Name: Przepiórcza błona chorioallantoiczna - narzędzie do diagnostyki i terapii fotodynamicznej (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-04-28T12:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 43 s
Description: Poznaj przygotowanie kultury ex ovo przepiórki japońskiej i zastosowanie błony chorioallantoicznej w fotodynamicznej diagnostyce oraz terapii nowotworów i zakażeń mikrobiologicznych. Ta metoda zapewnia szybki rozwój, łatwy dostęp do tkanek i zgodność z zasadami 3R.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Praca była wspierana przez VEGA 2/0042/21 i APVV 20-0129. Wkład V. Huntošovej jest wynikiem realizacji projektu: Otwarta społeczność naukowa na rzecz nowoczesnych interdyscyplinarnych badań w medycynie (akronim: OPENMED), ITMS2014+: 313011V455 wspieranego przez Program Operacyjny Zintegrowana Infrastruktura, finansowanego ze środków EFRR.

Badania przeprowadzono zgodnie z wytycznymi instytucjonalnymi. Cały sprzęt i odczynniki muszą zostać poddane autoklawowaniu lub sterylizacji 70% etanolem lub światłem UV.
1. Inkubacja jaj
<ol>
	<li>Zapłodnione jaja przepiórcze przechowywać w temperaturze 10-15 °C przez maksymalnie 4-5 dni przed rozpoczęciem inkubacji. Należy używać wyłącznie czystych i nieuszkodzonych jaj.</li>
	<li>Inkubować jaja w inkubatorze z wymuszonym obiegiem powietrza przez ~ 53-54 h. Jaja należy ułożyć poziomo przy wyłączonej rotacji, w wilgotności 50%-60% i temperaturze inkubacji 37.5 °C.</li>
</ol>
2. Przygotowanie hodowli ex ovo
UWAGA: Po wstępnej inkubacji jaja nadają się do rozpoczęcia hodowli ex ovo.
<ol>
	<li>Zdezynfekuj powierzchnię jaja 70% etanolem, nie obracając jaja.</li>
	<li>W sterylnej komorze z laminarnym przepływem powietrza otwórz skorupkę jaja za pomocą małych sterylnych nożyc chirurgicznych i przenieś zawartość do 6-dołkowej płytki hodowlanej. Przy prawidłowym wykonaniu zarodek będzie spoczywać na nieuszkodzonym żółtku. Po każdym jaju zdezynfekuj nożyce 70% etanolem.</li>
	<li>Dodaj około 5 mL sterylnej wody do wolnych przestrzeni w płytce 6-dołkowej, ponieważ wilgotność jest niezbędna, aby zapobiec wysychaniu CAM.</li>
	<li>Umieść zarodki w inkubatorze do czasu dalszych eksperymentów, utrzymując temperaturę 37 °C oraz wilgotność 80%-90%.</li>
	<li>Gdy CAM będzie w pełni rozwinięta (od ED7), umieść sterylizowany pierścień silikonowy (o średnicy 6 mm i grubości około 1,5 mm) na powierzchni CAM, wzdłuż małych naczyń włosowatego. Podczas umieszczania pierścienia unikaj głównych naczyń krwionośnych. 
	UWAGA: Pierścień wyznacza obszar roboczy, pomaga zaznaczyć miejsce aplikacji substancji i zapobiega wyciekaniu płynnej zawartości.</li>
	<li>Zakończ hodowlę zarodków zgodnie z obowiązującym prawodawstwem krajowym.</li>
	<li>Ważne jest, aby podczas pracy używać rękawiczek lub utrzymywać dłonie zdezynfekowane 70% etanolem. Zarodki nieprawidłowo ułożone lub jaja niezapłodnione usuń za pomocą aspiratora próżniowego.</li>
</ol>
<img alt="Eksperyment z wylęganiem jaj przekrzątek; rękawice podczas obsługi jaj, zestaw inkubacyjny, stadia rozwoju zarodkowego." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63422/63422fig01.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1: Przygotowanie hodowli ex ovo. (A) Jaja przekrzątek japońskich podczas przechowywania i inkubacji. (B) Dezynfekcja powierzchni jaj etanolem. (C) Wycięcie skorupy jaja nożyczkami. (D) Przelanie zawartości jaja do dołka. (E) Prawidłowo przygotowany 3-dniowy embrion z rozwijającym się układem naczyniowym błony chalazowej (CAM). (F) Płytki hodowlane przechowywane w inkubatorze. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63422/63422fig01large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Eksperyment z hodowlą komórkową; rozwój zarodka; układ płytki 6-dołkowej; badanie angiogenezy; analiza laboratoryjna." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63422/63422fig02.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rysunek 2"> 
Rysunek 2: Płytka hodowlana 6-dołkowa z zarodkami i umieszczonymi na górze pierścieniami silikonowymi. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63422/63422fig02large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
3. Inokulacja komórek nowotworowych
UWAGA: Wszystkie procedury wymagają użycia sterylnej komory z laminarnym przepływem powietrza.
<ol>
	<li>Hodować różne typy komórek adherentnych w kolbach zgodnie z odpowiednimi protokołami hodowli.
	<ol>
		<li>Usunąć starą pożywkę z kolb i wypłukać warstwę komórek sterylnym roztworem soli fizjologicznej buforowanej fosforanem (PBS), aby usunąć pozostałości pożywki.</li>
		<li>Po trypsynizacji zahamować działanie trypsyny poprzez dodanie pożywki hodowlanej i zebrać komórki do probówek wirówkowych. Odwiruj komórki i resuspendować osad komórkowy w świeżej pożywce hodowlanej. Policzyć komórki i resuspendować je w pożywce do hodowli komórkowej w pożądanym stężeniu. 
		UWAGA: Możliwe jest również wytworzenie trójwymiarowych hodowli komórkowych, tj. sferoidów, stosując na przykład metodę kropli wiszącej21.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Zaimplantować 1 x 105-1 x 106 komórek nowotworowych lub 5-15 sferoidów (na jedną błonę CAM) w 30 µL roztworu pożywki komórkowej do pierścienia silikonowego umieszczonego na błonie CAM. 
	UWAGA: Objętość zależy od rozmiaru użytego pierścienia silikonowego. W przypadku zastosowania pierścienia o większej średnicy wymagana jest większa objętość, aby pokryć cały obszar. W zależności od typu komórek lub rodzaju eksperymentu można stosować różne stężenia komórek. Czasami stosuje się delikatne zdrapywanie błony CAM, aby poprawić adhezję wszczepionych komórek.</li>
	<li>Przenieść błony CAM z zaszczepionymi komórkami z powrotem do inkubatora (37 °C i 80%-90% wilgotności).</li>
</ol>
<img alt="Przygotowanie hodowli komórkowej, pipetowanie roztworów do studzienek w eksperymentach tkankowych, proces laboratoryjny." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63422/63422fig03.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rysunek 3"> 
Rysunek 3: Inokulacja CAM guzami. (A) Aspiracja sferoidów pipetą oraz (B) implantacja na powierzchni CAM. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63422/63422fig03large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
4. Aplikacja fotouczulacza
<ol>
	<li>Aplikacja hyperycyny
	<ol>
		<li>Przy słabym oświetleniu przygotować roztwór stokowy hyperycyny o stężeniu 2 mM, rozpuszczając ją w 100% dimetylosulfoksydzie (DMSO). Krótko przed eksperymentem przygotować roztwór roboczy hyperycyny o stężeniu 79 µM w sterylnym PBS lub roztworze soli fizjologicznej. Należy upewnić się, że końcowe stężenie DMSO we wszystkich roztworach nie przekracza 0,2%, co nie wpływa na rozwój zarodka.</li>
		<li>W warunkach sterylnych nanieść odpowiednią objętość roztworu hyperycyny do pierścienia silikonowego. Objętość 30 µL jest wystarczająca do wypełnienia pierścienia o średnicy 6 mm.</li>
		<li>Przechowywać zarodki w inkubatorze w temperaturze 37 °C i wilgotności 80%-90%. Hyperycyna w roztworze wodnym staje się fotoaktywna po monomeryzacji w tkance, około 3 h po aplikacji na CAM.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Aplikacja hyperycyny z wykorzystaniem LDL, HDL lub nanocząsteczek jako systemów transportowych 
	UWAGA: Te systemy transportowe są stosowane w celu poprawy penetracji hyperycyny do wnętrza komórek i struktur komórkowych.
	<ol>
		<li>Ze względu na światłoczułość wszystkie etapy, w tym przygotowanie roztworów, należy przeprowadzać przy słabym oświetleniu, a roztwory przechowywać w ciemności.</li>
		<li>Przygotować formulacje hyperycyna-LDL oraz hyperycyna-HDL poprzez zmieszanie odpowiednich objętości lipoprotein i roztworów stokowych hyperycyny w PBS zgodnie z referencją15. Stosunek stężeń LDL lub HDL do hyperycyny wynosi 20:115.</li>
		<li>Zsyntetyzować polimerowe nanocząsteczki metodą żyjącej kationowej polimeryzacji z otwarciem pierścienia zgodnie z referencjami12,13. Dostosować stężenie hyperycyny w polimerowych nanocząsteczkach za pomocą PBS do poziomu 10 μM12,13.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. PDD i PDT
<ol>
	<li>Przeprowadzenie PDD
	<ol>
		<li>W warunkach sterylnych nanieść fotouczulacz (hiperycynę, polimerowe nanocząstki załadowane hiperycyną lub hiperycynę z nośnikiem lipoproteinowym) na powierzchnię CAM, z komórkami nowotworowymi (ED 7-9) lub bez nich.</li>
		<li>Naświetlać CAM fioletowym światłem wzbudzenia (specjalnie wykonana kolista lampa LED o długości fali 405 nm) i rejestrować fluorescencję hiperycyny w tkance CAM oraz w komórkach nowotworowych za pomocą kamery cyfrowej w odstępach czasu 0, 1, 3, 5, 24 i 48 h po podaniu hiperycyny.</li>
		<li>Jeśli badanie wymaga obrazu CAM w białym świetle, zarejestrować CAM przed podaniem hiperycyny oraz na koniec eksperymentu, krótko przed utrwaleniem tkanki, ponieważ światło wpływa na fotoaktywację hiperycyny.</li>
		<li>Ocenić intensywność fluorescencji za pomocą programu do przetwarzania i analizy obrazu (np. ImageJ22).
		<ol>
			<li>Rozdzielić kanały obrazu RGB na oddzielne obrazy czerwony, zielony i niebieski. Analizować obraz intensywności czerwieni w formie 8-bitowej. Ocenić intensywność czerwieni z obszaru wewnątrz pierścienia i przyjąć ją jako fluorescencję hiperycyny. Uzyskać wykresy profilu całego obrazu (używając wtyczki Profile Plot w programie ImageJ) w różnych odstępach czasu po podaniu hiperycyny (tj. od 0 h, bezpośrednio po podaniu, do 48 h).</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przeprowadzenie PDT
	<ol>
		<li>Wykonać PDT co najmniej 3 h po zastosowaniu hiperycyny.</li>
		<li>Umieścić światłowód nad powierzchnią CAM tak, aby promień lasera obejmował cały obszar wewnątrz silikonowego pierścienia.</li>
		<li>Przeprowadzić naświetlanie in vivo (1-2 min) światłem laserowym o długości fali 405 nm przy gęstości mocy 285 mW/cm2.</li>
		<li>Zarejestrować CAM przy użyciu białego światła i światła fluorescencyjnego 405 nm przed i po terapii fotodynamicznej (24 h i 48 h).</li>
		<li>Wykryć uszkodzenia fotochemiczne 24 h i 48 h po PDT na podstawie obrazów wykonanych w białym świetle. Ocenić uszkodzenia naczyniowe za pomocą półilościowej oceny16: 1 - brak zniszczeń; 2 - częściowe zamknięcie kapilar (średnica ≤10 µm) bez zniszczenia naczyń średnich lub większych (średnica ≥50 µm) oraz mniejszych naczyń (średnica 10-50 µm); 3 - częściowe zamknięcie mniejszych naczyń wraz z zanikiem kapilar; 4 - częściowe zamknięcie większych naczyń wraz z zanikiem mniejszych naczyń i kapilar; oraz 5 - całkowita fototromboza z zanikiem większości naczyń.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
<img alt="Ustawienie eksperymentu hodowli komórkowej z inkubatorem i cyfrową kontrolą temperatury do analizy badań biologicznych." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63422/63422fig04.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rysunek 4"> 
Rysunek 4: Naświetlanie CAM światłem laserowym. Zdjęcie wykonano w celach ilustracyjnych. W przypadku PDD lub PDT pomieszczenie musi być zaciemnione. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63422/63422fig04large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
6. Przygotowanie CAM do dalszej oceny
<ol>
	<li>Zatapianie w parafinie
	<ol>
		<li>Utrwal tkankę CAM w płytce hodowlanej w 4% paraformaldehydzie (PFA) w PBS przez minimum 2 h i maksymalnie przez noc.</li>
		<li>Usunąć PFA i ostrożnie wyciąć z CAM fragment tkanki znajdujący się w obrębie pierścienia silikonowego.</li>
		<li>Bezzwłocznie odwodnić tkankę CAM w rosnących stężeniach alkoholi w następujący sposób: umieścić tkankę CAM w 70% etanolu przez 3 min, w roztworze eozyny przez 2 min (dla łatwiejszej lokalizacji tkanki w bloku parafiny), w 96% etanolu 3 x 5 min (zawsze w nowej płytce Petriego), w 100% etanolu przez 5 min oraz w ksylenie 2 x 10 min.</li>
		<li>Za pomocą szpatułki lub cienkiego pędzla jak najszybciej przenieść próbki do roztopionej parafiny w płytkach Petriego (59 °C). Po 24 h umieścić tkankę w formie histologicznej, wypełnić ją medium do zatapiania w parafinie i pozwolić jej zastygnać w lodówce. Wyciąć zastygniętą tkankę CAM z medium zatapiającego, obrócić ją w kasecie o 90°, ponownie wypełnić medium zatapiającym i pozostawić do zastygnięcia.</li>
		<li>Przygotować skrawki o grubości 5-10 µm na mikrotomie do analizy histopatologicznej w celu oceny uszkodzeń indukowanych przez PDT.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotowanie zamrożonych skrawków CAM do histologii 
	UWAGA: W przypadku niektórych metodologii, w tym histologii, bardziej odpowiednie są skrawki mrożone przygotowane na mikrotomie kriostatu. W celu przygotowania zamrożonych skrawków CAM należy postępować zgodnie z poniższymi krokami.
	<ol>
		<li>Ostrożnie zamocować natywną lub utrwaloną w 4% paraformaldehydzie błonę CAM na szkiełku przedmiotowym.</li>
		<li>Wypełnić formę do zatapiania do połowy związku OCT (optimal cutting temperature compound) i zamrozić w ciekłym azocie lub mieszaninie suchego lodu i etanolu.</li>
		<li>Po zamrożeniu ostrożnie przechylić i zsunąć CAM ze szkiełka przedmiotowego na powierzchnię zamrożonego medium OCT. Ponownie umieścić w formie, przykryć medium OCT i zamrozić zgodnie z krokiem 6.2.2.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Analiza fraktalna CAM przepiórnika 
	UWAGA: Zmiany w układzie naczyniowym wywołane przez PDT można ocenić poprzez obliczenie współczynnika wymiaru fraktalnego19.
	<ol>
		<li>W komorze z laminarnym przepływem powietrza zalać CAM w płytce hodowlanej uprzednio podgrzanym (37 °C) roztworem utrwalającym składającym się z 4% paraformaldehydu i 2% glutaraldehydu w PBS.</li>
		<li>Usunąć roztwór utrwalający po 48 h. Ostrożnie oddzielić CAM od zarodka za pomocą mikronoareczek i cienkiego pędzla, a następnie przemyć w PBS.</li>
		<li>Zamocować przemyty CAM na szkiełku przedmiotowym i pozwolić mu powoli wyschnąć.</li>
		<li>Wykonać zdjęcie szkiełka za pomocą aparatu cyfrowego, używając transiluminatora jako źródła jednorodnego białego światła.</li>
		<li>Przetworzyć obrazy cyfrowe w oprogramowaniu ImageJ22. Do analizy wybrać kwadratowy obszar (512 × 512 pikseli) z regionu z dystalnymi gałęziami tętniczymi. Binaryzować i zszkieletować obrazy, a następnie obliczyć współczynnik wymiaru fraktalnego (Df) zgodnie z procedurami opisanymi w referencji31.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Analiza molekularna tkanki CAM
	<ol>
		<li>Do analizy molekularnej ostrożnie oddzielić natywny CAM, zamrozić w ciekłym azocie i przechowywać w temperaturze -80 °C.</li>
		<li>Określić ekspresję genów zgodnie ze standardowymi protokołami izolacji RNA23, odwrotnej transkrypcji do cDNA oraz ilościowego PCR24.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
<img alt="Schemat układu naczyniowego rośliny przedstawiający złożone użyłkowienie liści do badań biologicznych." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63422/63422fig05.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rysunek 5"> 
Rysunek 5: Tkanka CAM do analizy fraktalnej. Po PDT tkanka CAM zostaje utrwalona, umieszczona na szkiełku i wysuszona w celu przeprowadzenia analizy fraktalnej. Zdjęcie wykonano w świetle białym przy użyciu transiluminatora. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63422/63422fig05large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>

<ol><li>Nowak-Sliwinska, P., van Beijnum, J. R., van Berkel, M., vanden Bergh, H., Grifﬁoen, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vascular+regrowth+following+photodynamic+therapy+in+the+chicken+embryo+chorioallantoic+membrane%5BTitle%5D)+AND+%22Angiogenesis%22%5BJournal%5D)">Vascular regrowth following photodynamic therapy in the chicken embryo chorioallantoic membrane.</a> Angiogenesis. 13 (4), 281-292 (2010).</li>
<li>van Leengoed, H. L. L. M., vander Veen, N., Versteeg, A. A. C., Ouellet, R., van Lier, J. E., Star, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In-vivo+photodynamic+effects+of+phthalocyanines+in+a+skin-fold+observation+chamber+model%3A+role+of+central+metal+ion+and+degree+of+sulfonation%5BTitle%5D)+AND+%22Photochemistry+Photobiology%22%5BJournal%5D)">In-vivo photodynamic effects of phthalocyanines in a skin-fold observation chamber model: role of central metal ion and degree of sulfonation.</a> Photochemistry Photobiology. 58 (4), 575-580 (1993).</li>
<li>Ainsworth, S. J., Stanley, R. L., Evans, D. J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Developmental+stages+of+the+Japanese+quail%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Anatomy%22%5BJournal%5D)">Developmental stages of the Japanese quail.</a> Journal of Anatomy. 216 (1), 3(2010).</li>
<li>De Fouw, D. O., Rizzo, V. J., Steinfeld, R., Feinberg, R. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mapping+of+the+microcirculation+in+the+chick+chorioallantoic+membrane+during+normal+angiogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Microvascular+Research%22%5BJournal%5D)">Mapping of the microcirculation in the chick chorioallantoic membrane during normal angiogenesis.</a> Microvascular Research. 38 (2), 136-147 (1989).</li>
<li>Sandau, K., Kurz, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modelling+of+vascular+growth+processes%3A+a+stochastic+biophysical+approach+to+embryonic+angiogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Microscopy%22%5BJournal%5D)">Modelling of vascular growth processes: a stochastic biophysical approach to embryonic angiogenesis.</a> Journal of Microscopy. 175 (3), 205-213 (1994).</li>
<li>Kurz, H., Ambrosy, S., Wilting, J., Marmé, D., Christ, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proliferation+pattern+of+capillary+endothelial+cells+in+chorioallantoic+membrane+development+indicates+local+growth+control%2C+which+is+counteracted+by+vascular+endothelial+growth+factor+application%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Dynamics%22%5BJournal%5D)">Proliferation pattern of capillary endothelial cells in chorioallantoic membrane development indicates local growth control, which is counteracted by vascular endothelial growth factor application.</a> Developmental Dynamics. 203 (2), 174-186 (1995).</li>
<li>Huss, D., Poynter, G., Lansford, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Japanese+quail+%28Coturnix+japonica%29+as+laboratory+animal+model%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Animal%22%5BJournal%5D)">Japanese quail (Coturnix japonica) as laboratory animal model.</a> Lab Animal. 37 (11), 513-519 (2008).</li>
<li>Gottfried, V., Lindenbaum, E. S., Kimel, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+chick+chorioallantoic+membrane+%28CAM%29+as+an+in-vivo+model+for+photodynamic+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Photochemistry+and+Photobiology%2C+B%3A+Biology%22%5BJournal%5D)">The chick chorioallantoic membrane (CAM) as an in-vivo model for photodynamic therapy.</a> Journal of Photochemistry and Photobiology, B: Biology. 12 (2), 204-207 (1992).</li>
<li>Miškovský, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hypericin+-+a+new+antiviral+and+antitumor+photosensitizer%3A+mechanism+of+action+and+interaction+with+biological+molecules%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Drug+Targets%22%5BJournal%5D)">Hypericin - a new antiviral and antitumor photosensitizer: mechanism of action and interaction with biological molecules.</a> Current Drug Targets. 3 (1), 55-84 (2002).</li>
<li>Čavarga, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photodynamic+effect+of+hypericin+after+topical+application+in+the+ex+ovo+quail+chorioallantoic+membrane+model%5BTitle%5D)+AND+%22Planta+Medica%22%5BJournal%5D)">Photodynamic effect of hypericin after topical application in the ex ovo quail chorioallantoic membrane model.</a> Planta Medica. 80 (1), 56-62 (2014).</li>
<li>Martinez-Poveda, B., Quesada, A. R., Medina, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hypericin+in+the+dark+inhibits+key+steps+of+angiogenesis+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Europan+Journal+of+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">Hypericin in the dark inhibits key steps of angiogenesis in vitro.</a> Europan Journal of Pharmacology. 516 (2), 97-103 (2005).</li>
<li>Datta, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unravelling+the+excellent+chemical+stability+and+bioavailability+of+solvent+responsive+curcumin-loaded+2-ethyl-2-oxazoline-grad-2-%284-dodecyloxyphenyl%29-+2-oxazoline+copolymer+nanoparticles+for+drug+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22Biomacromolecules%22%5BJournal%5D)">Unravelling the excellent chemical stability and bioavailability of solvent responsive curcumin-loaded 2-ethyl-2-oxazoline-grad-2-(4-dodecyloxyphenyl)- 2-oxazoline copolymer nanoparticles for drug delivery.</a> Biomacromolecules. 19 (7), 2459-2471 (2018).</li>
<li>Huntošová, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alkyl+Chain+length+in+poly%282-oxazoline%29-based+amphiphilic+gradient+copolymers+regulates+the+delivery+of+hydrophobic+molecules%3A+a+case+of+the+biodistribution+and+the+photodynamic+activity+of+the+photosensitizer+hypericin%5BTitle%5D)+AND+%22Biomacromolecules%22%5BJournal%5D)">Alkyl Chain length in poly(2-oxazoline)-based amphiphilic gradient copolymers regulates the delivery of hydrophobic molecules: a case of the biodistribution and the photodynamic activity of the photosensitizer hypericin.</a> Biomacromolecules. 22 (10), 4199-4216 (2021).</li>
<li>Buríková, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hypericin+fluorescence+kinetics+in+the+presence+of+low+density+lipoproteins%3A+study+on+quail+CAM+assay+for+topical+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22General+Physiology+and+Biophysic%22%5BJournal%5D)">Hypericin fluorescence kinetics in the presence of low density lipoproteins: study on quail CAM assay for topical delivery.</a> General Physiology and Biophysic. 35 (4), 459-468 (2016).</li>
<li>Lenkavska, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Benefits+of+hypericin+transport+and+delivery+by+low-+and+high-density+lipoproteins+to+cancer+cells%3A+From+in+vitro+to+ex+ovo%5BTitle%5D)+AND+%22Photodiagnosis+and+Photodynamic+Therapy%22%5BJournal%5D)">Benefits of hypericin transport and delivery by low- and high-density lipoproteins to cancer cells: From in vitro to ex ovo.</a> Photodiagnosis and Photodynamic Therapy. 25, 214-224 (2019).</li>
<li>Rück, A., Böhmler, A., Steiner, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PDT+with+TOOKAD+studied+in+the+chorioallantoic+membrane+of+fertilized+eggs%5BTitle%5D)+AND+%22Photodiagnosis+and+Photodynamic+Therapy%22%5BJournal%5D)">PDT with TOOKAD studied in the chorioallantoic membrane of fertilized eggs.</a> Photodiagnosis and Photodynamic Therapy. 2 (1), 79-90 (2005).</li>
<li>Gottfried, V., Davidi, R., Averbuj, C., Kimel, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+damage+to+chorioallantoic+membrane+blood+vessels+by+porphycene-induced+photodynamic+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Photochemistry+and+Photobiology%2C+B%3A+Biology%22%5BJournal%5D)">In vivo damage to chorioallantoic membrane blood vessels by porphycene-induced photodynamic therapy.</a> Journal of Photochemistry and Photobiology, B: Biology. 30 (2-3), 115-121 (1995).</li>
<li>Buzzá, H. H., Silva, L. V., Moriyama, L. T., Bagnato, V. S., Kurachi, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+vascular+effect+of+Photodynamic+Therapy+in+chorioallantoic+membrane+using+different+photosensitizers%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Photochemistry+and+Photobiology+B%3A+Biology%22%5BJournal%5D)">Evaluation of vascular effect of Photodynamic Therapy in chorioallantoic membrane using different photosensitizers.</a> Journal of Photochemistry and Photobiology B: Biology. 138, 1-7 (2014).</li>
<li>Dougherty, T. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photodynamic+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+National+Cancer+Institute%22%5BJournal%5D)">Photodynamic therapy.</a> Journal of the National Cancer Institute. 90, 889-905 (1998).</li>
<li>Xiang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-time+optoacoustic+monitoring+of+vascular+damage+during+photodynamic+therapy+treatment+of+tumor%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomedical+Optics%22%5BJournal%5D)">Real-time optoacoustic monitoring of vascular damage during photodynamic therapy treatment of tumor.</a> Journal of Biomedical Optics. 12 (1), 01400-01408 (2007).</li>
<li>Foty, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+hanging+drop+cell+culture+protocol+for+generation+of+3D+spheroids%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">A simple hanging drop cell culture protocol for generation of 3D spheroids.</a> Journal of Visualized Experiments. (51), 2720(2011).</li>
<li>Abramoff, M. D., Magelhaes, P. J., Ram, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Image+Processing+with+ImageJ%5BTitle%5D)+AND+%22Biophotonics+International%22%5BJournal%5D)">Image Processing with ImageJ.</a> Biophotonics International. 11 (7), 36-42 (2004).</li>
<li>Chomczynski, P., Sacchi, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-step+method+of+RNA+isolation+by+acid+guanidium+thiocyanate-phenol-chloroform+extraction%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Single-step method of RNA isolation by acid guanidium thiocyanate-phenol-chloroform extraction.</a> Analytical Biochemistry. 162 (1), 156-159 (1987).</li>
<li>Máčajová, M., Čavarga, I., Sýkorová, M., Valachovič, M., Novotná, V., Bilčík, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modulation+of+angiogenesis+by+topical+application+of+leptin+and+high+and+low+molecular+heparin+using+the+Japanese+quail+chorioallantoic+membrane+model%5BTitle%5D)+AND+%22Saudi+Journal+of+Biological+Sciences%22%5BJournal%5D)">Modulation of angiogenesis by topical application of leptin and high and low molecular heparin using the Japanese quail chorioallantoic membrane model.</a> Saudi Journal of Biological Sciences. 27 (6), 1488-1493 (2020).</li>
<li>Mangir, N., Dikici, S., Claeyssens, F., MacNeil, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+Ex+Ovo+chick+chorioallantoic+membrane+%28CAM%29+assay+to+evaluate+the+biocompatibility+and+angiogenic+response+to+biomaterials%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Biomaterials+Science+Engineering%22%5BJournal%5D)">Using Ex Ovo chick chorioallantoic membrane (CAM) assay to evaluate the biocompatibility and angiogenic response to biomaterials.</a> ACS Biomaterials Science Engineering. 5 (7), 3190-3200 (2019).</li>
<li>Marshall, K. M., Kanczler, J. M., Oreffo, R. O. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evolving+applications+of+the+egg%3A+chorioallantoic+membrane+assay+and+ex+vivo+organotypic+culture+of+materials+for+bone+tissue+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Tissue+Engineering%22%5BJournal%5D)">Evolving applications of the egg: chorioallantoic membrane assay and ex vivo organotypic culture of materials for bone tissue engineering.</a> Journal of Tissue Engineering. 11, 1-25 (2020).</li>
<li>Merlos Rodrigo, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extending+the+applicability+of+in+ovo+and+ex+ovo+chicken+chorioallantoic+membrane+assays+to+study+cytostatic+activity+in+neuroblastoma+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Oncology%22%5BJournal%5D)">Extending the applicability of in ovo and ex ovo chicken chorioallantoic membrane assays to study cytostatic activity in neuroblastoma cells.</a> Frontiers in Oncology. 11, 1-10 (2021).</li>
<li>Meta, M., Kundeková, B., Bilčík, B., Máčajová, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effect+of+silicone+ring+application+on+CAM+vasculature+in+Japanese+Quail+%28Coturnix+japonica%29%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+Student+Scientific+Conference+Faculty+of+Natural+Sciences+of+Comenius+University%2C+Bratislava%2C+Slovakia%22%5BJournal%5D)">The effect of silicone ring application on CAM vasculature in Japanese Quail (Coturnix japonica).</a> Proceedings of the Student Scientific Conference Faculty of Natural Sciences of Comenius University, Bratislava, Slovakia. , 385-390 (2019).</li>
<li>Kohli, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pre-screening+the+intrinsic+angiogenic+capacity+of+biomaterials+in+an+optimised+ex+ovo+chorioallantoic+membrane+model%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Tissue+Engineering%22%5BJournal%5D)">Pre-screening the intrinsic angiogenic capacity of biomaterials in an optimised ex ovo chorioallantoic membrane model.</a> Journal of Tissue Engineering. 11, 1-15 (2020).</li>
<li>Kundeková, B., Máčajová, M., Meta, M., Čavarga, I., Bilčík, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chorioallantoic+membrane+models+of+various+avian+species+differences+and+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Biology-Basel%22%5BJournal%5D)">Chorioallantoic membrane models of various avian species differences and applications.</a> Biology-Basel. 10 (4), 301(2021).</li>
<li>Parsons-Wingerter, P., Elliott, K. E., Clark, J. I., Farr, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fibroblast+growth+factor-2+selectively+stimulates+angiogenesis+of+small+vessels+in+arterial+tree%5BTitle%5D)+AND+%22Arteriosclerosis%2C+Thrombosis+and+Vascular+Biology%22%5BJournal%5D)">Fibroblast growth factor-2 selectively stimulates angiogenesis of small vessels in arterial tree.</a> Arteriosclerosis, Thrombosis and Vascular Biology. 20 (5), 1250-1256 (2000).</li>
<li>Buzzá, H. H., Zangirolami, A. C., Davis, A., Gómez-García, P. B., Kurachi, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence+analysis+of+a+tumor+model+in+the+chorioallantoic+membrane+used+for+the+evaluation+of+different+photosensitizers+for+photodynamic+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Photodiagnosis+and+Photodynamic+Therapy%22%5BJournal%5D)">Fluorescence analysis of a tumor model in the chorioallantoic membrane used for the evaluation of different photosensitizers for photodynamic therapy.</a> Photodiagnosis and Photodynamic Therapy. 19, 78-83 (2017).</li>
</ol>

Autorzy nie pozostają w konflikcie interesów.

Aby udała się uprawa ex ovo , ważne jest, aby postępować zgodnie z powyższym protokołem. Co więcej, jeśli jaja nie zostaną wystarczająco ostrożnie otwarte lub podczas uprawy nie ma wystarczającej wilgotności, worek żółtkowy przykleja się do skorupki i często pęka. Rozpoczęcie hodowli ex ovo w czasie około 60 godzin inkubacji jaj zapewnia wysoką przeżywalność zarodków, ponieważ są one już wystarczająco duże, aby przetrwać obchodzenie się z nimi. W późniejszych stadiach rozwojowych CAM staje się cieńszy i...

Model błony kosmówkowo-omoczniowej kurczaka (CAM) jest dobrze znany i szeroko stosowany w różnych dziedzinach badań. Jest to bogato unaczyniony narząd pozaembrionalny, który zapewnia wymianę gazową i transport minerałów1. Ze względu na przezroczystość i dostępność tej błony, poszczególne naczynia krwionośne i ich zmiany strukturalne można obserwować w czasie rzeczywistym2. Pomimo zalet, CAM piskląt ma również pewne ograniczenia (np. większe obiekty hodowlane, produkcja jaj i spożycie paszy), których można by uniknąć, wykorzystując inne gatunki ptaków. W niniejszym protokole opisano alternatywny model CAM ex ovo z wykorzystaniem zarodka przepiórki japońskiej (Coturnix japonica). Ze względu na niewielkie rozmiary pozwala na wykorzystanie znacznie większej liczby osobników doświadczalnych niż CAM kurczaka. Co więcej, krótszy, 16-dniowy rozwój embrionalny zarodków przepiórczych jest kolejną zaletą. Pierwsze większe naczynia na CAM przepiórki pojawiają się w 7 dniu embrionalnym (ED). Można to bezpośrednio porównać z rozwojem zarodka pisklęcia (etapy 4-35); Jednak późniejsze etapy rozwoju nie są już porównywalne i wymagają mniej czasu dla zarodka przepiórki3. Interesujące jest regularne występowanie rozgałęzień mikronaczyniowych podobnych do tych u kurczaków CAMs4,5,6. Szybkie dojrzewanie płciowe, wysoka produkcja jaj i tania hodowla to inne przykłady, które przemawiają za użyciem tego eksperymentalnego modelu7.
Model CAM ptaków jest często używany w badaniach nad terapią fotodynamiczną (PDT)8. PDT jest stosowana w leczeniu kilku postaci raka (małe zlokalizowane guzy) i innych chorób nieonkologicznych. Jego zasada polega na dostarczeniu leku fluorescencyjnego, fotouczulacza (PS), do uszkodzonej tkanki i jego aktywacji światłem o odpowiedniej długości fali. Jednym z potencjalnych PS wykorzystywanych w badaniach jest hiperycyna, pierwotnie wyizolowana z rośliny leczniczej zwyczajnego (Hypericum perforatum)9. Silne działanie fotouczulające tego związku opiera się na jego właściwościach fotochemicznych i fotofizycznych. Charakteryzują się one wielokrotnymi pikami wzbudzenia fluorescencji w zakresie 400-600 nm, które indukują emisję fluorescencji przy około 600 nm. Maksima absorpcji hiperycyny w paśmie widmowym mieszczą się w zakresie 540-590 nm, a maksima fluorescencji mieszczą się w zakresie 590-640 nm9. Aby osiągnąć te fotouczulające efekty, hiperycyna jest wzbudzana światłem laserowym o długości fali 405 nm po miejscowym podaniu10. W obecności światła hiperycyna może wykazywać działanie wirusobójcze, antyproliferacyjne i cytotoksyczne11, podczas gdy nie występuje toksyczność ogólnoustrojowa i jest szybko uwalniana z organizmu. Hiperycyna jest substancją lipofilową, która tworzy nierozpuszczalne w wodzie, niefluorescencyjne agregaty, dlatego kilka rodzajów nanonośników, takich jak nanocząstki polimerowe12,13 lub lipoproteiny o wysokiej i niskiej gęstości (HDL, LDL)14,15, są stosowane w celu ułatwienia jej dostarczania i przenikania do komórek. Ponieważ CAM jest systemem z naturalnym niedoborem odporności, komórki nowotworowe mogą być implantowane bezpośrednio na powierzchni błony. Model doskonale nadaje się również do rejestrowania zakresu uszkodzeń naczyń krwionośnych wywołanych przez PDT zgodnie ze zdefiniowanym wynikiem16,17. Światło o mniejszym natężeniu w porównaniu do PDT może być wykorzystywane w diagnostyce fotodynamicznej (PDD). Monitorowanie tkanki pod wpływem fioletowego światła LED wzbudzonego światłem LED prowadzi również do fotoaktywacji fotouczulaczy18,19,20, co powoduje emisję światła fluorescencyjnego, ale nie dostarcza wystarczającej ilości energii, aby rozpocząć reakcję PDT i uszkodzić komórki. To sprawia, że jest to dobre narzędzie do wizualizacji i diagnozowania guza lub monitorowania farmakokinetyki używanych PSS14,15.
Ten artykuł opisuje przygotowanie testu CAM ex ovo przepiórek z przeżywalnością powyżej 80%. Ta hodowla ex ovo została z powodzeniem zastosowana w wielu eksperymentach.

<table><tbody><tr><td>6-dołkowa płytka do hodowli komórkowych</td><td>Sarstedt</td><td>83.392</td><td>Przezroczysty polistyren, sterylny</td></tr><tr><td>CO2 Inkubator ESCO CCL-0508</td><td>ESCO, Singapur</td><td>CCL-050B-8</td><td>CO2 inkubator do hodowli komórkowych</td></tr><tr><td>cryocut Leica CM 1800</td><td>Reichert-Jung, Stany Zjednoczone</td><td></td><td></td></tr><tr><td>aparat cyfrowy Canon EOS 6D II</td><td>Canon, Japonia</td><td></td><td></td></tr><tr><td>laser diodowy 405 nm</td><td>Ocean Optics, USA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>67-68-5</td><td>dimetylosulfoksydek</td></tr><tr><td>eozyna</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>15086-94-9</td><td></td></tr><tr><td>etanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>64-17-5</td><td></td></tr><tr><td>cienka szczotka rozmiar 2</td><td>Szczotka 281802 Faber-Castell</td><td></td><td>do separacji i manipulacji CAM</td></tr><tr><td>aldehyd</td> <td>glutarowySigma-Aldrich</td><td>111-30-8</td><td></td></tr><tr><td>hematoksylina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>517-28-2</td><td></td></tr><tr><td>hiperycyna</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>84082-80-4</td><td></td></tr><tr><td>inkubator Bios Midi</td><td>Bios Sedl<img alt="Równanie 1" src="/files/ftp_upload/63422/63422eq01.jpg" style="margines: auto; ">any, Republika</td><td></td> Czeska <td>Inkubator z wymuszonym ciągiem do inkubatora do inkubacji wstępnej</td></tr><tr><td>Memmert IF160</td><td>Memmert, Niemcy</td><td></td><td>Inkubator z wymuszonym obiegiem powietrza do inkubacji CAM</td></tr><tr><td>Kaiser slimlite plano, kaseton świetlny LED</td><td>Kaiser, Niemcy</td><td>2453</td><td>Światło transiluminatora</td></tr><tr><td>LED 405 nm</td><td></td><td></td><td>wykonany na zamówienie okrągły</td></tr><tr><td>obiektyw makro LED Canon MP- E 65 mm f/ 2.8</td><td>Canon, Japonia</td><td></td><td></td></tr><tr><td>mikroskop Kapa 2000</td><td>Kvant, Słowacja</td><td></td> mikroskop <td>optyczny</td></tr><tr><td>mikrotom Auxilab 508</td><td>Auxilab, Hiszpania</td><td></td><td>ręczny rotacyjny</td></tr><tr><td>mikrotom paraformaldehyd</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>30525-89-4</td><td></td></tr><tr><td>Paraplast Plus</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P3683</td><td>pożywka parafinowa do zatapiania tkanek</td></tr><tr><td>PBS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4417</td><td>Nożyczki buforowe do soli fosforanowej</td></tr><tr><td>Castroviejo</td><td>Orimed</td><td>  OR66-108</td><td>mikronożyczki do oprogramowania do separacji CAM</td></tr><tr><td>ImageJ 1.53</td><td>program do przetwarzania i analizy obrazów</td><td>w domenie</td><td></td> publicznej</tr> roztwór <tr><td>podstawowy HDL</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>437641-10MG</td> roztwór podstawowy <td>lipoprotein o wysokiej gęstości</td></tr><tr><td>LDL</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>437644-10MG</td><td>lipoproteiny o niskiej gęstości</td></tr><tr><td>Tissue-Tek OCT Związek</td><td>Sakura Finetek</td><td>4583</td><td>Butelki do wyciskania o optymalnej temperaturze cięcia 118 ml</td></tr></tbody></table>

przepiórcza błona chorioallantoiczna - narzędzie do diagnostyki i terapii fotodynamicznej

Quail Chorioallantoic Membrane - A Tool for Photodynamic Diagnosis and Therapy

Błona kosmówkowo-omoczniowa (CAM) ptasiego zarodka to cienka, pozaembrionalna błona, która funkcjonuje jako główny organ oddechowy. Jego właściwości sprawiają, że jest doskonałym modelem eksperymentalnym in vivo do badania angiogenezy, wzrostu guza, systemów dostarczania leków lub diagnostyki fotodynamicznej (PDD) i terapii fotodynamicznej (PDT). Jednocześnie model ten odnosi się do wymogu zastąpienia zwierząt doświadczalnych odpowiednią alternatywą. Wyhodowany zarodek ex ovo umożliwia łatwą aplikację substancji, dostęp, monitorowanie i dokumentację. Najczęściej stosowany jest chick CAM; jednak w tym artykule opisano zalety japońskiego CAM przepiórczego jako modelu o niskich kosztach i wysokiej przepustowości. Kolejną zaletą jest krótszy rozwój zarodkowy, co pozwala na większą rotację doświadczalną. Badana jest tutaj przydatność przepiórki CAM do PDD i PDT infekcji nowotworowych i bakteryjnych. Jako przykład opisano zastosowanie fotouczulacza hiperycyny w połączeniu z lipoproteinami lub nanocząstkami jako systemem dostarczania. Określono ocenę uszkodzeń od obrazów w świetle białym oraz zmiany intensywności fluorescencji tkanki CAM w świetle fioletowym (405 nm) wraz z analizą przekrojów histologicznych. Przepiórka CAM wyraźnie wykazała wpływ PDT na układ naczyniowy i tkanki. Ponadto można było zaobserwować zmiany, takie jak krwotok włośniczkowy, zakrzepica, liza małych naczyń i krwawienie większych naczyń. Przepiórka japońska CAM jest obiecującym modelem in vivo do diagnostyki fotodynamicznej i badań nad terapią, z zastosowaniami w badaniach angiogenezy nowotworów, a także terapii przeciwnaczyniowej i przeciwbakteryjnej.

Lokalizacja guza na powierzchni CAM jest trudna do ustalenia w świetle białym. Oczekuje się, że fotosensybilizator (w tym przypadku hyperycyna) stosowany w PDD zostanie selektywnie pobrany przez guza, co pomaga w jego wizualizacji. Dodanie hyperycyny i zastosowanie światła fluorescencyjnego (np. 405 nm) pozwoliło bardzo dokładnie zobrazować położenie guza (brodawczaka TE1) (Rycyna 6A). Analiza histologiczna wykazała obecność żywotnych komórek nowotworowych naciekających zdrowe tkanki. Widocz...

Błona kosmówkowo-omoczniowa (CAM) ptasiego zarodka jest bardzo użytecznym i przydatnym narzędziem w różnych dziedzinach badań. Specjalny model ex ovo przepiórki japońskiej CAM nadaje się do badań nad leczeniem fotodynamicznym.

Przepiórcza błona chorioallantoiczna - narzędzie do diagnostyki i terapii fotodynamicznej

The chorioallantoic membrane (CAM) of an avian embryo is a thin, extraembryonic membrane that functions as a primary respiratory organ. Its properties ...

Pokażemy Ci, jak przygotować hodowlę przepiórek japońskich ex ovo i jak wykorzystać błonę kosmówkowo-omoczniową lub w skrócie CAM do diagnostyki fotodynamicznej i terapii raka lub infekcji bakteryjnych. Zaletami tej metody są szybki wzrost rozwojowy, niewielkie rozmiary, dobry dostęp do tkanki i łatwa obsługa. Respektuje również zasady zasady 3R dotyczące prowadzenia badań na zwierzętach.Ze względu na podobieństwo strukturalne do błon śluzowych, takich jak pęcherz moczowy, płuca lub łożysko, nadaje się do badań in vivo potencjalnych leków, testów toksyczności lub badań transplantacyjnych. Procedurę zademonstrują Barbora Kundekova i Majlinda Meta, doktorantki z mojego laboratorium. Na początek użyj zapłodnionych jaj przepiórczych, świeżych lub przechowywanych w temperaturze od 10 do 15 stopni Celsjusza maksymalnie 4 do 5 dni przed rozpoczęciem inkubacji.Używaj tylko czystych i nieuszkodzonych jaj, a następnie wysiaduj jaja w inkubatorze z wymuszonym ciągiem w temperaturze od 50 do 60% wilgotności i 37,5 stopni Celsjusza przez około 54 godziny, umieszczonym poziomo z wyłączonym obracaniem jaj. Zdezynfekuj powierzchnię jaja 70% etanolem bez obracania jaja. Następnie, w sterylnej komorze z przepływem laminarnym, w rękawiczkach, otwórz skorupkę jajka za pomocą małych sterylnych nożyczek chirurgicznych i przenieś zawartość do 6-dołkowej płytki hodowlanej.Po każdym jajku zdezynfekuj nożyczki 70% etanolem. Dodaj około 5 mililitrów sterylnej wody do szczelin w płytce 6-dołkowej, ponieważ wilgotność jest niezbędna, aby zapobiec wysychaniu CAM. Następnie należy zaaspirować zarodki o nieprawidłowo zakończonych końcówkach lub niezapłodnione jaja za pomocą aspiratora próżniowego, a następnie umieścić zarodki w inkubatorze do czasu dalszych eksperymentów, utrzymując temperaturę 37 stopni Celsjusza przy wilgotności od 80 do 90%.Kiedy CAM jest wystarczająco rozwinięty, zwykle od 7 dnia embrionalnego, umieść wysterylizowany silikonowy pierścień na powierzchni CAM wzdłuż małych naczyń włosowatych, unikając głównych naczyń krwionośnych. W sterylnych warunkach nanieść odpowiednią objętość roztworu hiperycyny 30 mikrolitrów na silikonowy pierścień i trzymać zarodki w inkubatorze w temperaturze 37 stopni Celsjusza przy wilgotności od 80 do 90%. Aby przeprowadzić diagnostykę fotodynamiczną, należy oświetlić CAM za pomocą fioletowego światła wzbudzającego i zarejestrować fluorescencję tkanki i komórek nowotworowych hiperycyny i CAM za pomocą kamery cyfrowej w różnych odstępach czasu po podaniu hiperycyny.Jeśli badanie wymaga obrazu CAM w świetle białym, należy zarejestrować CAM przed podaniem hiperycyny i na koniec eksperymentu, na krótko przed utrwaleniem tkanki, ponieważ światło wyzwala fotoaktywację hiperycyny. Aby przeprowadzić terapię fotodynamiczną po zastosowaniu hiperycyny, należy umieścić CAM pod światłowodem, aby wiązka lasera pokryła cały obszar w pierścieniu silikonowym. Po przeprowadzeniu naświetlania in vivo, w tym konkretnym przypadku światłem laserowym o długości 405 nanometrów i szybkości fluencji 285 miliwatów na centymetr kwadratowy, należy zarejestrować CAM przy użyciu światła białego i/lub fluorescencyjnego przed i po zabiegu fotodynamicznym.Umocuj tkankę CAM na płytce hodowlanej z 4% paraformaldehydem w PBS na co najmniej 2 godziny i maksymalnie przez noc, a następnie usuń paraformaldehyd i ostrożnie wytnij z CAM część tkanki w silikonowym pierścieniu. Wszystkie te czynności należy wykonać w dygestorium. Umyj wyciętą część tkanki CAM w wodzie przez 10 minut, a następnie odwodnij w rosnącej serii alkoholowej, umieszczając tkankę CAM w 70% etanolu na 3 minuty, roztworze eozyny na 2 minuty, trocynie 96% etanolu przez 5 minut, 100% etanolu przez 5 minut i dwukrotnie w ksylenie przez 10 minut na nowej szalce Petriego.Następnie jak najszybciej przenieść próbki do rozpuszczonej parafiny na szalkach Petriego za pomocą szpatułki lub cienkiej szczotki. Po 24 godzinach umieść tkankę w formie histologicznej, napełnij ją pożywką do zatapiania parafiny i pozwól jej zastygnąć w lodówce, a następnie odetnij zestaloną pożywkę CAM z podłoża do zatapiania, obróć ją na tacy o 90 stopni, ponownie napełnij pożywką do zatapiania i pozwól jej zastygnąć. Przygotuj skrawki od 5 do 10 mikrometrów na mikrotomie do analizy histopatologicznej w celu określenia uszkodzeń wywołanych przez PDT.Aby przygotować zamrożone skrawki CAM do histologii, ostrożnie zamontuj natywny lub 4% paraformaldehyd utrwalony CAM na szkiełku szkiełkowym, wypełnij formę do zatapiania do połowy OCT i zamroź w ciekłym azocie lub mieszaninie suchego lodu i etanolu. Po zamrożeniu ostrożnie przechylić i wsunąć CAM ze szklanego szkiełka na wierzch zamrożonego podłoża OCT. Umieść ponownie w formie, przykryj ją pożywką OCT i zamroź zgodnie z wcześniejszym opisem.Do analizy układu naczyniowego CAM potrzebne są całe próbki CAM. W komorze z przepływem laminarnym przelej CAM wstępnie podgrzanym roztworem utrwalającym 4% aldehydu paraform i 2% aldehydu glutarowego w PBS, a następnie usuń roztwór utrwalający po 48 godzinach. Następnie ostrożnie oddziel CAM od zarodka za pomocą mikronożyczek i cienkiej szczoteczki i umyj go w PBS, a następnie zamontuj umytą CAM na szklanym szkiełku i pozwól mu powoli wyschnąć.Następnie sfotografuj slajd za pomocą aparatu cyfrowego w transiluminatorze jako źródła jednorodnego białego światła. Lokalizacja guza na powierzchni CAM została uwidoczniona w świetle białym i świetle fluorescencyjnym po dodaniu hiperycyny. Analiza histologiczna wykazała koncentryczne struktury nieprawidłowych komórek płaskonabłonkowych atakujących zdrowe tkanki, którym towarzyszył obrzęk i pogrubienie błony.Po leczeniu PDT zaobserwowano wyraźną różnicę w gęstości naczyń wewnątrz pierścienia i jego otoczenia. Promieniowanie laserowe bez obecności fotouczulacza nie spowodowało żadnych uszkodzeń porównywalnych do kontroli bez żadnego leczenia. Po 3 godzinach inkubacji z hiperycyną, naświetlanie laserem spowodowało fluorescencję spowodowaną monomeryzacją zagregowanej hiperycyny z rozległym uszkodzeniem układu krwionośnego.Analiza histologiczna wykazała, że nieleczona CAM kontrolna miała stosunkowo równą grubość. Jednak leczenie PDT spowodowało, że CAM stał się cieńszy i bardziej kruchy. Właśnie pokazaliśmy, jak przygotować test CAM ex ovo przepiórki i jak go używać.Przy zachowaniu wytycznych, metodologia ta jest łatwa do opanowania i może przynieść szybkie rezultaty.

quail-chorioallantoic-membrane-tool-for-photodynamic-diagnosis

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Badania nad rakiem

W tym filmie opisujemy metodę wspólnego hodowania zwojów korzenia grzbietowego i komórek rakowych na błonie kosmówkowo-omoczniowej kurcząt lub CAM w celu zbadania inwazji okołonerwowej.

Błona kosmówkowo-omocznaniowa piskląt lub model guza CAM: metoda in ovo do symulacji okołonerwowej inwazji komórek nowotworowych

Ten film pokazuje izolację błony kosmówkowo-omoczniowej zawierającej guz od zarodka kurczaka. Pozyskany CAM może być wykorzystany do dalszych zastosowań.

Zbiór błony chorioallantoicznej piskląt: metoda izolowania błony chorioomocznowej zawierającej przeszczep guza z jaja kurzego

Opisany tutaj protokół pozwala na ocenę skuteczności terapii fotodynamicznej (PDT) w liniach komórkowych i optymalizację ustawień PDT przed zastosowaniem terapii na modelach zwierzęcych.

Cytotoksyczna skuteczność terapii fotodynamicznej w komórkach kostniakomięsaka in vitro

Ten manuskrypt opisuje nowatorską procedurę konfiguracji i obsługi mikroskopii fotoakustycznej i optycznej koherentnej tomografii dual-modality do nieinwazyjnego, bezznacznikowego obrazowania kosmówkowo-siatkówkowego większych zwierząt, takich jak króliki.

Nowatorska mikroskopia fotoakustyczna i optyczna tomografia koherentna Obrazowanie naczyniówkowe siatkówki dwumodalnej w żywych oczach królika

Terapia fotodynamiczna (PDT) to procedura medyczna, która polega na inkubacji egzogennie zastosowanego fotouczulacza (PS), a następnie fotoaktywacji światłem widzialnym w celu wywołania apoptozy. Przedstawiamy protokół PDT in vitro przeznaczony do symulacji PDT, który może być wykorzystany do badania różnic w inkubacji PS i parametrach leczenia światłem.

Podejście in vitro do terapii fotodynamicznej

Inwazja okołonerwowa jest agresywnym fenotypem dla raka płaskonabłonkowego głowy i szyi oraz innych nowotworów. Model błony kosmówkowo-omoczniowej pisklęcia został wykorzystany do badania angiogenezy, inwazji raka i przerzutów. Tutaj pokazujemy, w jaki sposób ten model można wykorzystać do oceny inwazji okołonerwowej in vivo.

Błona naczyniówkowo-omocznaniowa piskląt w modelu in vivo do oceny inwazji okołonerwowej w raku głowy i szyi

Kompaktowy system stacjonarnej tomografii fotoakustycznej oparty na pulsacyjnych diodach laserowych (PLD-PAT) jest demonstrowany do szybkiego dynamicznego obrazowania in vivo naczyń korowych małych zwierząt.

Pulsacyjna tomografia fotoakustyczna oparta na diodach laserowych do monitorowania wymywania i wymywania barwnika w uczynieniu kory mózgowej szczura

Prezentujemy model błony kosmówkowo-omoczniowej kurczaka jako alternatywny, nadający się do przeszczepu, model in vivo do wszczepiania ginekologicznych i urologicznych linii komórkowych raka oraz guzów pochodzących od pacjentów.

Wykorzystanie błony chorio-omoczniowej kurczaka w modelu in vivo do badania nowotworów ginekologicznych i urologicznych

To jest skuteczna metoda do wykrywania supresorów lub czynników powodujących przerzuty raka. Komórki, transdukowane biblioteką ekspresji, są wstrzykiwane do układu naczyniowego błony kosmówkowo-omoczniowej kurczaka w celu utworzenia kolonii przerzutowych. Kolonie o zmniejszonej lub zwiększonej inwazyjności są wycinane, namnażane, ponownie wstrzykiwane w celu potwierdzenia ich fenotypu, a na koniec analizowane przy użyciu sekwencjonowania o wysokiej przepustowości.

Odkrycie regulatorów przerzutów przy użyciu szybkiego i ilościowego modelu błony nazębiowej przyżyciowej kurcząt

Niniejszy protokół opisuje implantację i ocenę czerniaka w mysim naczyniówce za pomocą optycznej koherentnej tomografii.

Implantacja i ocena czerniaka w mysim naczyniówce za pomocą optycznej koherentnej tomografii

Tutaj opisujemy protokół rozwoju modelu ksenoprzeszczepu błony kosmówkowo-omoczniowej (CAM) dla ludzkiej tkanki jajnika i demonstrujemy skuteczność tej techniki, ramy czasowe rewaskularyzacji przeszczepu oraz żywotność tkanki w ciągu 6-dniowego okresu szczepienia.

Model błony moczowo-omoczniowej kurcząt (CAM) jako narzędzie do badania przeszczepu tkanki jajnika

Poznaj przygotowanie kultury ex ovo przepiórki japońskiej i zastosowanie błony chorioallantoicznej w fotodynamicznej diagnostyce oraz terapii nowotworów i zakażeń mikrobiologicznych. Ta metoda zapewnia szybki rozwój, łatwy dostęp do tkanek i zgodność z zasadami 3R.

Przepiórcza błona chorioallantoiczna - narzędzie do diagnostyki i terapii fotodynamicznej

Przeglądaj więcej filmów