Name: Ruchliwość pojedynczych cząsteczek i klastrów dwukierunkowej kinezyny-5 Cin8 oczyszczonej z komórek S. cerevisiae (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-02-02T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 46 s
Description: Poznaj mechanizm dwukierunkowej ruchliwości kinezyny-5 Cin8 z Saccharomyces cerevisiae. Ta metoda pozwala badać wpływ klasteryzacji na prędkość i kierunkowość ruchu białek silnikowych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

To badanie było częściowo wspierane przez grant Izraelskiej Fundacji Naukowej (ISF-386/18) oraz grant Izraelskiej Fundacji Nauki Dwunarodowej (BSF-2019008), przyznany L.G.

<ol><li>Singh, S. K., Pandey, H., Al-Bassam, J., Gheber, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bidirectional+motility+of+kinesin-5+motor+proteins%3A+structural+determinants%2C+cumulative+functions+and+physiological+roles%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+and+Molecular+Life+Sciences%22%5BJournal%5D)">Bidirectional motility of kinesin-5 motor proteins: structural determinants, cumulative functions and physiological roles.</a> Cellular and Molecular Life Sciences. 75 (10), 1757-1771 (2018).</li>
<li>Hoyt, M. A., He, L., Totis, L., Saunders, W. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Loss+of+function+of+Saccharomyces+cerevisiae+kinesin-related+CIN8+and+KIP1+is+suppressed+by+KAR3+motor+domain+mutations%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Loss of function of Saccharomyces cerevisiae kinesin-related CIN8 and KIP1 is suppressed by KAR3 motor domain mutations.</a> Genetics. 135 (1), 35-44 (1993).</li>
<li>Saunders, W. S., Hoyt, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kinesin-related+proteins+required+for+structural+integrity+of+the+mitotic+spindle%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Kinesin-related proteins required for structural integrity of the mitotic spindle.</a> Cell. 70 (3), 451-458 (1992).</li>
<li>Hoyt, M. A., He, L., Loo, K. K., Saunders, W. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two+Saccharomyces+cerevisiae+kinesin-related+gene+products+required+for+mitotic+spindle+assembly%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Two Saccharomyces cerevisiae kinesin-related gene products required for mitotic spindle assembly.</a> Journal of Cell Biology. 118 (1), 109-120 (1992).</li>
<li>Gerson-Gurwitz, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mid-anaphase+arrest+in+S.+cerevisiae+cells+eliminated+for+the+function+of+Cin8+and+dynein%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+and+Molecular+Life+Sciences%22%5BJournal%5D)">Mid-anaphase arrest in S. cerevisiae cells eliminated for the function of Cin8 and dynein.</a> Cellular and Molecular Life Sciences. 66 (2), 301-313 (2009).</li>
<li>Fridman, V., Gerson-Gurwitz, A., Movshovich, N., Kupiec, M., Gheber, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Midzone+organization+restricts+interpolar+microtubule+plus-end+dynamics+during+spindle+elongation%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Reports%22%5BJournal%5D)">Midzone organization restricts interpolar microtubule plus-end dynamics during spindle elongation.</a> EMBO Reports. 10 (4), 387-393 (2009).</li>
<li>Movshovich, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Slk19-dependent+mid-anaphase+pause+in+kinesin-5-mutated+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Science%22%5BJournal%5D)">Slk19-dependent mid-anaphase pause in kinesin-5-mutated cells.</a> Journal of Cell Science. 121 (15), 2529-2539 (2008).</li>
<li>Gerson-Gurwitz, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Directionality+of+individual+kinesin-5+Cin8+motors+is+modulated+by+loop+8%2C+ionic+strength+and+microtubule+geometry%5BTitle%5D)+AND+%22Embo+Journal%22%5BJournal%5D)">Directionality of individual kinesin-5 Cin8 motors is modulated by loop 8, ionic strength and microtubule geometry.</a> Embo Journal. 30 (24), 4942-4954 (2011).</li>
<li>Roostalu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Directional+switching+of+the+kinesin+Cin8+through+motor+coupling%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Directional switching of the kinesin Cin8 through motor coupling.</a> Science. 332 (6025), 94-99 (2011).</li>
<li>Shapira, O., Goldstein, A., Al-Bassam, J., Gheber, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+potential+physiological+role+for+bi-directional+motility+and+motor+clustering+of+mitotic+kinesin-5+Cin8+in+yeast+mitosis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Science%22%5BJournal%5D)">A potential physiological role for bi-directional motility and motor clustering of mitotic kinesin-5 Cin8 in yeast mitosis.</a> Journal of Cell Science. 130 (4), 725-734 (2017).</li>
<li>Goldstein-Levitin, A., Pandey, H., Allhuzaeel, K., Kass, I., Gheber, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intracellular+functions+and+motile+properties+of+bi-directional+kinesin-5+Cin8+are+regulated+by+neck+linker+docking%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Intracellular functions and motile properties of bi-directional kinesin-5 Cin8 are regulated by neck linker docking.</a> eLife. 10, 71036(2021).</li>
<li>Pandey, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drag-induced+directionality+switching+of+kinesin-5+Cin8+revealed+by+cluster-motility+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Advances%22%5BJournal%5D)">Drag-induced directionality switching of kinesin-5 Cin8 revealed by cluster-motility analysis.</a> Science Advances. 7 (6), 1687(2021).</li>
<li>Pandey, H., Popov, M., Goldstein-Levitin, A., Gheber, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+by+which+kinesin-5+motors+perform+their+multiple+intracellular+functions%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Sciences%22%5BJournal%5D)">Mechanisms by which kinesin-5 motors perform their multiple intracellular functions.</a> International Journal of Molecular Sciences. 22 (12), 6420(2021).</li>
<li>Fridman, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kinesin-5+Kip1+is+a+bi-directional+motor+that+stabilizes+microtubules+and+tracks+their+plus-ends+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Science%22%5BJournal%5D)">Kinesin-5 Kip1 is a bi-directional motor that stabilizes microtubules and tracks their plus-ends in vivo.</a> Journal of Cell Science. 126, 4147-4159 (2013).</li>
<li>Edamatsu, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bidirectional+motility+of+the+fission+yeast+kinesin-5%2C+Cut7%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+and+Biophysical+Research+Communications%22%5BJournal%5D)">Bidirectional motility of the fission yeast kinesin-5, Cut7.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 446 (1), 231-234 (2014).</li>
<li>Popchock, A. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mitotic+kinesin-14+KlpA+contains+a+context-dependent+directionality+switch%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">The mitotic kinesin-14 KlpA contains a context-dependent directionality switch.</a> Nature Communications. 8, 13999(2017).</li>
<li>Bodrug, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+kinesin-5+tail+domain+directly+modulates+the+mechanochemical+cycle+of+the+motor+domain+for+anti-parallel+microtubule+sliding%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">The kinesin-5 tail domain directly modulates the mechanochemical cycle of the motor domain for anti-parallel microtubule sliding.</a> eLife. 9 (9), 51131(2020).</li>
<li>Gheber, L., Kuo, S. C., Hoyt, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Motile+properties+of+the+kinesin-related+Cin8p+spindle+motor+extracted+from+Saccharomyces+cerevisiae+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Motile properties of the kinesin-related Cin8p spindle motor extracted from Saccharomyces cerevisiae cells.</a> Journal of Biological Chemistry. 274 (14), 9564-9572 (1999).</li>
<li>Pandey, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flexible+microtubule+anchoring+modulates+the+bi-directional+motility+of+the+kinesin-5+Cin8%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+and+Molecular+Life+Sciences%22%5BJournal%5D)">Flexible microtubule anchoring modulates the bi-directional motility of the kinesin-5 Cin8.</a> Cellular and Molecular Life Sciences. 78 (16), 6051-6068 (2021).</li>
<li>Shapira, O., Gheber, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Motile+properties+of+the+bi-directional+kinesin-5+Cin8+are+affected+by+phosphorylation+in+its+motor+domain%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Motile properties of the bi-directional kinesin-5 Cin8 are affected by phosphorylation in its motor domain.</a> Scientific Reports. 6, 25597(2016).</li>
<li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fiji%3A+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li>
<li>Britto, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Schizosaccharomyces+pombe+kinesin-5+switches+direction+using+a+steric+blocking+mechanism%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Schizosaccharomyces pombe kinesin-5 switches direction using a steric blocking mechanism.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (47), 7483-7489 (2016).</li>
<li>Kapitein, L. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microtubule+cross-linking+triggers+the+directional+motility+of+kinesin-5%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Microtubule cross-linking triggers the directional motility of kinesin-5.</a> Journal of Cell Biology. 182 (3), 421-428 (2008).</li>
<li>Furuta, K., Edamatsu, M., Maeda, Y., Toyoshima, Y. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diffusion+and+directed+movement+in+vitro+motile+properties+of+fission+yeast+kinesin-14+Pkl1%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Diffusion and directed movement in vitro motile properties of fission yeast kinesin-14 Pkl1.</a> Journal of Biological Chemistry. 283 (52), 36465-36473 (2008).</li>
<li>Katrukha, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Probing+cytoskeletal+modulation+of+passive+and+active+intracellular+dynamics+using+nanobody-functionalized+quantum+dots%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Probing cytoskeletal modulation of passive and active intracellular dynamics using nanobody-functionalized quantum dots.</a> Nature Communications. 8, 14772(2017).</li>
<li>Tinevez, J. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TrackMate%3A+An+open+and+extensible+platform+for+single-particle+tracking%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">TrackMate: An open and extensible platform for single-particle tracking.</a> Methods. 115, 80-90 (2017).</li>
<li>Jakobs, M. A. H., Dimitracopoulos, A., Franze, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((KymoBulter%2C+a+deep+learning+software+for+automated+kymograph+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">KymoBulter, a deep learning software for automated kymograph analysis.</a> eLife. 8, 42288(2019).</li>
</ol>

Autorzy nie mają do ujawnienia żadnych konfliktów interesów.

W pracy przedstawiono protokół oznaczania ruchliwości pojedynczej cząsteczki z dwukierunkową kinezyną-5 Cin8 oraz analizę ruchliwości. Pełnowymiarowy Cin818 , w tym natywny sygnał lokalizacji jądrowej (NLS) na C-końcu, został oczyszczony z natywnego gospodarza S. cerevisiae. Ponieważ Cin8 jest jądrowym białkiem motorycznym, mielenie komórek S. cerevisiae pod ciekłym azotem okazuje się najbardziej efektywną metodą lizy komórek. Po lizie, łącząc chromatografię powinowactwa do metal...

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/63425">Motility of Single Molecules and Clusters of Bi-directional Kinesin-5 Cin8 Purified from S. cerevisiae Cells</a>. The Authors section was updated.
One of the author names was updated from:
Roy Abraham
to:
Roy Avraham

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/63425">Motility of Single Molecules and Clusters of Bi-directional Kinesin-5 Cin8 Purified from S. cerevisiae Cells</a>. The Authors section was updated.

Erratum: Motility of Single Molecules and Clusters of Bi-directional Kinesin-5 Cin8 Purified from S. cerevisiae Cells

Liczna grupa zdarzeń związanych z motywnością w komórkach eukariotycznych jest pośredniczona przez działanie białek motorów molekularnych. Motory te poruszają się wzdłuż filamentów cytoszkieletu – filamentów aktynowych oraz mikrotubul (MT), przekształcając energię chemiczną hydrolizy ATP w siły kinetyczne i mechaniczne niezbędne do napędzania motywności biologicznej wewnątrz komórek. Białko Cin8 z S. cerevisiae oparte na MT jest bipolarnym, homotetramerycznym białkiem motorycznym kinezyny-5, które sieciuje i przesuwa mikrotubule wrzeciona od siebie1. Cin8 pełni kluczowe funkcje podczas mitozy, w procesie budowy wrzeciona2,3,4 oraz wydłużania wrzeciona podczas anafazy5,6,7. Wcześniej wykazano, że Cin8 jest motorem bidirekcjonalnym, który zmienia kierunkowość w zależności od warunków eksperymentalnych. Na przykład w warunkach wysokiej siły jonowej pojedyncze motory Cin8 poruszają się w stronę końca minus MT, natomiast w klastrach, w testach poślizgu MT z wieloma motorami oraz pomiędzy antyrównoległymi MT, motory Cin8 poruszają się głównie w stronę końców plus MT8,9,10,11,12. Odkrycia te były wysoce nieoczekiwane z kilku powodów. Po pierwsze, Cin8 posiada katalityczną domenę motorową na terminusie aminowym, a uważano wcześniej, że takie motory są wyłącznie skierowane w stronę końca plus, podczas gdy wykazano, że na poziomie pojedynczych cząsteczek Cin8 jest skierowany w stronę końca minus. Po drugie, sądzono, że motory kinezynowe są jednokierunkowe – skierowane albo w stronę końca minus, albo końca plus – podczas gdy wykazano, że Cin8 jest bidirekcjonalny, zależnie od warunków eksperymentalnych. Wreszcie, ze względu na orientację MT we wrzecionie mitotycznym, klasyczna rola motorów kinezyny-5 w rozdzielaniu biegunów wrzeciona podczas jego budowy i anafazy B mogła być wyjaśniona jedynie przez ich motywność w stronę końca plus na sieciowanych przez nie MT1,13. Po pierwszych doniesieniach o bidirekcjonalności Cin8 wykazano, że kilka innych motorów kinezynowych również jest bidirekcjonalnych14,15,16, co wskazuje, że bidirekcjonalna motywność motorów kinezynowych może być bardziej powszechna, niż wcześniej sądzono.
Wcześniej zgłoszono, że w komórkach Cin8 również porusza się w sposób dwukierunkowy8, co wspiera tezę, że dwukierunkowa motylość niektórych motorów kinesyny-5 jest istotna dla ich funkcji wewnątrzkomórkowych. Ponadto, ponieważ trzy raportowane jako dwukierunkowe motory kinesyny-5 pochodzą z komórek grzybów, niedawno zaproponowano możliżną rolę dwukierunkowości motorów kinesyny-5 w takich komórkach10. Zgodnie z tym modelem, w zamkniętej mitozie komórek grzybów, w której otoczka jądrowa nie ulega rozpadowi podczas mitozy, motory kinesyny-5 dostarczają początkowej siły rozdzielającej bieguny wrzeciona przed jego złożeniem. Aby zrealizować to zadanie, przed rozdzieleniem biegunów wrzeciona, motory kinesyny-5 lokalizują się w pobliżu biegunów wrzeciona dzięki motylości skierowanej do końca minus pojedynczych mikrotubul (MT) jądra. Po zajęciu tej pozycji motory kinesyny-5 grupują się, zmieniają kierunkowość, przechwytują i sieciują MT z sąsiednich biegunów wrzeciona. Następnie motory kinesyny-5 zapewniają wstępne rozdzielenie biegunów poprzez motylość skierowaną do końca plus na sieciowanych przez siebie MT. Według tego modelu, zarówno motylość skierowana do końca minus na pojedynczych MT, jak i motylość skierowana do końca plus na sieciowanych MT podczas poślizgu antyrównoległego są niezbędne, aby motory kinesyny-5 grzybów mogły pełnić swoje role w procesie składania wrzeciona1,13.
Ogólnym celem opisanego sposobu jest uzyskanie wysokiej czystości grzybowej kinezyny-5 Cin8 znakowanej GFP oraz przeprowadzenie testów ruchliwości pojedynczych cząsteczek (Rycina 1), przy jednoczesnej oddzielnej analizie ruchliwości pojedynczych cząsteczek i skupisk Cin8. Rozdzielenie pojedynczych cząsteczek od skupisk jest istotne, ponieważ jednym z czynników, które wykazano, że wpływają na kierunkowość Cin8, jest jego akumulacja w skupiskach na mikrotubulach (MT)10,12. Alternatywne testy ruchliwości, takie jak testy poślizgu po powierzchni MT oraz testy przesuwania MT, nie dostarczają informacji dotyczących aktywności pojedynczych białek motorowych17,18. Opisane tutaj niezawodne metody analizy i testy ruchliwości pojedynczych cząsteczek zostały z powodzeniem zastosowane do charakterystyki różnych aspektów motorów kinezyny-5, Cin8 i Kip110,11,12,14,19,20.
W niniejszym materiale przedstawiono szczegółowy protokół nadekspresji i oczyszczania białka Cin8, polimeryzacji mikrotubul (MT) oraz testu ruchomości pojedynczych cząsteczek. Ponadto opisano analizy służące do rozróżnienia pojedynczych cząsteczek od skupisk białka Cin8, a także do wyznaczania prędkości pojedynczych motorów i skupisk za pomocą analizy średniego przemieszczenia (MD) oraz średniego kwadratu przemieszczenia (MSD). Celem niniejszego protokołu jest pomoc badaczom w wizualizacji wszystkich etapów procedur oraz wsparcie w rozwiązywaniu problemów pojawiających się podczas tego typu testów.
<img alt="Schemat oddziaływania białka motorycznego z mikrotubulami; ruch Cin8 na mikrotubuli znakowanej rodamyną na szkiełku podstawowym." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63425/63425fig01v2.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1: Schematyczny przedstawienie testu ruchliwości pojedynczych cząsteczek. Biotynilowane fluorescencyjne MT są przytwierdzone do szklanej powierzchni pokrytej awidyną, która oddziałuje z przytwierdzonym do powierzchni biotynilowanym BSA. Zielona strzałka reprezentuje kierunek ruchu pojedynczych cząsteczek Cin8 w warunkach wysokiej siły jonowej. +/- reprezentują polarność MT. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63425/63425fig01largev2.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>

<table><tbody><tr><td>Adenina</td><td>FORMEDIUM</td><td>DOC0230</td><td></td></tr><tr><td>ATP</td><td>Sigma</td><td>A7699</td><td></td></tr><tr><td>Biotynylowany-BSA</td><td>Sigma</td><td>A8549</td><td></td></tr><tr><td>Kazeina</td><td>Sigma</td><td>C7078</td><td></td></tr><tr><td>Katalaza (C40)</td><td>Sigma</td><td>C40</td><td></td></tr><tr><td>Kinaza kreatynowa</td><td>Sigma</td><td>C3755</td><td></td></tr><tr><td>Ditiotreitol (DTT)</td><td>Sigma</td><td>D0632</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma</td><td>E5134</td><td></td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Sigma</td><td>E4378</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw filtrów fluorescencyjnych do GFP</td><td>Chroma</td><td>49002: ET-EGFP (FITC/Cy2)</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw filtrów fluorescencyjnych do rodaminy</td><td>Chroma</td><td>49004: ET-CY3/TRITC</td><td></td></tr><tr><td>Fluorescencyjny mikroskop odwrócony</td><td>Zeiss</td><td>Axiovert 200M</td><td></td></tr><tr><td>Galaktoza</td><td>Tivan Biotech</td><td>GAL02</td><td></td></tr><tr><td>Glukoza</td><td>Sigma</td><td>G8270</td><td></td></tr><tr><td>Oksydaza glukozowa</td><td>Sigma</td><td>G7141</td><td></td></tr><tr><td>Glicerol</td><td>Sigma</td><td>G5516</td><td></td></tr><tr><td>Glicyloglicyna</td><td>Merck</td><td>G0674</td><td></td></tr><tr><td>GMPCPP</td><td>Jana Bioscience</td><td>Nu-405L</td><td></td></tr><tr><td>GTB</td><td>Cytoszkielet</td><td>BST01-010</td><td></td></tr><tr><td>GTP</td><td>Sigma</td><td>G8877</td><td></td></tr><tr><td>Histidine</td><td>Duchefa Biochemie</td><td>H0710.0100</td><td></td></tr><tr><td>Oprogramowanie ImageJ-FIJI</td><td>https://imagej.net/plugins/trackmate/</td> <td>wersja 2.1.0/1.53c; Java 1.8.0_172 [64-bit] dla Windows 10</td><td></td></tr><tr><td>Imidazole</td><td>Sigma</td><td>I0125</td><td></td></tr><tr><td>InstantBlue Coomassie Protein Stain</td><td>Abcam</td><td>ab119211</td><td></td></tr><tr><td>Obiektyw</td><td>Zeiss</td><td>100x/1.4 olej DIC Lizyna</td><td></td></tr><tr><td></td><td>FORMEDIUM</td><td>DOC0161</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek magnezu</td><td>Sigma</td><td>M8266</td><td></td></tr><tr><td>Metionina</td><td>Duchefa Biochemie</td><td>M0715.0100</td><td></td></tr><tr><td>Neo</td><td>Andor Technologies</td><td>Kamera</td><td></td>sCMOS</tr><tr><td>NeutraAvidin</td><td>Life</td><td>A2666</td><td></td></tr><tr><td>Ni-NTA Agaroza</td><td>Invitrogen</td><td>R901-15</td><td></td></tr><tr><td>Fosfokreatyna</td><td>Sigma</td><td>P1937</td><td></td></tr><tr><td>Rury</td><td>Sigma</td><td>P1851</td><td></td></tr><tr><td>Kwas pluronowy F-127 (poloksamer)</td><td>Sigma</td><td>P2443</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek potasu</td><td>Sigma</td><td>P9541</td><td></td></tr><tr><td>Rafinoza</td><td>Tivan Biotech</td><td>RAF01</td><td></td></tr><tr><td>Przyrząd do chromatografii wykluczającej rozmiar</td><td>GE Healthcare</td><td>AKTA Czysty</td><td></td></tr><tr><td>spektrofotometr</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>NanoDrop</td><td></td></tr><tr><td>Superose-6 10/300 GL</td><td>GE Healthcare</td><td>17-5172-01</td><td></td></tr><tr><td>Tris</td><td>Roshe</td><td>10708976001</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma</td><td>T8787</td><td></td></tr><tr><td>Tryptofan</td><td>Duchefa Biochemie</td><td>T0720.0100</td><td></td></tr><tr><td>Cytoszkielet</td><td>białka tubuliny</td><td>T240</td><td></td></tr><tr><td>Tubulina, biotynylowany</td><td>cytoszkielet</td><td>T333P</td><td></td></tr><tr><td>Tubulina, TRITC Cytoszkielet rodaminy</td><td></td><td>TL530M</td><td></td></tr><tr><td>Uracil</td><td>Sigma</td><td>U0750-100G</td><td></td></tr><tr><td>Drożdżowa baza azotowa</td><td>FORMEDIUM</td><td>CYN0401S</td><td></td></tr><tr><td>&alfa;-GFP przeciwciało</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>SC8036</td><td></td></tr><tr><td>&beta;-merkaptoetanol</td><td>Sigma</td><td>M3148</td><td></td></tr></tbody></table>

ruchliwość pojedynczych cząsteczek i klastrów dwukierunkowej kinezyny-5 cin8 oczyszczonej z komórek s. cerevisiae

Motility of Single Molecules and Clusters of Bi-Directional Kinesin-5 Cin8 Purified from S. cerevisiae Cells

Mitotyczne bipolarne silniki kinezynowe-5 pełnią podstawowe funkcje w dynamice wrzeciona. Silniki te wykazują strukturę homo-tetrameryczną z dwiema parami katalitycznych domen motorycznych, położonymi na przeciwległych końcach kompleksu aktywnego. Ta unikalna architektura umożliwia silnikom kinezyny-5 sieciowanie i przesuwanie antyrównoległych mikrotubul wrzeciona (MT), zapewniając w ten sposób siłę skierowaną na zewnątrz, która oddziela bieguny wrzeciona. Wcześniej uważano, że silniki Kinesin-5 są skierowane wyłącznie na plus-end. Jednak ostatnie badania wykazały, że kilka grzybowych silników kinezyny-5 jest skierowanych na poziomie pojedynczej cząsteczki i może zmieniać kierunkowość w różnych warunkach eksperymentalnych. Saccharomyces cerevisiae kinesin-5 Cin8 jest przykładem takiego dwukierunkowego białka motorycznego: w warunkach wysokiej siły jonowej pojedyncze cząsteczki Cin8 poruszają się w kierunku ujemnym końca MT. Wykazano również, że Cin8 tworzy ruchliwe gromady, głównie na ujemnym końcu MT, a takie grupowanie pozwala Cin8 na zmianę kierunku i powolną, ukierunkowaną ruchliwość na dodatnim końcu. Ten artykuł zawiera szczegółowy protokół dla wszystkich etapów pracy z kinezyną-5 Cin8 znakowaną GFP, od nadekspresji białka w komórkach S. cerevisiae i jego oczyszczania do testu ruchliwości pojedynczej cząsteczki in vitro. Nowo opracowana metoda opisana tutaj pomaga rozróżnić pojedyncze cząsteczki i klastry Cin8 na podstawie ich intensywności fluorescencji. Metoda ta umożliwia odrębną analizę ruchliwości pojedynczych cząsteczek i klastrów Cin8, zapewniając tym samym charakterystykę zależności ruchliwości Cin8 od wielkości jego klastra.

Celem eksperymentu jest zbadanie charakterystyki ruchliwości dwukierunkowego białka motorowego Cin8 o różnych rozmiarach skupisk na pojedynczych MT. Reprezentatywna ruchliwość Cin8-GFP jest również widoczna na kymografach na Rysunku 5A, gdzie przedstawiono pozycję przestrzenną motoru w czasie.
W celu analizy właściwości ruchowych Cin8-GFP najpierw przypisano wielkość klastra (krok 4.3) do każdej cząsteczki Cin8-GFP poruszającej się i przytwierdzonej do mikrotubul ...

Dwukierunkowa mitoza kinezyna-5 Cin8 gromadzi się w klastrach, które rozdzielają się i łączą podczas swojej ruchliwości. Akumulacja w gromadach zmienia również prędkość i kierunkowość Cin8. W tym miejscu opisano protokół oznaczania ruchliwości z oczyszczonym Cin8-GFP oraz analizy właściwości ruchliwych pojedynczych cząsteczek i klastrów Cin8.

Ruchliwość pojedynczych cząsteczek i klastrów dwukierunkowej kinezyny-5 Cin8 oczyszczonej z komórek S. cerevisiae

The mitotic bipolar kinesin-5 motors perform essential functions in spindle dynamics. These motors exhibit a homo-tetrameric structure with two pairs of ...

Kinezyna-5 Cin8 Saccharomyces cerevisiae jest dwukierunkowym białkiem motorycznym. Cin8 porusza się w kierunku ujemnym końca mikrotubul jako pojedyncza cząsteczka i zmienia kierunkowość w wielu różnych warunkach eksperymentalnych. Ogólnym celem naszych badań jest zrozumienie mechanizmu ruchliwości dwukierunkowej poprzez badanie czynników i elementów strukturalnych, które regulują dwukierunkową ruchliwość Cin8.Protokół ten kompleksowo wyjaśnia oczyszczanie nadekspresji Cin8 o pełnej długości typu GFP w komórkach drożdży, test ruchliwości pojedynczej cząsteczki, a następnie analizę właściwości ruchliwych pojedynczych cząsteczek i klastrów Cin8. Ta separacja jest ważna, ponieważ na kierunkowość Cin8 wpływa jego akumulacja w klastrach na mikrotubulach. Technikę tę można łatwo dostosować do oczyszczania innych białek jądrowych z drożdży.Dodatkowo można go nakładać na dowolne cząstki fluorescencyjne, które muszą być podzielone na grupy wielkości na podstawie ich intensywności fluorescencji. Procedurę zademonstrują dr Mary Popov, kierownik naszego laboratorium, dr Alina Goldstein-Levitin i dr Nurit Siegler, stypendyści podoktoranccy; Tatiana Zvagelsky, Mayan Sadan i Shira Hershfinkel, doktoranci; oraz Neta Yanir, Yahel Abraham, Roy Avraham i Meital Haberman, studenci studiów licencjackich z naszego laboratorium. Na początek hoduj komórki Saccharomyces cerevisiae zawierające plazmid do nadekspresji Cin8-GFP-6His do fazy wzrostu wykładniczego w jednym litrze pożywki selektywnej dla drożdży, uzupełnionej 2% rafinozą w temperaturze 28 stopni Celsjusza.Następnie wyindukuj nadekspresję Cin8-GFP-6His przez dodanie 2% galaktozy i monitoruj wzrost kultury drożdży, mierząc absorbancję przy 600 nanometrach. Pięć godzin po dodaniu galaktozy zbierz komórki przez odwirowanie. Ponownie zawieś komórki w buforze do lizy i zamroź je w ciekłym azocie.Następnie za pomocą schłodzonego moździerza i tłuczka zmiel zamrożone komórki w ciekłym azocie. Podczas mielenia dodawaj ciekły azot, aby ekstrakty pozostały zamrożone. Monitoruj lizę komórek pod mikroskopem kontrastowym z interferencją fazową lub różnicową.Następnie rozmrozić zmielone komórki i odwirować je. Załadować supernatant do kolumny grawitacyjnej wypełnionej dwoma mililitrami niklu-NTA i wstępnie zrównoważyć go buforem do lizy. Pozwól, aby supernatant wypłynął przez kolumnę.Przemyć kolumnę pięcioma objętościami buforu do lizy, a następnie pięcioma objętościami buforu do lizy uzupełnionymi 25-milimolowym imidazolem. Następnie wymyj Cin8-GFP-6His za pomocą buforu elucyjnego. Analizuj eluowane próbki przez frakcjonowanie SDS-PAGE, a następnie barwienie na niebiesko Coomassie i analizę Western blot z przeciwciałem anty-GFP.Po zebraniu frakcji zawierających Cin8-GFP-6His, należy je oczyścić metodą chromatografii wykluczającej przy natężeniu przepływu 0,5 mililitra na minutę i ciśnieniu w kolumnie granicznym 1,5 megapaskala. Jednocześnie monitoruj absorbancję przy 280 nanometrach. Zbierz frakcje odpowiadające tetramerowi Cin8-GFP i przeanalizuj je za pomocą SDS-PAGE i Western bloting.Następnie podziel wybrane frakcje, zamroź je i przechowuj do czasu użycia w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza. Aby spolimeryzować i ustabilizować mikrotubule znakowane biotyną i rodaminą, wymieszaj składniki reakcji w 1,5-mililitrowej probówce i inkubuj mieszaninę przez godzinę w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Następnie dodaj 80 mikrolitrów ciepłego ogólnego buforu tubuliny, dokładnie wymieszaj i odwiruj.Odrzucić supernatant i ostrożnie zawiesić osad, pipetując w górę i w dół 50 mikrolitrami ciepłego ogólnego buforu tubulinowego. Następnie przechowywać zawiesinę w temperaturze 28 lub 37 stopni Celsjusza. Zbadaj mikrotubule za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego, używając 647-nanometrowego kanału rodaminowego.Następnie usuń papier ochronny z pasków taśmy i umieść silanizowane szkiełko nakrywkowe na paskach, aby utworzyć trzy komory przepływu objętościowego o pojemności 10 mikrolitrów. Następnie wykonaj powłokę awidynową szkiełka nakrywkowego poprzez sekwencyjne dodawanie wskazanych odczynników. Inkubować szkiełko nakrywkowe przez trzy do pięciu minut przed przemyciem go 80 mikrolitrami ogólnego buforu tubulinowego.Następnie przymocuj biotynylowane mikrotubule do szkiełek nakrywkowych pokrytych b-BSA/awidyną, wkładając 20 mikrolitrów mikrotubul do komory przepływowej. Inkubować szkiełka z szkiełkiem nakrywkowym skierowanym w dół w ciemnej komorze wilgotnościowej przez pięć minut w temperaturze pokojowej. Następnie umyć szkiełka 200 mikrolitrami ogólnego buforu tubuliny.Następnie nałóż 30 mikrolitrów mieszanki reakcji ruchliwości, a następnie silniki Cin8-GFP rozcieńczone w 20 mikrolitrach mieszanki reakcji ruchliwości do komory przepływowej i natychmiast przystąp do obrazowania ruchu silników wzdłuż mikrotubul. W celu obrazowania motoryki umieść kroplę olejku immersyjnego na obiektywie mikroskopu, a następnie umieść komorę przepływową na stoliku mikroskopu fluorescencyjnego, tak aby szkiełko nakrywkowe było skierowane w stronę obiektywu. Włącz kanał rodaminy, aby skupić się na mikrotubulach przyczepionych do powierzchni szkiełka nakrywkowego.Następnie, za pomocą oprogramowania ImageJ Micro-Manager, uzyskaj obraz z 20-milisekundową ekspozycją. Następnie włącz kanał GFP i uzyskaj 90 zdjęć poklatkowych z jednosekundowym interwałem i 800-milisekundową ekspozycją. W oprogramowaniu ImageJ Fiji otwórz film poklatkowy i odpowiadający mu obraz pola mikrotubul.Zsynchronizuj te dwa okna, wybierając pozycję Analizuj, a następnie Narzędzia i Synchronizuj okna. Aby uzyskać kimograf, podświetl jedną mikrotubulę za pomocą opcji Linia segmentowana. Następnie w obszarze Analizuj wybierz kartę Multi Kymograph (Multi Kymograph).Aby określić wielkość klastra cząsteczek Cin8-GFP, wykonaj odejmowanie tła i korekcję nierównomiernego oświetlenia, klikając Proces, a następnie Odejmij tło. Ustaw promień toczącej się piłki na 100 pikseli i zaznacz opcję Paraboloida przesuwna. Następnie śledź określony nieruchomy silnik Cin8-GFP za pomocą wtyczki TrackMate w oprogramowaniu ImageJ Fiji.Wybierz Wtyczki, a następnie Śledzenie, TrackMate, detektor LoG i Prosty tracker LAP, aby śledzić średnią intensywność fluorescencji silnika Cin8-GFP w funkcji czasu w okręgu o promieniu czterech pikseli. Po powtórzeniu procedury dla różnych silników Cin8-GFP, wykreśl intensywność fluorescencji w funkcji czasu. Następnie, aby śledzić ruchliwość cząsteczek Cin8-GFP wzdłuż ścieżek mikrotubul, przytnij mikrotubule do analizy w sekwencji poklatkowej zarejestrowanych klatek, podświetlając je narzędziem prostokąta i klikając Obraz, a następnie Przytnij.Do analizy należy wybrać fluorescencyjną cząstkę Cin8-GFP. Zapisz współrzędne cząstek w każdej klatce sekwencji poklatkowej za pomocą narzędzia punktowego i opcji Zmierz. Podobnie zapisz współrzędne innych cząstek fluorescencyjnych w sekwencji poklatkowej.Następnie przypisz rozmiar klastra do wszystkich badanych cząstek Cin8-GFP w pierwszej klatce ich pojawienia się, jak pokazano wcześniej. Następnie, korzystając ze wskazanego wzoru i wyznaczonych współrzędnych ruchu Cin8-GFP, oblicz przemieszczenia Cin8-GFP w każdym punkcie czasowym w stosunku do współrzędnych początkowych. Na podstawie tych wartości przemieszczenia oblicz przemieszczenie dla wszystkich możliwych przedziałów czasowych dla określonej cząstki Cin8-GFP.Powtórz procedurę dla wszystkich badanych cząstek Cin8-GFP. Na koniec wykreśl średnie przemieszczenie wszystkich badanych cząstek Cin8-GFP w funkcji przedziału czasu i poddaj je dopasowaniu liniowemu. Nachylenie tego dopasowania reprezentuje średnią prędkość ruchliwych cząstek Cin8-GFP.Przedstawiono charakterystykę ruchliwości dwukierunkowego białka motorycznego Cin8 o różnych rozmiarach klastrów na pojedynczych mikrotubulach. Dla każdej kategorii wielkości klastra wyodrębniono z nagrań ponad 40 trajektorii poszczególnych Cin8-GFP. Wykreślenie średnich przemieszczeń pojedynczych cząsteczek i klastrów silników Cin8 w funkcji przedziału czasu wykazało, że pojedyncze cząsteczki Cin8-GFP poruszają się w jednokierunkowy sposób skierowany na koniec ujemny z dużą prędkością.Natomiast klastry Cin8 wykazują mniejszą prędkość i wyższą ruchliwość dwukierunkową. Podczas wykonywania tej procedury należy użyć białka motorycznego o wysokiej czystości, aby uniknąć wszelkich zanieczyszczeń, które mogą wpływać na grupowanie motoryczne. Analizując intensywność fluorescencji motorycznej, ważne jest, aby zbadać silniki w pierwszej klatce, w której się pojawiają, aby uniknąć efektu fotowybielania.Podczas badania ruchliwości silników dwukierunkowych niezwykle ważne jest osobne analizowanie pojedynczych cząsteczek i klastrów, ponieważ grupowanie motoryczne jest jednym z kluczowych czynników wpływających na kierunkowość motoryczną.

motility-single-molecules-clusters-bi-directional-kinesin-5-cin8

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemia

Molekularne wahadła składające się z funkcjonalizowanych mikrotubul przesuwających się po przytwierdzonych do powierzchni białkach motorycznych kinezynach mogą służyć jako nanoskala system transportowy. W niniejszej pracy opisano montaż typowego systemu wahadłowego.

Ładowanie ładunku na molekularne wahadła napędzane kinezyną

Niniejszy protokół opisuje sposób izolacji aktywnej, pełnowymiarowej kinezyny z embrionów Drosophila do biofizycznych badań pojedynczych cząsteczek. Przedstawiamy sposób zbierania embrionów, przygotowania lizatu embrionalnego, a następnie polimeryzacji mikrotubul (MT). Kinezynę oczyszcza się poprzez jej unieruchomienie na mikrotubulach, odwirowanie kompleksów kinezyna-MT, a następnie uwolnienie kinezyny z mikrotubul poprzez dodanie ATP.

Izolacja i oczyszczanie kinezyny z embrionów Drosophila

Wewnątrzkomórkowy transport ładunków, takich jak pęcherzyki czy organelle, odbywa się za pomocą molekularnych białek motorycznych, które śledzą na spolaryzowanych mikrotubulach. Protokół ten opisuje korelację kierunkowości transportu pojedynczych cząstek ładunku poruszających się wewnątrz neuronów, do względnej ilości i rodzaju związanych z nimi białek motorycznych.

Charakterystyka składu silników molekularnych na ruchomym ładunku aksonalnym za pomocą analizy "mapowania ładunku"

Tutaj prezentowany jest protokół identyfikacji ładunków Kinesin-1. Bezsilnikowy mutant ciężkiego łańcucha Kinesin-1 (KIF5B) agreguje się w cytoplazmie i indukuje agregację jej ładunków. Oba agregaty są wykrywane pod mikroskopią fluorescencyjną. Podobną strategię można zastosować do identyfikacji ładunków innych białek motorycznych.

Identyfikacja ładunków kinezyny-1 za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej

Montaż i ustawienie wrzeciona mitotycznego zależy od połączonych sił generowanych przez dynamikę mikrotubul, białka motoryczne i sieciery. Tutaj przedstawiamy nasze ostatnio opracowane metody, w których geometryczne uwięzienie sferycznych kropelek emulsji jest wykorzystywane do odtworzenia od dołu do góry podstawowych wrzecion mitotycznych.

Rekonstytucja podstawowych wrzecion mitotycznych w sferycznych kropelkach emulsji

Caenorhabditis elegans (C. elegans) jest dobrym modelem do badania transportu aksonalnego i wewnątrzkomórkowego. W tym miejscu opisuję protokół rejestracji i analizy in vivo transportu aksonalnego i wewnątrzwiciowego u C. elegans.

Unieruchomienie Caenorhabditis elegans w celu analizy transportu wewnątrzkomórkowego w neuronach

Prezentujemy protokół budowy molekularnych wahadłowców, gdzie przylegające do powierzchni białka motoryczne kinezyny napędzają mikrotubule znakowane barwnikiem. Słabe oddziaływania kinezyn z powierzchnią umożliwiają ich odwracalne przywiązanie do niej. W ten sposób powstaje system w nanoskali, który wykazuje dynamiczny montaż i demontaż swoich elementów przy zachowaniu swojej funkcjonalności.

Montaż molekularnych wahadłowców zasilanych przez odwracalnie przyłączone kinezyny

Celem tego protokołu jest tworzenie zespołów silników molekularnych na nanostrukturach origami DNA i obserwowanie ruchliwości zespołu za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej z całkowitym wewnętrznym odbiciem.

Produkcja zespołów motorycznych dyneiny i kinezyny na nanostrukturach DNA origami do obserwacji pojedynczych cząsteczek

Tutaj prezentujemy protokół odtwarzania wiązek mikrotubul in vitro i bezpośredniego ilościowego określania sił wywieranych w ich obrębie za pomocą jednoczesnego pułapkowania optycznego i mikroskopii fluorescencyjnej z całkowitym wewnętrznym odbiciem. Test ten pozwala na pomiar sił i przemieszczeń generowanych przez zespoły białek w aktywnych sieciach mikrotubul na poziomie nanoskali.

Bezpośredni pomiar sił w odtworzonych wiązkach aktywnych mikrotubul

To badanie szczegółowo opisuje oczyszczanie KIF1A(1-393LZ), członka rodziny kinezyny-3, przy użyciu systemu ekspresji Sf9-bakulowirusa. Analiza in vitro pojedynczych cząsteczek i wielu silników ślizgowych tych oczyszczonych silników wykazała silne właściwości ruchliwości porównywalne z silnikami z lizatu komórkowego ssaków. W ten sposób system Sf9-bakulowirusa jest podatny na ekspresję i oczyszczanie białka motorycznego będącego przedmiotem zainteresowania.

Analiza pojedynczych cząsteczek oczyszczonych superprocesyjnych silników z rodziny Kinesin-3 Sf9

Poznaj mechanizm dwukierunkowej ruchliwości kinezyny-5 Cin8 z Saccharomyces cerevisiae. Ta metoda pozwala badać wpływ klasteryzacji na prędkość i kierunkowość ruchu białek silnikowych.

Ruchliwość pojedynczych cząsteczek i klastrów dwukierunkowej kinezyny-5 Cin8 oczyszczonej z komórek S. cerevisiae

Przeglądaj więcej filmów