istotnych informacji. Korzystaj ze smartfonów lub innych aparatów, które rejestrują współrzędne GPS.

Kompleksowo przeszukaj wszystkie larwalne części roślin żywicielskich, takie jak liście, pąki kwiatowe, kwiaty lub rozwijające się owoce, o których wiadomo, że są wybierane przez dorosłe samice motyli składające jaja na jaja. W przypadku większości Lycaenidae szukaj białych wyklutych jaj z wyraźnym otworem w środku, przypominającym pączka, z którego wyłoniła się larwa noworodka. Szukaj niewyklutych jaj, które są ciemniejsze, często zielone lub niebieskawe i będą całkowicie nienaruszone bez w środku.

Po zlokalizowaniu wyklutego jaja załóż rękawice nitrylowe. Za pomocą sterylnych i spiczastych kleszczy chwyć i delikatnie wyciągnij wyklute jajo z rośliny żywicielskiej i umieść je bezpośrednio w oznakowanej probówce do mikrowirówki wypełnionej buforem do lizy. Podobnie można wykorzystać i przetworzyć inne próbki tkanek.

Upewnij się, że cały zebrany materiał jest całkowicie zanurzony w buforze do lizy w każdej 1.5 mililitrowej probówce mikrowirówkowej. Postukaj dnem rurki o twardą powierzchnię, aby w razie potrzeby ponownie zanurzyć próbki. Podczas pobierania nowej próbki należy wyrzucić zużyte rękawice nitrylowe i zastąpić je czystą parą.

Po każdym pobraniu jaj dokładnie wyczyść końcówki kleszczy, zanurzając je lub oblewając je w fiolce z 95% etanolem z wyciskanej butelki lub za pomocą chusteczek nasączonych alkoholem. Zebrać co najmniej pięć próbek na kępę rośliny żywicielskiej na miejsce, przy czym każda próbka zawiera od jednego do 20 jaj, dążąc do uzyskania łącznie ponad 50 jaj w danym miejscu, jeśli jest to możliwe. Zbierz od jednego do 20 wyklutych jaj z wielu roślin w tym samym plastrze żywiciela do jednej probówki mikrowirówkowej i mocno zamknij pokrywę.

W przypadku gatunków motyli wykorzystujących większe zielne lub drzewiaste gatunki żywicielskie, zbierz wiele jaj z różnych miejsc na tej samej roślinie, jeśli plamy żywiciela są ograniczone. W odpornym na warunki atmosferyczne zeszycie polowym zapisz przypisaną niepowtarzalną etykietę identyfikacyjną wraz z rodzajem próbki, przybliżoną liczbą wyklutych jaj i informacjami o kolekcji. Umieść zamkniętą probówkę wirówkową z próbką resztek jaj z powrotem w 64-dołkowym pojemniku do przechowywania mikrowirówek.

Trzymaj schowek w lodówce z lodem podczas pracy w terenie. Umieść wszystkie inne materiały do zbiórki w pudełku na sprzęt do zbiórki, aby zapewnić bezpieczne i skonsolidowane przechowywanie i transport między miejscami. Z tych 160 próbek udało się wyekstrahować DNA z 88 o średnim stężeniu 1,67 nanograma na mikrolitr, a najwyższa wydajność DNA wyniosła 26,8 nanogramów na mikrolitr.

Stężenia DNA w zależności od rodzaju tkanki potwierdziły, że próbki zawierające pojedyncze szczątki jaj miały tylko jedną skrzynkę jajową, a próbki zawierające wiele komórek jaj miały co najmniej dwie skrzynki, przy czym liczba przypadków wahała się od dwóch do 20, średnio 5,3 na próbkę. Materiały do zebrania do 563 próbek zostały wysłane do ośmiu naukowców zajmujących się ochroną przyrody i społecznością z dziewięciu stanów w całym zakresie występowania gatunków we wschodniej Ameryce Północnej. Materiały zostały wysłane w ciągu trzech miesięcy w 2021 r. przed lokalnymi godzinami szczytu lotów.

Łącznie otrzymano 160 próbek tkanek tęczówki Calephelis. Bardzo ważne jest, aby zminimalizować zanieczyszczenie krzyżowe między próbkami, upewnić się, że pobrana próbka jest całkowicie zanurzona w buforze do lizy oraz dokładnie zapisać unikalną etykietę identyfikacyjną i dane dotyczące kolekcji dla każdej próbki. Protokół ten umożliwił szerokie zastosowanie i wykorzystanie przez naukowców społecznych do nieniszczącego pobierania próbek istniejących populacji rzadkiego motyla, aby pomóc w przeprowadzeniu szerokiej gamy analiz struktury genetycznej.