Ocena błędu oceny myszy za pomocą zadania kopania węchowego

Jest to pierwsze w historii zadanie dotyczące błędu oceny myszy, które zostało zweryfikowane jako wrażliwe na zmiany w stanie afektywnym, innymi słowy, nastroju lub emocji. Może być używany do badania wpływu dowolnej zmiennej na wpływ myszy. Protokół ten wykorzystuje projekt etologiczny, dzięki czemu myszy łatwo się uczą, a także jest przyjazny dla dobrostanu, ponieważ zadanie pozwala uniknąć stosowania kary lub negatywnego wzmocnienia.

Zadanie to może ocenić wpływ hodowli lub procedur eksperymentalnych na stany afektywne myszy, co czyni je cennym w różnych dziedzinach, takich jak badania nad dobrostanem zwierząt lub modelowanie zaburzeń afektywnych u ludzi. Zakładając, że badacze są już zaznajomieni z nieawersyjnymi metodami obchodzenia się, naszą główną radą jest wykorzystanie pilotów przed szkoleniem w celu zidentyfikowania odpowiednich mieszanin zapachów, innymi słowy, tych, które myszy traktują jako niejednoznaczne. Ten test behawioralny to oparte na zapachu zadanie kopania go-go, w którym mysz musi kopać w poszukiwaniu nagród w postaci jedzenia o wysokiej lub niskiej wartości.

Aparatura doświadczalna składa się z prostokątnej areny z dwoma ramionami. Jedno ramię jest zawsze wyśrodkowane i oznaczone pozytywnym lub negatywnym zapachem bodźca dyskryminującego, a drugie ramię jest zawsze bezzapachowe. Doniczki do kopania zawierają dostępną i niedostępną komorę oddzieloną perforowaną plastikową barierą.

Oba pojemniki w aparacie zawsze zawierają pokarm o wysokiej i niskiej wartości, ale smakołyki są dostępne w zależności od ramienia i rodzaju próby. Podczas pozytywnych prób treningowych mysz może zdecydować się na eksplorację i kopanie w pachnącym ramieniu, które zawiera doniczkę oznaczoną pozytywnym zapachem bodźca dyskryminującego i zakopaną nagrodą w postaci jedzenia o wysokiej wartości. Mysz może również zdecydować się na wkopanie się w bezzapachowe ramię, które jest oznaczone wodą destylowaną i zawiera nagrodę w postaci jedzenia o niskiej wartości.

Podczas negatywnych prób treningowych mysz może ponownie wybierać między pachnącym ramieniem, które teraz zawiera doniczkę oznaczoną negatywnym zapachem bodźca dyskryminującego i brakiem dostępnej nagrody w postaci jedzenia, a bezzapachowym ramieniem, które jest ponownie oznaczone wodą destylowaną i zawiera nagrodę w postaci jedzenia o niskiej wartości. Następnie myszy są testowane w pozytywnych i ujemnych próbach bez wzmocnienia, w których nie są dostępne nagrody w postaci jedzenia, a te, które nauczyły się zadania, przejdą niewzmocnioną niejednoznaczną próbę. W niejednoznacznym badaniu, ramię zapachowe zawiera doniczkę oznaczoną mieszanką pozytywnych i negatywnych sygnałów zapachowych bodźca dyskryminującego, co powoduje niejednoznaczny zapach, podczas gdy ramię bezzapachowe jest oznaczone tylko wodą destylowaną, jak zawsze.

Myszy ujawniają swoje uprzedzenia w ocenie w tym niejednoznacznym badaniu. Do przygotowania eksperymentalnego, za pomocą jednomililitrowej strzykawki lub mikropipety, dodaj miętę i ekstrakt waniliowy do oznaczonych probówek wirówkowych. Rozcieńczyć ekstrakty w stosunku 1:4 wodą destylowaną i kilkakrotnie wymieszać, odwracając.

Rób je codziennie i wielokrotnie odwracaj przed użyciem, aby upewnić się, że mieszanki są świeże i spójne. W przypadku mieszaniny o niejednoznacznym zapachu, po rozcieńczeniu esencji mięty i wanilii, dodaj równe objętości do probówki wirówkowej, aby uzyskać mieszaninę rozcieńczonych esencji w stosunku 1:1. Następnie, podczas wzmocnionych prób, w celu uzyskania pozytywnego zapachu bodźca dyskryminującego, umieść jeden kawałek karmy w niedostępnej komorze i zakop jeden kawałek chipsa bananowego w dostępnym obszarze doniczki.

W przypadku pojemnika na zapach negatywnego bodźca dyskryminacyjnego umieść jeden kawałek karmy i jeden kawałek chipsa bananowego w niedostępnej komorze. Następnie napełnij doniczkę trzema centymetrami ściółki z kolb kukurydzy. Żadne nagrody w postaci jedzenia nie będą dostępne w dostępnym obszarze tej puli.

W przypadku doniczek bezzapachowych umieść jeden kawałek chipsa bananowego w niedostępnej przegródce i zakop jeden kawałek karmy w dostępnym miejscu doniczki. Podczas wszystkich niewzmocnionych prób umieść jeden kawałek karmy i jeden kawałek chipsa bananowego w niedostępnej komorze. Następnie napełnij doniczkę trzema centymetrami ściółki z kolb kukurydzy.

Żadne nagrody w postaci jedzenia nie będą dostępne w dostępnym obszarze tej puli. Po napełnieniu doniczek za pomocą strzykawki lub mikropipety narysuj 100 mikrolitrów odpowiedniej mieszanki zapachowej lub wody destylowanej i wstrzyknij ją bezpośrednio na kolbę kukurydzy okrężnymi ruchami. Następnie, aby przygotować dozowniki zapachów, umieść jeden kawałek wacika w podstawie kasety na chusteczki.

Następnie za pomocą jednomililitrowej strzykawki lub mikropipety pobierz 100 mikrolitrów odpowiedniej mieszanki zapachowej lub wody destylowanej i wstrzyknij ją na kawałek bawełny. Przykryj kasetę na chusteczki pokrywką, aby zamknąć pachnącą bawełnę i stworzyć dozownik zapachu. Umieść garnki do kopania na końcach ramion areny, a dozowniki zapachów na początku każdego ramienia.

Włóż zdejmowane drzwiczki bezpośrednio przed szczelinami kasety, aby zablokować wejście do ramion areny i utworzyć komorę startową. Wykonuj wszystkie sesje treningowe i testowe pod czerwonym światłem podczas ciemnej i aktywnej fazy myszy. Pościj mysz przez godzinę w klatce przed każdym treningiem lub sesją testową, wyjmując jedzenie z zasobnika.

Pierwszego dnia treningu kopania umieść nagrody w postaci jedzenia na trzycentymetrowej ściółce z kolb kukurydzy, zamiast zakopywać je pod spodem. Stopniowo zakopuj nagrody głębiej pod kolbą kukurydzy przez następne cztery dni, aż znajdą się na dnie trzycentymetrowej ściółki do piątego dnia. Aby rozpocząć próby treningowe, przesuń mysz z klatki transportowej do komory startowej areny.

Zdejmij drzwi startowe, natychmiast opuść pokrywę z pleksiglasu nad arenę i uruchom pięciominutowy próbny stoper. Następnie zapisz opóźnienie do kopania jako czas, w którym obserwuje się pierwsze wystąpienie kopania, a opóźnienie do jedzenia jako czas, w którym obserwuje się pierwsze wystąpienie jedzenia. W przypadku treningu z dyskryminacją przeprowadź jedno badanie z wynikiem pozytywnym, a następnie jedno badanie z wynikiem negatywnym, wzmocnione w dniach od pierwszego do piątego.

W dniach od 6 do 10 pseudolosowo zrandomizuj kolejność prób, tak aby każda mysz przeszła dwie pozytywne i dwie negatywne próby dziennie. W fazie testowania należy codziennie przeprowadzać jedną pozytywną lub negatywną próbę testową bez wzmocnienia dla każdej myszy, aż zostaną spełnione kryteria uczenia. Każdego dnia wykonuj jedną pozytywną i jedną negatywną wzmocnioną próbę w randomizowanej kolejności przed próbą testową nagraną wideo oraz kolejną pozytywną i ujemną wzmocnioną próbę po próbie testowej.

Upewnij się, że badania z wynikiem dodatnim i ujemnym są przeprowadzane naprzemiennie przez kilka dni. Aby przeprowadzić nagraną na wideo próbę testową bez wzmocnienia, przenieś mysz z klatki transportowej do komory startowej areny. Następnie ustaw kamerę wideo na statywie tak, aby oba garnki na końcach ramion były w view i rozpocznij nagrywanie.

Upewnij się, że podczas oceniania wideo nagrałeś kartę cue z kodem ślepym myszy i typem próby. Zdejmij drzwi startowe, natychmiast opuść pokrywę z pleksiglasu nad areną i rozpocznij dwuminutowy odliczacz próby. Po przetestowaniu włóż mysz z powrotem do klatki transportowej.

Oceń filmy z badań klinicznych z pozytywnym i negatywnym wynikiem testu w dniu testu, aby ocenić, czy myszy spełniły kryteria uczenia się. Upewnij się, że ocena wideo jest dostępna tego samego dnia, ponieważ zwierzęta, które spełniają kryteria uczenia się, następnego dnia przejdą niejednoznaczne testy. Korzystając z oprogramowania do nagrywania zdarzeń lub stopera, pozwól badaczowi, który jest ślepy na leczenie, zarejestrować opóźnienie każdej myszy do kopania i czas kopania w każdej doniczce podczas pierwszej minuty pozytywnych i negatywnych prób testowych.

Rejestruj opóźnienie kopania jako czas, w którym obserwuje się pierwsze wystąpienie kopania, a czas trwania kopania jako całkowity czas, jaki mysz spędza na kopaniu. Porównaj czas kopania w pachnącej doniczce między próbami pozytywnymi i negatywnymi, aby określić, czy myszy mogą rozróżnić zadanie. Kryteria uczenia się są spełnione, jeśli czas kopania w doniczce o pozytywnym zapachu bodźca dyskryminującego jest co najmniej dwukrotnie dłuższy niż w doniczce o zapachu bodźca negatywnego w ciągu pierwszej minuty testowania.

W przypadku myszy, które spełniły kryteria uczenia się, przetestuj reakcje na niejednoznaczną mieszaninę zapachów. Wykonaj jedno dodatnie i jedno ujemne wzmocnione badanie w randomizowanej kolejności. Następnie wykonaj jedną próbę testową nagraną na wideo z użyciem niejednoznacznej mieszaniny zapachów.

Na potrzeby analizy danych należy wykreślić średnie opóźnienia metodą najmniejszych kwadratów w każdym typie próby, aby potwierdzić, że przedstawiona niejednoznaczna wskazówka została zinterpretowana jako pośrednia. Oceniając błąd systematyczny w ocenie zarówno w jednej, jak i dwóch minutach testu, typ próby oparty na pozytywnej dyskryminacyjnej interakcji bodziec-zapach był istotny. Ujawnia to, że myszy z miętą jako pozytywnym bodźcem dyskryminacyjnym nieoczekiwanie zinterpretowały niejednoznaczne mieszanki zapachowe jako pozytywne, podczas gdy myszy z wanilią jako pozytywnym bodźcem dyskryminacyjnym traktowały te same niejednoznaczne mieszanki zapachowe jako pośrednie.

Odkrycie to wskazuje, że tylko myszy, których naturalnym bodźcem dyskryminującym była wanilia, spełniały techniczny wymóg traktowania mieszaniny zapachowej jako produktu pośredniego między pozytywnym a negatywnym bodźcem dyskryminującym. W ten sposób myszy, których pozytywnym bodźcem dyskryminacyjnym była mięta, zostały wykluczone z późniejszych analiz błędów osądu. U myszy, u których wanilia była pozytywnym bodźcem dyskryminacyjnym, pomieszczenia wpłynęły na opóźnienia kopania, przy czym zwierzęta trzymane konwencjonalnie wolniej kopały w niejednoznacznych próbach niż myszy wzbogacone środowiskowo, ale nie w próbach pozytywnych lub negatywnych.

Te pesymistyczne interpretacje niejednoznacznych wskazówek przez myszy trzymane w konwencjonalnych warunkach odzwierciedlają negatywne błędy oceny wskazujące na negatywny afekt. Podczas wykonywania tego protokołu ważne jest, aby spełnione były kryteria techniczne. Myszy powinny spełniać kryterium uczenia się, pokazujące, że są w stanie rozróżniać wskazówki i interpretować niejednoznaczne wskazówki jako pośrednie.

Opracowanie tego nowego zadania dotyczącego błędu osądu otwiera drzwi do przetestowania ważnych hipotez dotyczących stanów afektywnych myszy, zarówno z korzyścią dla dobrostanu zwierząt, jak i implikacjami klinicznymi.