Wielkoskalowa, zautomatyzowana produkcja sferoid komórek macierzystych pochodzących z tkanki tłuszczowej do biodruku 3D
31 marca 2022
Tutaj opisujemy produkcję na dużą skalę sferoidów zrębu/komórek macierzystych (ASC) pochodzących z tkanki tłuszczowej przy użyciu automatycznego systemu pipetowania do zasiewania zawiesiny komórkowej, zapewniając w ten sposób jednorodność wielkości i kształtu sferoidy. Te sferoidy ASC mogą być używane jako elementy budulcowe dla podejść do biodruku 3D.
Znaczenie protokołu polega na ograniczeniu błędów ludzkich i zanieczyszczeń mikrobiologicznych. Ponadto odpowiedzialny za produkcję tysięcy sferoid do podejść do biodruku 3D. Główną zaletą tej sprawy jest jednak to, że zoptymalizowano godziny pracy.
Parametry oprogramowania są kluczowe, ponieważ mogą wpływać na końcową jakość sferoid. A najlepszą radą byłoby wykonywanie testów tylko z pożywkami do hodowli komórkowych. Wizualna demonstracja tej metody ma kluczowe znaczenie, ponieważ jest to stara tradycyjna metoda hodowli komórek 3D oparta na Begin polegającym na pobraniu zawiesiny komórek macierzystych za pomocą 10-mililitrowej pipety serologicznej i przeniesieniu jej do 50-mililitrowej probówki wirówkowej.
Następnie odwirować w temperaturze 400 RCF przez 5 minut, aby uzyskać osad ASC. Ponownie zawiesić osad komórkowy za pomocą DMEM-Low zawierającego 10% FBS. Po zliczeniu komórek należy umieścić ASC w oddzielnych 15-mililitrowych probówkach wirówkowych, aby zasiać 81 i 256 recesji mikroformowanych nieprzylegającym hydrożelem.
Szczegółowe informacje na temat liczby użytych komórek można znaleźć w rękopisie tekstu. Dodaj 500 mikrolitrów sterylnego 2% ultra czystego roztworu agarozy na środek silikonowej formy zawierającej 81 lub 256 okrągłych wgłębień. Po 40 minutach wyjmij ultra czystą agarozę z formy silikonowej i umieść ją w dołku 12-dołkowej plastikowej płytki.
Dodaj dwa mililitry DMEM-Low do studzienki z mikroformowaną agarozą i inkubuj w temperaturze 37 stopni Celsjusza z 5% dopływem atmosferycznego dwutlenku węgla przez co najmniej 12 godzin przed wysiewem ASC. Upewnij się, że przepływ laminarny jest włączony, a przepływ powietrza w szafie działa prawidłowo. Upewnij się, że urządzenie jest podłączone do właściwej objętościtage i tablet jest podłączony do urządzenia.
Sprawdź, czy wysokość szyby ochronnej szafy jest na tym samym poziomie, co oznaczenie czujnika urządzenia. Naciśnij przycisk włączania lub wyłączania po lewej stronie urządzenia. Następnie poczekaj, aż tablet i sprzęt się uruchomią.
Umieść pudełka na końcówki, stojak na probówki wirówkowe i płytkę zawierającą mikroformowany hydrożel agarozowy w przestrzeni roboczej urządzenia. W oprogramowaniu otwartym na tablecie kliknij LabWare Editor. Skonfiguruj wirtualny stół roboczy i wybierz pozycje pipet, pojemników na końcówki, stojaka na plastikowe rurki i płytek.
Kliknij przycisk przełączania do procedury, aby uwzględnić wszystkie parametry i polecenia wykonywane przez sprzęt podczas eksperymentu. Poczekaj, aż w oprogramowaniu otworzy się pasek narzędzi i lista procedur. Początkowo, aby wskazać polecenia, należy wprowadzić liczbę próbek do pipetowania i przeciągnąć ją na listę procedur.
Następnie kliknij na transfer odczynników"przycisk poleceń w oprogramowaniu, aby przenieść zawiesinę ASC do dołków 12-dołkowej płytki zawierającej mikropleśnie i przeciągnij ją do listy procedur. Kliknij właściwości"aby ustawić pozycje początkowe" i końcowe dla sprzętu do przenoszenia próbki. Poczekaj, aż oprogramowanie powróci do strony Stół roboczy.
Skonfiguruj parametry automatycznego rozmieszczania ASC zgodnie z opisem w manuskrypcie tekstowym. Wybierz wodę jako standardowy rodzaj cieczy. Kliknij na opcje", aby ustawić parametry w celu utworzenia jednorodnego zawieszenia ASC, zgodnie z opisem w rękopisie tekstowym.
Kliknij przycisk z symbolem wyboru na górnym pasku oprogramowania, aby upewnić się, że nie ma błędu programowania. Kliknij na "grać"przycisk na górnym pasku oprogramowania, aby uruchomić program. Pozwól sprzętowi uruchomić się zgodnie z programem.
I poczekaj, aż wyda dźwięk wskazujący, że się skończył. Zebrać 12-dołkową płytkę, a następnie inkubować ją w temperaturze 37 stopni Celsjusza z 5% atmosferycznym dopływem dwutlenku węgla przez co najmniej 18 godzin, aby umożliwić pełne i zwarte tworzenie sferoid. Ręcznie zbierz sferoidy po jednym, trzech i siedmiu dniach hodowli w celu analizy.
Przepłucz podłoże mikropipetą, aby uwolnić sferoidy z mikroformowanego, nieprzywierającego hydrożelu agarozowego. Zbierz sferoidy ręcznie za pomocą mikropipety i przenieś je do 15-mililitrowej probówki wirówkowej. W sumie zmierzono 85 i 160 sferoid z mikroformowanych nieadhezyjnych hydrożeli z odpowiednio 81 i 256 okrągłymi recesjami.
Automatyczny system pipet w ciągu 15 minut umieścił zawiesinę komórek ASC w 12 dołkach na pojedynczej 12-dołkowej płytce. Używając 81 mikroformowanych, nieprzylegających hydrożeli, wyprodukowano 972 sferoidy w tym badaniu. Podczas gdy 256 mikroformowany, nieprzylegający hydrożel, wytworzył 3072 sferoidy.
Sferoidy ASC analizowano pod kątem jednorodności ich wielkości i kształtu. Steroidy ASC z mikropleśni z 81 recesjami wykazały jednorodną średnicę w okresie hodowli. W przeciwieństwie do sterydów ASC z mikropleśni z 256 recesjami, stosunek najmniejszych i największych średnic był bliski jednemu w sferoidach ASC z mikropleśni z 81 i 256 recesjami.
Analizy żywotności, morfologii i siły dostarczyły dowodów na udaną produkcję sferoid ASC na dużą skalę. Najczęściej chodzi o to, aby problem został rozwiązany nagle bez błędów.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejszy artykuł opisuje protokół wielkoskalowej produkcji sferoidów z komórek macierzystych/stromalnych pochodzących z tkanki tłuszczowej (ASC) z wykorzystaniem zautomatyzowanego systemu pipetowania. Metoda ta zwiększa homogeniczność rozmiaru i kształtu sferoidów, czyniąc je odpowiednimi do zastosowań w biodruku 3D.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Hodowle komórkowe
- Biodruk 3D
- Badania nad komórkami macierzystymi
Wprowadzenie
- Tradycyjne metody hodowli komórkowych 3D mogą być podatne na błędy ludzkie.
- Kontaminacja mikrobiologiczna stanowi istotny problem w hodowlach komórkowych.
- Systemy zautomatyzowane mogą zoptymalizować proces produkcji.
- Jakość sferoidów zależy od parametrów oprogramowania.
Cel badania
- Ograniczenie błędów ludzkich podczas produkcji sferoidów.
- Zminimalizowanie ryzyka kontaminacji.
- Efektywna produkcja tysięcy sferoidów na potrzeby badań i zastosowań.
Zastosowane metody
- Zautomatyzowany system pipetowania do wysiewu zawiesiny komórkowej.
- Zastosowanie pipet serologicznych do zbierania zawiesiny komórek macierzystych.
- Przenoszenie zawiesiny komórkowej do probówek do wirowania w celu przeprowadzenia dalszych procesów.
- Testy z użyciem pożywek do hodowli komórkowych w celu optymalizacji warunków.
Główne wyniki
- Skuteczna produkcja jednorodnych sferoidów ASC.
- Zmniejszenie nakładu pracy potrzebnej do wytworzenia sferoidów.
- Udoskonalona kontrola jakości dzięki automatyzacji.
- Zaprezentowanie skuteczności metody w formacie wizualnym.
Wnioski
- Zautomatyzowana metoda zwiększa niezawodność produkcji sferoidów.
- Stanowi ona skalowalne rozwiązanie dla zastosowań w biodruku 3D.
- Przyszłe badania mogą opierać się na tym protokole w różnych zastosowaniach.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Wielkoskalowa, zautomatyzowana produkcja sferoidów z komórek macierzystych pochodzących z tkanki tłuszczowej (ASC) eliminuje krytyczne wąskie gardło w procesach biodruku 3D, umożliwiając powtarzalne generowanie jednolitych jednostek budulcowych przy zminimalizowanym ryzyku kontaminacji. Zdolność ta zwiększa pewność prognostyczną w inżynierii tkankowej i wspiera skalowalne, wysokoprzepustowe potoki biofabrykacji. Niezawodna produkcja sferoidów bezpośrednio wpływa na potencjał translacyjny tkanek inżynieryjnych w zastosowaniach przedklinicznych i na etapie odkryć.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Umożliwia rzetelną weryfikację hipotez dotyczących oddziaływań międzykomórkowych oraz oddziaływań między komórkami a macierzą w mikrośrodowiskach 3D.
- Wspiera ograniczanie ryzyka biologicznego poprzez dostarczenie fizjologicznie istotnych modeli tkanek.
- Ułatwia funkcjonalną walidację celów terapeutycznych dzięki standaryzowanym i powtarzalnym systemom sferoidów.
Przesiewanie i opracowanie analizy
- Przygotowuje zwalidowane, homogeniczne sferoidy do późniejszego screeningu związków oraz opracowywania testów.
- Poprawia powtarzalność testów i spójność wyników ilościowych poprzez minimalizację błędów ludzkich oraz kontaminacji.
- Umożliwia skalowalną produkcję gotowych do testów mikro-tkanek 3D dla procesów wysokoprzepustowych.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Zapewnia istotne dla przebiegu choroby trójwymiarowe konstrukty tkankowe do modelowania translacyjnego i badań nad biomarkerami.
- Zapewnia ciągłość od etapu odkrycia po walidację przedkliniczną poprzez standaryzację jakości i wielkości sferoidów.
- Zmniejsza ryzyko przy wdrażaniu konstruktów tkankowych do badań in vivo oraz badań translacyjnych.
Integracja potoku i przepływu pracy
Ta zautomatyzowana metoda produkcji sferoidów wpisuje się w obszar łączący wczesne etapy odkryć, rozwój testów oraz tworzenie modeli przedklinicznych, wspierając przejście od badań opartych na hipotezach do skalowalnej inżynierii tkankowej.
- Biologia odkrywcza: Wspiera badania mechanistyczne poprzez umożliwienie kontrolowanych środowisk hodowli 3D do weryfikacji hipotez.
- Przesiewanie: Dostarcza powtarzalne, ilościowe wyniki w postaci sferoidów do oceny związków i standaryzacji testów.
- Analityka: Zapewnia mierzalne, jednorodne populacje sferoidów do analizy porównawczej w różnych warunkach.
- Badania translacyjne: Odpowiada na potrzeby modelowania chorób i poszukiwania biomarkerów poprzez wytwarzanie fizjologicznie istotnych konstruktów 3D.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Tworzy skalowalną, zautomatyzowaną możliwość wielokrotnego zastosowania w wielu programach B+R.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorczy
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność prognostyczną i zmniejsza niejednoznaczność mechanistyczną w modelowaniu tkanek 3D.
- Wartość operacyjna: Standaryzuje produkcję, skraca czas pracy i minimalizuje ryzyko kontaminacji.
- Wartość strategiczna: Umożliwia lepsze podejmowanie decyzji o kontynuacji lub przerwaniu badań oraz zwiększa efektywność kapitałową poprzez wspieranie wysokoprzepustowych, powtarzalnych procesów roboczych.
- Wpływ na portfolio: Ułatwia priorytetyzację skorygowaną o ryzyko oraz rozwój projektów z zakresu inżynierii tkankowej.
Uwagi dotyczące wdrożenia
- Wymagana jest wiedza specjalistyczna w zakresie hodowli komórek macierzystych oraz procesów biodruku 3D.
- Niezbędny jest dostęp do zautomatyzowanych systemów pipetowania oraz infrastruktury do mikroodlewania hydrożeli.
- Wymagana jest standaryzacja parametrów oprogramowania i protokołów kontroli jakości pomiędzy zespołami.
- Możlizna jest konieczność adaptacji metody dla różnych typów komórek lub formatów hydrożeli.
- Homogenność i żywotność muszą być rutynowo walidowane, aby zapewnić wiarygodność dalszych etapów analizy.
Najczęściej zadawane pytania dotyczące biofarmacji
Chapters in this video
0:05
Introduction
0:55
Trypsinization of ASC Monolayer at Passage Three
1:45
Micro Molded Non-Adherent Agarose Hydrogel Fabrication
2:31
Bio-Fabrication of ASC Spheroids Using the Automated Pipetting System
5:48
Results: Automated Pipette System for Large-Scale Generation of ASC Spheroids
7:17
Conclusion
