Name: Optyczne oczyszczanie tkanek roślinnych do obrazowania fluorescencyjnego (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-01-05T15:00:00.000+00:00
Duration: 4 min 55 s
Description: Poznaj metodę optycznego oczyszczania tkanek roślinnych do obrazowania fluorescencyjnego bez konieczności fizycznego cięcia. Technika ta umożliwia głębokie obrazowanie struktur roślinnych i badanie wzorców ekspresji genów w Arabidopsis thaliana.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez Japońskie Towarzystwo Promocji Nauki (Grant-in-Aid for Scientific Research on Innovative Areas (JP16H06464, JP16H06280 T.H.), Grant-in-Aid for Scientific Research (B, JP17H03697 do D.K.), Grant-in-Aid for Challenging Exploratory Research (JP18K19331 do D.K.), Grant-in-Aid for Scientific Research on Innovative Areas (JP20H05358 dla D.K.)) oraz Japońską Agencję Nauki i Technologii (program PRESTO (JPMJPR15QC do Y.M., JPMJPR18K4 do D.K.)). Autorzy są wdzięczni Centrum Obrazowania na Żywo w Instytucie Transformacyjnych Bio-Molekuł (WPI-ITbM) Uniwersytetu w Nagoi za wsparcie badań mikroskopowych i Editage (www.editage.com) do edycji w języku angielskim.

1. Przygotowanie roztworów przejrzystości
<ol>
	<li>Aby przygotować roztwór CS, rozpuścić 10% (w/v) ksylitolu, 15% (w/v) deoksycholan sodu oraz 25% (w/v) mocznika w wodzie destylowanej przy użyciu mieszadła magnetycznego. 
	UWAGA: Proszek deoksycholan sodu należy odważyć w komorze ciągu, ponieważ łatwo unosi się w powietrzu. Roztwór CS można przechowywać w temperaturze pokojowej, w ciemności, przez ponad rok.</li>
	<li>Aby przygotować roztwór CSA, dodać siarczyn sodu (stężenie końcowe 50 mM) do otrzymanego powyżej roztworu CS. 
	​UWAGA: Siarczyn sodu należy dodać do roztworu CS bezpośrednio przed użyciem, ponieważ czynnik redukujący łatwo ulega dezaktywacji.</li>
</ol>
2. Przygotowanie roztworu utrwalającego
<ol>
	<li>Przenieś 40 mL sterylnej wody do probówki stożkowej i dodaj 2 g paraformaldehydu. Dodaj 200 µL 2 N NaOH, aby zwiększyć pH roztworu. Po zamknięciu i uszczelnieniu probówki parafilmem, inkubuj w temperaturze 60 °C, sporadycznie odwracając probówkę, aż do całkowitego rozpuszczenia substancji.</li>
	<li>Po ochłodzeniu roztworu do temperatury pokojowej dodaj 5 mL 10x soli fizjologicznej w buforze fosforanowym (PBS), aby dostosować pH do 7,4. Dopełnij objętość do 50 mL sterylną wodą. 
	UWAGA: Zaleca się stosowanie świeżo przygotowanego roztworu utrwalającego. Roztwór można również przechowywać w temperaturze -30 °C przez kilka miesięcy.</li>
</ol>
3. Fixacja próbek
<ol>
	<li>Zanurz próbki roślinne w roztworze utrwalającym w mikroprobówce (Rysunek 1A), upewniając się, że objętość roztworu utrwalającego jest ponad pięciokrotnie większa od objętości próbki.</li>
	<li>Uszczelnij mikroprobówkę parafimem i wykonaj otwory za pomocą igły. Nie pozostawiaj probówki otwartej ze względu na ryzyko rozlania próbki podczas dekompresji próżniowej.</li>
	<li>Umieść mikroprobówkę w eksykatorze i powoli dostosuj stopień próżni (~690 mmHg), tak aby z próbek stopniowo wydostawały się pęcherzyki powietrza (Rysunek 1B-C). Wyłącz pompę próżniową po odpompowaniu powietrza z eksykatora. Pozostaw mikroprobówkę w spokoju na 30 min w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Ostrożnie wypuść powietrze z eksykatora, aby nie poruszyć próbek. Ponownie włącz pompę próżniową i wyłącz ją po odpompowaniu powietrza z eksykatora. Pozostaw mikroprobówkę w spokoju na 30 min w temperaturze pokojowej. 
	UWAGA: Należy zachować ostrożność, aby nie uszkodzić próbek podczas wypuszczania powietrza z eksykatora. Penetracja roztworu utrwalającego do wnętrza próbek jest zwiększana przez dwukrotne poddanie działaniu próżni. Dalsza obróbka próżniowa pomaga w przenikaniu roztworu utrwalającego do grubszych próbek.</li>
	<li>Ostrożnie otwórz eksykator, unikając gwałtownego wzburzenia roztworu utrwalającego w mikroprobówce. Za pomocą mikropipety usuń roztwór utrwalający i dodaj 1x PBS. Po odczekaniu 1 min wymień stary PBS na nowy 1x PBS (Rysunek 1D).</li>
</ol>
4. Przejaśnianie
<ol>
	<li>Po usunięciu PBS dodać pięciokrotność objętości próbki roztworu do klarowania.</li>
	<li>Uszczelnić mikroprobówkę parafilmem i wykonać otwory za pomocą igły. Umieścić próbki w eksykatorze, odessać powietrze zgodnie z krokiem 3.3, a następnie wyłączyć pompę próżniową. Pozostawić mikroprobówkę bez poruszania przez 60 min w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Ostrożnie otworzyć eksykator. Zamknąć mikroprobówkę parafilmem i przechowywać w temperaturze pokojowej w ciemności, aby uniknąć fotoblaknięcia białek fluorescencyjnych. Odwracać mikroprobówkę co 1-2 dni, aby przyspieszyć proces klarowania.</li>
	<li>Gdy roztwór do klarowania zmieni kolor na zielony, wymieniać go na nowy roztwór do klarowania do momentu, aż roztwór pozostanie bezbarwny (Rycina 1E-H).</li>
</ol>
<img alt="Proces ekstrakcji próbek tkanek roślinnych w probówkach do mikrocentryfugi, etapy eksperymentu krok po kroku." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63428/63428fig01.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1: Procedura obróbki CS. (A) Siewka Arabidopsis w 4% roztworze PFA (paraformaldehydu). (B) Próbka zostaje umieszczona w eksyكاتهrze. (C) Siewka jest utrwalana w próżni. (D) Siewka jest moczona w roztworze PFA po obróbce próżniowej. (E) Siewka po 3 dniach traktowania roztworem przejaśniającym. Zwróć uwagę na zielony kolor roztworu przejaśniającego. (F) Roztwór przejaśniający zostaje wymieniony 3 dni po obróbce. (G) Siewka po 5 dniach traktowania roztworem przejaśniającym. (H) Roztwór przejaśniający zostaje wymieniony 5 dni po obróbce. Paski skali: 1 cm (A,C-H) oraz 5 cm (B). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63428/63428fig01large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.</a>
5. Barwienie barwnikami chemicznymi
<ol>
	<li>Do mikroprobówki dodać Hoechst 33342 (stężenie końcowe 10 µg/mL) do barwienia jąder komórkowych lub Calcofluor White (stężenie końcowe 1 mg/mL) do barwienia ścian komórkowych i inkubować przez 1 h. Po usunięciu roztworu barwiącego przemyć próbkę świeżym roztworem przejrzystym przez 1 h. 
	UWAGA: Barwienie i płukanie przez noc mogą poprawić penetrację barwnika fluorescencyjnego do tkanek i zmniejszyć fluorescencję tła. Różne barwniki fluorescencyjne są kompatybilne z roztworem CS, takie jak fuksyna zasadowa9 (lignina), Auramine O9 (lignina, suberyna i kutyna), Nile Red9 (suberyna), Direct Yellow 969, Direct Red 239 oraz SR220010,11 (ściany komórkowe).</li>
</ol>
6. Obserwacja
<ol>
	<li>Wytnij z arkusza gumy silikonowej za pomocą żyletki ramkę, która będzie służyć jako dystans (Rysunek 2A). 
	UWAGA: Dobierz grubość arkusza gumy silikonowej do grubości próbki. Próbki poddane działaniu roztworu przejrzystością są miękkie i mogą ulec uszkodzeniu, jeśli zostaną bezpośrednio przykryte szkiełkiem nakrywką.</li>
	<li>Umieść silikonową ramkę na szkiełku nakrywce (np. 25 x 60 mm) (Rysunek 2B). Umieść przetworzone próbki wewnątrz ramki i dodaj ~100 µL roztworu przejrzystością, aby usunąć pęcherzyki powietrza z wnętrza ramki. Przykryj całość kolejnym szkiełkiem nakrywką (18 x 18 mm lub 24 x 24 mm), aby zapobiec odparowywaniu roztworu przejrzystością (Rysunek 2C).</li>
	<li>Obserwuj próbki pod mikroskopem fluorescencyjnym. Po obserwacji przenieś próbki z powrotem do roztworu przejrzystością w probówce typu microtube i przechowuj w temperaturze pokojowej, w ciemności.</li>
</ol>
<img alt="Schemat procesu wykonania; krok po kroku montaż komponentów urządzenia mikroprzepływowego." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63428/63428fig02.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rycina 2"> 
Rycina 2: Przygotowanie próbki do obserwacji mikroskopowych. (A) Wycięcie ramki z arkusza silikonu o grubości 0.2 mm. (B) Umieszczenie ramki z arkusza silikonu na szkiełku nakrywkowym. (C) Umieszczenie próbki poddanej działaniu roztworu klarującego (oznaczonej przerywaną linią) wewnątrz ramki i przykrycie jej szkiełkiem nakrywkowym. Paski skali: 5 mm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63428/63428fig02large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>

<ol><li>Vogelmann, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Light+within+the+plant%5BTitle%5D)+AND+%22Photomorphogenesis+in+Plants%22%5BJournal%5D)">Light within the plant.</a> Photomorphogenesis in Plants. , 491-535 (1994).</li>
<li>Krause, G. H., Weis, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chlorophyll+fluorescence+and+photosynthesis%3A+The+basics%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Plant+Physiology+and+Plant+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Chlorophyll fluorescence and photosynthesis: The basics.</a> Annual Review of Plant Physiology and Plant Molecular Biology. 42 (1), 313-349 (1991).</li>
<li>Pourcel, L., Routaboul, J., Cheynier, V., Lepiniec, L., Debeaujon, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flavonoid+oxidation+in+plants%3A+from+biochemical+properties+to+physiological+functions%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Plant+Science%22%5BJournal%5D)">Flavonoid oxidation in plants: from biochemical properties to physiological functions.</a> Trends in Plant Science. 12 (1), 29-36 (2007).</li>
<li>Lersten, N. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+annotated+bibliography+of+botanical+clearing+methods%5BTitle%5D)+AND+%22Iowa+State+Journal+of+Science%22%5BJournal%5D)">An annotated bibliography of botanical clearing methods.</a> Iowa State Journal of Science. 41 (4), 481-486 (1967).</li>
<li>Villani, T. S., Koroch, A. R., Simon, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+improved+clearing+and+mounting+solution+to+replace+chloral+hydrate+in+microscopic+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Applications+in+Plant+Sciences%22%5BJournal%5D)">An improved clearing and mounting solution to replace chloral hydrate in microscopic applications.</a> Applications in Plant Sciences. 1 (5), 1300016(2013).</li>
<li>Becker, K., Jährling, N., Saghafi, S., Weiler, R., Dodt, H. -U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemical+clearing+and+dehydration+of+GFP+expressing+mouse+brains%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Chemical clearing and dehydration of GFP expressing mouse brains.</a> PLoS ONE. 7 (3), 33916(2012).</li>
<li>Kurihara, D., Mizuta, Y., Sato, Y., Higashiyama, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ClearSee%3A+a+rapid+optical+clearing+reagent+for+whole-plant+fluorescence+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">ClearSee: a rapid optical clearing reagent for whole-plant fluorescence imaging.</a> Development. 142 (23), 4168-4179 (2015).</li>
<li>Kurihara, D., Mizuta, Y., Nagahara, S., Higashiyama, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ClearSeeAlpha%3A+advanced+optical+clearing+for+whole-plant+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+and+Cell+Physiology%22%5BJournal%5D)">ClearSeeAlpha: advanced optical clearing for whole-plant imaging.</a> Plant and Cell Physiology. 62 (8), 1302-1310 (2021).</li>
<li>Ursache, R., Andersen, T. G., Marhavý, P., Geldner, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+protocol+for+combining+fluorescent+proteins+with+histological+stains+for+diverse+cell+wall+components%5BTitle%5D)+AND+%22The+Plant+Journal%22%5BJournal%5D)">A protocol for combining fluorescent proteins with histological stains for diverse cell wall components.</a> The Plant Journal. 93 (2), 399-412 (2018).</li>
<li>Tofanelli, R., Vijayan, A., Scholz, S., Schneitz, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protocol+for+rapid+clearing+and+staining+of+fixed+Arabidopsis+ovules+for+improved+imaging+by+confocal+laser+scanning+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Methods%22%5BJournal%5D)">Protocol for rapid clearing and staining of fixed Arabidopsis ovules for improved imaging by confocal laser scanning microscopy.</a> Plant Methods. 15 (1), 120(2019).</li>
<li>Vijayan, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+digital+3D+reference+atlas+reveals+cellular+growth+patterns+shaping+the+Arabidopsis+ovule%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">A digital 3D reference atlas reveals cellular growth patterns shaping the Arabidopsis ovule.</a> eLife. 10, 1-38 (2021).</li>
<li>Müller, S. M., Galliardt, H., Schneider, J., George Barisas, B., Seidel, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantification+of+F%C3%B6rster+resonance+energy+transfer+by+monitoring+sensitized+emission+in+living+plant+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Plant+Science%22%5BJournal%5D)">Quantification of Förster resonance energy transfer by monitoring sensitized emission in living plant cells.</a> Frontiers in Plant Science. 4, 1-20 (2013).</li>
<li>Mizuta, Y., Kurihara, D., Higashiyama, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-photon+imaging+with+longer+wavelength+excitation+in+intact+Arabidopsis+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Protoplasma%22%5BJournal%5D)">Two-photon imaging with longer wavelength excitation in intact Arabidopsis tissues.</a> Protoplasma. 252, 1231-1240 (2015).</li>
<li>Littlejohn, G. R., Gouveia, J. D., Edner, C., Smirnoff, N., Love, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Perfluorodecalin+enhances+in+vivo+confocal+microscopy+resolution+of+Arabidopsis+thaliana+mesophyll%5BTitle%5D)+AND+%22New+Phytologist%22%5BJournal%5D)">Perfluorodecalin enhances in vivo confocal microscopy resolution of Arabidopsis thaliana mesophyll.</a> New Phytologist. 186 (4), 1018-1025 (2010).</li>
<li>Warner, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+optical+clearing+technique+for+plant+tissues+allowing+deep+imaging+and+compatible+with+fluorescence+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiology%22%5BJournal%5D)">An optical clearing technique for plant tissues allowing deep imaging and compatible with fluorescence microscopy.</a> Plant Physiology. 166 (4), 1684-1687 (2014).</li>
<li>Hasegawa, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+imaging+of+plant+organs+using+a+simple+and+rapid+transparency+technique%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+and+Cell+Physiology%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional imaging of plant organs using a simple and rapid transparency technique.</a> Plant and Cell Physiology. 57 (3), 462-472 (2016).</li>
<li>Musielak, T. J., Slane, D., Liebig, C., Bayer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+versatile+optical+clearing+protocol+for+deep+tissue+imaging+of+fluorescent+proteins+in+Arabidopsis+thaliana%5BTitle%5D)+AND+%22PLOS+ONE%22%5BJournal%5D)">A versatile optical clearing protocol for deep tissue imaging of fluorescent proteins in Arabidopsis thaliana.</a> PLOS ONE. 11 (8), 0161107(2016).</li>
<li>Sakamoto, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+clearing+method+contributes+to+deep+imaging+of+plant+organs%5BTitle%5D)+AND+%22Research+Square%22%5BJournal%5D)">Improved clearing method contributes to deep imaging of plant organs.</a> Research Square. , (2021).</li>
<li>Tanaka, E., Ono, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole-leaf+fluorescence+imaging+to+visualize+in+planta+fungal+structures+of+Victory+onion+leaf+rust+fungus%2C+Uromyces+japonicus%2C+and+its+taxonomic+evaluation%5BTitle%5D)+AND+%22Mycoscience%22%5BJournal%5D)">Whole-leaf fluorescence imaging to visualize in planta fungal structures of Victory onion leaf rust fungus, Uromyces japonicus, and its taxonomic evaluation.</a> Mycoscience. 59 (2), 137-146 (2018).</li>
<li>Ohtsu, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatiotemporal+deep+imaging+of+syncytium+induced+by+the+soybean+cyst+nematode+Heterodera+glycines%5BTitle%5D)+AND+%22Protoplasma%22%5BJournal%5D)">Spatiotemporal deep imaging of syncytium induced by the soybean cyst nematode Heterodera glycines.</a> Protoplasma. 254, 2107-2115 (2017).</li>
<li>Duman, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Short+de-etiolation+increases+the+rooting+of+VC801+Avocado+rootstock%5BTitle%5D)+AND+%22Plants%22%5BJournal%5D)">Short de-etiolation increases the rooting of VC801 Avocado rootstock.</a> Plants. 9 (11), 1481(2020).</li>
<li>Ho, W. W. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrative+multi-omics+analyses+of+barley+rootzones+under+salinity+stress+reveal+two+distinctive+salt+tolerance+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Communications%22%5BJournal%5D)">Integrative multi-omics analyses of barley rootzones under salinity stress reveal two distinctive salt tolerance mechanisms.</a> Plant Communications. 1 (3), 100031(2020).</li>
<li>Arsovski, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BrphyB+is+critical+for+rapid+recovery+to+darkness+in+mature+Brassica+rapa+leaves%5BTitle%5D)+AND+%22bioRxiv%22%5BJournal%5D)">BrphyB is critical for rapid recovery to darkness in mature Brassica rapa leaves.</a> bioRxiv. , (2020).</li>
<li>Doll, Y., Koga, H., Tsukaya, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+diversity+of+stomatal+development+regulation+in+Callitriche+is+related+to+the+intrageneric+diversity+in+lifestyles%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">The diversity of stomatal development regulation in Callitriche is related to the intrageneric diversity in lifestyles.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 118 (14), (2021).</li>
<li>Eliyahu, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vegetative+propagation+of+elite+Eucalyptus+clones+as+food+source+for+honeybees+%28Apis+mellifera%29%3B+adventitious+roots+versus+callus+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Israel+Journal+of+Plant+Sciences%22%5BJournal%5D)">Vegetative propagation of elite Eucalyptus clones as food source for honeybees (Apis mellifera); adventitious roots versus callus formation.</a> Israel Journal of Plant Sciences. 67 (1-2), 83-97 (2020).</li>
<li>Kelliher, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MATRILINEAL%2C+a+sperm-specific+phospholipase%2C+triggers+maize+haploid+induction%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">MATRILINEAL, a sperm-specific phospholipase, triggers maize haploid induction.</a> Nature. 542, 105-109 (2017).</li>
<li>Aki, S. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytokinin+signaling+is+essential+for+organ+formation+in+Marchantia+polymorpha%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+and+Cell+Physiology%22%5BJournal%5D)">Cytokinin signaling is essential for organ formation in Marchantia polymorpha.</a> Plant and Cell Physiology. 60 (8), 1842-1854 (2019).</li>
<li>Kinoshita, A., Koga, H., Tsukaya, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+profiles+of+ANGUSTIFOLIA3+and+SHOOT+MERISTEMLESS%2C+key+genes+for+meristematic+activity+in+a+one-leaf+plant+Monophyllaea+glabra%2C+revealed+by+whole-mount+in+situ+hybridization%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Plant+Science%22%5BJournal%5D)">Expression profiles of ANGUSTIFOLIA3 and SHOOT MERISTEMLESS, key genes for meristematic activity in a one-leaf plant Monophyllaea glabra, revealed by whole-mount in situ hybridization.</a> Frontiers in Plant Science. 11, 1-11 (2020).</li>
<li>Okazawa, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Localization+of+planteose+hydrolysis+during+seed+germination+of+Orobanche+minor%5BTitle%5D)+AND+%22bioRxiv%22%5BJournal%5D)">Localization of planteose hydrolysis during seed germination of Orobanche minor.</a> bioRxiv. , 448768(2021).</li>
<li>Chen, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((VAPYRIN+attenuates+defence+by+repressing+PR+gene+induction+and+localized+lignin+accumulation+during+arbuscular+mycorrhizal+symbiosis+of+Petunia+hybrida%5BTitle%5D)+AND+%22New+Phytologist%22%5BJournal%5D)">VAPYRIN attenuates defence by repressing PR gene induction and localized lignin accumulation during arbuscular mycorrhizal symbiosis of Petunia hybrida.</a> New Phytologist. 229 (6), 3481-3496 (2021).</li>
<li>Chu, T. T. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sub-cellular+markers+highlight+intracellular+dynamics+of+membrane+proteins+in+response+to+abiotic+treatments+in+rice%5BTitle%5D)+AND+%22Rice%22%5BJournal%5D)">Sub-cellular markers highlight intracellular dynamics of membrane proteins in response to abiotic treatments in rice.</a> Rice. 11, 23(2018).</li>
<li>Alaguero-Cordovilla, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+auxin-mediated+regulatory+framework+for+wound-induced+adventitious+root+formation+in+tomato+shoot+explants%5BTitle%5D)+AND+%22Plant%2C+Cell+%26+Environment%22%5BJournal%5D)">An auxin-mediated regulatory framework for wound-induced adventitious root formation in tomato shoot explants.</a> Plant, Cell & Environment. 44 (5), 1642-1662 (2021).</li>
<li>Okuda, A., Matsusaki, M., Masuda, T., Urade, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+and+characterization+of+GmPDIL7%2C+a+soybean+ER+membrane-bound+protein+disulfide+isomerase+family+protein%5BTitle%5D)+AND+%22The+FEBS+Journal%22%5BJournal%5D)">Identification and characterization of GmPDIL7, a soybean ER membrane-bound protein disulfide isomerase family protein.</a> The FEBS Journal. 284 (3), 414-428 (2017).</li>
<li>Kim, D. -R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+mutualistic+interaction+between+Streptomyces+bacteria%2C+strawberry+plants+and+pollinating+bees%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">A mutualistic interaction between Streptomyces bacteria, strawberry plants and pollinating bees.</a> Nature Communications. 10 (1), 4802(2019).</li>
<li>Wu, J., Mock, H. -P., Giehl, R. F. H., Pitann, B., Mühling, K. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Silicon+decreases+cadmium+concentrations+by+modulating+root+endodermal+suberin+development+in+wheat+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Hazardous+Materials%22%5BJournal%5D)">Silicon decreases cadmium concentrations by modulating root endodermal suberin development in wheat plants.</a> Journal of Hazardous Materials. 364, 581-590 (2019).</li>
<li>Isoda, M., Oyama, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+a+duckweed+species%2C+Wolffiella+hyalina%2C+for+whole-plant+observation+of+physiological+behavior+at+the+single-cell+level%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Use of a duckweed species, Wolffiella hyalina, for whole-plant observation of physiological behavior at the single-cell level.</a> Plant Biotechnology. 35 (4), 387-391 (2018).</li>
<li>Ben-Targem, M., Ripper, D., Bayer, M., Ragni, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Auxin+and+gibberellin+signaling+cross-talk+promotes+hypocotyl+xylem+expansion+and+cambium+homeostasis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Botany%22%5BJournal%5D)">Auxin and gibberellin signaling cross-talk promotes hypocotyl xylem expansion and cambium homeostasis.</a> Journal of Experimental Botany. 72 (10), 3647-3660 (2021).</li>
<li>Shwartz, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+VIL+gene+CRAWLING+ELEPHANT+controls+maturation+and+differentiation+in+tomato+via+polycomb+silencing%5BTitle%5D)+AND+%22bioRxiv%22%5BJournal%5D)">The VIL gene CRAWLING ELEPHANT controls maturation and differentiation in tomato via polycomb silencing.</a> bioRxiv. , (2021).</li>
<li>Levin, K. A., Tucker, M. R., Strock, C. F., Lynch, J. P., Mather, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+imaging+reveals+that+positions+of+cyst+nematode+feeding+sites+relative+to+xylem+vessels+differ+between+susceptible+and+resistant+wheat%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional imaging reveals that positions of cyst nematode feeding sites relative to xylem vessels differ between susceptible and resistant wheat.</a> Plant Cell Reports. 40 (2), 393-403 (2021).</li>
<li>Nouri, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phosphate+suppression+of+arbuscular+mycorrhizal+symbiosis+involves+gibberellic+acid+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+and+Cell+Physiology%22%5BJournal%5D)">Phosphate suppression of arbuscular mycorrhizal symbiosis involves gibberellic acid signaling.</a> Plant and Cell Physiology. 62 (6), 959-970 (2021).</li>
<li>Evangelisti, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Artificial+intelligence+enables+the+identification+and+quantification+of+arbuscular+mycorrhizal+fungi+in+plant+roots%5BTitle%5D)+AND+%22bioRxiv%22%5BJournal%5D)">Artificial intelligence enables the identification and quantification of arbuscular mycorrhizal fungi in plant roots.</a> bioRxiv. , 434067(2021).</li>
</ol>

ClearSee zostaje skomercjalizowany (Fujifilm Wako Pure Chemical Corporation, Japonia). Uniwersytet w Nagoi posiada patent (JP6601842) na odczynnik clearingowy ClearSee. Wynalazcą patentu jest D. Kurihara. Autorzy deklarują brak sprzecznych interesów finansowych.

Ta metoda polega na utrwalaniu, myciu i czyszczeniu. Fiksacja jest krytycznym krokiem w tym protokole. Jeśli białko fluorescencyjne nie zostanie zaobserwowane po związaniu PFA, nie będzie ono obserwowane po leczeniu roztworem klarującym. Przenikanie roztworu PFA do tkanek ma kluczowe znaczenie, ale obróbka w wysokiej próżni nie jest zalecana, ponieważ może zniszczyć strukturę komórkową. Warunki próżni i okresy utrwalania powinny być zoptymalizowane dla każdego rodzaju tkanki i gatunku. Zaleca się sprawdzanie białek fluorescencyjnych nawet po utrwaleniu. Chociaż próbki były zwykle utrwalane przez 30-60 minut w temperaturze pokojowej, można je utrwalić w temperaturze 4 °C przez dłuższy czas (przez noc lub dłużej).
Jak pokazano na rysunku 6A, niektóre deoksycholany sodu miały bladożółty kolor po rozpuszczeniu. Takie roztwory deoksycholanu sodu wykazywały silną autofluorescencję w obszarze 400-600 nm po wzbudzeniu przy 380 nm (ryc. 6B). Ta autofluorescencja zapobiega oczyszczaniu optycznemu i obrazowaniu fluorescencyjnemu. Użytkownicy powinni sprawdzić kolor roztworu deoksycholanu sodu, ponieważ jakość odczynnika może się różnić ze względu na czystość, różnice między partiami lub z innych powodów.
Zastosowane tutaj roztwory oczyszczające mają wysokie stężenia deoksycholanu sodu, który może zniszczyć strukturę błony. Marker błony komórkowej (RPS5Apro::tdTomato-LTI6b) obserwowano nawet po leczeniu CS7. Jednak lepszym rozwiązaniem może być zmniejszenie stężenia deoksycholanu sodu, w zależności od struktury i tkanki będącej przedmiotem zainteresowania. Rzeczywiście, obrazy o lepszej klarowności uzyskano dla słupków Arabidopsis ze zmodyfikowanym CS, w których stężenie deoksycholanu sodu jest zmniejszone o połowę; jednak zmniejszone stężenia deoksycholanu sodu wymagały wydłużenia czasu leczenia (np. 1 miesiąc w przypadku słupków Arabidopsis ).
CS może redukować czerwoną autofluorescencję (>610 nm) w celu usunięcia chlorofilu z próbek poddanych działaniu substancji. Jednak autofluorescencja w zakresie 500-600 nm (od żółtego do pomarańczowego) utrzymywała się nawet w próbkach poddanych działaniu CS7. Uważa się, że ta autofluorescencja pochodzi ze ściany komórkowej i innych składników komórkowych, takich jak lignina 12,13. Dlatego trudno jest sprawić, by tkanki, takie jak łodygi z rozwiniętymi ściankami wtórnymi, były całkowicie przezroczyste przez leczenie CS.
Kilka odczynników czyszczących, oprócz tych zastosowanych tutaj, zostało opracowanych do obserwacji białek fluorescencyjnych w roślinach za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej 14,15,16,17. W porównaniu z tymi metodami, CS i CSA usuwają chlorofil i zmniejszają autofluorescencję, dzięki czemu tkanki roślinne są bardziej przezroczyste. Niedawno Sakamoto i in. opracowali ulepszoną metodę, iTOMEI, do utrwalania, czyszczenia detergentu i montażu w celu regulacji niedopasowania współczynnika załamania światła18. W przypadku siewek rzodkiewnika iTOMEI usunął tkankę w ciągu 26 godzin.
CS ma zastosowanie do szerokiej gamy gatunków roślin, takich jak Arabidopsis thaliana, Physcomitrium patens7, Chrysanthemum morifolium, Cucumis sativus, Nicotiana benthamiana, Nicotiana tabacum, Torenia fournieri8, Allium ochotense19, Astragalus sinicus20, awokado21, jęczmień22, Brassica rapa23, Callitriche24, Eucalyptus25, kukurydza26, Marchantia polymorpha27, Monophyllaea glabra28, Orobanche minor29, petunia30, ryż31, Solanum lycopersicum32, soja33, truskawka34, pszenica35 i Wolffiella hyalina36. W przypadku grubszych tkanek CS może również sprawić, że sekcje wibratomu będą przezroczyste37,38. Metoda ta pozwoliła na badanie struktury komórkowej i wzorców ekspresji genów u roślin37,38. Co więcej, infekcje nicieniami20,39, infekcje grzybicze i symbioza 19,40,41 obserwowano również głęboko w tkankach traktowanych CS. W związku z tym metoda ta jest przydatna do obrazowania całych tkanek w skali od mikro do makro i może pomóc w odkryciu nowych interakcji między różnymi komórkami, tkankami, narządami i organizmami.

Wizualizacja struktur komórkowych i lokalizacji białek w organizmach żywych jest ważna dla wyjaśnienia ich funkcji in vivo. Ponieważ jednak żywy organizm nie jest przezroczysty, trudno jest obserwować wewnętrzną strukturę organizmów żywych bez sekcji. Szczególnie w przypadku tkanek roślinnych, które są wielowarstwowe z komórkami o różnych kształtach, problematyczne jest niedopasowanie indeksu spowodowane ich budową i obecnością pigmentów pochłaniających światło. Na przykład liście roślin mają złożoną strukturę, która pozwala im efektywnie wykorzystywać światło, które dostaje się do ich ciał do fotosyntezy1, podczas gdy struktura powoduje również niedopasowanie współczynnika załamania światła, co utrudnia ich obserwację. Jednak liście mają wiele pigmentów pochłaniających światło, takich jak chlorofil, który emituje silną czerwoną fluorescencję, a brązowawe pigmenty są wytwarzane przez utlenianie2,3. Pigmenty te utrudniają również obserwacje mikroskopii fluorescencyjnej w całej górze u roślin. Dlatego do obserwacji wewnętrznej struktury roślin, od dawna stosuje się odbarwianie i utrwalanie alkoholem oraz oczyszczanie za pomocą hydratu chloralu w celu wyeliminowania niedopasowania współczynnika załamania światła i autofluorescencji4,5. Te konwencjonalne metody są stosowane od wielu lat, ale mają tę wadę, że jednocześnie eliminują fluorescencję białek fluorescencyjnych6,7. Jest to problematyczne, ponieważ białka fluorescencyjne stały się niezbędne w obecnym obrazowaniu fluorescencyjnym.
Dlatego ClearSee (CS) i ClearSeeAlpha (CSA) zostały opracowane jako odczynniki do optycznego czyszczenia tkanek roślinnych. Oba odczynniki redukują autofluorescencję chlorofilu, zachowując jednocześnie stabilność białek fluorescencyjnych7,8. CSA jest szczególnie przydatny, gdy brązowe pigmenty są wytwarzane w wyniku utleniania tkanek. Za pomocą tych odczynników czyszczących można obserwować strukturę komórkową i lokalizację białek w ciele rośliny bez fizycznego cięcia.

<table><tbody><tr><td>Calcofluor White</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F3543</td><td>Rozjaśniacz fluorescencyjny 28; 100 mg/ml w H2O</td></tr><tr><td>ClearSee</td><td></td><td></td><td>10% (w/v) ksylitol, 15% (w/v) deoksycholan sodu, 25% (w/v) mocznik</td></tr><tr><td>Szkło nakrywkowe (18 razy; 18 No.1)</td> <td>MATSUNAMI</td><td>C018181</td><td></td></tr><tr><td>Szkło nakrywkowe (24 razy; 24 No.1)</td><td>MATSUNAMI</td><td>C024241</td><td></td></tr><tr><td>Szkło nakrywkowe (25&razy; 60 No.1)</td> <td>MATSUNAMI</td><td>C025601</td><td></td></tr><tr><td>Eksykator</td><td>AS One</td><td>1-5801-11</td><td></td></tr><tr><td>Hoechst 33342</td><td>DOJINDO</td><td>346-07951</td><td>1 mg / ml w igle H2O</td></tr><tr><td></td><td>TERUMO</td><td>NN-2238S</td><td></td></tr><tr><td>Parafilm</td><td>Bemis</td><td>PM-996</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyd</td><td>Nacalai Tesque</td><td>26126-25</td><td></td></tr><tr><td>Buforowany fosforanem sól fizjologiczna, pH 7,4</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Arkusz kauczuku silikonowego</td><td>AS One</td><td>6-9085-12</td><td></td></tr><tr><td>Deoksycholan sodu</td><td>Tokio Przemysł chemiczny</td><td>C0316</td><td>Rysunek 6_1; Partia PSGYK-QB</td></tr><tr><td>Deoksycholan sodu</td><td>Kishida Chemical</td><td>260-71412</td><td>Rysunek 6_2; Partia C05543H</td></tr><tr><td>Deoksycholan sodu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D6750</td><td>Rysunek 6_3; Partia SLBS7362</td></tr><tr><td>Deoksycholan sodu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>30970</td><td>Rysunek 6_4; Partia BCBW0612</td></tr><tr><td>Deoksycholan sodu</td><td>Nacalai Tesque</td><td>10712-96</td><td>Rysunek 6_5; Partia M5R3403</td></tr><tr><td>Deoksycholan sodu</td><td>FUJIFILM Wako Pure Chemical</td><td>194-08311</td><td>Rysunek 6_6; Lot LKL0648</td></tr><tr><td>Wodorotlenek sodu</td><td>Nacalai Tesque</td><td>31511-05</td><td></td></tr><tr><td>Siarczyn sodu</td><td>FUJIFILM Wako Pure Chemical</td><td>190-03411</td><td></td></tr><tr><td>Mocznik</td><td>FUJIFILM Wako Pure Chemical</td><td>211-01213</td><td></td></tr><tr><td>Pompa próżniowa</td><td>BUCHI</td><td>V-700</td><td></td></tr><tr><td>Ksylitol</td><td>FUJIFILM Wako Pure Chemical</td><td>248-00545</td><td></td></tr></tbody></table>

optyczne oczyszczanie tkanek roślinnych do obrazowania fluorescencyjnego

Optical Clearing of Plant Tissues for Fluorescence Imaging

Trudno jest bezpośrednio obserwować wewnętrzną strukturę wielowarstwowych i nieprzezroczystych okazów roślin, bez sekcji, pod mikroskopem. Ponadto autofluorescencja przypisywana chlorofilowi utrudnia obserwację białek fluorescencyjnych w roślinach. Przez długi czas stosowano różne odczynniki czyszczące, aby rośliny były przezroczyste. Jednak konwencjonalne odczynniki czyszczące zmniejszają sygnały fluorescencyjne; W związku z tym nie było możliwe zaobserwowanie struktur komórkowych i wewnątrzkomórkowych za pomocą białek fluorescencyjnych. Opracowano odczynniki, które mogą oczyszczać tkanki roślinne poprzez usuwanie chlorofilu przy jednoczesnym zachowaniu stabilności białek fluorescencyjnych. Szczegółowy protokół jest dostępny tutaj do optycznego oczyszczania tkanek roślinnych za pomocą odczynników czyszczących, ClearSee (CS) lub ClearSeeAlpha (CSA). Przygotowanie oczyszczonych tkanek roślinnych obejmuje trzy etapy: utrwalanie, mycie i oczyszczanie. Utrwalanie jest kluczowym krokiem w utrzymaniu struktur komórkowych i stabilności wewnątrzkomórkowej białek fluorescencyjnych. Czas inkubacji do oczyszczenia zależy od rodzaju tkanki i gatunku. U Arabidopsis thaliana czas potrzebny do oczyszczenia za pomocą CS wynosił 4 dni w przypadku liści i korzeni, 7 dni w przypadku siewek i 1 miesiąc w przypadku słupków. CS potrzebował również stosunkowo krótkiego czasu 4 dni, aby liście gametofityczne Physcomitrium patens stały się przezroczyste. W przeciwieństwie do tego, słupki w tytoniu i torenii wytwarzały brązowy pigment w wyniku utleniania podczas leczenia CS. CSA zmniejszył brązowy pigment, zapobiegając utlenianiu i mógł sprawić, że słupki tytoniu i torenia były przezroczyste, chociaż zajęło to stosunkowo dużo czasu (1 lub 2 miesiące). CS i CSA były również kompatybilne z barwieniem przy użyciu barwników chemicznych, takich jak DAPI (4',6-diamidino-2-fenyloindole) i Hoechst 33342 dla DNA oraz Calcofluor White, SR2200 i Direct Red 23 dla ściany komórkowej. Metoda ta może być przydatna do obrazowania całej rośliny w celu ujawnienia nienaruszonej morfologii, procesów rozwojowych, interakcji roślina-mikroorganizm i infekcji nicieniami.

CS może oczyszczać liście różnych gatunków (Rysunek 3A-H). Roztwór CS z trudnością penetruje liść ryżu, ponieważ powierzchnia liścia tej rośliny jest pokryta woskiem kutykularnym. Jednak po usunięciu wosku kutykularnego poprzez zanurzenie w chloroformie na 10 s, CS był w stanie przejrzyścić liście ryżu (Rysunek 3H). CS nie mógł jednak przeniknąć Chamaecyparis obtusa liście, które są mniej przepuszczalne dla CS (Rysunek 3I,J). W Chryzantema liście, w liściach traktowanych CS zaobserwowano brązową pigmentację wywołaną utlenianiem polifenoli (Rysunek 3K,L). Podobnie, słupki tytoniu oraz torenii wykazały brązową pigmentację podczas traktowania CS (Rycina 3M,O). Ponieważ siarczyn sodu wchodzący w skład CSA zapobiega utlenianiu polifenoli dzięki działaniu redukującemu, CSA umożliwia oczyszczanie pręcików tytoniu i torenii bez powstawania brązowych przebarwień (Rycina 3N,P).
Rysunek 4B pokazuje, że traktowanie CS zmniejszyło bladozielony kolor liścia Arabidopsis H2B-mClover (pole jasne) i zwiększyło intensywność fluorescencji H2B-mClover w porównaniu z inkubacją w PBS (Rysunek 4A). Poza roślinami kwiatowymi, CS znajduje zastosowanie również w przypadku mchów (Rysunek 4C); po 4 dniach traktowania CS fluorescencja H2B-mRFP była wyraźnie wykrywalna w całym gametoforze przy zredukowanej autofluorescencji chlorofilu. Rysunki 4D,E przedstawiają obrazy rekonstrukcji 3D słupka H2B-mClover w Nicotiana benthamiana przejaśnionego przy użyciu CSA. Głębokość próbki wynosiła 440 µm. Jak pokazuje obraz maksymalnej projekcji intensywności kodowany głębokością, CSA umożliwia głębokie obrazowanie trudnych tkanek, takich jak słupki tytoniu.
CS i CSA okazały się również kompatybilne z barwieniem barwnikami fluorescencyjnymi. Rysunek 5 pokazuje, że CS może być jednocześnie stosowany do obserwacji białka fluorescencyjnego (H2B-mClover) oraz barwienia organicznym barwnikiem fluorescencyjnym (Calcofluor White). Po rekonstrukcji 3D z obrazów stosu z (z-stack) możliwa była obserwacja dowolnego przekroju.
<img alt="Morfologia i anatomia liści, obrazy mikroskopowe, edukacyjna analiza botaniczna, różnorodne kształty liści." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63428/63428fig03.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rysunek 3"> 
Rysunek 3: Przejaśnianie optyczne liści i słupków z użyciem roztworów przejaśniających. (A-L) Utrwalone liście różnych gatunków inkubowano w PBS (A,C,E,G,I,K) lub CS (B,D,F,H,J,L) przez 8 dni oraz w CS (M,O) lub CSA (N,P) przez 2 dni. (A,B,O,P) Torenia fournieri, (C,D) Nicotiana tabacum, (E,F) Cucumis sativus, (G,H) Oryza sativa, (I,J) Chamaecyparis obtusa, (K,L) Chrysanthemum morifolium, (M,N) Nicotiana benthamiana. Paski skali: 1 cm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63428/63428fig03large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Mikroskopia w polu jasnym i fluorescencyjna komórek roślinnych wykazująca autofluorescencję oraz H2B-mClover/mRFP." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63428/63428fig04.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rysunek 4"> 
Rysunek 4: Obrazowanie fluorescencyjne tkanek traktowanych roztworami do przejaśniania. (A,B) Liście Arabidopsis thaliana UBQ10pro::H2B-mClover były traktowane PBS (A) lub CS (B) przez 3 dni. (C) Liściaste gametofory H2B-mRFP Physcomitrium patens były traktowane CS przez 4 dni. Jądra komórkowe zostały znakowane H2B-mRFP (kolor zielony). Obróbka CS zredukowała autofluorescencję chlorofilu (kolor magenta). Sygnał H2B-mRFP w obszarze apikalnym był wyraźnie widoczny zarówno na obrazach scalonych H2B-mRFP i autofluorescencji, jak i w polu jasnym. (D,E) Przetworki UBQ10pro::H2B-mClover Nicotiana benthamiana były traktowane w CSA przez 1 miesiąc. Projekcja maksymalnej intensywności (D) oraz projekcja maksymalnej intensywności z kodowaniem głębokości (E) zostały wygenerowane z 88 obrazów stosu z (z-stack) w odstępach 5 µm. Paski skali: 100 µm. Obrazy wykonano przy użyciu mikroskopii szerokopolowej (A,B), konfokalnej (C) oraz mikroskopii z dwufotonowym wzbudzeniem (D,E). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63428/63428fig04large.jpg" target="_blank">Proszę kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Obraz mikroskopii konfokalnej; struktura komórki na schemacie przekroju poprzecznego." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63428/63428fig05.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rysunek 5"> 
Rysunek 5: Barwienie barwnikami fluorescencyjnymi jest kompatybilne z CS. (A) Liście poddane działaniu CS obserwowane za pomocą mikroskopii dwufotonowej z wzbudzeniem 950 nm. Ściana komórkowa jest zabarwiona Calcofluor White (cyjan). Jądra komórkowe są znakowane UBQ10pro::H2B-mClover (żółty). Obrazy yz (B) i xz (C) to przekroje poprzeczne w pozycji wskazanej białymi przerywanymi liniami na (A). Pasek skali: 100 µm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63428/63428fig05large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Analiza widm fluorescencji; probówki do wirowania i wykres przedstawiający intensywność w funkcji długości fali." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63428/63428fig06.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rysunek 6"> 
Rysunek 6: Przezroczystość deoksycholanu sodu. (A) Kolory różnych 15% roztworów deoksycholanu sodu (wymienione w Tabeli materiałów). (B) Widmo fluorescencji każdego 15% roztworu deoksycholanu sodu przy wzbudzeniu 380 nm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63428/63428fig06large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>

Tutaj opisana jest metoda uczynienia tkanek roślinnych przezroczystymi przy jednoczesnym zachowaniu stabilności białek fluorescencyjnych. Technika ta ułatwia głębokie obrazowanie oczyszczonych tkanek roślinnych bez fizycznego cięcia.

Optyczne oczyszczanie tkanek roślinnych do obrazowania fluorescencyjnego

It is challenging to directly observe the internal structure of multi-layered and opaque plant specimens, without dissection, under a microscope. In ...

Metoda ta może być pomocna w obrazowaniu całej rośliny w celu ujawnienia nienaruszonej morfologii, procesów rozwojowych i interakcji roślina-mikroorganizm. Główną zaletą tej techniki jest to, że możemy bezpośrednio obserwować wnętrze ciała rośliny bez wyrządzania mu uszkodzeń. Ponieważ metoda ta ma zastosowanie do szerokiej gamy gatunków roślin i tkanek, może pomóc w przyspieszeniu odkrywania nowych zjawisk w badaniach biologicznych roślin.Utrwalenie jest krytycznym krokiem w tej procedurze. Przed etapem oczyszczania należy sprawdzić intensywność białka fluorescencyjnego po utrwaleniu. Na początek zanurz próbki roślin w roztworze utrwalającym w mikroprobówce i upewnij się, że objętość roztworu utrwalającego jest ponad pięciokrotnie większa niż objętość próbki.Uszczelnij mikrorurkę parafilmem i wykonaj otwory za pomocą igły. Umieść mikrorurkę w eksykatorze i powoli dostosuj stopień podciśnienia do około 690 milimetrów słupa rtęci, tak aby z próbek stopniowo pojawiały się pęcherzyki. Wyłączyć pompę próżniową po opróżnieniu eksykatora.Ostrożnie odpowietrzyć środek osuszający, nie naruszając próbek. Ponownie włączyć pompę próżniową i wyłączyć ją po opróżnieniu eksykatora. Ostrożnie otworzyć eksykator, nie uderzając roztworem utrwalającym w mikroprobówce.Usunąć roztwór utrwalający i dodać 1x PBS za pomocą mikropipety. Po przechowywaniu przez jedną minutę wymień stary PBS na nowy 1x PBS. Po usunięciu PBS w ilości pięciokrotnie większej od objętości próbki roztworu klarującego, uszczelnij mikroprobówkę parafilmem i wykonaj otwory igłą.Umieścić próbki w eksykatorze. Opróżnij i wyłącz pompę próżniową. Delikatnie otwórz eksykator, a następnie zamknij mikroprobówkę.Odwróć mikrorurkę co jeden do dwóch dni, aby przyspieszyć proces oczyszczania. W przypadku ramy dystansowej wytnij arkusz gumy silikonowej za pomocą żyletki, dostosowując grubość arkusza gumy silikonowej w zależności od grubości próbki. Umieść silikonową ramkę na szkle nakrywkowym, a następnie umieść poddane działaniu substancji próbki w ramce i dodaj około 100 mikrolitrów roztworu klarującego, aby usunąć wszelkie pęcherzyki.Przykryj innym szkłem nakrywkowym, aby zapobiec parowaniu roztworu klarującego. Obserwuj próbki pod mikroskopem fluorescencyjnym. Po obserwacji umieścić próbki z powrotem w roztworze klarującym w mikroprobówce.Stałe liście różnych gatunków inkubowano w PBS lub ClearSee przez osiem dni, w ClearSee lub ClearSeeAlpha przez dwa dni. ClearSee może usuwać liście różnych gatunków. Po usunięciu naskórka, ClearSee może usunąć liście ryżu.Ponieważ składnik siarczynu sodu w ClearSeeAlpha zapobiega utlenianiu polifenoli ze względu na działanie redukujące, ClearSeeAlpha może usunąć słupki tytoniu i tiranii bez brązowej pigmentacji. Liście promotora ubikwityny-10 H2B-mClover arabidopsis thaliana leczono PBS lub ClearSee przez trzy dni. Zabieg ClearSee zmniejszył bladozielony kolor liścia Arabidopsy H2B-mClover i zwiększył intensywność fluorescencji H2B-mClover w porównaniu z inkubacją PBS.Liście traktowane ClearSee obserwowano za pomocą mikroskopii wzbudzenia dwufotonowego ze wzbudzeniem 950 nanometrów. Ściana komórkowa jest zabarwiona na biało mąką wapienną. Jądra są znakowane promotorem ubikwityny-10, H2B-mClover.Obrazy Y, Z i X Z są przekrojami poprzecznymi w miejscu wskazanym przez białe linie przerywane. Przygotowanie roztworu utrwalającego jest ważne dla utrwalenia próbek. Należy jednak zachować ostrożność, aby zapobiec uszkodzeniu próbek w próżni.Obrazowanie mikroskopowe można przeprowadzić w celu zbadania wielu wzorców ekspresji genów i komunikacji wewnątrzkomórkowej podczas rozwoju rośliny i infekcji po tej procedurze.

optical-clearing-of-plant-tissues-for-fluorescence-imaging

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Mikroskopia wielofotonowa całych organów myszy jest możliwa dzięki optycznemu klarowaniu organu przed obrazowaniem, jednak nie wszystkie protokoły zachowują sygnał fluorescencyjny białek fluorescencyjnych. Stosując metodę klarowania optycznego z dehydratacją opartą na etanolu oraz klarowaniem za pomocą mieszaniny alkoholu benzylowego i benzojanu benzylowego, prezentujemy wysokorozdzielcze obrazy wielofotonowe całego mózgu myszy wykazującego ekspresję YFP.

Mikroskopia wielofotonowa oczyszczonego mózgu mysiego z ekspresją YFP

Aby uzyskać obrazy o wysokiej rozdzielczości fluorescencyjnie znakowanych komórek w dużych tkankach, najlepiej byłoby, gdyby próbki biologiczne były obrazowane bez dzielenia na sekcje. 3DISCO to prosta procedura oczyszczania tkanek oparta na sekwencyjnej inkubacji z rozpuszczalnikami organicznymi. Po oczyszczeniu narządy stają się przezroczyste, co pozwala na kompleksowe skanowanie laserowe próbki.

Obrazowanie oczyściło nienaruszone systemy biologiczne na poziomie komórkowym za pomocą 3DISCO

Techniki optycznego oczyszczania rewolucjonizują sposób wizualizacji tkanek. W tym raporcie opisujemy modyfikacje oryginalnego protokołu CLARITY (Clear, Lipid-exchanged, Engineerized Rigid Imaging-compatible Tissue-hYdrogel), który zapewnia bardziej spójne i tańsze wyniki.

Optyczne oczyszczanie ośrodkowego układu nerwowego myszy za pomocą pasywnego CLARITY

W tym protokole opisujemy techniki prawidłowego preparowania kwiatów i krzemionek Arabidopsis, niektóre podstawowe techniki oczyszczania oraz wybrane procedury barwienia dla obserwacji struktur rozrodczych na całej powierzchni.

Całościowe oczyszczanie i barwienie organów kwiatowych Arabidopsis i krzemianek

Połączenie znakowania przeciwciałami, optycznego oczyszczania i zaawansowanej mikroskopii świetlnej pozwala na trójwymiarową analizę całych struktur lub organów. Opisano tutaj prostą metodę łączenia znakowania immunologicznego grubych plasterków nerki, oczyszczania optycznego za pomocą cynamonianu etylu oraz obrazowania konfokalnego, które umożliwia wizualizację i kwantyfikację trójwymiarowych struktur nerkowych.

Optyczne oczyszczanie i obrazowanie znakowanej immunologicznie tkanki nerki

Sferoidy nowotworowe są coraz częściej wykorzystywane do oceny interakcji komórek nowotworowych z mikrośrodowiskiem i odpowiedzi na terapię. Niniejszy protokół opisuje solidną, ale prostą metodę pół-wysokoprzepustowego obrazowania sferoid guza 3D przy użyciu szybkiego usuwania optycznego.

Szybkie oczyszczanie optyczne do półwysokoprzepustowej analizy sferoidów nowotworowych

Obecny protokół opisuje technikę oczyszczania pędów ryżu, które są trudne do przygotowania do wewnętrznych obserwacji strukturalnych ze względu na twardą, grubą lub warstwową naturę tkanek. Metoda ta ułatwia ciągłe i głębokie obserwacje fluorescencyjne, nawet u dorosłych roślin ryżu.

Głęboka obserwacja fluorescencji pędów ryżowych za pomocą technologii oczyszczania

Obecny protokół opisuje zoptymalizowaną metodę obserwacji histologicznej galasów indukowanych przez Plasmodiophora brassicae. Skrawki wibratomu hipokotyli są oczyszczane przed obrazowaniem fluorescencyjnym w celu zbadania udziału czynników transkrypcyjnych i fitohormonów podczas progresji choroby. Protokół ten przezwycięża ograniczenia związane z zatapianiem żywicy, umożliwiając wizualizację białek fluorescencyjnych w plantach.

Połączenie mikroskopii oczyszczającej i fluorescencyjnej w celu wizualizacji zmian w ekspresji genów i reakcjach fizjologicznych na Plasmodiophora brassicae

Zawiązki liści kukurydzy są głęboko ukryte i zwinięte, co utrudnia ich badanie. W niniejszej pracy przedstawiono metody przygotowania przekrojów poprzecznych i rozwiniętych całych wierzchowców zawiązków liści kukurydzy do obrazowania fluorescencyjnego i konfokalnego.

Ulepszone metody przygotowania przekrojów poprzecznych i rozwiniętych całych mocowań zawiązków liści kukurydzy do obrazowania fluorescencyjnego i konfokalnego

Obecny protokół zapewnia krok po kroku procedurę szybkiego i jednoczesnego oczyszczania optycznego, wieloetapowego znakowania i wolumetrycznej rekonstrukcji 3D dziesiątek pośmiertnych odcinków ludzkiego mózgu poprzez połączenie (SWITCH - H2O2 - Pozyskiwanie antygenu R- 2,2'-tiodieetanol [TDE]) KRÓTKA technika transformacji tkankowej z obrazowaniem mikroskopii fluorescencyjnej za pomocą arkusza świetlnego w rutynowym protokole wysokoprzepustowym.

Optyczne oczyszczanie i znakowanie w mikroskopii fluorescencyjnej arkuszy świetlnych w wielkoskalowym obrazowaniu ludzkiego mózgu

Techniki oczyszczania optycznego, takie jak roztwory cząsteczek absorpcyjnych, tymczasowo zmniejszają rozpraszanie światła w celu poprawy obrazowania biologicznego i oferują biokompatybilne, odwracalne strategie obrazowania in vivo dla głęboko osadzonych narządów. Protokół ten przedstawia szczegółowe procedury eksperymentalne, a także zaawansowane przetwarzanie obrazu w celu uzyskania wysokiej jakości, dynamicznego obrazowania dynamiki w czasie rzeczywistym u żywych zwierząt.

Przejściowe oczyszczanie optyczne z wykorzystaniem cząsteczek absorpcyjnych do obrazowania ex vivo i in vivo

Poznaj metodę optycznego oczyszczania tkanek roślinnych do obrazowania fluorescencyjnego bez konieczności fizycznego cięcia. Technika ta umożliwia głębokie obrazowanie struktur roślinnych i badanie wzorców ekspresji genów w Arabidopsis thaliana.

Optyczne oczyszczanie tkanek roślinnych do obrazowania fluorescencyjnego

Przeglądaj więcej filmów