Wykorzystanie mikrotomografii komputerowej do analizy interakcji pasożytniczych między rośliną a żywicielem

Protokół ten znacznie poprawia kontrast między tkankami rośliny pasożytniczej a żywicielem w próbkach, które będą analizowane za pomocą mikrotomografii. Opisana tutaj technika przyspiesza proces perfuzji kontrastowej przez próbkę, umożliwiając analizę określonych tkanek i struktur powstałych między rośliną pasożytniczą a żywicielem. Podejście próżniowe jest bardzo proste i nie powinno sprawiać żadnych trudności.

Z drugiej strony aparat perfuzyjny może być nieco trudny do skonfigurowania. Ale wcześniejsza praktyka może pomóc. W przypadku małych próbek niedrzewnych do aplikacji można zastosować metodę próżniową.

Natomiast metoda profuzji powinna być stosowana do próbek, które są większe i zdrewniałe, w tym segmentu łodygi lub korzenia gospodarza. W przypadku stosowania metody próżniowej należy umieścić próbkę w fiolce zawierającej kontrastowy roztwór. Następnie umieścić fiolkę w komorze próżniowej lub eksykatorze podłączonym do pompy próżniowej.

Zdjąć pokrywkę z fiolki i zamknąć komorę próżniową lub eksykator. Sprawdź, czy nie ma pęknięć na komorze próżniowej lub eksykatorze. Otwórz zawór wydechowy komory lub eksykatora, aby wypchnąć powietrze.

Włącz pompę i poczekaj, aż ciśnienie osiągnie około 20 cali słupa rtęci lub 10 psi. Zamknij komorę lub zawór wydechowy eksykatora, aby zapobiec ponownemu przedostawaniu się powietrza. Następnie szybko wyłącz pompę.

Pozostawić próbkę w próżni przez co najmniej dwie godziny. W przypadku korzystania z metody profuzji należy wybrać zbiornik zasilający zgodnie z wielkością próbki. W przypadku małych próbek jako zbiornik można użyć 50-mililitrowej strzykawki bez igły.

Podłącz jeden koniec przezroczystej plastikowej rurki do zbiornika zasilającego. Następnie podłącz drugi koniec do zaworu dwudrogowego lub trójdrogowego. Podłącz drugi przewód do innego wylotu w zaworze.

Zabezpiecz zbiornik zasilający w pozycji podniesionej bez demontażu aparatury ustawionej w poprzednim kroku. Zamknij zawór trójdrogowy lub dwudrogowy, aby zapobiec wydostawaniu się cieczy z systemu rurek i wlej kontrastowy roztwór do zbiornika zasilającego. Upewnij się, że w systemie rurek nie ma dużych pęcherzyków powietrza i ponownie zamknij zawór, pozostawiając urządzenie na miejscu.

Aby przygotować próbkę do obfitości roztworu kontrastowego, trzymaj ją zanurzoną w płynie i odetnij końcówkę bliższego końca łodygi lub korzenia gospodarza. Ostrożnie otwórz zawór, aby kontrastowy roztwór mógł powoli przepływać i napełnij plastikową rurkę podłączoną do zbiornika, trzymając otwarty koniec systemu w lekko uniesionej pozycji, aby zapobiec rozlaniu kontrastowego roztworu. Podłącz proksymalny koniec łodygi lub korzenia gospodarza w próbce do otwartego końca systemu przewodów.

Pozwól roztworowi przenikać próbkę przez co najmniej dwie godziny lub do momentu, gdy roztwór zgromadzi się wewnątrz pojemnika. Zamknij zawór i ostrożnie odłącz próbkę od aparatu. Umyj próbkę, zanurzając ją w wodzie na dwie minuty.

Umieść próbkę w ręczniku papierowym w temperaturze pokojowej, aby nadmiar wody odparował przez dwie do pięciu minut, nie dopuszczając do całkowitego wyschnięcia próbki. Owiń próbkę w folię parafinową i unikaj składania folii na próbce. Skanowanie mikro-CT można wykorzystać do lepszego zrozumienia złożonych struktur roślin pasożytniczych i ich interakcji z żywicielami w nieniszczący, trójwymiarowy sposób.

Opisane tutaj protokoły działają dla różnych systemów mikro-CT. Jednak ustawienia i parametry zależą od systemu i próbek. Obrazy z mikroskopu rentgenowskiego 3D były tak samo skuteczne, jak przekroje anatomiczne obserwowane pod mikroskopem świetlnym w celu analizy organizacji i topologii tkanek na styku pasożyta gospodarza.

Na podstawie różnicy koloru jasnobiałego i ciemnoszarego spowodowanej zróżnicowaną absorpcją roztworu kontrastowego, można zaobserwować obfitość miąższu otaczającego rdzeń naczyniowy haustorium. Rdzeń naczyniowy jest łatwo widoczny w przekrojach, ponieważ dwie nici naczyniowe są oddzielone miąższem. Endopasożyt Viscum minimum, rosnący wewnątrz soczystej rośliny żywicielskiej, wykazał komórki miąższowe, które magazynują węglowodany w postaci skrobi.

Różnica w wchłanianiu jodu pozwoliła na wykrycie skomplikowanej sieci nici korowych utworzonych przez endopasożyta w ciele gospodarza. Wyniki uzyskane dla Cuscuta Americana i Struthantus marcianus pomagają zilustrować wygodę podejścia mikrotomografii odpowiednio dla małych i większych próbek. Wirtualna sekwencja seryjna grzyba Sibelium wykazała, że naczynia w korzeniu żywiciela rozwidlają się w bulwę pasożyta i że ciągłość ksylemu między dwiema roślinami jest tworzona przez połączenie naczynia z naczyniem za pomocą płytek perforacyjnych.

Opisana tutaj procedura może być łączona z innymi technikami, takimi jak wirtualna segmentacja, aby uzyskać nowy wgląd w trójwymiarową strukturę połączenia między roślinami pasożytniczymi a ich żywicielami. Technika ta utorowała drogę do analizy różnych aspektów biologii roślin pasożytniczych, w tym rozwoju endopasożytów i funkcjonalności połączeń hiperpasożytniczych.