Name: Rozwój organoidów z przysadki mysiej jako modelu in vitro w celu zbadania biologii przysadkowych komórek macierzystych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-02-25T14:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 48 s
Description: Poznaj metodę hodowli organoidów przysadki mysiej w celu badania biologii komórek macierzystych. Technika ta umożliwia wiarygodne rozwijanie pierwotnych komórek macierzystych przysadki w warunkach homeostazy, starzenia i wzrostu guzów.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez granty z Funduszu Badawczego KU Leuven i Funduszu Badań Naukowych (FWO) - Flandria. E.L. (11A3320N), i C.N. (1S14218N) są wspierane przez stypendium doktoranckie z FWO/FWO-SB.

Eksperymenty na zwierzętach w tym badaniu zostały zatwierdzone przez Komitet Etyczny ds. Eksperymentów na Zwierzętach KU Leuven (P153/2018). Wszystkie myszy były trzymane w uniwersyteckim ośrodku dla zwierząt w znormalizowanych warunkach (stała temperatura 23 ± 1,5 °C, wilgotność względna 40%-60% i cykl dnia i nocy 12 godzin), z dostępem do wody i pożywienia ad libitum.
1. Myszy
<ol>
	<li>Używaj dostępnych na rynku szczepów myszy, takich jak myszy C57BL/6J, w wieku młodych dorosłych (8-12 tygodni). Ogólnie rzecz biorąc, 2-3 myszy zapewniają wystarczającą liczbę komórek AL do protokołu.</li>
</ol>
2. Izolacja i dysocjacja myszy AL
UWAGA: Średnie A, B i C są przygotowywane z wyprzedzeniem19,20. Składy przedstawiono w tabeli 2.
<ol>
	<li>Izolacja mysiego AL
	<ol>
		<li>Poddaj myszy eutanazji przez uduszenie CO2 , a następnie ścięcie głowy (<silna klasa = "xfig">Ryc. 2A). Umyj głowy myszy wodą dejonizowaną, aby usunąć krew i spryskaj je 70% EtOH, aby wytworzyć sterylne środowisko.</li>
		<li>Za pomocą sterylnych narzędzi chirurgicznych usuń skórę głowy między uszami (<silna klasa="xfig">Ryc. 2B).</li>
		<li>Otwórz czaszkę i usuń mózg.
		<ol>
			<li>Złam "grzbiet nosowy" (tj. przednią część kości czołowej; <silna klasa="xfig">Rysunek 2B) za pomocą sterylnych nożyczek.</li>
			<li>Otwórz czaszkę dalej nożyczkami, zaczynając od złamanego grzbietu nosa w kierunku uszu, po obu stronach (<silna klasa="xfig">Rysunek 2C).</li>
			<li>Usuń czaszkę i mózg za pomocą sterylnej pęsety, nie dotykając przysadki mózgowej (<silna klasa="xfig">Rysunek 2D).</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Usuń przeponę za pomocą pęsety, nie uszkadzając przysadki mózgowej. Odrzuć PL i IL z AL pod mikroskopem stereoskopowym. 
		UWAGA: PL i IL są połączone, a tym samym usuwane jednocześnie. Części te wyglądają jak biała tkanka, w porównaniu z różowym AL (<silna klasa="xfig">Rysunek 2D).</li>
		<li>Ostrożnie wyizolować AL pęsetą i zebrać go w kolbie Erlenmeyera o pojemności 10 ml, wypełnionej 3 ml pożywki A (patrz Tabela 2). Umieścić kolbę na lodzie do czasu dalszej obróbki.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Dysocjacja AL myszy
	<ol>
		<li>Usunąć sklarowaną nad osadem (SN) pożywkę A z kolby Erlenmeyera zawierającej wyizolowany AL. Dodać 2 ml wstępnie podgrzanego (37 °C) 2,5% roztworu trypsyny i inkubować w temperaturze 37 °C przez 15 minut.</li>
		<li>Nie usuwając roztworu trypsyny, dodać 2 ml wstępnie podgrzanego (37 °C) roztworu DNazy (2 μg/ml w pożywce A; sterylnie przefiltrowanej przez siatkę 0,22 μm) i zamieszać kolbę Erlenmeyera 10 razy. Pozwól, aby przysadka opadła na dno (~1 min) i usuń SN.</li>
		<li>Dodać 2 ml podgrzanego (37 °C) roztworu inhibitora trypsyny (0,1 mg/ml w pożywce A; sterylnie przefiltrowanym przez siatkę 0,22 μm) i inkubować w temperaturze 37 °C przez 10 minut. Niech przysadka osadza się na dnie i usuń SN.</li>
		<li>Dodać 2 ml podgrzanego (37 °C) podłoża B (patrz tabela 2) i inkubować w temperaturze 37 °C przez 5 minut. Nie usuwając SN, dodać 2 ml wstępnie podgrzanego (37 °C) podłoża C (patrz tabela 2) i inkubować w temperaturze 37 °C przez 15 minut.</li>
		<li>Pozwól, aby przysadka opadła na dno i usuń SN. Przepłukać przysadkę trzykrotnie podgrzanym (37 °C) medium C.</li>
		<li>Dysocjuj przysadkę mózgową na pojedyncze komórki.
		<ol>
			<li>Dodać 2 ml podgrzanego (37 °C) podłoża C. Kilkakrotnie odessać i wydalić przysadkę mózgową sterylną, wypolerowaną płomieniowo pipetą Pasteura, aż fragmenty przestaną być widoczne.</li>
			<li>Przenieść zawiesinę do probówki o pojemności 15 ml z 4,5 ml wstępnie podgrzanego (37 °C) roztworu DNazy (2 μg/ml w pożywce A; sterylnie przefiltrowane przez siatkę 0,22 μm). Przepłukać Erlenmeyera trzykrotnie 2 ml wstępnie podgrzanego (37 °C) podłoża C i przenieść zawiesinę do probówki o pojemności 15 ml.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Wymieszaj zebraną zawiesinę komórek i przefiltruj ją przez sitko o pojemności 40 μm do probówki o pojemności 30 ml. Przepłukać trzykrotnie probówkę o pojemności 15 ml i sitko do komórek 2 ml pożywki C i przenieść zawiesinę do probówki o pojemności 30 ml.</li>
		<li>Umieścić końcówkę szklanej pipety Pasteura, wypełnioną 2 ml 3% roztworu albuminy surowicy bydlęcej (BSA) (w pożywce A; sterylnie przefiltrowanej przez siatkę 0,22 μm) na dnie probówki i delikatnie odpipetować, aby utworzyć widoczną warstwę gęstości. Wirować przy 190 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C.</li>
		<li>Usuń SN, odwracając rurkę jednym płynnym ruchem i usuń pozostałe kropelki SN za pomocą końcówki P1000. Ponownie zawiesić osad komórkowy w 1 ml lodowatego Advanced DMEM/F12 (Adv DMEM/F12) i oznaczyć ilościowo komórki za pomocą licznika komórek.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Zakładanie i hodowla organoidów pochodzących z AL
UWAGA: Rozmrozić ECM na lodzie z wyprzedzeniem (2-3 godziny na 1 ml) i trzymać go na lodzie przez cały czas trwania protokołu.
<ol>
	<li>Siew i hodowla organoidów
	<ol>
		<li>Odwirować zawiesinę komórek AL o stężeniu 190 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C i usunąć SN. Ponownie zawiesić osad komórkowy w Adv DMEM/F12, używając objętości właściwej obliczonej w celu osiągnięcia gęstości komórek 1,1 x 106 komórek/mL. 
		UWAGA: Na przykład, jeśli zawiesina komórek zawiera 500 000 komórek/ml, należy ponownie zawiesić osad komórkowy w 454,54 μl Adv DMEM/F12, aby osiągnąć pożądaną gęstość 1,1 x 106 komórek/ml.</li>
		<li>Pobrać objętość zawiesiny komórek potrzebną do posiewu (zgodnie z pożądaną liczbą dołków do wysiewu w celu rozwoju organoidów) i dodać ECM w stosunku 30:70 (30% zawiesiny komórek (w Adv DMEM/F12 ) i 70% ECM). Dobrze wymieszać, pipetując w górę i w dół. 
		UWAGA: Na przykład, dla jednej kropli 30 μL (patrz krok 3.1.3), należy (delikatnie) zmieszać 9 μl zawiesiny komórkowej (zawierającej ~10 000 komórek pobranych z zawiesiny 1,1 x 106 komórek/ml) z 21 μl ECM.</li>
		<li>Na każdy studzienek należy nanieść 30 μl kropli mieszaniny zawiesiny komórek/ECM (patrz krok 3.1.2) na wstępnie ogrzaną (37 °C) 48-dołkową płytkę. Odwrócić płytkę do góry nogami i pozostawić ECM do zestalenia się w temperaturze 37 °C przez 20 minut 
		UWAGA: Wstępnie podgrzej płytki hodowlane przez co najmniej 24 godziny w temperaturze 37 °C.</li>
		<li>Przywróć płytkę do właściwej orientacji i ostrożnie dodaj 250 μl wstępnie podgrzanego (37 °C) PitOM (patrz Tabela 1) uzupełnionego 10 μM inhibitorem skał (Y-27632).</li>
		<li>Kontynuuj hodowlę organoidów, zmieniając podłoże (pozbawione Y-27632) co 2-3 dni, aż organoidy będą w pełni rozwinięte, co zajmuje od 10 do 14 dni (<silna klasa = "xfig">Rysunek 3A). Następnie przełóż organoidy. 
		UWAGA: Podczas zasysania medium należy uważać, aby nie zakłócić pracy kopuły ECM. Lekko przechyl płytkę hodowlaną i usuń pożywkę z dolnej krawędzi studzienki. Świeże (podgrzane w temperaturze 37 °C) podłoże należy delikatnie dodać na bok studzienki. Jeśli kropelki żelu odczepią się, zebrać organoidy i ponownie je zawiesić, a następnie ponownie wyhodować w nowej kropli ECM.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Pasażowanie organoidów
	<ol>
		<li>Delikatnie odessać pożywkę i dodać 400 μl lodowatego Adv DMEM/F12 w celu rozdrobnienia ECM i zebrania organoidów w probówce do mikrowirówki. Przemyć raz 400 μl lodowatego Adv DMEM/F12 EM. Wirować przy 200 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C.</li>
		<li>Ostrożnie usunąć SN i dodać 400 μl podgrzanego (37 °C) enzymu TrypLE Express (1X). Wymieszać kilkakrotnie odwracając probówkę i inkubować w temperaturze 37 °C przez 5 minut.</li>
		<li>Dodać 400 μl lodowatego Adv DMEM/F12 i odwirować przy 200 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C. Usunąć SN.</li>
		<li>Zawiesić osad w 100 μl lodowatego Adv DMEM/F12, a następnie rozbić organoidy poprzez energiczne pipetowanie w górę iw dół zwężoną końcówką P200 (tj. docisnąć pustą końcówkę do dna probówki do mikrowirówki, aby zmniejszyć jej średnicę otworu), aż do uzyskania fragmentów organoidów (o średnicy około 50 μm) (<silna klasa="xfig">Rysunek 3B). 
UWAGA: Mieszanina dysocjująca powinna zawierać głównie fragmenty organoidów i tylko kilka pojedynczych komórek. Ostra dysocjacja organoidów na pojedyncze komórki negatywnie wpływa na ponowny wzrost organoidów.</li>
		<li>Dodać 800 μl Adv DMEM/F12 i odwirować przy 190 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C. Usunąć SN.</li>
		<li>Pasaż organoidy w stosunku 1:2 do 1:4. Ponownie zawiesić osad w odpowiedniej objętości Adv DMEM/F12 zgodnie z potrzebami do posiewu i dodać ECM w stosunku 30:70 (30% zawiesiny komórek i 70% ECM). Dobrze wymieszaj, pipetując w górę i w dół.</li>
		<li>Wysiewanie nasion i hodowla organoidów zgodnie z powyższym opisem w krokach 3.1.3-3.1.5. 
		UWAGA: Średnio z 10 000 wysianych komórek całego AL (0,2%) rozwija się średnio 20 organoidów na studzienkę. Te organoidy pasażowe 0 można podzielić w stosunku 1:2, co daje >50 organoidów rozwijających się na dołek (pasaż 1). Organoidy mogą być następnie dzielone w stosunku 1:2 do 1:4 podczas kolejnych pasaży. Ponowny wzrost organoidów spowalnia po ~10 pasażach (co odpowiada 3 miesiącom hodowli), konkretyzując się w stopniowo coraz mniejszej liczbie i mniejszych organoidach.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. Kriokonserwacja organoidów pochodzących z AL i ich rozmrażanie
<ol>
	<li>Kriokonserwacja organoidów
	<ol>
		<li>Postępuj zgodnie z protokołem przejścia od kroku 3.2.1 do kroku 3.2.5.</li>
		<li>Zawiesić osad organoidowy (zawierający fragmenty i komórki) w 1 ml pożywki do kriokonserwacji (Tabela 3). Przenieść zawiesinę do kriowialnego i umieścić na lodzie. 
		UWAGA: Organoidy (tj. powstałe fragmenty i komórki) z maksymalnie czterech dołków 48-dołkowej płytki można połączyć w jednym kriowialu.</li>
		<li>Umieścić kriowiale w pojemniku do zamrażania i przenieść je do temperatury -80 °C.</li>
		<li>Po 24 godzinach przenieść próbki do krioboxu i przechowywać je w ciekłym azocie (-196 °C) do długotrwałego przechowywania.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Rozmrażanie kriokonserwowanych organoidów
	<ol>
		<li>Wyjmij kriowial ze zbiornika ciekłego azotu i umieść go na lodzie. Natychmiast przejdź do protokołu rozmrażania.</li>
		<li>Rozmrozić roztwór z kriokonserwowanymi fragmentami organoidów i pojedynczymi komórkami w temperaturze 37 °C (łaźnia wodna). 
		UWAGA: Nie przechowywać roztworu dłużej niż 2 minuty w temperaturze 37 °C, aby uniknąć toksyczności komórek przez DMSO.</li>
		<li>Przenieść zawartość do probówki o pojemności 15 ml zawierającej 10 ml lodowatego Adv DMEM/F12 z 30% płodową surowicą bydlęcą (FBS). Przepłukać kriowial 1 ml Adv DMEM/F12 z 30% FBS.</li>
		<li>Wirować przy 190 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C. Zawiesić osad w 1 ml lodowatego Adv DMEM/F12 i przenieść zawiesinę do probówki do mikrowirówki.</li>
		<li>Wirować przy 190 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C. Zawiesić osad w odpowiedniej objętości Adv DMEM/F12 zgodnie z potrzebami do posiewu i dodać ECM w stosunku 30:70. Dobrze wymieszaj, pipetując w górę i w dół.</li>
		<li>Wysiewanie nasion i hodowla organoidów zgodnie z powyższym opisem w krokach 3.1.3–3.1.5.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. Walidacja organoidów pochodzących z AL
<ol>
	<li>Pobieranie i liza organoidów do izolacji RNA
	<ol>
		<li>Zebrać i odwirować organoidy w sposób opisany powyżej (etap 3.2.1).</li>
		<li>Usunąć SN i dodać 350 μl buforu do lizy z 1% 2-merkaptoetanolem. Wirować przez 30 s i przechowywać w temperaturze -80 °C lub natychmiast przejść do izolacji RNA. 
		UWAGA: Należy pamiętać, że 2-merkaptoetanol jest związkiem toksycznym. Wszystkie prace należy wykonywać w okapie oparów chemicznych w rękawicach nitrylowych, masce przeciwpyłowej i okularach ochronnych. 2-merkaptoetanol może powodować nieodwracalne uszkodzenia oczu i skóry.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Utrwalanie i osadzanie organoidów do barwienia immunohistochemicznego/fluorescencyjnego
	<ol>
		<li>Zebrać i odwirować organoidy w sposób opisany powyżej (etap 3.2.1).</li>
		<li>Usuń SN, dodaj 1 ml 4% paraformaldehydu (PFA) i inkubuj przez 30 minut w temperaturze pokojowej (RT) na wytrząsarce orbitalnej (100 obr./min). 
		UWAGA: PFA jest znanym czynnikiem rakotwórczym dla ludzi, który może powodować nieodwracalne uszkodzenie rogówki. Wszystkie prace należy wykonywać w dygestoriach chemicznych. Należy zawsze nosić rękawice nitrylowe i okulary ochronne.</li>
		<li>Wirować przy 200 x g przez 5 minut i usunąć SN. Dodać 1 ml PBS, inkubować przez 10 minut w temperaturze pokojowej na wytrząsarce orbitalnej (100 obr./min) i odwirować przy 90 x g przez 3 minuty w temperaturze 4 °C. Powtórzyć etap mycia dwukrotnie. Przechowywać w PBS w temperaturze 4 °C.</li>
		<li>W celu przetworzenia tkanek i odwodnienia usuń SN i dodaj 150 μl 2% żelu agarozowego (w PBS) do osadu organoidowego za pomocą wstępnie podgrzanej, poszerzonej końcówki p200 (wykonanej przez odcięcie małego kawałka końcówki). Natychmiast odpipetować całą objętość i wysunąć do pokrywy probówki do mikrowirówki. 
		UWAGA: Ważne jest, aby pracować szybko, ponieważ żel zawierający organoidy szybko zastygnie.</li>
		<li>Pozwól żelowi mocno zestalić się przez 30 minut i przenieś krążek żelu do kasety histologicznej. Zanurz i przechowuj w 50% EtOH, aż do odwodnienia w procesorze tkankowym.</li>
		<li>W celu zatopienia parafiny umieścić krążek żelu (za pomocą kleszczy) w formie do zatapiania i wypełnić ciepłą parafiną (60 °C). Umieść foremki w temperaturze 4 °C, aż parafina stanie się twarda (około 45 min). Próbki te mogą być przechowywane w temperaturze 4 °C lub mogą być natychmiast poddane podziałowi.</li>
		<li>Mikrotomować bloki parafinowe zawierające organoidy o grubości 5 μm i pobrać próbki na szkiełkach podstawowych. Dodaj jedną kroplę wody dejonizowanej pod każdą sekcję, aby umożliwić prawidłowe rozciągnięcie sekcji i umieść szkiełka na płaskiej płycie grzewczej w temperaturze 37 °C przez noc. Przechowywać szkiełka z sekcjami w temperaturze 4 °C lub bezpośrednio kontynuować barwienie immunohistochemiczne lub immunofluorescencyjne.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Melmed, S. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aMelmed%2C+S+%22The+pituitary.+3rd+ed%22">The pituitary. 3rd ed</a>. , Elsevier/Academic Press. Cambridge. 1(2011).</li>
<li>Chen, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+adult+pituitary+contains+a+cell+population+displaying+stem%2Fprogenitor+cell+and+early-embryonic+characteristics%5BTitle%5D)+AND+%22Endocrinology%22%5BJournal%5D)">The adult pituitary contains a cell population displaying stem/progenitor cell and early-embryonic characteristics.</a> Endocrinology. 146 (9), 3985-3998 (2005).</li>
<li>Chen, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pituitary+progenitor+cells+tracked+down+by+side+population+dissection%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Pituitary progenitor cells tracked down by side population dissection.</a> Stem Cells. 27 (5), 1182-1195 (2009).</li>
<li>Fauquier, T., Rizzoti, K., Dattani, M., Lovell-Badge, R., Robinson, I. C. A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SOX2-expressing+progenitor+cells+generate+all+of+the+major+cell+types+in+the+adult+mouse+pituitary+gland%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">SOX2-expressing progenitor cells generate all of the major cell types in the adult mouse pituitary gland.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (8), 2907-2912 (2008).</li>
<li>Rizzoti, K., Akiyama, H., Lovell-Badge, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mobilized+adult+pituitary+stem+cells+contribute+to+endocrine+regeneration+in+response+to+physiological+demand%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Mobilized adult pituitary stem cells contribute to endocrine regeneration in response to physiological demand.</a> Cell Stem Cell. 13 (4), 419-432 (2013).</li>
<li>Andoniadou, C. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sox2%2B+stem%2Fprogenitor+cells+in+the+adult+mouse+pituitary+support+organ+homeostasis+and+have+tumor-inducing+potential%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Sox2+ stem/progenitor cells in the adult mouse pituitary support organ homeostasis and have tumor-inducing potential.</a> Cell Stem Cell. 13 (4), 433-445 (2013).</li>
<li>Nys, C., Vankelecom, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pituitary+disease+and+recovery%3A+How+are+stem+cells+involved%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cellular+Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Pituitary disease and recovery: How are stem cells involved.</a> Molecular and Cellular Endocrinology. 525 (4), 111176(2021).</li>
<li>Schneider, H. J., Aimaretti, G., Kreitschmann-Andermahr, I., Stalla, G. K., Ghigo, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hypopituitarism%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet%22%5BJournal%5D)">Hypopituitarism.</a> Lancet. 369 (9571), 1461-1470 (2007).</li>
<li>Fu, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+adult+pituitary+shows+stem%2Fprogenitor+cell+activation+in+response+to+injury+and+is+capable+of+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Endocrinology%22%5BJournal%5D)">The adult pituitary shows stem/progenitor cell activation in response to injury and is capable of regeneration.</a> Endocrinology. 153 (7), 3224-3235 (2012).</li>
<li>Willems, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regeneration+in+the+pituitary+after+cell-ablation+injury%3A+time-related+aspects+and+molecular+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Regeneration in the pituitary after cell-ablation injury: time-related aspects and molecular analysis.</a> Endocrinology. 157 (2), 705-721 (2016).</li>
<li>Gremeaux, L., Fu, Q., Chen, J., Vankelecom, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activated+phenotype+of+the+pituitary+stem%2Fprogenitor+cell+compartment+during+the+early-postnatal+maturation+phase+of+the+gland%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+and+Development%22%5BJournal%5D)">Activated phenotype of the pituitary stem/progenitor cell compartment during the early-postnatal maturation phase of the gland.</a> Stem Cells and Development. 21 (5), 801-813 (2012).</li>
<li>Zhu, X., Tollkuhn, J., Taylor, H., Rosenfeld, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Notch-dependent+pituitary+SOX2%2B+stem+cells+exhibit+a+timed+functional+extinction+in+regulation+of+the+postnatal+gland%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Notch-dependent pituitary SOX2+ stem cells exhibit a timed functional extinction in regulation of the postnatal gland.</a> Stem Cell Reports. 5 (6), 1196-1209 (2015).</li>
<li>Russell, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pituitary+stem+cells+produce+paracrine+WNT+signals+to+control+the+expansion+of+their+descendant+progenitor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Pituitary stem cells produce paracrine WNT signals to control the expansion of their descendant progenitor cells.</a> eLife. 10 (1), 59142(2021).</li>
<li>Vennekens, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interleukin-6+is+an+activator+of+pituitary+stem+cells+upon+local+damage%2C+a+competence+quenched+in+the+aging+gland%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Interleukin-6 is an activator of pituitary stem cells upon local damage, a competence quenched in the aging gland.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 118 (25), 2100052118(2021).</li>
<li>Mertens, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pituitary+tumors+contain+a+side+population+with+tumor+stem+cell-associated+characteristics%5BTitle%5D)+AND+%22Endocrine-Related+Cancer%22%5BJournal%5D)">Pituitary tumors contain a side population with tumor stem cell-associated characteristics.</a> Endocrine-Related Cancer. 22 (4), 481-504 (2015).</li>
<li>Laporte, E., Vennekens, A., Vankelecom, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pituitary+remodeling+throughout+life%3A+are+resident+stem+cells+involved%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Pituitary remodeling throughout life: are resident stem cells involved.</a> Frontiers in Endocrinology. 11 (1), 604519(2021).</li>
<li>Yoshida, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+adult+pituitary+stem%2Fprogenitor+cell+clusters+located+in+the+parenchyma+of+the+rat+anterior+lobe%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Research%22%5BJournal%5D)">Isolation of adult pituitary stem/progenitor cell clusters located in the parenchyma of the rat anterior lobe.</a> Stem Cell Research. 17 (2), 318-329 (2016).</li>
<li>Cox, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organoids+from+pituitary+as+novel+research+model+to+study+pituitary+stem+cell+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Organoids from pituitary as novel research model to study pituitary stem cell biology.</a> Journal of Endocrinology. 240 (2), 287-308 (2019).</li>
<li>Denef, C., Hautekeete, E., De Wolf, A., Vanderschueren, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pituitary+basophils+from+immature+male+and+female+rats%3A+distribution+of+gonadotrophs+and+thyrotrophs+as+studied+by+unit+gravity+sedimentation%5BTitle%5D)+AND+%22Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Pituitary basophils from immature male and female rats: distribution of gonadotrophs and thyrotrophs as studied by unit gravity sedimentation.</a> Endocrinology. 130 (3), 724-735 (1978).</li>
<li>Vander Schueren, B., Denef, C., Cassiman, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultrastructural+and+functional+characteristics+of+rat+pituitary+cell+aggregates%5BTitle%5D)+AND+%22Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Ultrastructural and functional characteristics of rat pituitary cell aggregates.</a> Endocrinology. 110 (2), 513-523 (1982).</li>
<li>Claes, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+stem+cell-derived+monocytes+and+microglia-like+cells+reveal+impaired+amyloid+plaque+clearance+upon+heterozygous+or+homozygous+loss+of+TREM2%5BTitle%5D)+AND+%22Alzheimer%27s+and+Dementia%22%5BJournal%5D)">Human stem cell-derived monocytes and microglia-like cells reveal impaired amyloid plaque clearance upon heterozygous or homozygous loss of TREM2.</a> Alzheimer's and Dementia. 15 (3), 453-464 (2019).</li>
<li>Trompeter, H. -I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNAs+miR-26a%2C+miR-26b%2C+and+miR-29b+accelerate+osteogenic+differentiation+of+unrestricted+somatic+stem+cells+from+human+cord+blood%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Genomics%22%5BJournal%5D)">MicroRNAs miR-26a, miR-26b, and miR-29b accelerate osteogenic differentiation of unrestricted somatic stem cells from human cord blood.</a> BMC Genomics. 14, 111(2013).</li>
<li>Suga, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Self-formation+of+functional+adenohypophysis+in+three-dimensional+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Self-formation of functional adenohypophysis in three-dimensional culture.</a> Nature. 480 (7375), 57-62 (2011).</li>
<li>Matsumoto, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Congenital+pituitary+hypoplasia+model+demonstrates+hypothalamic+OTX2+regulation+of+pituitary+progenitor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Congenital pituitary hypoplasia model demonstrates hypothalamic OTX2 regulation of pituitary progenitor cells.</a> Journal of Clinical Investigation. 130 (2), 641-654 (2019).</li>
<li>Kanie, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pathogenesis+of+anti-PIT-1+antibody+syndrome%3A+PIT-1+presentation+by+HLA+class+I+on+anterior+pituitary+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+Endocrine+Society%22%5BJournal%5D)">Pathogenesis of anti-PIT-1 antibody syndrome: PIT-1 presentation by HLA class I on anterior pituitary cells.</a> Journal of the Endocrine Society. 3 (11), 1969-1978 (2019).</li>
<li>Lee, S. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor+evolution+and+drug+response+in+patient-derived+organoid+models+of+bladder+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Tumor evolution and drug response in patient-derived organoid models of bladder cancer.</a> Cell. 173 (2), 515-528 (2018).</li>
<li>Yan, H. H. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+comprehensive+human+gastric+cancer+organoid+biobank+captures+tumor+subtype+heterogeneity+and+enables+therapeutic+screening%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">A comprehensive human gastric cancer organoid biobank captures tumor subtype heterogeneity and enables therapeutic screening.</a> Cell Stem Cell. 23 (6), 882-897 (2018).</li>
<li>Nolan, L. A., Kavanagh, E., Lightman, S. L., Levy, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anterior+pituitary+cell+population+control%3A+basal+cell+turnover+and+the+effects+of+adrenalectomy+and+dexamethasone+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroendocrinology%22%5BJournal%5D)">Anterior pituitary cell population control: basal cell turnover and the effects of adrenalectomy and dexamethasone treatment.</a> Journal of Neuroendocrinology. 10 (3), 207-215 (1998).</li>
</ol>

Autorzy deklarują brak sprzecznych interesów finansowych.

Organoidy pochodzące z AL, jak opisano tutaj, stanowią potężny model badawczy do badania przysadkowych komórek macierzystych in vitro. Obecnie to podejście organoidalne jest jedynym dostępnym narzędziem do niezawodnego i solidnego wzrostu i ekspansji pierwotnych przysadkowych komórek macierzystych. Model organoidu przysadki pochodzący z embrionalnych komórek macierzystych (ESC) lub indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (iPSC) został opisany wcześniej, co ściśle podsumowuje organogenezę zarodkową ...

Przysadka mózgowa to maleńki gruczoł dokrewny znajdujący się u podstawy mózgu, gdzie jest połączony z podwzgórzem. Gruczoł integruje wejścia obwodowe i ośrodkowe (podwzgórze) w celu wygenerowania dostrojonego i skoordynowanego uwalniania hormonów, regulując w ten sposób docelowe narządy dokrewne (takie jak nadnercza i gonady) w celu produkcji odpowiednich hormonów we właściwym czasie. Przysadka mózgowa jest kluczowym regulatorem układu hormonalnego i dlatego jest słusznie nazywana gruczołem głównym1.
Przysadka mysza składa się z trzech płatów (<silna klasa="xfig">Rysunek 1), tj. płata przedniego (AL), płata pośredniego (IL) i płata tylnego (PL). Główny endokrynny AL zawiera pięć typów komórek hormonalnych, w tym somatotropy, które wytwarzają hormon wzrostu (GH); laktotropy wytwarzające prolaktynę (PRL); kortykotropy, które wydzielają hormon adrenokortykotropowy (ACTH); tyreotropy odpowiedzialne za produkcję hormonu tyreotropowego (TSH); oraz gonadotropy, które wytwarzają hormon luteinizujący (LH) i hormon folikulotropowy (FSH). PL składa się z wypustek aksonalnych z podwzgórza, w których przechowywane są hormony oksytocyna i wazopresyna (hormon antydiuretyczny). IL znajduje się pomiędzy AL i PL i zawiera melanotropy, które wytwarzają hormon stymulujący melanocyty (MSH). W ludzkiej przysadce mózgowej IL cofa się podczas rozwoju, a melanotropy rozprzestrzeniają się w AL1. Oprócz komórek endokrynnych, przysadka mózgowa zawiera również pulę komórek macierzystych, zasadniczo oznaczonych przez czynnik transkrypcyjny SOX22,3,4,5,6. Te komórki SOX2+ znajdują się w strefie brzeżnej (MZ), wyściółce nabłonka szczeliny (embrionalna pozostałość światła między AL i IL) lub są rozmieszczone jako skupiska w miąższu AL, proponując w ten sposób dwie nisze komórek macierzystych w gruczole (<silna klasa="xfig">Rysunek 1)2,3,4,5,6.
Biorąc pod uwagę nieodzowną naturę przysadki mózgowej, nieprawidłowe działanie gruczołu wiąże się z poważną chorobowością. Nadczynność przysadki (charakteryzująca się nadmiernym wydzielaniem jednego lub więcej hormonów) i niedoczynność przysadki (wadliwa lub brakująca produkcja jednego lub więcej hormonów) mogą być spowodowane przez guzy neuroendokrynne przysadki (PitNETs; np. guzy wytwarzające ACTH prowadzące do choroby Cushinga) lub przez wady genetyczne (np. niedobór GH powodujący karłowatość)7. Ponadto chirurgia przysadki mózgowej (np. w celu usunięcia guzów), infekcje (np. gruźlica podwzgórze-przysadka lub infekcje po bakteryjnym zapaleniu opon mózgowo-rdzeniowych lub mózgu), zespół Sheehana (martwica spowodowana niewystarczającym przepływem krwi z powodu dużej utraty krwi podczas porodu), apopleksja przysadki i urazowe uszkodzenie mózgu to inne ważne przyczyny niedoczynności przysadki8. Wykazano, że przysadka mózgowa myszy posiada zdolność regeneracyjną, będąc w stanie naprawić miejscowe uszkodzenia wprowadzone przez transgeniczną ablację komórek endokrynnych9,10. Komórki macierzyste SOX2+ ostro reagują na zadane urazy, wykazując aktywowany fenotyp, charakteryzujący się zwiększoną proliferacją (prowadzącą do ekspansji komórek macierzystych) i zwiększoną ekspresją czynników i szlaków związanych z macierzystą (np. WNT / NOTCH). Co więcej, komórki macierzyste zaczynają wyrażać hormon, któremu uległa ablacja, co ostatecznie skutkuje znacznym przywróceniem zubożonej populacji komórek w ciągu następnych (5 do 6) miesięcy9,10. Ponadto, podczas fazy dojrzewania gruczołu noworodkowego (pierwsze 3 tygodnie po urodzeniu), przysadkowe komórki macierzyste rozwijają się w stanie aktywowanym6,11,12,13, podczas gdy starzenie się organizmu wiąże się ze spadkiem funkcjonalności komórek macierzystych in situ, z powodu rosnącego środowiska zapalnego (mikro) podczas starzenia się (lub 'inflammaging')10,14. Ponadto nowotworzenie gruczołu jest również związane z aktywacją komórek macierzystych7,15. Chociaż aktywacja komórek macierzystych została wykryta w kilku sytuacjach przebudowy przysadki mózgowej (przegląd w7,16), mechanizmy leżące u podstaw pozostają niejasne. Ponieważ podejścia in vivo (takie jak śledzenie linii u myszy transgenicznych) nie dostarczyły jasnego ani kompleksowego obrazu przysadkowych komórek macierzystych, niezbędne jest opracowanie wiarygodnych modeli in vitro w celu zbadania biologii komórek macierzystych w prawidłowej i chorej przysadce. Standardowa hodowla in vitro pierwotnych komórek macierzystych przysadki pozostaje niewystarczająca ze względu na bardzo ograniczoną zdolność wzrostu i niefizjologiczne (2D) warunki z szybką utratą fenotypu (bardziej szczegółowy przegląd można znaleźć w 16). Hodowle sferyczne 3D (przysadki mózgowe) zostały stworzone z komórek macierzystych przysadki mózgowej, zidentyfikowanych na podstawie populacji bocznej i fenotypu SOX2+2,3,4. Przysadki mózgowe wyrastają klonalnie z komórek macierzystych, wyrażają markery macierzyste i wykazują zdolność różnicowania się do typów komórek endokrynnych. Nie rozszerzają się one jednak znacząco, wykazując jedynie ograniczoną przechodniość (2-3 przejścia)3,4. Struktury podobne do kul uzyskano również z niezdysocjowanych klastrów przysadkowych komórek macierzystych, gdy hodowano je w 50% rozcieńczonym Matrigel przez 1 tydzień, ale nie wykazano rozszerzalności17. Podejście oparte na przysadce mózgowej jest najczęściej używane jako narzędzie do odczytu liczby komórek macierzystych, ale dalsze zastosowania są ograniczone przez gorszą zdolność ekspansji16.
Aby rozwiązać te niedociągnięcia, niedawno stworzono nowy model 3D, tj. organoidy, zaczynając od głównego endokrynologicznego AL myszy zawierającego MZ i miąższowe komórki macierzyste. Wykazano, że organoidy rzeczywiście pochodzą z komórek macierzystych przysadki mózgowej i wiernie oddają ich fenotyp18. Co więcej, organoidy są podatne na długotrwałą ekspansję, zachowując przy tym swoją naturę łodygi. W związku z tym stanowią niezawodną metodę ekspansji pierwotnych przysadkowych komórek macierzystych w celu dogłębnej eksploracji. Taka eksploracja nie jest osiągalna przy ograniczonej liczbie komórek macierzystych, które można wyizolować z przysadki mózgowej, które również nie są rozszerzalne w warunkach 2D16. Wykazano, że organoidy są cennymi i niezawodnymi narzędziami do odkrywania nowych cech przysadkowych komórek macierzystych (przekładających się na in vivo)14,18. Co ważne, model organoidowy wiernie odzwierciedla stan aktywacji przysadki komórek macierzystych występujący podczas miejscowego uszkodzenia tkanek i dojrzewania noworodków, wykazując zwiększoną wydajność tworzenia i replikację regulowanych w górę szlaków molekularnych14,18. W związku z tym model organoidów pochodzących z przysadki jest innowacyjnym i potężnym modelem badawczym biologii przysadkowych komórek macierzystych, a także narzędziem do odczytu aktywacji komórek macierzystych.
Ten protokół szczegółowo opisuje tworzenie organoidów pochodzących z przysadki myszy. W tym celu AL jest izolowany i dysocjowany na pojedyncze komórki, które są osadzone w Matrigel naśladującym macierz zewnątrzkomórkową (zwaną dalej ECM). Zespół komórka-ECM jest następnie hodowany w określonym pożywce, zasadniczo zawierającej czynniki wzrostu komórek macierzystych i regulatory embrionalne przysadki (dalej określane jako "przysadkowe podłoże organoidowe" (PitOM)18; Tabela 1). Gdy organoidy są w pełni rozwinięte (po 10-14 dniach), można je dalej namnażać poprzez sekwencyjne pasażowanie i poddawać szeroko zakrojonym dalszym badaniom (np. immunofluorescencja, RT-qPCR i transkryptomika masowa lub jednokomórkowa; <silna klasa="xfig">Rysunek 1). W dłuższej perspektywie oczekuje się, że organoidy przysadki komórek macierzystych utorują drogę do metod naprawy tkanek i medycyny regeneracyjnej.

<table><tbody><tr><td>2-merkaptoetanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M6250</td><td></td></tr><tr><td>48-dołkowe płytki, poddane obróbce TC, pakowane pojedynczo</td><td>Costar</td><td>734-1607</td><td></td></tr><tr><td>A83-01</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>SML0788</td><td></td></tr><tr><td>Advanced DMEM/F12</td><td>Gibco</td><td>12634010</td><td></td></tr><tr><td>Albumina bydlęca (klasa hodowli komórkowych)</td><td>Suplement Serva</td><td>47330</td><td></td></tr><tr><td>B-27 ( 50X), bez witaminy A</td><td>Formy bazowe Gibco</td><td>12587010</td><td></td></tr><tr><td></td><td>VWR</td><td>720-1918</td><td></td></tr><tr><td>Bufor RLT</td><td>Qiagen</td><td>79216</td><td></td></tr><tr><td>Kasety, Q Path Microtwin</td><td>VWR</td><td>720-2191</td><td></td></tr><tr><td>Sitko do komórek, 40 i mikro; m siatka, jednorazowa</td><td>Falcon</td><td>352340</td><td></td></tr><tr><td>Toksyna z Vibrio cholerae</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C8052</td><td></td></tr><tr><td>Deoksyrybonukleaza I z trzustki bydła</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D5025</td><td></td></tr><tr><td>D-glukoza</td><td>Merck</td><td>108342</td><td></td></tr><tr><td>Dimethylsulfoxide (DMSO)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D2650</td><td></td></tr><tr><td>DMEM, proszek, rurki</td><td>Eppendorf</td><td>52100039 Safe-Lock</td><td></td>o wysokiej zawartości glukozy</tr><tr><td>, 1,5 ml</td><td></td><td></td> Szkiełka adhezyjne Eppendorf 30120086 <td></td></tr><tr><td>Epredia SuperFrost Plus Thermo</td><td>Fisher Scientific</td><td>J1800AMNZ</td><td></td></tr><tr><td>Stacja robocza do osadzania Epredia HistoStar, 220 do 240 V AC</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>12587976</td><td></td></tr><tr><td>Absolut etanolu 99,8+%</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td></td><td></td>10342652</tr><tr><td>Płodowa surowica bydlęca (FBS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F7524</td><td></td></tr><tr><td>GlutaMAX Suplement</td><td>Gibco</td><td>35050061</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H4034</td><td></td></tr><tr><td>HEPES Roztwór buforowy</td><td>Gibco</td><td>15630056</td><td></td></tr><tr><td>InSolution Y-27632</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>688001</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamina (200 mM)</td><td>Gibco</td><td>25030081</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel Matryca membrany podstawnej o obniżonym czynniku wzrostu (GFR), bez LDEV</td><td>Pojemnik</td><td></td> do zamrażania Corning 15505739 <td></td></tr><tr><td>Mr. Frosty</td> Suplement N-2 <td>Thermo Fisher Scientific</td><td>5100-0001</td><td></td></tr> (<tr><td>100X)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>17502048</td><td></td></tr><tr><td>N-acetylo-L-cysteina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A7250</td><td></td></tr><tr><td>Nunc Biobank i hodowle komórkowe Probówki kriogeniczne</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>375353</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyd do syntezy (PFA)</td><td>Merck</td><td>818715</td><td></td></tr><tr><td>PBS, pH 7,4</td><td>Gibco</td><td>10010023</td><td></td></tr><tr><td>Sól sodowa penicyliny G</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P3032</td><td></td></tr><tr><td>Penicylina-Streptomycyna (10 000 U/ml)</td><td>Gibco</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>Czerwień fenolowa</td><td>Merck</td><td>107241</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek potasu (KCl)</td><td></td><td></td>Rekombinowane ludzkie białko EGF 104936 <td></td></tr><tr><td>Merck, CF</td><td>R& Systemy D</td><td>236-EG</td><td></td></tr><tr><td>Rekombinowany ludzki FGF zasadowy/FGF2/bFGF (157 aa) Białko</td><td>R& Systemy D</td><td>234-FSE</td><td></td></tr><tr><td>Rekombinowany ludzki FGF-10</td><td>Peprotech</td><td>100-26</td><td></td></tr><tr><td>Rekombinowany ludzki IGF-1</td><td>Peprotech</td><td>100-11</td><td></td></tr><tr><td>Rekombinowany ludzki IL-6</td><td>Peprotech</td><td>200-06</td><td></td></tr><tr><td>Rekombinowany ludzki Noggin</td><td>Peprotech</td><td>120-10C</td><td></td></tr><tr><td>Rekombinowany ludzki R-Spondin-1</td><td>Peprotech</td><td>120-38</td><td></td></tr><tr><td>Rekombinowany człowiek/mysz FGF-8b</td><td>Peprotech</td><td>100-25</td><td></td></tr><tr><td>Rekombinowana mysz Sonic Hedgehog/Shh (C25II) N-Endus</td><td>R& D systems</td><td>464-SH</td><td></td></tr><tr><td>RNeasy micro kit</td><td>Qiagen</td><td>74004</td><td></td></tr><tr><td>SB202190</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7067</td><td></td></tr><tr><td>SeaKem LE Agaroza</td><td>Lonza</td><td>50004</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek sodu (NaCl)</td><td>BDH</td><td>102415K</td><td></td></tr><tr><td>Sodu Di-wodorofosforan 1-hydrat</td><td>PanReac-AppliChem</td><td>A1047</td><td></td></tr><tr><td>Sód Wodorowęglan (NaHCO3)</td><td>Merck</td><td>106329</td><td></td></tr><tr><td>pirogronian sodu (C3H3NaO3)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5280</td><td></td></tr><tr><td>Stericup-GP, 0,22 i mikro; m</td><td>Millipore</td><td>SCGPU02RE</td><td></td></tr><tr><td>Steriflip-GP Sterylny filtr górny z probówką wirówkową, 0,22 & mu; m</td><td>Millipore</td><td>SCGP00525</td><td></td></tr><tr><td>Sterylna woda</td><td>Fresenius</td><td>B230531</td><td></td></tr><tr><td>Sól siarczanu streptomycyny</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S6501</td><td></td></tr><tr><td>Thermo Scientific Excelsior ES Procesor tkanek</td><td>Thermo Scientific</td><td>12505356</td><td></td></tr><tr><td>Titriplex III</td><td>Merck</td><td>108418</td><td></td></tr><tr><td>TrypL Express Enzyme (1X), czerwień fenolowa</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>12605028</td><td></td></tr><tr><td>Inhibitor trypsyny z Glycine max (soja)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T9003</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór trypsyny 2,5 %</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15090046</td><td></td></tr></tbody></table>

rozwój organoidów z przysadki mysiej jako modelu in vitro w celu zbadania biologii przysadkowych komórek macierzystych

Development of Organoids from Mouse Pituitary as In Vitro Model to Explore Pituitary Stem Cell Biology

Przysadka mózgowa jest głównym gruczołem dokrewnym regulującym kluczowe procesy fizjologiczne, w tym wzrost ciała, metabolizm, dojrzewanie płciowe, reprodukcję i reakcję na stres. Ponad dekadę temu w przysadce mózgowej zidentyfikowano komórki macierzyste. Jednak pomimo zastosowania transgenicznych podejść in vivo, ich fenotyp, biologia i rola pozostają niejasne. Aby rozwiązać tę zagadkę, opracowano nowy i innowacyjny model organoidów in vitro, który pozwoli dogłębnie rozwikłać zagadkę biologii przysadki komórek macierzystych. Organoidy reprezentują struktury komórkowe 3D, które w określonych warunkach hodowli rozwijają się samoczynnie z (nabłonkowych) komórek macierzystych tkanki i podsumowują wiele cech charakterystycznych tych komórek macierzystych i ich tkanki. Pokazano tutaj, że organoidy pochodzące z przysadki myszy rozwijają się z komórek macierzystych gruczołu i wiernie odwzorowują ich cechy fenotypowe i funkcjonalne in vivo. Między innymi odtwarzają one stan aktywacji komórek macierzystych jako in vivo, który występuje w odpowiedzi na transgenicznie zadane uszkodzenia miejscowe. Organoidy są długotrwale rozszerzalne, zachowując jednocześnie swój fenotyp łodygi. Nowy model badawczy jest bardzo cenny dla rozszyfrowania fenotypu i zachowania komórek macierzystych w kluczowych warunkach przebudowy przysadki, od dojrzewania noworodków po zanikanie związane ze starzeniem się, od zdrowych do chorych gruczołów. W tym miejscu przedstawiono szczegółowy protokół mający na celu ustalenie organoidów pochodzących z przysadki myszy, które stanowią potężne narzędzie do zanurzenia się w tajemniczym jeszcze świecie przysadkowych komórek macierzystych.

Po izolacji i dysocjacji AL otrzymane pojedyncze komórki wysiewa się w ECM i hoduje w PitOM (Rysunek 1, Tabela 1). Rysunek 3A przedstawia hodowlę komórkową oraz gęstość w momencie wysiewu (dzień 0). Może występować niewielka ilość zanieczyszczeń (Rysunek 3A, białe groty strzałek), które znikną podczas pasażowania. Czternaście dni po wysiewie organoidy pochodzące z AL są w pełni rozwinięte (Rysun...

Przysadka mózgowa jest kluczowym regulatorem układu hormonalnego organizmu. W artykule opisano rozwój organoidów z przysadki myszy jako nowatorski model 3D in vitro do badania populacji komórek macierzystych gruczołu, których biologia i funkcja pozostają słabo poznane.

Rozwój organoidów z przysadki mysiej jako modelu in vitro w celu zbadania biologii przysadkowych komórek macierzystych

The pituitary is the master endocrine gland regulating key physiological processes, including body growth, metabolism, sexual maturation, reproduction, ...

Nasz model organoidowy jest bardzo cenny w badaniu biologii przysadkowych komórek macierzystych w warunkach homeostazy i przebudowy przysadki, takich jak dojrzewanie gruczołu u noworodków, związany ze starzeniem się spadek funkcji i wzrost guza w gruczole. Do tej pory nasza technika organoidów przysadki jest jedynym dostępnym narzędziem do niezawodnego i solidnego wzrostu i ekspansji pierwotnych przysadkowych komórek macierzystych myszy. Procedurę zademonstrują Emma Laporte i Charlotte Nys, doktorantki w mojej grupie badawczej.Na początek umyj głowę myszy wodą dejonizowaną, aby usunąć krew. Spryskaj głowę 70% etanolem, aby wytworzyć sterylne środowisko. Następnie usuń skórę między uszami za pomocą sterylnych narzędzi chirurgicznych.Aby otworzyć czaszkę, przełam grzbiet nosa sterylnymi nożyczkami. Dalej otwórz czaszkę, zaczynając od grzbietu nosa w kierunku uszu po obu stronach. Usuń czaszkę i mózg za pomocą sterylnej pęsety, nie dotykając przysadki mózgowej.Usuń przeponę za pomocą pęsety. Następnie pod mikroskopem stereoskopowym oddziel płat przedni od płata tylnego i pośredniego. Ostrożnie odizoluj przedni płat pęsetą i zbierz go do 10-mililitrowej kolby Erlenmeyera zawierającej trzy mililitry pożywki A. Dodaj dwa mililitry wstępnie podgrzanego 2,5% roztworu trypsyny.Inkubować w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 15 minut. Dodać dwa mililitry wstępnie podgrzanego roztworu DNAzy i zamieszać kolbę Erlenmeyera 10 razy. Pozwól przysadce opaść na dno i usuń supernatant.Dodaj dwa mililitry wstępnie podgrzanego roztworu inhibitora trypsyny i inkubuj w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 10 minut. Usuń supernatant, gdy przysadka opadnie na dno. Dodaj dwa mililitry podgrzanego podłoża B i inkubuj przez pięć minut.Dodaj do tego dwa mililitry wstępnie podgrzanego podłoża C i inkubuj przez 15 minut. Pozwól przysadce opaść na dno i usuń supernatant. Następnie spłucz go trzykrotnie podgrzanym podłożem C. Dodaj dwa mililitry podgrzanego podłoża C. Odessać i wydalić przysadkę mózgową sterylną, wypolerowaną płomieniowo pipetą Pasteura kilka razy, aż fragmenty przestaną być widoczne.Przenieś zawiesinę do 15-mililitrowej probówki zawierającej 4,5 mililitra wstępnie podgrzanego roztworu DNAse. Przepłukać kolbę trzykrotnie dwoma mililitrami wstępnie podgrzanego podłoża C i przenieść zawiesinę do probówki. Wymieszaj zebraną zawiesinę komórek i przefiltruj ją przez sitko do komórek o grubości 40 mikronów do 30-mililitrowej probówki.Przepłukać probówkę i sitko trzykrotnie dwoma mililitrami pożywki C i przenieść zawiesinę do probówki. Napełnij szklaną pipetę Pasteura dwoma mililitrami BSA. Umieść końcówkę pipety na dnie probówki i delikatnie odpipetuj pipetę, aby utworzyć widoczną warstwę gęstości.Wirować w temperaturze 190 razy G przez 10 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Usuń supernatant i ponownie zawieś osad ogniwa w jednym mililitrze lodowatego zaawansowanego DMEM / F-12. Następnie określ ilościowo komórki za pomocą licznika komórek.Odwirować zawiesinę komórkową o stężeniu 190 razy G przez 10 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza i usunąć supernatant. Ponownie zawiesić osad komórkowy w zaawansowanym DMEM / F-12, aby osiągnąć gęstość komórek od 1,1 razy 10 do 6 komórek na mililitr. Dodaj ECM do żądanej objętości zawiesiny komórek w stosunku 30:70 i dobrze wymieszaj.Umieść 30-mikrolitrową kroplę tej mieszaniny w każdym dołku wstępnie podgrzanej 48-dołkowej płytki. Odwróć płytkę do góry nogami i pozwól ECM zestalać się w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 20 minut. Po inkubacji ostrożnie dodać 250 mikrolitrów wstępnie podgrzanego podłoża organoidowego przysadki mózgowej uzupełnionego 10-mikromolowym inhibitorem ROCK.Co dwa do trzech dni zmieniaj podłoże bez inhibitora ROCK przez 10 do 14 dni, aż organoidy będą w pełni rozwinięte. Aby przejść przez organoidy, najpierw delikatnie zassaj pożywkę i dodaj 400 mikrolitrów lodowatego zaawansowanego DMEM/F-12, aby zdezintegrować ECM. Następnie zbierz organoidy w probówce do mikrowirówki.Umyj studnię 400 mikrolitrami lodowatego zaawansowanego DMEM/F-12. Odwirować probówkę o temperaturze 200 razy G przez pięć minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Usuń supernatant i dodaj 400 mikrolitrów wstępnie podgrzanego enzymu TrypLE Express.Wymieszaj, kilkakrotnie odwracając probówkę i inkubuj w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez pięć minut. Dodaj 400 mikrolitrów lodowatego zaawansowanego DMEM/F-12. Wirować w temperaturze 200 razy G przez pięć minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza i usunąć supernatant.Ponownie zawiesić granulat za pomocą 100 mikrolitrów lodowatego zaawansowanego DMEM/F-12. Zwęź końcówkę P-200 i użyj końcówki do dysocjacji organoidów poprzez energiczne pipetowanie, aż do uzyskania fragmentów organoidów. Dodaj 800 mikrolitrów zaawansowanego DMEM/F-12.Wirować w temperaturze 190 razy G przez 10 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza i usunąć supernatant. Aby przejść przez organoidy, należy ponownie zawiesić osad w odpowiedniej objętości zaawansowanego DMEM/F-12 i dodać ECM w stosunku 30:70. Dobrze wymieszaj.Kontynuuj wysiewanie i hodowlę organoidów zgodnie z opisem w manuskrypcie tekstowym. Zdysocjowane pojedyncze komórki z płata przedniego wysiewano w ECM i hodowano w pożywce organoidowej przysadki. 14 dni po wysiewie organoidy były w pełni rozwinięte i osiągnęły średnicę do 500 mikrometrów.Na tym etapie organoidy wykazywały morfologię torbielowatą z warstwą nabłonkową otaczającą światło. Nie zaleca się stosowania studni, w których po wzroście pojawiają się gęste struktury. Do pasażowania do wysiewu użyto fragmentów organoidów.Siedem dni po pasażowaniu zaobserwowano korzystny odrost organoidów ze strukturami torbielowatymi. Gęste organoidy należy wyrzucić, ponieważ niekorzystne organoidy mogą przejąć kulturę. Analiza barwienia immunofluorescencyjnego dla markerów nabłonkowych E-kadheryny i cytokeratyn 8 i 18 potwierdziła nabłonkowy charakter organoidów.Ekspresja markerów przysadkowych komórek macierzystych Sox2 i Trop2 wykazała pnianość, a specyficzny dla przysadki marker LHX3 wykazał fenotyp przysadki organoidów. Ekspresja markera Ki67 wykazała, że komórki tworzące organoidy są w stanie proliferacyjnym. Analiza RTQ PCR wykazała wyższą ekspresję markerów macierzystych w organoidach niż w płacie przednim, nawet po wielu pasażach, co potwierdza wzbogacenie komórek macierzystych.Ważne jest, aby przy początkowym wysiewie umieścić odpowiednią liczbę pojedynczych komórek w kopule ECM, a przy przechodzeniu organoidów należy pamiętać o ponownym wysiewie fragmentów, a nie pojedynczych komórek.

development-organoids-from-mouse-pituitary-as-vitro-model-to-explore

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia rozwojowa

Metoda hodowli trójwymiarowej opisana w tym protokole podsumowuje rozwój trzustki z rozproszonych embrionalnych przodków trzustki myszy, włączając ich znaczną ekspansję, różnicowanie i morfogenezę do rozgałęzionego organu. Ta metoda jest podatna na obrazowanie, funkcjonalną ingerencję i manipulację niszą.

In vitro Organogeneza trzustki z rozproszonych przodków embrionalnych myszy

Tutaj prezentujemy protokół generowania ekspresji insuliny 3D mysich trzustek z swobodnie pływających e10.5 dysocjowanych komórek progenitorowych trzustki i związanych z nimi mezenchymów.

Wytwarzanie bezrusztowaniowych, trójwymiarowych trzustek eksprymujących insulinę z mysich progenitorów trzustki in vitro

Ten protokół opisuje produkcję mysiego pozawątrobowego przewodu żółciowego 3-wymiarowego systemu organoidowego. Te organoidy żółciowe można utrzymywać w kulturze w celu badania biologii cholangiocytów. Organoidy żółciowe wyrażają markery zarówno komórek progenitorowych, jak i żółciowych i składają się ze spolaryzowanych komórek nabłonka.

Wytwarzanie organoidów z pozawątrobowych dróg żółciowych myszy

Pokazujemy metodę sekcji zwłok i sekcji mysich modeli raka prostaty, skupiając się na sekcji guza prostaty. Przedstawiono również protokół krok po kroku generowania organoidów guza gruczołu krokowego u myszy.

Generowanie organoidów nowotworowych z genetycznie modyfikowanych mysich modeli raka prostaty

Ten protokół został stworzony jako sposób na produkcję organoidów mózgowych w uproszczony, tani sposób, bez egzogennych czynników wzrostu lub macierzy błony podstawnej, przy jednoczesnym zachowaniu różnorodności typów komórek mózgowych i wielu cech organizacji komórkowej.

Statyczna, samosterowna metoda generowania organoidów mózgowych z ludzkich embrionalnych komórek macierzystych

Prezentujemy szczegółowe protokoły generowania i charakterystyki modeli rozwoju 2D i 3D ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (hIPSC) opartych na korze nowej, a także uzupełniające metodologie umożliwiające jakościową i ilościową analizę biogenezy i funkcji rzęsek pierwotnych (PC).

Modele 2D i 3D oparte na pluripotencjalnych komórkach macierzystych indukowanych przez człowieka do analizy pierwotnego zaangażowania rzęsek podczas rozwoju kory nowej

Przedstawiamy protokół rozwoju kultur organoidów nabłonkowych, zaczynając od ludzkiego zęba. Organoidy są bardzo rozprężalne i rekapitulują nabłonkowe komórki macierzyste zęba, w tym ich zdolność do różnicowania ameloblastów. Unikalny model organoidowy stanowi obiecujące narzędzie do badania biologii ludzkiej uzębienia (komórek macierzystych) z perspektywami podejścia regeneracyjnego zębów.

Ustanowienie organoidów z ludzkiego zęba jako potężnego narzędzia w kierunku badań mechanistycznych i terapii regeneracyjnej

W tym badaniu przedstawiamy szczegółową technikę prostego, ale solidnego systemu hodowli organoidów korowych przy użyciu standardowych kultur hPSC bez karmienia. Jest to szybki, wydajny i powtarzalny protokół generowania organoidów, które modelują aspekty starzenia się mózgu in vitro.

Solidna i wysoce odtwarzalna generacja organoidów korowych mózgu do modelowania starzenia się neuronów mózgu in vitro

Protokół ten opisuje generowanie modelu mięśni prostaty wyhodowanego w 2D. Obejmuje dysocjację organoidów, zasiewanie komórek, różnicowanie, ocenę integralności nabłonka oraz zakażenie in vitro uropatogenicznym Escherichia coli. Model zapewnia dostępność wierzchołkową i nadaje się do badania interakcji gospodarz-patogen, przezwyciężając ograniczenia tradycyjnych trójwymiarowych systemów organoidalnych.

Opracowanie modelu opartego na organoidzie prostaty myszy do badania interakcji gospodarz-patogen

Tutaj prezentowana jest nowa metoda, która pozwala na przekształcenie dorosłych fibroblastów skóry w komórki wydzielające insulinę. Technika ta opiera się na konwersji epigenetycznej, nie wiąże się z użyciem wektorów retrowirusowych ani nabyciem stabilnego stanu pluripotencjalnego. Jest zatem bardzo obiecujący w zastosowaniach medycyny translacyjnej.

Konwersja epigenetyczna jako bezpieczna i prosta metoda pozyskiwania komórek wydzielających insulinę z fibroblastów skóry dorosłych

Poznaj metodę hodowli organoidów przysadki mysiej w celu badania biologii komórek macierzystych. Technika ta umożliwia wiarygodne rozwijanie pierwotnych komórek macierzystych przysadki w warunkach homeostazy, starzenia i wzrostu guzów.

Rozwój organoidów z przysadki mysiej jako modelu in vitro w celu zbadania biologii przysadkowych komórek macierzystych

Przeglądaj więcej filmów