Kauteryzacja pełnego koła rąbka splotu naczyniowego w przypadku jaskry wywołanej chirurgicznie u gryzoni

Opracowaliśmy prostą metodę wywoływania silnego i postępującego zwyrodnienia jaskry w oparciu o tymczasowe podwyższenie ciśnienia wewnątrzgałkowego. Stanowi to wyjątkową okazję do zbadania kluczowych punktów patofizjologii jaskry. Jest to łatwy do nauczenia, nieinwazyjny, tani i wysoce powtarzalny model, który umożliwia analizę funkcji in vivo i krótkoterminowe projekty eksperymentalne z wykorzystaniem zmniejszonej liczby zwierząt w każdym eksperymencie.

Siatkówka i nerw wzrokowy są możliwymi do oceny częściami ośrodkowego układu nerwowego, więc modelowanie postępującego upośledzenia tych struktur może dostarczyć cennych informacji na temat innych zaburzeń neurodegeneracyjnych. Aby zmierzyć podstawowe ciśnienie wewnątrzgałkowe lub IOP, zarówno eksperymentalnych, jak i przeciwległych oczu kontrolnych, umieść znieczulonego szczura w brzusznej pozycji odleżynowej na blacie stołu, tak aby powierzchnia rogówki była łatwo dostępna dla końcówki tonometru. Ustaw końcówkę tonometru tak, aby lekko dotykała prostopadle środkowej strefy rogówki.

Następnie uzyskaj pomiar, naciskając przycisk pomiaru. Następnie umieść szczura w lekkiej bocznej pozycji odleżynowej pod mikroskopem stereoskopowym i zbadaj eksperymentalne oko w 40-krotnym powiększeniu. Podczas zabiegu należy nasmarować przeciwległe oko kontrolne, wkraplając kroplę karmelozy sodowej lub hialuronianu sodu.

Następnie, za pomocą zakrzywionych kleszczy, delikatnie popchnij eksperymentalną gałkę oczną do przodu, aby odsłonić naczynia krwionośne otaczające 360 stopni rąbka. Następnie, drugą ręką, za pomocą niskotemperaturowej kauteryzacji okulistycznej, delikatnie kauteryzuj naczynia wokół rogówki. Uważaj, aby nie kauteryzować obwodu rogówki.

Potwierdź powodzenie zabiegu chirurgicznego, obserwując pojawienie się małych kolistych śladów kauteryzacji na rąbku twardówki, zatarcie naczyń rąbkowych i rozszerzenie źrenicy w operowanym oku. Po zabiegu należy sprawdzić bezpośrednio po operacji ciśnienie wewnątrzgałkowe w obu oczach, jak pokazano wcześniej. Następnie nałóż kroplę octanu prednizolonu na przednią powierzchnię oka doświadczalnego.

Po 40 sekundach zastąp go maścią z antybiotykiem okulistycznym. Stosuj codzienną obserwację kliniczną oka eksperymentalnego za pomocą miejscowych leków składających się z niesteroidowego leku przeciwzapalnego i maści z antybiotykiem. W celu analizy reakcji optomotorycznej umieść szczura w celu przyzwyczajenia się do niego na platformie zbudowanej z czterech monitorów komputerowych w czworokącie.

Utrzymuj czerwony kursor celownika na klatce wideo między oczami swobodnie poruszającego się szczura, ponieważ wskazuje on środek wirtualnego cylindra. Obserwuj reakcję optomotoryczną polegającą na odruchowym śledzeniu głowy i szyi szczura wywołanym przez obracające się stopnie. Początkowo wprowadź bodziec o niskiej częstotliwości przestrzennej, a następnie stopniowo zwiększaj częstotliwość, aż ruch śledzenia nie zostanie zauważony.

Aby zarejestrować elektroretinogram wzorca, po znieczuleniu szczura ostrożnie włóż aktywną elektrodę na skroniowym obrzeżu rogówki. Dodatkowo należy wprowadzić elektrodę referencyjną do tkanki podskórnej ipsilateralnej kanty skroniowej, a elektrodę masową do jednej z kończyn tylnych. Następnie umieść szczura w odległości 20 centymetrów od ekranu bodźca, monitoruj linię bazową sygnału i rozpocznij akwizycję, naciskając przycisk Analiza w systemie akwizycji.

Po wyizolowaniu siatkówki przenieś je do 24-dołkowej płytki hodowlanej zawierającej jeden mililitr PBS, trzymając wewnętrzną siatkówkę skierowaną do góry. Przepuszczalność tkanki poprzez przemycie 0,5% niejonowym środkiem powierzchniowo czynnym rozcieńczonym w PBS. Następnie inkubować tkankę i roztwór blokujący przez godzinę w temperaturze pokojowej, delikatnie wstrząsając.

Podczas inkubacji należy przygotować roztwór przeciwciała pierwszorzędowego Brn-3a i przechowywać w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Po zablokowaniu tkanek inkubować siatkówki w 200 mikrolitrach roztworu przeciwciała pierwotnego w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez 72 godziny, delikatnie wstrząsając. Następnie umyj chusteczkę PBS.

Inkubować tkankę w 200 mikrolitrach roztworu przeciwciała wtórnego przez dwie godziny w temperaturze pokojowej, a następnie z roztworem przeciwbarwiącym jądro przez 10 minut w celu barwienia jąder fluorescencyjnych. Po trzech płukaniach PBS przenieś siatkówkę na szklane szkiełko mikroskopowe za pomocą dwóch małych szczotek, utrzymując szklistą stronę do góry. Ustaw kwadrant grzbietowej siatkówki do góry na szkiełku mikroskopowym.

Na koniec nałóż 200 mikrolitrów środka mocującego zapobiegającego blaknięciu na szklane szkiełko nakrywkowe i umieść je na płasko zamontowanej siatkówce w celu analizy mikroskopowej. Pod konfokalnym mikroskopem epifluorescencyjnym, używając obiektywu powiększającego 40 razy, zbadaj płaskie mocowania, aby oszacować komórki zwojowe siatkówki. Po wyłuszczeniu gałki ocznej należy usunąć proksymalny odcinek wewnątrzoczodołowej części nerwu wzrokowego, w tym część części wewnątrzgałkowej.

Następnie natychmiast umieść próbki w fiolkach lub probówkach zawierających od 200 do 300 mikrolitrów zimnego utrwalacza. Po dwóch godzinach przemyj tkankę zimnym 100 mikromolowym buforem kakodylanu sodu. Następnie utrwalaj tkankę przez godzinę w 1% tetratlenku osmu i pięciu nanomolowym chlorku wapnia w temperaturze czterech stopni Celsjusza pod delikatnym potrząsaniem.

Po trzech przepłukaniach zimnym buforem kakodylanu sodu przemyj fragmenty nerwu wzrokowego zimną wodą destylowaną przed inkubacją przez noc i 1% octanem moczu w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Następnego dnia, po trzech płukaniach wodą, stopniowo odwadniaj tkankę w rosnącym stężeniu acetonu. Następnie wykonaj trzy rundy zatapiania i roztworów acetonu żywicy epoksydowej przed zatopieniem tkanki w czystej żywicy epoksydowej na 24 godziny.

Następnego dnia wyjmij próbki z nośnika próbki i przenieś je do form do zatapiania na 48 godzin w temperaturze 60 stopni Celsjusza. Po polimeryzacji za pomocą ultramikrotomu wyciąć poprzeczne półcienkie odcinki fragmentów nerwu wzrokowego. Następnie zbierz skrawki i przenieś je na szkiełko mikroskopowe.

Wybarwić skrawki błękitem toluidynowym i zobrazować je za pomocą mikroskopu optycznego w 100-krotnym powiększeniu. W przypadku ultra analizy statyczno-wytrzymałościowej należy wykonać ultracienkie przekroje i zebrać je na siatce miedzianej. Następnie wybarwić skrawki octanem pisuaru i cytrynianem ołowiu do badania pod mikroskopem transmisyjnym.

Kauteryzacja pełnego koła indukowała wzrost ciśnienia wewnątrzgałkowego natychmiast po operacji w porównaniu z oczami kontrolnymi. Szczyt pooperacyjnej wartości IOP obserwowano w pierwszym dniu i stopniowo zmniejszał się do poziomu wyjściowego w szóstym dniu. Ponadto funkcję siatkówki oceniano zarówno behawioralnie, jak i elektrofizjologicznie za pomocą odpowiednio odruchu optomotorycznego i elektroretinogramu wzorcowego.

Po operacji oba parametry wykazały dwie odrębne fazy upośledzenia: nadciśnienie oczne w trzeciej dobie i wtórną fazę zwyrodnieniową w 30. dniu. W porównaniu z grupą kontrolną nerwów wzrokowych, liczba aksonów i półcienkie poprzeczne odcinki nerwu wzrokowego zmniejszały się stopniowo po operacji. Transmisyjne mikrografie elektronowe nerwów wzrokowych z oka kontrolnego wykazały gęsto upakowane włókna mielinizowane oddzielone cienkimi wyrostkami komórek glejowych oraz wyraźne mikrotubule aksonalne i neurofilamenty.

Natomiast po trzech dniach nadciśnienia ocznego zaobserwowano kilka zdegenerowanych włókien, wakuolizację cytoplazmatyczną w procesach komórek glejowych i skondensowaną chromatynę w jądrach komórek glejowych. Po siedmiu dniach nastąpił wzrost zdegenerowanych włókien aksonalnych i hipertonicznych procesów komórek glejowych. A po 14 dniach zaobserwowano większe rozmieszczenie włókien nerwu wzrokowego związane z inwazją procesów komórek glejowych między aksonami.

Ponadto gęstość komórek zwojowych siatkówki zmniejszała się z czasem, głównie w kwadrantach grzbietowych i skroniowych siatkówki. Podczas wykonywania tej procedury staraj się delikatnie dotykać naczyń rąbkowych końcówką kauteryzacyjną, oszczędzając obwód pępowiny i upewniając się, że wokół rąbka twardówki obserwuje się ciągłe ślady kauteryzacji. Po tej procedurze można zastosować różne metody, takie jak funkcjonalna biochemiczna i immunohistochemiczna ocena struktur oka oraz inne metody, które mogą potwierdzić fizjopatologię jaskry.