Ruchliwość pojedynczych cząsteczek i klastrów dwukierunkowej kinezyny-5 Cin8 oczyszczonej z komórek S. cerevisiae
2 lutego 2022
Dwukierunkowa mitoza kinezyna-5 Cin8 gromadzi się w klastrach, które rozdzielają się i łączą podczas swojej ruchliwości. Akumulacja w gromadach zmienia również prędkość i kierunkowość Cin8. W tym miejscu opisano protokół oznaczania ruchliwości z oczyszczonym Cin8-GFP oraz analizy właściwości ruchliwych pojedynczych cząsteczek i klastrów Cin8.
Kinezyna-5 Cin8 Saccharomyces cerevisiae jest dwukierunkowym białkiem motorycznym. Cin8 porusza się w kierunku ujemnym końca mikrotubul jako pojedyncza cząsteczka i zmienia kierunkowość w wielu różnych warunkach eksperymentalnych. Ogólnym celem naszych badań jest zrozumienie mechanizmu ruchliwości dwukierunkowej poprzez badanie czynników i elementów strukturalnych, które regulują dwukierunkową ruchliwość Cin8.
Protokół ten kompleksowo wyjaśnia oczyszczanie nadekspresji Cin8 o pełnej długości typu GFP w komórkach drożdży, test ruchliwości pojedynczej cząsteczki, a następnie analizę właściwości ruchliwych pojedynczych cząsteczek i klastrów Cin8. Ta separacja jest ważna, ponieważ na kierunkowość Cin8 wpływa jego akumulacja w klastrach na mikrotubulach. Technikę tę można łatwo dostosować do oczyszczania innych białek jądrowych z drożdży.
Dodatkowo można go nakładać na dowolne cząstki fluorescencyjne, które muszą być podzielone na grupy wielkości na podstawie ich intensywności fluorescencji. Procedurę zademonstrują dr Mary Popov, kierownik naszego laboratorium, dr Alina Goldstein-Levitin i dr Nurit Siegler, stypendyści podoktoranccy; Tatiana Zvagelsky, Mayan Sadan i Shira Hershfinkel, doktoranci; oraz Neta Yanir, Yahel Abraham, Roy Avraham i Meital Haberman, studenci studiów licencjackich z naszego laboratorium. Na początek hoduj komórki Saccharomyces cerevisiae zawierające plazmid do nadekspresji Cin8-GFP-6His do fazy wzrostu wykładniczego w jednym litrze pożywki selektywnej dla drożdży, uzupełnionej 2% rafinozą w temperaturze 28 stopni Celsjusza.
Następnie wyindukuj nadekspresję Cin8-GFP-6His przez dodanie 2% galaktozy i monitoruj wzrost kultury drożdży, mierząc absorbancję przy 600 nanometrach. Pięć godzin po dodaniu galaktozy zbierz komórki przez odwirowanie. Ponownie zawieś komórki w buforze do lizy i zamroź je w ciekłym azocie.
Następnie za pomocą schłodzonego moździerza i tłuczka zmiel zamrożone komórki w ciekłym azocie. Podczas mielenia dodawaj ciekły azot, aby ekstrakty pozostały zamrożone. Monitoruj lizę komórek pod mikroskopem kontrastowym z interferencją fazową lub różnicową.
Następnie rozmrozić zmielone komórki i odwirować je. Załadować supernatant do kolumny grawitacyjnej wypełnionej dwoma mililitrami niklu-NTA i wstępnie zrównoważyć go buforem do lizy. Pozwól, aby supernatant wypłynął przez kolumnę.
Przemyć kolumnę pięcioma objętościami buforu do lizy, a następnie pięcioma objętościami buforu do lizy uzupełnionymi 25-milimolowym imidazolem. Następnie wymyj Cin8-GFP-6His za pomocą buforu elucyjnego. Analizuj eluowane próbki przez frakcjonowanie SDS-PAGE, a następnie barwienie na niebiesko Coomassie i analizę Western blot z przeciwciałem anty-GFP.
Po zebraniu frakcji zawierających Cin8-GFP-6His, należy je oczyścić metodą chromatografii wykluczającej przy natężeniu przepływu 0,5 mililitra na minutę i ciśnieniu w kolumnie granicznym 1,5 megapaskala. Jednocześnie monitoruj absorbancję przy 280 nanometrach. Zbierz frakcje odpowiadające tetramerowi Cin8-GFP i przeanalizuj je za pomocą SDS-PAGE i Western bloting.
Następnie podziel wybrane frakcje, zamroź je i przechowuj do czasu użycia w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza. Aby spolimeryzować i ustabilizować mikrotubule znakowane biotyną i rodaminą, wymieszaj składniki reakcji w 1,5-mililitrowej probówce i inkubuj mieszaninę przez godzinę w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Następnie dodaj 80 mikrolitrów ciepłego ogólnego buforu tubuliny, dokładnie wymieszaj i odwiruj.
Odrzucić supernatant i ostrożnie zawiesić osad, pipetując w górę i w dół 50 mikrolitrami ciepłego ogólnego buforu tubulinowego. Następnie przechowywać zawiesinę w temperaturze 28 lub 37 stopni Celsjusza. Zbadaj mikrotubule za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego, używając 647-nanometrowego kanału rodaminowego.
Następnie usuń papier ochronny z pasków taśmy i umieść silanizowane szkiełko nakrywkowe na paskach, aby utworzyć trzy komory przepływu objętościowego o pojemności 10 mikrolitrów. Następnie wykonaj powłokę awidynową szkiełka nakrywkowego poprzez sekwencyjne dodawanie wskazanych odczynników. Inkubować szkiełko nakrywkowe przez trzy do pięciu minut przed przemyciem go 80 mikrolitrami ogólnego buforu tubulinowego.
Następnie przymocuj biotynylowane mikrotubule do szkiełek nakrywkowych pokrytych b-BSA/awidyną, wkładając 20 mikrolitrów mikrotubul do komory przepływowej. Inkubować szkiełka z szkiełkiem nakrywkowym skierowanym w dół w ciemnej komorze wilgotnościowej przez pięć minut w temperaturze pokojowej. Następnie umyć szkiełka 200 mikrolitrami ogólnego buforu tubuliny.
Następnie nałóż 30 mikrolitrów mieszanki reakcji ruchliwości, a następnie silniki Cin8-GFP rozcieńczone w 20 mikrolitrach mieszanki reakcji ruchliwości do komory przepływowej i natychmiast przystąp do obrazowania ruchu silników wzdłuż mikrotubul. W celu obrazowania motoryki umieść kroplę olejku immersyjnego na obiektywie mikroskopu, a następnie umieść komorę przepływową na stoliku mikroskopu fluorescencyjnego, tak aby szkiełko nakrywkowe było skierowane w stronę obiektywu. Włącz kanał rodaminy, aby skupić się na mikrotubulach przyczepionych do powierzchni szkiełka nakrywkowego.
Następnie, za pomocą oprogramowania ImageJ Micro-Manager, uzyskaj obraz z 20-milisekundową ekspozycją. Następnie włącz kanał GFP i uzyskaj 90 zdjęć poklatkowych z jednosekundowym interwałem i 800-milisekundową ekspozycją. W oprogramowaniu ImageJ Fiji otwórz film poklatkowy i odpowiadający mu obraz pola mikrotubul.
Zsynchronizuj te dwa okna, wybierając pozycję Analizuj, a następnie Narzędzia i Synchronizuj okna. Aby uzyskać kimograf, podświetl jedną mikrotubulę za pomocą opcji Linia segmentowana. Następnie w obszarze Analizuj wybierz kartę Multi Kymograph (Multi Kymograph).
Aby określić wielkość klastra cząsteczek Cin8-GFP, wykonaj odejmowanie tła i korekcję nierównomiernego oświetlenia, klikając Proces, a następnie Odejmij tło. Ustaw promień toczącej się piłki na 100 pikseli i zaznacz opcję Paraboloida przesuwna. Następnie śledź określony nieruchomy silnik Cin8-GFP za pomocą wtyczki TrackMate w oprogramowaniu ImageJ Fiji.
Wybierz Wtyczki, a następnie Śledzenie, TrackMate, detektor LoG i Prosty tracker LAP, aby śledzić średnią intensywność fluorescencji silnika Cin8-GFP w funkcji czasu w okręgu o promieniu czterech pikseli. Po powtórzeniu procedury dla różnych silników Cin8-GFP, wykreśl intensywność fluorescencji w funkcji czasu. Następnie, aby śledzić ruchliwość cząsteczek Cin8-GFP wzdłuż ścieżek mikrotubul, przytnij mikrotubule do analizy w sekwencji poklatkowej zarejestrowanych klatek, podświetlając je narzędziem prostokąta i klikając Obraz, a następnie Przytnij.
Do analizy należy wybrać fluorescencyjną cząstkę Cin8-GFP. Zapisz współrzędne cząstek w każdej klatce sekwencji poklatkowej za pomocą narzędzia punktowego i opcji Zmierz. Podobnie zapisz współrzędne innych cząstek fluorescencyjnych w sekwencji poklatkowej.
Następnie przypisz rozmiar klastra do wszystkich badanych cząstek Cin8-GFP w pierwszej klatce ich pojawienia się, jak pokazano wcześniej. Następnie, korzystając ze wskazanego wzoru i wyznaczonych współrzędnych ruchu Cin8-GFP, oblicz przemieszczenia Cin8-GFP w każdym punkcie czasowym w stosunku do współrzędnych początkowych. Na podstawie tych wartości przemieszczenia oblicz przemieszczenie dla wszystkich możliwych przedziałów czasowych dla określonej cząstki Cin8-GFP.
Powtórz procedurę dla wszystkich badanych cząstek Cin8-GFP. Na koniec wykreśl średnie przemieszczenie wszystkich badanych cząstek Cin8-GFP w funkcji przedziału czasu i poddaj je dopasowaniu liniowemu. Nachylenie tego dopasowania reprezentuje średnią prędkość ruchliwych cząstek Cin8-GFP.
Przedstawiono charakterystykę ruchliwości dwukierunkowego białka motorycznego Cin8 o różnych rozmiarach klastrów na pojedynczych mikrotubulach. Dla każdej kategorii wielkości klastra wyodrębniono z nagrań ponad 40 trajektorii poszczególnych Cin8-GFP. Wykreślenie średnich przemieszczeń pojedynczych cząsteczek i klastrów silników Cin8 w funkcji przedziału czasu wykazało, że pojedyncze cząsteczki Cin8-GFP poruszają się w jednokierunkowy sposób skierowany na koniec ujemny z dużą prędkością.
Natomiast klastry Cin8 wykazują mniejszą prędkość i wyższą ruchliwość dwukierunkową. Podczas wykonywania tej procedury należy użyć białka motorycznego o wysokiej czystości, aby uniknąć wszelkich zanieczyszczeń, które mogą wpływać na grupowanie motoryczne. Analizując intensywność fluorescencji motorycznej, ważne jest, aby zbadać silniki w pierwszej klatce, w której się pojawiają, aby uniknąć efektu fotowybielania.
Podczas badania ruchliwości silników dwukierunkowych niezwykle ważne jest osobne analizowanie pojedynczych cząsteczek i klastrów, ponieważ grupowanie motoryczne jest jednym z kluczowych czynników wpływających na kierunkowość motoryczną.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejsze badanie analizuje dwukierunkową motywność kinezyny-5 Cin8 w Saccharomyces cerevisiae. Badania koncentrują się na sposobie, w jaki Cin8 gromadzi się w klastrach, co wpływa na jej prędkość i kierunkowość podczas testów motywności.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neuronauka
- Biologia komórki
- Dynamika białek
Wstęp
- Cin8 jest dwukierunkowym białkiem motorycznym, które przemieszcza się wzdłuż mikrotubul.
- Jego ruchliwość zależy od warunków eksperymentalnych oraz zachowania skupiającego.
- Zrozumienie mechanizmu działania Cin8 może dostarczyć cennych informacji na temat funkcji białek motorycznych.
- Niniejszy protokół można dostosować do oczyszczania innych białek jądrowych z drożdży.
Cel badania
- Wyjaśnienie mechanizmów regulujących dwukierunkową ruchliwość Cin8.
- Analiza wpływu klastrowania na właściwości ruchliwości Cin8.
- Przedstawienie kompleksowego protokołu badania białek motorowych.
Zastosowane metody
- Oczyszczanie pełnowymiarowego białka Cin8 znakowanego GFP z komórek drożdży.
- Analizy ruchliwości pojedynczych cząsteczek w celu obserwacji zachowania Cin8.
- Analiza właściwości ruchliwych pojedynczych cząsteczek oraz klastrów.
- Badanie zmian kierunkowości w różnych warunkach.
Główne wyniki
- Cin8 wykazuje dwukierunkową ruchliwość zależną od stopnia jego klastrowania.
- Prędkość i kierunkowość zmieniają się w zależności od akumulacji Cin8.
- Test ruchliwości skutecznie demonstruje właściwości białka Cin8.
- Uzyskane spostrzeżenia można zastosować do innych białek jądrowych.
Wnioski
- Badanie to pogłębia zrozumienie dynamiki białek motorowych.
- Klastrowanie odgrywa istotną rolę w ruchliwości Cin8.
- Niniejszy protokół stanowi cenne narzędzie dla przyszłych badań nad białkami motorowymi.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Analiza motywności pojedynczych cząsteczek oraz klastrów dwukierunkowej kinezyny-5 Cin8 dostarcza kluczowych informacji na temat mechanistycznych podstaw dynamiki wrzeciona mitotycznego oraz regulacji białek motorowych. Możliwość ta umożliwia badaniom biofarmaceutycznym R&Zespoły badawcze mogą przeanalizować, w jaki sposób klastrowanie białek moduluje kierunkowość i prędkość, co ma bezpośredni wpływ na walidację celu oraz ograniczanie ryzyka mechanistycznego we wczesnej fazie odkrywania leków. Zdolność tej metody do rozróżniania i kwantyfikowania zachowań motorycznych w zależności od wielkości klastra zwiększa pewność prognostyczną w kluczowych punktach zwrotnych procesu odkrywania leków.
Strategiczne zastosowania w badaniach biofarmaceutycznych&D
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Umożliwia precyzyjne badanie funkcji białek motorycznych oraz mechanizmów regulacyjnych istotnych dla celów mitotycznych.
- Wspiera biologiczne ograniczanie ryzyka poprzez wyjaśnienie, w jaki sposób klastrowanie wpływa na kierunkowość i aktywność białek.
- Ułatwia funkcjonalną walidację celu poprzez kwantyfikację zmian ruchliwości na poziomie pojedynczych cząsteczek i klastrów.
- Dostarcza danych mechanistycznych niezbędnych do określenia pewności predykcyjnej oraz podejmowania decyzji dotyczących selekcji projektów w portfolio.
Przesiewanie i opracowywanie testów
- Ustanawia zwalidowane układy in vitro do ilościowej analizy ruchliwości białek oraz efektów ich klastrowania.
- Umożliwia powtarzalną separację i pomiar pojedynczych cząsteczek w porównaniu z klastrami z wykorzystaniem intensywności fluorescencji.
- Wspiera standaryzację i skalowalność testów do późniejszego przesiewania związków ukierunkowanego na motory mitotyczne.
- Dostarcza ilościowe wyniki niezbędne do wiarygodnej oceny modulatorów funkcji białek motorycznych.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Zapewnia wgląd mechanistyczny w regulację motorów mitotycznych o potencjalnym znaczeniu chorobowym w onkologii i zaburzeniach podziału komórkowego.
- Umożliwia zachowanie ciągłości od odkryć molekularnych do walidacji przedklinicznej poprzez powiązanie zachowania białek z efektami funkcjonalnymi.
- Wspiera decyzje o dalszym rozwoju projektu w oparciu o analizę ryzyka poprzez wyjaśnienie wpływu klastrowania na aktywność celu.
- Oferuje wartość w zakresie predykcyjnego ograniczania ryzyka dla dopasowania biomarkerów translacyjnych, gdy jest to wsparte badaniami następczymi.
Integracja potoku i przepływu pracy
Metoda ta integruje się z kontinuum odkryć, od wczesnych badań mechanistycznych, poprzez opracowywanie testów, aż po badania przedkliniczne, wspierając zarówno weryfikację hipotez, jak i analitykę ilościową.
- Biologia odkrywcza: Wyjaśnia, w jaki sposób klasteryzacja moduluje kierunkowość kinezyny-5, co wspiera analizę szlaków i ograniczanie ryzyka biologicznego.
- Przesiewanie: Zapewnia powtarzalne, ilościowe pomiary ruchliwości w celu przygotowania testów i oceny związków.
- Analityka: Umożliwia przypisanie wielkości klastra na podstawie fluorescencji oraz odczyty prędkości dla rzetelnego porównania statystycznego.
- Badania translacyjne: Tworzy podstawy do powiązania zachowania motorów molekularnych z fenotypami istotnymi dla chorób w przypadku rozszerzenia metody na modele chorobowe.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Protokół możliwy do adaptacji dla innych białek jądrowych lub systemów cząstek fluorescencyjnych wymagających separacji opartej na wielkości oraz analizy ruchliwości.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorczy
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność prognostyczną i zmniejsza niejednoznaczność mechanistyczną w walidacji celów mitotycznych.
- Wartość operacyjna: Standaryzuje testy ruchliwości i umożliwia powtarzalne, skalowalne przepływy pracy w analizie białek.
- Wartość strategiczna: Dostarcza informacji do decyzji go/no-go i zwiększa efektywność kapitałową poprzez wczesne wyjaśnienie zachowania celu.
- Wpływ na portfolio: Wspiera priorytetyzację skorygowaną o ryzyko i rozwój celów mitotycznych w oparciu o dane mechanistyczne.
Wskazówki dotyczące wdrożenia
- Wymaga doświadczenia w zakresie oczyszczania białek, mikroskopii fluorescencyjnej oraz ilościowej analizy obrazu.
- Wymaga dostępu do wysokiej jakości platform obrazowania i oprogramowania analitycznego (np. ImageJ Fiji, TrackMate).
- Konieczna jest rygorystyczna standaryzacja międzyzespołowa w celu zapewnienia powtarzalności pomiarów ruchliwości i klastrowania.
- Metoda jest dostosowywalna do innych systemów modelowych lub białek znakowanych fluorescencyjnie o podobnych wymaganiach analitycznych.
- Staranna kontrola czystości białka oraz fotowyblakania jest niezbędna do dokładnej oceny wielkości klastrów i ruchliwości.
Najczęściej zadawane pytania dotyczące biofarmacji
Chapters in this video
0:05
Introduction
1:51
Cin8 Overexpression and Purification from Saccharomyces cerevisiae Cells
4:06
Single-Molecule Motility Assay with the Purified Cin8
6:29
Motility Analysis
9:13
Results: Motility Characteristics of Different Cluster Sizes of Cin8 on Single Microtubules
9:58
Conclusion
