Metoda podwójnego barwienia do wykrywania pektyn w interakcji roślina-grzyb

Protokół ten jest istotny, ponieważ umożliwia identyfikację interakcji roślina-grzyb. Oprócz barwienia pektyny wykazuje również defekty na polimerze ściany komórkowej patogenu i umożliwia identyfikację struktur grzyba. Ta prosta i nieskomplikowana technika może być wykonywana za pomocą mikroskopii świetlnej i nie wymaga drogiego sprzętu, takiego jak skaningowy mikroskop elektronowy.

Ponadto jest to szybka technika, która uzyskuje doskonałe wyróżnienie struktur roślinnych do badań histopatologicznych. Technika ta identyfikuje interakcję roślina-grzyb. W związku z tym współpracuje w diagnostyce chorób wywoływanych przez grzyby biotroficzne i nekrotroficzne, takie jak rdza kawy i cerkossporioza.

Na początek zbierz i około 10 milimetrów kwadratowych próbki liści w środkowej części zmiany za pomocą skalpela i pęsety i zanurz ją w 30 mililitrach roztworu utrwalającego Karnovsky'ego. Poddać próbkę liścia działaniu niskiej próżni od 500 do 600 milibarów przez 15 minut za pomocą pompy olejowej, co najmniej cztery razy, aby zwiększyć przepuszczalność roztworu utrwalającego w tkance liścia. Po utrwaleniu przemyć próbkę liści trzykrotnie w 0,5 M buforze kakodylowym rozcieńczonym w wodzie destylowanej przez pięć minut każdy, a następnie przenieść ją do sortowanego szeregu etanolowego na 15 minut przy każdym stężeniu etanolu.

Aby stopniowo przenosić próbki do metakrylanu glikolu, należy przygotować roztwór A, mieszając jeden gram proszku metakrylanu glikolu ze 100 mililitrami żywicy zasadowej pod mieszaniem magnetycznym. Następnie zanurzyć próbki w stosunku jeden do dwóch roztworu A i 100% etanolu na trzy godziny. Zanurz próbki w stosunku jeden do jednego dla roztworu A: 100% etanolu na trzy godziny, a następnie zanurz w czystej żywicy zasadowej na dwa do czterech dni.

Poddać próbkę działaniu niskiej próżni co najmniej cztery razy dziennie przez 15 minut, a następnie dokonać rotacji. Wymieszaj 15 mililitrów roztworu A z jednym mililitrem utwardzacza w zlewce z obracaniem przez dwie minuty, aby wytworzyć roztwór polimeryzacyjny B. Umieść 1,2 mililitra tego roztworu polimeryzacyjnego B w plastikowych formach. Za pomocą drewnianego kilofa przenieś uszkodzone próbki liści z czystej żywicy zasadowej do roztworu B i unikaj używania pęsety, ponieważ mogą one spowodować zgniecenie tkanki.

Upewnij się, że próbki liści są szybko ustawione prostopadle do plastikowych form, ponieważ roztwór B szybko staje się lepki. Po osiągnięciu prostopadłej orientacji próbek liści odczekaj 30 minut, a następnie przenieś plastikową formę do plastikowej lub szklanej komory zawierającej żel krzemionkowy, aby zapobiec wilgoci. Gdy żywica i próbka liści zostaną spolimeryzowane po dwóch do trzech godzinach, odłącz powstały blok od plastikowej formy, szlifując podstawę bloku pilnikiem szlifierskim.

Następnie przyklej klocek do kawałka drewna. Pokrój blok na odcinki o grubości pięciu mikrometrów za pomocą obracającego się mikrotomu wyposażonego w ośmiocentymetrowe stalowe ostrza. Umieść skrawki na szkiełkach pokrytych wodą destylowaną.

Następnie przenieś szkiełka na gorącą płytę do wyschnięcia w temperaturze 40 stopni Celsjusza i zwiększ przyczepność sekcji do szkiełek szklanych. Po wyschnięciu oznacz szkiełka nazwą odniesienia do bloku i numerem szkiełka. Przykryj sekcje dwoma mililitrami 5% błękitu bawełnianego w laktofenolu i podgrzewaj je na gorącej płycie w temperaturze 45 stopni Celsjusza przez pięć minut.

Usunąć nadmiar barwnika, myjąc szkiełko trzykrotnie w zlewce wypełnionej wodą destylowaną. Zaplamić go dwoma mililitrami 0,01% czerwieni rutenu w wodzie przez jedną minutę. Usunąć nadmiar barwnika, myjąc szkiełko trzykrotnie w zlewce wypełnionej wodą destylowaną.

Umieść kroplę wody destylowanej na sekcjach i przykryj je szkiełkiem nakrywkowym w celu przeprowadzenia analizy mikroskopowej w świetle. W metodzie podwójnego barwienia strzępki Hemileia vastatrix zawierające ściany komórkowe i gęstą zawartość protoplastów wydawały się ciemnoniebieskie zarówno w miąższu gąbczastym, jak i palisadowym. Komórka macierzysta haustorium i haustoria również miały ciemnoniebieski kolor.

Barwienie przeciw czerwienią rutenową wyraźnie określiło rozmieszczenie grzybów w przestrzeniach międzykomórkowych. Podczas interakcji komórka macierzysta Hemileia vastatrix haustorium złamała ścianę komórkową gospodarza i rozwinęła szyjkę haustorialną otoczoną związkami pektynowymi. Bogata w pektyny różowo-czerwona obudowa szyjki haustorialnej nie może zapobiec tworzeniu się haustorialu.

W niektórych przypadkach bogata w pektyny enkapsulacja niecałkowicie otaczała haustorium. A w niektórych przypadkach haustorium jest w pełni zamknięte. Bogata w pektyny ściana komórkowa utrzymuje integralność na granicy zmiany, gdzie grzyb nie jest obecny.

Metoda podwójnego barwienia wykazała obecność strzępek międzykomórkowych. W strefach interakcji ściany komórkowe pektyn wydawały się tracić swoją integralność z powodu rozpuszczania. Struktury rozrodcze, takie jak konidia, znaleziono w naskórku adaksjalnym.

Strzępki Cercospora coffeicola znaleziono w komorze podstomatycznej jako struktury zwijające się, a miąższ palisady w obszarze zmiany wydaje się ulegać lizie ściany komórkowej. Unikaj używania pęsety, ponieważ może to spowodować zgniecenie tkanki. Należy przeprowadzić dalsze badania histopatologiczne nad rdzą, antraknozą, cerkosporozją, smutkami i innymi biotroficznymi, hemibiotroficznymi i nekrotroficznymi interakcjami roślina-grzyb w celu zbadania potencjalnego zastosowania tej techniki w różnych patosystemach.