Rozwój organoidów z przysadki mysiej jako modelu in vitro w celu zbadania biologii przysadkowych komórek macierzystych
February 25th, 2022
Przysadka mózgowa jest kluczowym regulatorem układu hormonalnego organizmu. W artykule opisano rozwój organoidów z przysadki myszy jako nowatorski model 3D in vitro do badania populacji komórek macierzystych gruczołu, których biologia i funkcja pozostają słabo poznane.
Nasz model organoidowy jest bardzo cenny w badaniu biologii przysadkowych komórek macierzystych w warunkach homeostazy i przebudowy przysadki, takich jak dojrzewanie gruczołu u noworodków, związany ze starzeniem się spadek funkcji i wzrost guza w gruczole. Do tej pory nasza technika organoidów przysadki jest jedynym dostępnym narzędziem do niezawodnego i solidnego wzrostu i ekspansji pierwotnych przysadkowych komórek macierzystych myszy. Procedurę zademonstrują Emma Laporte i Charlotte Nys, doktorantki w mojej grupie badawczej.
Na początek umyj głowę myszy wodą dejonizowaną, aby usunąć krew. Spryskaj głowę 70% etanolem, aby wytworzyć sterylne środowisko. Następnie usuń skórę między uszami za pomocą sterylnych narzędzi chirurgicznych.
Aby otworzyć czaszkę, przełam grzbiet nosa sterylnymi nożyczkami. Dalej otwórz czaszkę, zaczynając od grzbietu nosa w kierunku uszu po obu stronach. Usuń czaszkę i mózg za pomocą sterylnej pęsety, nie dotykając przysadki mózgowej.
Usuń przeponę za pomocą pęsety. Następnie pod mikroskopem stereoskopowym oddziel płat przedni od płata tylnego i pośredniego. Ostrożnie odizoluj przedni płat pęsetą i zbierz go do 10-mililitrowej kolby Erlenmeyera zawierającej trzy mililitry pożywki A. Dodaj dwa mililitry wstępnie podgrzanego 2,5% roztworu trypsyny.
Inkubować w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 15 minut. Dodać dwa mililitry wstępnie podgrzanego roztworu DNAzy i zamieszać kolbę Erlenmeyera 10 razy. Pozwól przysadce opaść na dno i usuń supernatant.
Dodaj dwa mililitry wstępnie podgrzanego roztworu inhibitora trypsyny i inkubuj w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 10 minut. Usuń supernatant, gdy przysadka opadnie na dno. Dodaj dwa mililitry podgrzanego podłoża B i inkubuj przez pięć minut.
Dodaj do tego dwa mililitry wstępnie podgrzanego podłoża C i inkubuj przez 15 minut. Pozwól przysadce opaść na dno i usuń supernatant. Następnie spłucz go trzykrotnie podgrzanym podłożem C. Dodaj dwa mililitry podgrzanego podłoża C. Odessać i wydalić przysadkę mózgową sterylną, wypolerowaną płomieniowo pipetą Pasteura kilka razy, aż fragmenty przestaną być widoczne.
Przenieś zawiesinę do 15-mililitrowej probówki zawierającej 4,5 mililitra wstępnie podgrzanego roztworu DNAse. Przepłukać kolbę trzykrotnie dwoma mililitrami wstępnie podgrzanego podłoża C i przenieść zawiesinę do probówki. Wymieszaj zebraną zawiesinę komórek i przefiltruj ją przez sitko do komórek o grubości 40 mikronów do 30-mililitrowej probówki.
Przepłukać probówkę i sitko trzykrotnie dwoma mililitrami pożywki C i przenieść zawiesinę do probówki. Napełnij szklaną pipetę Pasteura dwoma mililitrami BSA. Umieść końcówkę pipety na dnie probówki i delikatnie odpipetuj pipetę, aby utworzyć widoczną warstwę gęstości.
Wirować w temperaturze 190 razy G przez 10 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Usuń supernatant i ponownie zawieś osad ogniwa w jednym mililitrze lodowatego zaawansowanego DMEM / F-12. Następnie określ ilościowo komórki za pomocą licznika komórek.
Odwirować zawiesinę komórkową o stężeniu 190 razy G przez 10 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza i usunąć supernatant. Ponownie zawiesić osad komórkowy w zaawansowanym DMEM / F-12, aby osiągnąć gęstość komórek od 1,1 razy 10 do 6 komórek na mililitr. Dodaj ECM do żądanej objętości zawiesiny komórek w stosunku 30:70 i dobrze wymieszaj.
Umieść 30-mikrolitrową kroplę tej mieszaniny w każdym dołku wstępnie podgrzanej 48-dołkowej płytki. Odwróć płytkę do góry nogami i pozwól ECM zestalać się w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 20 minut. Po inkubacji ostrożnie dodać 250 mikrolitrów wstępnie podgrzanego podłoża organoidowego przysadki mózgowej uzupełnionego 10-mikromolowym inhibitorem ROCK.
Co dwa do trzech dni zmieniaj podłoże bez inhibitora ROCK przez 10 do 14 dni, aż organoidy będą w pełni rozwinięte. Aby przejść przez organoidy, najpierw delikatnie zassaj pożywkę i dodaj 400 mikrolitrów lodowatego zaawansowanego DMEM/F-12, aby zdezintegrować ECM. Następnie zbierz organoidy w probówce do mikrowirówki.
Umyj studnię 400 mikrolitrami lodowatego zaawansowanego DMEM/F-12. Odwirować probówkę o temperaturze 200 razy G przez pięć minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Usuń supernatant i dodaj 400 mikrolitrów wstępnie podgrzanego enzymu TrypLE Express.
Wymieszaj, kilkakrotnie odwracając probówkę i inkubuj w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez pięć minut. Dodaj 400 mikrolitrów lodowatego zaawansowanego DMEM/F-12. Wirować w temperaturze 200 razy G przez pięć minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza i usunąć supernatant.
Ponownie zawiesić granulat za pomocą 100 mikrolitrów lodowatego zaawansowanego DMEM/F-12. Zwęź końcówkę P-200 i użyj końcówki do dysocjacji organoidów poprzez energiczne pipetowanie, aż do uzyskania fragmentów organoidów. Dodaj 800 mikrolitrów zaawansowanego DMEM/F-12.
Wirować w temperaturze 190 razy G przez 10 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza i usunąć supernatant. Aby przejść przez organoidy, należy ponownie zawiesić osad w odpowiedniej objętości zaawansowanego DMEM/F-12 i dodać ECM w stosunku 30:70. Dobrze wymieszaj.
Kontynuuj wysiewanie i hodowlę organoidów zgodnie z opisem w manuskrypcie tekstowym. Zdysocjowane pojedyncze komórki z płata przedniego wysiewano w ECM i hodowano w pożywce organoidowej przysadki. 14 dni po wysiewie organoidy były w pełni rozwinięte i osiągnęły średnicę do 500 mikrometrów.
Na tym etapie organoidy wykazywały morfologię torbielowatą z warstwą nabłonkową otaczającą światło. Nie zaleca się stosowania studni, w których po wzroście pojawiają się gęste struktury. Do pasażowania do wysiewu użyto fragmentów organoidów.
Siedem dni po pasażowaniu zaobserwowano korzystny odrost organoidów ze strukturami torbielowatymi. Gęste organoidy należy wyrzucić, ponieważ niekorzystne organoidy mogą przejąć kulturę. Analiza barwienia immunofluorescencyjnego dla markerów nabłonkowych E-kadheryny i cytokeratyn 8 i 18 potwierdziła nabłonkowy charakter organoidów.
Ekspresja markerów przysadkowych komórek macierzystych Sox2 i Trop2 wykazała pnianość, a specyficzny dla przysadki marker LHX3 wykazał fenotyp przysadki organoidów. Ekspresja markera Ki67 wykazała, że komórki tworzące organoidy są w stanie proliferacyjnym. Analiza RTQ PCR wykazała wyższą ekspresję markerów macierzystych w organoidach niż w płacie przednim, nawet po wielu pasażach, co potwierdza wzbogacenie komórek macierzystych.
Ważne jest, aby przy początkowym wysiewie umieścić odpowiednią liczbę pojedynczych komórek w kopule ECM, a przy przechodzeniu organoidów należy pamiętać o ponownym wysiewie fragmentów, a nie pojedynczych komórek.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Przegląd
Ten artykuł przedstawia nowatorski 3D in vitro model opracowany z mysich organoidalnych przysadki w celu badania populacji komórek macierzystych gruczołu. Model jest kluczowy dla badań nad biologią komórek macierzystych przysadki w różnych warunkach, w tym dojrzewanie noworodków i wzrost nowotworu.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neuronauki
- Biologia komórek macierzystych
- Endokrynologia
Tło
- Przysadka reguluje układ dokrewny.
- Zrozumienie jej populacji komórek macierzystych jest istotne dla wniknięcia w różne warunki.
- Obecne techniki badania tych komórek są ograniczone.
- To badanie wprowadza niezawodną metodę hodowli komórek macierzystych przysadki.
Cel badania
- Rozwój 3D modelu organoidalnego z mysiej przysadki.
- Zbadanie biologii i funkcji komórek macierzystych przysadki.
- Dostarczenie narzędzia do badania warunków wpływających na przysadkę.
Zastosowanie metod
- Izolacja mysich komórek macierzystych przysadki.
- Rozwój kultur organoidalnych.
- Ocena wzrostu i ekspansji komórek macierzystych.
- Zastosowanie modelu w różnych warunkach fizjologicznych.
Główne wyniki
- Model organoidalny z powodzeniem wspiera wzrost pierwotnych mysich komórek macierzystych przysadki.
- Umożliwia badanie zachowania komórek macierzystych w warunkach homeostazy i remodelacji.
- Wykazał potencjał do badania spadku funkcjonalnego związanego z starzeniem się.
- Dostarcza wnikliwych informacji na temat dynamiki wzrostu nowotworów w przysadce.
Wnioski
- Opracowany model organoidalny jest istotnym postępem w badaniach nad przysadką.
- Oferuje unikalną platformę do badania biologii komórek macierzystych.
- Ta technika może prowadzić do lepszego zrozumienia zaburzeń związanych z przysadką.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
Establishing mouse pituitary-derived organoids as a robust in vitro model enables systematic exploration of pituitary stem cell biology under both homeostatic and remodeling conditions. This platform addresses a critical gap in target validation and mechanistic de-risking for endocrine and regenerative research portfolios. The model's reproducibility and long-term expansion support predictive confidence for early discovery and translational studies.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables interrogation of pituitary stem cell phenotype and activation states in defined conditions.
- Supports biological de-risking by recapitulating in vivo stemness and tissue-specific markers.
- Facilitates predictive confidence in target selection for endocrine and regenerative programs.
Screening & Assay Development
- Provides a validated 3D system for quantitative assessment of stem cell proliferation and differentiation.
- Enables assay standardization through reproducible organoid expansion and marker expression analysis.
- Supports screening readiness for compounds affecting pituitary stem cell function or remodeling.
Translational & Preclinical Research
- Aligns with disease-relevant modeling of pituitary maturation, aging, and tumorigenesis.
- Enables continuity from discovery through preclinical validation of stem cell-targeted interventions.
- Supports risk-adjusted advancement by modeling both healthy and diseased gland states.
Pipeline & Workflow Integration
This organoid model integrates into the discovery-to-preclinical continuum, enabling hypothesis testing, pathway clarification, and functional validation of pituitary stem cell targets.
- Discovery Biology: Supports null hypothesis testing of stem cell activation and phenotype under controlled conditions.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative outputs for evaluating compound effects on organoid growth and marker expression.
- Analytics: Enables measurement of proliferation (Ki67), stemness (Sox2, Trop2), and tissue-specific markers (LHX3) for comparative analysis.
- Translational Research: Models key physiological transitions and disease states relevant to endocrine disorders.
- Enterprise Reuse: Provides a scalable, reusable platform for cross-program stem cell biology investigations.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in pituitary stem cell research.
- Operational Value: Standardizes workflows for organoid culture, expansion, and phenotypic analysis.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions and capital efficiency by enabling robust early-stage validation.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization of endocrine and regenerative discovery programs.
Implementation Considerations
- Requires expertise in organoid culture, stem cell marker analysis, and quantitative imaging.
- Needs access to advanced cell culture, imaging, and molecular analysis infrastructure.
- Demands cross-team standardization for reproducible seeding, passaging, and marker validation.
- Adaptation may be needed for other species or disease models beyond mouse pituitary.
- Careful control of cell density and fragment selection is critical for consistent organoid quality.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:04
Introduction
0:53
Isolation of Mouse Anterior Lobe
1:57
Dissociation of Pituitary into Single Cells
4:28
Establishment and Culturing of Anterior Lobe Derived Organoids
7:31
Results: Establishment and Validation of Anterior Lobe Derived Organoids
9:21
Conclusion
