Name: Wielkoskalowa, zautomatyzowana produkcja sferoid komórek macierzystych pochodzących z tkanki tłuszczowej do biodruku 3D (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-03-31T13:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 40 s
Description: Poznaj zautomatyzowaną metodę produkcji sferoid komórek macierzystych z tkanki tłuszczowej do biodruku 3D. Protokół zmniejsza ryzyko zanieczyszczeń mikrobiologicznych i optymalizuje czas pracy.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy Narodowemu Instytutowi Metrologii, Jakości i Technologii (INMETRO, RJ, Brazylia) za korzystanie z ich urządzeń. Badanie to było częściowo wspierane przez Fundację Carlosa Chagasa Filho na rzecz Wspierania Badań Naukowych Stanu Rio de Janeiro (Faperj) (kod finansowy: E26/202.682/2018 i E-26/010.001771/2019), Narodową Radę Rozwoju Naukowego i Technologicznego (CNPq) (kod finansowy: 307460/2019-3) oraz Biuro Badań Marynarki Wojennej (ONR) (kod finansowy: N62909-21-1-2091). Prace te były częściowo wspierane przez Narodowe Centrum Nauki i Technologii Medycyny Regeneracyjnej – INCT Regenera (http://www.inctregenera.org.br/).

ASC użyte w tym badaniu zostały wcześniej wyizolowane od zdrowych ludzkich dawców i poddane krioprezerwacji, jak opisano 14 według Komisji Etyki Badań Szpitala Uniwersyteckiego Clementino Fraga Filho, Uniwersytetu Federalnego Rio de Janeiro, Brazylia (25818719.4.0000.5257). Szczegółowe informacje na temat wszystkich materiałów i sprzętu użytego w tym badaniu można znaleźć w Tabeli Materiałów.
1. Trypsyna monowarstwy ASC w trzecim przejściu
<ol>
	<li>Otworzyć kolbę tkankową o długości 175cm2 zawierającą monowarstwę ASC przy 80% zbiegu i odrzucić supernatant.</li>
	<li>Dodać 7 ml soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS, 0,01 M) i dwukrotnie przemyć monowarstwę. Następnie wylej płyn.</li>
	<li>Dodaj 5 ml 0,125% trypsyny z 0,78 mM kwasu etylenodiaminotetraoctowego (EDTA). Następnie inkubować przez 5 minut w temperaturze 37 °C.</li>
	<li>Dodać 10 ml zmodyfikowanego podłoża Eagle Medium firmy Dulbecco o niskiej zawartości glukozy (DMEM LOW) z 10% płodową surowicą bydlęcą (FBS) do kolby tkankowej o długości 175cm2 i dobrze wymieszać zawiesinę komórkową za pomocą pipety sorologicznej o pojemności 10 ml.</li>
	<li>Zawiesinę komórkową pobrać za pomocą pipety serologicznej o pojemności 10 ml i przenieść do probówki wirówkowej o pojemności 50 ml. Następnie odwirować przy 400 × g przez 5 minut, aby uzyskać osad ASC. Ponownie zawiesić osad komórkowy za pomocą DMEM LOW zawierającego 10% FBS.</li>
	<li>Wykonaj zliczanie komórek przez wykluczenie trypana.</li>
	<li>Po policzeniu weź w sumie 1 × 106 ASC w oddzielnej probówce wirówkowej o pojemności 15 ml, aby zasiać 81 recesji mikroformowanych nieprzylegającym hydrożelem (w sumie 10 000 komórek/ml wysianych tutaj). Aby zasiać 256 wgłębień mikroformowanego, nieprzylegającego hydrożelu, weź w sumie 5 × 105 ASC do probówki wirówkowej (w sumie 2,500 komórek/ml wysianych tutaj).</li>
</ol>
2. Produkcja mikroformowanego, nieprzylegającego hydrożelu agarozowego
<ol>
	<li>Przygotuj 50 ml sterylnego roztworu 2% ultraczystej agarozy w 0,9% NaCl w ultraczystej wodzie. Roztwór należy sterylizować w autoklawie przez 30 minut w temperaturze 121 °C.</li>
	<li>Dodaj 500 μl sterylnego 2% ultraczystego roztworu agarozy na środek silikonowej formy zawierającej 81 lub 256 okrągłych wgłębień.</li>
	<li>Po 40 minutach wyjmij ultraczystą agarozę z formy silikonowej i umieść ją w dołku 12-dołkowej plastikowej płytki.</li>
	<li>Dodać 2 ml DMEM LOW do studzienki z mikroformowaną agarozą i inkubować w inkubatorze w temperaturze 37 °C w atmosferze 5% CO2 przez co najmniej 12 godzin przed wysiewem ASC.</li>
</ol>
3. Biofabrykacja sferoidów ASC za pomocą automatycznego systemu pipetowania
<ol>
	<li>Sprawdź następujące elementy:
	<ol>
		<li>Sprawdź, czy przepływ laminarny jest włączony i czy przepływ powietrza w szafie działa prawidłowo.</li>
		<li>Sprawdź, czy urządzenie jest podłączone do właściwej objętościtage.</li>
		<li>Sprawdź, czy tablet jest podłączony do urządzenia.</li>
		<li>Sprawdź, czy wysokość szyby ochronnej szafy jest na tej samej wysokości, co oznaczenie czujnika urządzenia.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Naciśnij przycisk włączania/wyłączania po lewej stronie urządzenia i poczekaj, aż tablet i urządzenie się uruchomią.</li>
	<li>Umieść pudełka na końcówki, stojak na probówki wirówkowe i płytkę zawierającą mikroformowany hydrożel agarozowy w przestrzeni roboczej urządzenia.</li>
	<li>Na tablecie z otwartym oprogramowaniem najpierw kliknij Edytor oprogramowania laboratoryjnego.</li>
	<li>Skonfiguruj wirtualny stół roboczy i wybierz pozycje pipet, pojemników na końcówki, stojaka na plastikowe rurki i płytek. 
	UWAGA: Wirtualny stół roboczy musi reprezentować fizyczne położenie akcesoriów w sprzęcie.</li>
	<li>Kliknij przycisk Przełącz na produkcję, aby uwzględnić parametry (patrz krok 3.10) i polecenia, które sprzęt będzie wykonywał przez cały czas trwania eksperymentu. Poczekaj, aż w oprogramowaniu otworzy się pasek narzędzi i lista produktów.</li>
	<li>Początkowo, aby wskazać polecenia, należy podać liczbę próbek do pipetowania i przeciągnąć ją do listy producentów. 
	UWAGA: Liczba próbek to liczba plastikowych probówek wirówkowych zawierających zawiesinę ASC, która ma być wysiana w środku mikroform.</li>
	<li>Po wprowadzeniu liczby próbek kliknij przycisk polecenia Transfer próbki w oprogramowaniu, aby przenieść zawiesinę ASC do dołków 12-dołkowej płytki, zawierającej mikroformy, i przeciągnij ją do listy produktów.</li>
	<li>Kliknij Właściwości, aby ustawić pozycję początkową i końcową dla sprzętu do przenoszenia próbki.</li>
	<li>Poczekaj, aż oprogramowanie powróci do strony Stół roboczy. Kliknij przycisk Opcje, aby ustawić parametry automatycznego wysiewu ASC: i) Szybkość aspiracji 15,4 s-1; ii) Prędkość dozowania 1 s-1; iii) Opóźnienie ciosu 0 ms; iv) Prędkość nadmuchu 15,4 s-1; v) Początkowy skok 100%. Wybierz Wodę jako Standardowy rodzaj cieczy.</li>
	<li>Ustaw parametry mieszania ASC w celu uzyskania jednorodnej zawiesiny: i) Liczba cykli 5; ii) Prędkość 6,5 s-1; iii) Objętość 300 μl.</li>
	<li>Po ustawieniu parametrów dodaj Czas 40 minut do Listy Produktów. 
	UWAGA: Ten czas jest potrzebny na poczekanie, aż zawiesina ASC zdekantuje się na dnie mikroformy.</li>
	<li>Na liście produktów uwzględnij opcję Transfer odczynników, aby przenieść pożywkę do hodowli sferoidalnej do odpowiednich dołków płytki.</li>
	<li>Powtórz kroki 3.9-3.11, aby ustawić konfigurację pozycji i parametrów do przenoszenia pożywki do hodowli sferoidalnej.</li>
	<li>Kliknij przycisk z symbolem wyboru na górnym pasku oprogramowania, aby upewnić się, że nie ma błędu programowania.</li>
	<li>Kliknij przycisk Odtwórz (z symbolem trójkąta) na górnym pasku oprogramowania, aby uruchomić program.</li>
	<li>Pozwól urządzeniu uruchomić się zgodnie z programem i poczekaj, aż wyda dźwięk wskazujący, że się skończyło.</li>
	<li>Zebrać 12-dołkową płytkę i inkubować ją w inkubatorze w temperaturze 37 °C, 5% CO2 przez co najmniej 18 godzin, aby sferoidy były całkowicie uformowane i zwarte.</li>
	<li>Ręcznie zbierz sferoidy po 1, 3 i 7 dniach hodowli do analizy. Ręcznie przepłukać podłoże mikropipetą, aby uwolnić sferoidy z mikroformowanego, nieprzylegającego hydrożelu agarozowego.</li>
	<li>Po 5 minutach sprawdź pod mikroskopem, czy sferoidy są całkowicie uwolnione z mikroformowanego, nieprzylegającego hydrożelu agarozowego.</li>
	<li>Zebrać sferoidy ręcznie za pomocą mikropipety i przenieść je do probówki wirówkowej o pojemności 15 ml.</li>
	<li>Przemyć sferoidy co najmniej dwa razy 0,01 M PBS. Ocenić żywotność i przeprowadzić analizy biomechaniczne na świeżych próbkach sferoidów. W celu analizy morfologicznej (histologii) inkubować próbki sferoidalne w 4% paraformaldehydzie w PBS przez co najmniej 18 godzin w temperaturze 2–8 °C.</li>
</ol>

<ol><li>Gentile, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Filling+the+gaps+between+the+in+vivo+and+in+vitro+microenvironment%3A+Engineering+of+spheroids+for+stem+cell+technology%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Stem+Cell+Research+%26+Therapy%22%5BJournal%5D)">Filling the gaps between the in vivo and in vitro microenvironment: Engineering of spheroids for stem cell technology.</a> Current Stem Cell Research & Therapy. 11 (8), 652-665 (2016).</li>
<li>Bartosh, T. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aggregation+of+human+mesenchymal+stromal+cells+%28MSCs%29+into+3D+spheroids+enhances+their+antiinflammatory+properties%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Aggregation of human mesenchymal stromal cells (MSCs) into 3D spheroids enhances their antiinflammatory properties.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (31), 13724-13729 (2010).</li>
<li>Frith, J. E., Thomson, B., Genever, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+three-dimensional+culture+methods+enhance+mesenchymal+stem+cell+properties+and+increase+therapeutic+potential%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Engineering+Part+C%3A+Methods%22%5BJournal%5D)">Dynamic three-dimensional culture methods enhance mesenchymal stem cell properties and increase therapeutic potential.</a> Tissue Engineering Part C: Methods. 16 (4), 735-749 (2009).</li>
<li>Cortês, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+scaffold-+and+serum-free+method+to+mimic+human+stable+cartilage+validated+by+secretome%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Engineering%3A+Part+A%22%5BJournal%5D)">A scaffold- and serum-free method to mimic human stable cartilage validated by secretome.</a> Tissue Engineering: Part A. 27 (5-6), 311-327 (2021).</li>
<li>Kronemberger, G. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Scaffold-+and+serum-free+hypertrophic+cartilage+tissue+engineering+as+an+alternative+approach+for+bone+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Artificial+Organs%22%5BJournal%5D)">Scaffold- and serum-free hypertrophic cartilage tissue engineering as an alternative approach for bone repair.</a> Artificial Organs. 44 (7), 288-299 (2020).</li>
<li>Kronemberger, G. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+hypertrophic+cartilage+induction+influences+the+building-block+capacity+of+human+adipose+stem%2Fstromal+cell+spheroids+for+biofabrication%5BTitle%5D)+AND+%22Artificial+Organs%22%5BJournal%5D)">The hypertrophic cartilage induction influences the building-block capacity of human adipose stem/stromal cell spheroids for biofabrication.</a> Artificial Organs. 45 (10), 1208-1218 (2021).</li>
<li>Mehesz, A. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Scalable+robotic+biofabrication+of+tissue+spheroids%5BTitle%5D)+AND+%22Biofabrication%22%5BJournal%5D)">Scalable robotic biofabrication of tissue spheroids.</a> Biofabrication. 3 (2), 025002(2011).</li>
<li>Koudan, E. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+scalable+standardized+biofabrication+of+tissue+spheroids+from+different+cell+types+using+nonadhesive+technology%5BTitle%5D)+AND+%223D+Printing+and+Additive+Manufacturing%22%5BJournal%5D)">The scalable standardized biofabrication of tissue spheroids from different cell types using nonadhesive technology.</a> 3D Printing and Additive Manufacturing. 4 (1), 53-60 (2017).</li>
<li>Parfenov, V. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((label-free+and+nozzle-free+biofabrication+technology+using+magnetic+levitational+assembly%5BTitle%5D)+AND+%22Biofabrication%22%5BJournal%5D)">label-free and nozzle-free biofabrication technology using magnetic levitational assembly.</a> Biofabrication. 10 (3), 034104(2018).</li>
<li>Laschke, M. W., Menger, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Life+is+3D%3A+Boosting+spheroid+function+for+tissue+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Life is 3D: Boosting spheroid function for tissue engineering.</a> Trends in Biotechnology. 35 (2), 133-144 (2017).</li>
<li>Gutzweiler, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Large+scale+production+and+controlled+deposition+of+single+HUVEC+spheroids+for+bioprinting+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Biofabrication%22%5BJournal%5D)">Large scale production and controlled deposition of single HUVEC spheroids for bioprinting applications.</a> Biofabrication. 9 (2), 025027(2017).</li>
<li>Lin, H., Li, Q., Lei, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+tissues+using+human+pluripotent+stem+cell+spheroids+as+biofabrication+building+blocks%5BTitle%5D)+AND+%22Biofabrication%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional tissues using human pluripotent stem cell spheroids as biofabrication building blocks.</a> Biofabrication. 9 (2), 025007(2017).</li>
<li>Groll, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biofabrication%3A+reappraising+the+definition+of+an+evolving+field%5BTitle%5D)+AND+%22Biofabrication%22%5BJournal%5D)">Biofabrication: reappraising the definition of an evolving field.</a> Biofabrication. 8 (1), 013001(2016).</li>
<li>Baptista, L. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+alternative+method+for+the+isolation+of+mesenchymal+stromal+cells+derived+from+lipoaspirate+samples%5BTitle%5D)+AND+%22Cytotherapy%22%5BJournal%5D)">An alternative method for the isolation of mesenchymal stromal cells derived from lipoaspirate samples.</a> Cytotherapy. 11 (6), 706-715 (2009).</li>
<li>Conway, M. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Scalable+96-well+plate+based+iPSC+culture+and+production+using+a+robotic+liquid+handling+system%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3AJoVE%22%5BJournal%5D)">Scalable 96-well plate based iPSC culture and production using a robotic liquid handling system.</a> Journal of Visualized Experiments:JoVE. (99), e52755(2015).</li>
<li>Moutsatsou, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automation+in+cell+and+gene+therapy+manufacturing%3A+from+past+to+future%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnology+Letters%22%5BJournal%5D)">Automation in cell and gene therapy manufacturing: from past to future.</a> Biotechnology Letters. 41 (11), 1245-1253 (2019).</li>
<li>Doulgkeroglou, M. -K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automation%2C+monitoring%2C+and+standardization+of+cell+product+manufacturing%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Bioengineering+and+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Automation, monitoring, and standardization of cell product manufacturing.</a> Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 8, 811(2020).</li>
<li>Bhise, N. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+liver-on-a-chip+platform+with+bioprinted+hepatic+spheroids%5BTitle%5D)+AND+%22Biofabrication%22%5BJournal%5D)">A liver-on-a-chip platform with bioprinted hepatic spheroids.</a> Biofabrication. 8 (1), 014101(2016).</li>
<li>Daly, A. C., Kelly, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biofabrication+of+spatially+organised+tissues+by+directing+the+growth+of+cellular+spheroids+within+3D+printed+polymeric+microchambers%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Biofabrication of spatially organised tissues by directing the growth of cellular spheroids within 3D printed polymeric microchambers.</a> Biomaterials. 197, 194-206 (2019).</li>
<li>Lopa, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidic+biofabrication+of+3D+multicellular+spheroids+by+modulation+of+non-geometrical+parameters%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Bioengineering+and+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Microfluidic biofabrication of 3D multicellular spheroids by modulation of non-geometrical parameters.</a> Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 8, 366(2020).</li>
<li>Meseguer-Ripolles, J., Kasarinaite, A., Lucendo-Villarin, B., Hay, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protocol+for+automated+production+of+human+stem+cell+derived+liver+spheres%5BTitle%5D)+AND+%22STAR+Protocols%22%5BJournal%5D)">Protocol for automated production of human stem cell derived liver spheres.</a> STAR Protocols. 2 (2), 100502(2021).</li>
<li>Lee, G. -H., Suh, Y., Park, J. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+paired+bead+and+magnet+array+for+molding+microwells+with+variable+concave+geometries%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">A paired bead and magnet array for molding microwells with variable concave geometries.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (131), e55548(2018).</li>
<li>Becerra, D., Wu, T., Jeffs, S., Ott, H. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+culture+method+of+induced+pluripotent+stem+cell-derived+alveolar+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Engineering+Part+C+-+Methods%22%5BJournal%5D)">High-throughput culture method of induced pluripotent stem cell-derived alveolar epithelial cells.</a> Tissue Engineering Part C - Methods. 27 (12), 639-648 (2021).</li>
<li>Mironov, V., Kasyanov, V., Markwald, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organ+printing%3A+from+bioprinter+to+organ+biofabrication+line%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Organ printing: from bioprinter to organ biofabrication line.</a> Current Opinion Biotechnology. 22 (5), 667-673 (2011).</li>
<li>De Moor, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+fabrication+of+vascularized+spheroids+for+bioprinting%5BTitle%5D)+AND+%22Biofabrication%22%5BJournal%5D)">High-throughput fabrication of vascularized spheroids for bioprinting.</a> Biofabrication. 10 (3), 035009(2018).</li>
</ol>

Autorzy deklarują brak konfliktu interesów.

W artykule przedstawiono wielkoskalową generację sferoid ASC przy użyciu zautomatyzowanego systemu pipet. Kluczowym etapem protokołu jest precyzyjne skonfigurowanie oprogramowania w celu zapewnienia prawidłowej objętości zawiesiny komórek, prędkości i odległości do pipetowania. Parametry opisane w protokole zostały określone po przeprowadzeniu szeregu prób mających na celu optymalizację dozowania zawiesiny komórek ASC do studzienek 12-dołkowych płytek zawierających mikroformowane, nieprzylegające hydrożele. Optymalizacja...

sferoidy są uważane za podejście wolne od rusztowań w inżynierii tkankowej. ASC są zdolne do tworzenia sferoid w procesie samoorganizacji. Mikroarchitektura 3D sferoidy zwiększa potencjał regeneracyjny ASC, w tym zdolność różnicowania do wielu linii1,2,3. Ta grupa badawcza pracowała nad sferoidami ASC do inżynierii tkanki chrzęstnej i kostnej4,5,6. Co ważniejsze, sferoidy są uważane za elementy budulcowe w biofabrykacji tkanek i narządów, głównie ze względu na ich zdolność do fuzji.
Wykorzystanie sferoidów do tworzenia tkanek zależy od trzech głównych punktów: (1) rozwoju standardowych i skalowalnych metod robotycznych do ich biofabrykacji7, (2) systematycznego fenotypowania sferoidów tkankowych8, (3) rozwoju metod składania tkanek 3D9. Te sferoidy mogą być formowane z różnych typów komórek i uzyskiwane różnymi metodami, w tym wiszącą kroplą, reagregacją, mikrofluidyką i mikroformami8,9,10. Każda z tych metod ma zalety i wady związane z jednorodnością wielkości i kształtu sferoid, odzyskiwaniem sferoid po uformowaniu, liczbą wytworzonych sferoid, automatyzacją procesów, pracochłonnością i kosztami11.
W metodzie mikroformy, komórki są dozowane i umieszczane na dnie mikroformy z powodu grawitacji. Nieadhezyjny hydrożel nie pozwala komórkom przylegać do dna, a interakcje międzykomórkowe prowadzą do powstania pojedynczej sferoidy na recesję8,12. Ta metoda biofabrykacji generuje sferoidy o jednorodnym i kontrolowanym rozmiarze, może być zrobotyzowana do produkcji na dużą skalę w sposób efektywny czasowo przy minimalnym wysiłku i ma dobre czynniki krytyczne pod względem opłacalności w projektowaniu biofabrykacji sferoidy tkankowej7,8. Metoda ta może być zastosowana do tworzenia sferoid dowolnej linii komórkowej w celu przygotowania nowego typu tkanki o przewidywalnych, optymalnych i kontrolowanych cechach8.
Biofabrykacja jest zdefiniowana jako "zautomatyzowane generowanie biologicznie funkcjonalnych produktów z organizacją strukturalną ... "13. Dlatego zautomatyzowana produkcja sferoid jest uważana za pierwszy obowiązkowy krok do opracowania linii biofabrykacji, która jest kontynuowana w procesie biodruku 3D i kończy się pełnym dojrzewaniem biodrukowanej tkanki przez fuzję sferoidalną. W tym badaniu, aby poprawić skalowalność biofabrykacji sferoidów ASC, używamy zautomatyzowanego systemu pipetowania do wysiewu zawiesiny komórek, zapewniając w ten sposób jednorodność wielkości i kształtu sferoidy. Ten artykuł pokazuje, że możliwe było wyprodukowanie dużej liczby (tysięcy) sferoid potrzebnych do podejść do biodruku 3D w celu biofabrykacji bardziej złożonych modeli tkanek.

<table><tbody><tr><td>12-dołkowa plastikowa płytka</td><td>Corning</td><td>3512</td><td></td></tr><tr><td>50 ml probówka wirówkowa</td><td>Corning</td><td>CLS430828</td><td></td></tr><tr><td>EpMotion 5070</td><td>Eppendorf</td><td>5070000282</td><td></td></tr><tr><td>epT.I.P.S. Motion</td><td>Eppendorf</td><td>30015231</td><td></td></tr><tr><td>kwas etylenodiaminotetraoctowy (EDTA)</td><td>Invitrogen</td><td>15576028</td><td></td></tr><tr><td>płodowa surowica bydlęca (FBS)</td><td>Gibco</td><td>10082147</td><td></td></tr><tr><td>Low Glucose Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM LOW)</td><td>Gibco</td><td>31600034</td><td></td></tr><tr><td>Mikrotkanki 3D Petriego Sferoidy mikro-pleśni - tablica 16 x 16</td><td>Sigma</td><td></td><td></td>Z764000</tr><tr><td>Mikrotkanki 3D Sferoidy mikropleśni na szalkę Petriego - matryca 9 x 9</td><td>Sigma</td><td>Z764019</td><td></td></tr><tr><td>bufor soli fosforanowej (PBS)</td><td>Kolba</td> do hodowli tkankowych Sigma <td>806552</td><td></td></tr><tr><td>chlorek sodu (NaCl)</td><td>Sigma</td><td>S8776</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Corning</td><td>430720U</td><td></td></tr><tr><td>trypan</td><td>Lonza</td><td>17-942E</td><td></td></tr><tr><td>trypsyna</td><td>Gibco</td><td>27250018</td><td></td></tr><tr><td>ultraczysta agaroza</td><td>Invitrogen</td><td>16500100</td><td></td></tr></tbody></table>

wielkoskalowa, zautomatyzowana produkcja sferoid komórek macierzystych pochodzących z tkanki tłuszczowej do biodruku 3d

Large-Scale, Automated Production of Adipose-Derived Stem Cell Spheroids for 3D Bioprinting

Komórki zrębowe/macierzyste (ASC) pochodzące z tkanki tłuszczowej to subpopulacja komórek znajdujących się we frakcji zrębu naczyniowego ludzkiej podskórnej tkanki tłuszczowej, uznawana za klasyczne źródło mezenchymalnych komórek zrębowych/macierzystych. Opublikowano wiele badań z ASC dla podejść inżynierii tkankowej opartych na rusztowaniach, w których badano głównie zachowanie tych komórek po ich wysianiu na bioaktywnych rusztowaniach. Pojawiają się jednak podejścia bez rusztowań do inżynierii tkanek in vitro i in vivo, głównie przy użyciu sferoidów, w celu przezwyciężenia ograniczeń podejść opartych na rusztowaniach.
Sferoidy to mikrotkanki 3D powstałe w procesie samoorganizacji. Mogą lepiej naśladować architekturę i mikrośrodowisko tkanek natywnych, głównie dzięki powiększeniu interakcji między komórkami i między komórkami a macierzą zewnątrzkomórkową. Ostatnio sferoidy są badane głównie jako modele chorób, badania przesiewowe leków i elementy budulcowe biodruku 3D. Jednak w przypadku podejść do biodruku 3D liczne sferoidy, jednorodne pod względem wielkości i kształtu, są niezbędne do biofabrykacji złożonych modeli tkanek i narządów. Ponadto, gdy sferoidy są wytwarzane automatycznie, istnieje niewielka szansa na zanieczyszczenie mikrobiologiczne, co zwiększa powtarzalność metody.
Produkcja sferoidów na dużą skalę jest uważana za pierwszy obowiązkowy krok do opracowania linii biofabrykacji, która kontynuuje proces biodruku 3D i kończy się pełnym dojrzewaniem konstruktu tkankowego w bioreaktorach. Jednak liczba badań, które dotyczyły produkcji sferoidów ASC na dużą skalę, jest nadal niewielka, wraz z liczbą badań, w których wykorzystano sferoidy ASC jako elementy budulcowe do biodruku 3D. Dlatego artykuł ten ma na celu pokazanie produkcji sferoidów ASC na dużą skalę przy użyciu nieadhezyjnej techniki mikroformowanego hydrożelu rozprowadzającego sferoidy ASC jako elementy budulcowe dla podejść do biodruku 3D.

Automatyczny system pipetujący może nanieść zawiesinę komórek ASC do 12 dołków jednej płytki 12-dołkowej w ciągu 15 min. Zastosowanie hydrożelu nieprzylegającego z 81 mikrootworami pozwoli na otrzymanie 972 sferoidów po zakończeniu protokołu. Zastosowanie hydrożelu nieprzylegającego z 256 mikrootworami pozwoli na otrzymanie 3 072 sferoidów po zakończeniu protokołu. Sferoidy ASC analizowano pod kątem homogeniczności ich wielkości i kształtu. Sferoidy ASC z mikrootworów z 81 wgłębieniami wykazywały homogeniczną średnicę w ...

Tutaj opisujemy produkcję na dużą skalę sferoidów zrębu/komórek macierzystych (ASC) pochodzących z tkanki tłuszczowej przy użyciu automatycznego systemu pipetowania do zasiewania zawiesiny komórkowej, zapewniając w ten sposób jednorodność wielkości i kształtu sferoidy. Te sferoidy ASC mogą być używane jako elementy budulcowe dla podejść do biodruku 3D.

Wielkoskalowa, zautomatyzowana produkcja sferoid komórek macierzystych pochodzących z tkanki tłuszczowej do biodruku 3D

Adipose-derived stromal/stem cells (ASCs) are a subpopulation of cells found in the stromal vascular fraction of human subcutaneous adipose tissue ...

Znaczenie protokołu polega na ograniczeniu błędów ludzkich i zanieczyszczeń mikrobiologicznych. Ponadto odpowiedzialny za produkcję tysięcy sferoid do podejść do biodruku 3D. Główną zaletą tej sprawy jest jednak to, że zoptymalizowano godziny pracy.Parametry oprogramowania są kluczowe, ponieważ mogą wpływać na końcową jakość sferoid. A najlepszą radą byłoby wykonywanie testów tylko z pożywkami do hodowli komórkowych. Wizualna demonstracja tej metody ma kluczowe znaczenie, ponieważ jest to stara tradycyjna metoda hodowli komórek 3D oparta na Begin polegającym na pobraniu zawiesiny komórek macierzystych za pomocą 10-mililitrowej pipety serologicznej i przeniesieniu jej do 50-mililitrowej probówki wirówkowej.Następnie odwirować w temperaturze 400 RCF przez 5 minut, aby uzyskać osad ASC. Ponownie zawiesić osad komórkowy za pomocą DMEM-Low zawierającego 10% FBS. Po zliczeniu komórek należy umieścić ASC w oddzielnych 15-mililitrowych probówkach wirówkowych, aby zasiać 81 i 256 recesji mikroformowanych nieprzylegającym hydrożelem.Szczegółowe informacje na temat liczby użytych komórek można znaleźć w rękopisie tekstu. Dodaj 500 mikrolitrów sterylnego 2% ultra czystego roztworu agarozy na środek silikonowej formy zawierającej 81 lub 256 okrągłych wgłębień. Po 40 minutach wyjmij ultra czystą agarozę z formy silikonowej i umieść ją w dołku 12-dołkowej plastikowej płytki.Dodaj dwa mililitry DMEM-Low do studzienki z mikroformowaną agarozą i inkubuj w temperaturze 37 stopni Celsjusza z 5% dopływem atmosferycznego dwutlenku węgla przez co najmniej 12 godzin przed wysiewem ASC. Upewnij się, że przepływ laminarny jest włączony, a przepływ powietrza w szafie działa prawidłowo. Upewnij się, że urządzenie jest podłączone do właściwej objętościtage i tablet jest podłączony do urządzenia.Sprawdź, czy wysokość szyby ochronnej szafy jest na tym samym poziomie, co oznaczenie czujnika urządzenia. Naciśnij przycisk włączania lub wyłączania po lewej stronie urządzenia. Następnie poczekaj, aż tablet i sprzęt się uruchomią.Umieść pudełka na końcówki, stojak na probówki wirówkowe i płytkę zawierającą mikroformowany hydrożel agarozowy w przestrzeni roboczej urządzenia. W oprogramowaniu otwartym na tablecie kliknij LabWare Editor. Skonfiguruj wirtualny stół roboczy i wybierz pozycje pipet, pojemników na końcówki, stojaka na plastikowe rurki i płytek.Kliknij przycisk przełączania do procedury, aby uwzględnić wszystkie parametry i polecenia wykonywane przez sprzęt podczas eksperymentu. Poczekaj, aż w oprogramowaniu otworzy się pasek narzędzi i lista procedur. Początkowo, aby wskazać polecenia, należy wprowadzić liczbę próbek do pipetowania i przeciągnąć ją na listę procedur.Następnie kliknij na transfer odczynników"przycisk poleceń w oprogramowaniu, aby przenieść zawiesinę ASC do dołków 12-dołkowej płytki zawierającej mikropleśnie i przeciągnij ją do listy procedur. Kliknij właściwości"aby ustawić pozycje początkowe" i końcowe dla sprzętu do przenoszenia próbki. Poczekaj, aż oprogramowanie powróci do strony Stół roboczy.Skonfiguruj parametry automatycznego rozmieszczania ASC zgodnie z opisem w manuskrypcie tekstowym. Wybierz wodę jako standardowy rodzaj cieczy. Kliknij na opcje", aby ustawić parametry w celu utworzenia jednorodnego zawieszenia ASC, zgodnie z opisem w rękopisie tekstowym.Kliknij przycisk z symbolem wyboru na górnym pasku oprogramowania, aby upewnić się, że nie ma błędu programowania. Kliknij na "grać"przycisk na górnym pasku oprogramowania, aby uruchomić program. Pozwól sprzętowi uruchomić się zgodnie z programem.I poczekaj, aż wyda dźwięk wskazujący, że się skończył. Zebrać 12-dołkową płytkę, a następnie inkubować ją w temperaturze 37 stopni Celsjusza z 5% atmosferycznym dopływem dwutlenku węgla przez co najmniej 18 godzin, aby umożliwić pełne i zwarte tworzenie sferoid. Ręcznie zbierz sferoidy po jednym, trzech i siedmiu dniach hodowli w celu analizy.Przepłucz podłoże mikropipetą, aby uwolnić sferoidy z mikroformowanego, nieprzywierającego hydrożelu agarozowego. Zbierz sferoidy ręcznie za pomocą mikropipety i przenieś je do 15-mililitrowej probówki wirówkowej. W sumie zmierzono 85 i 160 sferoid z mikroformowanych nieadhezyjnych hydrożeli z odpowiednio 81 i 256 okrągłymi recesjami.Automatyczny system pipet w ciągu 15 minut umieścił zawiesinę komórek ASC w 12 dołkach na pojedynczej 12-dołkowej płytce. Używając 81 mikroformowanych, nieprzylegających hydrożeli, wyprodukowano 972 sferoidy w tym badaniu. Podczas gdy 256 mikroformowany, nieprzylegający hydrożel, wytworzył 3072 sferoidy.Sferoidy ASC analizowano pod kątem jednorodności ich wielkości i kształtu. Steroidy ASC z mikropleśni z 81 recesjami wykazały jednorodną średnicę w okresie hodowli. W przeciwieństwie do sterydów ASC z mikropleśni z 256 recesjami, stosunek najmniejszych i największych średnic był bliski jednemu w sferoidach ASC z mikropleśni z 81 i 256 recesjami.Analizy żywotności, morfologii i siły dostarczyły dowodów na udaną produkcję sferoid ASC na dużą skalę. Najczęściej chodzi o to, aby problem został rozwiązany nagle bez błędów.

large-scale-automated-production-adipose-derived-stem-cell-spheroids

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioinżynieria

A kartezjańska biodrukarka została zaprojektowana i wyprodukowana, aby umożliwić osadzanie wielu materiałów w precyzyjnych, powtarzalnych geometriach, jednocześnie umożliwiając kontrolę czynników środowiskowych. Korzystając z trójwymiarowej biodrukarki, można drukować i łatwo odtwarzać złożone i żywotne konstrukcje.

Żywotność biodrukowanych konstruktów komórkowych przy użyciu drukarki kartezjańskiej z trzema dozownikami

Ten protokół opisuje metodologię biodruku przy użyciu zautomatyzowanego zrobotyzowanego systemu deponowania, który łączy wytrawione wskazówki topograficzne z precyzyjnym osadzaniem biotuszu z hydrożelu na komórce. Wydrukowane komórki są dostarczane bezpośrednio do wytrawionych elementów i są w stanie je wyczuć i zorientować się w sytuacji.

Zautomatyzowana zrobotyzowana technika dozowania do prowadzenia powierzchni i biodruku komórek

Ten protokół opisuje biodrukowanie 3D tkanki serca bez użycia biomaterials. 3D biodrukowane plastry serca wykazują mechaniczną integrację sferoid składowych i są bardzo obiecujące w regeneracji tkanki serca oraz jako modele 3D chorób serca.

Tworzenie tkanki serca wykazującej mechaniczną integrację sferoid za pomocą biodruku 3D

Opracowaliśmy heterogeniczny model raka piersi składający się z unieśmiertelnionych komórek guza i fibroblastów osadzonych w biodrukowalnym biotuszu alginian/żelatyna. Model podsumowuje mikrośrodowisko guza in vivo i ułatwia tworzenie wielokomórkowych sferoid guza, dostarczając informacji na temat mechanizmów napędzających nowotworzenie nowotworów.

Biodrukowalny hydrożel alginianowo-żelatynowy 3D Systemy modelowe in vitro indukują tworzenie sferoidów komórkowych

Prezentujemy napędzane silnikiem odśrodkowe urządzenie mikroprzepływowe, które może hodować sferoidy komórek. Za pomocą tego urządzenia sferoidy jednego lub wielu typów komórek mogą być łatwo hodowane w warunkach wysokiej grawitacji.

Platforma lab-on-a-CD do generowania wielokomórkowych trójwymiarowych sferoid

Celem tego protokołu jest bezpośrednie biodrukowanie komórek nabłonka piersi jako wielokomórkowych sferoid na wstępnie utworzonych sieciach śródbłonka, aby szybko stworzyć modele 3D kokultury piersi i śródbłonka, które mogą być wykorzystane do badań przesiewowych leków.

Bezpośrednie biodrukowanie wielokomórkowych sferoid piersi 3D na sieciach śródbłonka

Obecny protokół opisuje technikę wytwarzania sferoidów tkankowych na dużą skalę przy użyciu wydrukowanego w 3D urządzenia przypominającego stempel.

Generowanie sferoid tkankowych za pomocą wydrukowanego w 3D urządzenia przypominającego stempel

Zaprojektowane klapy wymagają wbudowanej funkcjonalnej sieci naczyniowej. W tym protokole przedstawiamy metodę wytwarzania wydrukowanego w 3D płata tkankowego zawierającego hierarchiczną sieć naczyniową i jej bezpośrednie zespolenia mikrochirurgiczne z tętnicą udową szczura.

Wytwarzanie zaprojektowanych płatów naczyniowych przy użyciu technologii druku 3D

Tutaj opisujemy różne metody tworzenia wielokomórkowych sferoidów, aby przeprowadzić następczą wieloparametrową mikroskopię żywych komórek. Wykorzystując mikroskopię obrazowania czasu życia fluorescencji (FLIM), autofluorescencję komórkową, barwniki barwiące i nanocząstki, przedstawiono podejście do analizy metabolizmu komórkowego, niedotlenienia i śmierci komórki w żywych trójwymiarowych (3D) nowotworach i sferoidach pochodzących z komórek macierzystych.

Produkcja i wieloparametrowa mikroskopia obrazowania czasu życia fluorescencji żywych komórek (FLIM) sferoid wielokomórkowych

To badanie przedstawia opłacalną i efektywną metodologię generowania struktur komórkowych 3D za pomocą systemu opartego na stemplach do tworzenia mikrostudzienek w formach agarozowych. System sprzyja tworzeniu się jednolitych sferoidów/organoidów, poprawiając w ten sposób interakcje komórkowe. Takie podejście zmniejsza zmienność eksperymentalną i wspiera zastosowania w testowaniu leków i inżynierii tkankowej.

Generowanie trójwymiarowych sferoidów/organoidów z dwuwymiarowych kultur komórkowych przy użyciu nowatorskiego urządzenia do stemplowania

Poznaj zautomatyzowaną metodę produkcji sferoid komórek macierzystych z tkanki tłuszczowej do biodruku 3D. Protokół zmniejsza ryzyko zanieczyszczeń mikrobiologicznych i optymalizuje czas pracy.

Wielkoskalowa, zautomatyzowana produkcja sferoid komórek macierzystych pochodzących z tkanki tłuszczowej do biodruku 3D

Przeglądaj więcej filmów