Name: Bezznacznikowa optyka nieliniowa do badania zależnych od tubuliny defektów w centralnej mielinie (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-03-24T12:20:00.000+00:00
Duration: 8 min 7 s
Description: Poznaj mikroskopię generacji drugiej harmonicznej do badania oligodendrocytów z mikrotubulami w modelu tubulinopatii. Ta metoda pozwala analizować dynamikę mikrotubul w chorobach neurologicznych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Prace te były wspierane przez Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología (CONACYT) poprzez następujące granty: infraestructura 226450 dla VP-CIO, infraestructura 255277 dla V.P. oraz FORDECYT-PRONACES/194171/2020 dla V.H. Dziękujemy za wsparcie Juvenala Hernándeza Guevary z działu informatyki w tworzeniu filmów.

Wszystkie opisane procedury zostały przeprowadzone zgodnie z przepisami i kodeksami zatwierdzonymi w siódmym tytule Rozporządzenia Ogólnego Prawa Zdrowia dotyczącego Badań Zdrowotnych Rządu Meksyku (NOM-062-ZOO-1999) oraz zgodnie z zaleceniami Przewodnika Narodowych Instytutów Zdrowia dotyczącego Opieki i Wykorzystania Zwierząt Doświadczalnych i zostały zatwierdzone przez Instytucjonalną Komisję Bioetyki w Badaniach Naukowych Universidad de Guanajuato i Benemérita Universidad Autónoma de Puebla.
1. Ustawienia mikroskopu
<ol>
	<li>Włączyć system mikroskopowy.</li>
	<li>Włącz laser impulsowy, aby zagwarantować, że po ekstrakcji i przygotowaniu próbki będzie gotowy do laserowania na optymalnym i stałym poziomie mocy.</li>
	<li>Dostrój laser do długości fali 810 nm. Do badania mikrotubul tisularnych wykorzystuje się 10%-20% dostępnej mocy lasera, co w opisywanym systemie odpowiada 13-26 mW mierzonej w tylnej płaszczyźnie ogniskowej obiektywu.</li>
	<li>Upewnij się, że mikroskop jest ustawiony zgodnie z Köhlerem (plik uzupełniający 1) z obiektywem, który będzie używany do obrazowania SHG. UWAGA: Jest to ważne, ponieważ w konfiguracji komercyjnej używanej w tej pracy detekcja odbywa się w trybie transmisji i przez kondensator.</li>
	<li>Usuń niechciane filtry ze ścieżki wykrywania optycznego (Rysunek 1A).</li>
	<li>Upewnij się, że membrana skraplacza jest całkowicie otwarta, aby upewnić się, że żadne światło nie zostanie niepotrzebnie zatrzymane na tym poziomie.</li>
	<li>Przygotuj obiektyw olejowy z aperturą numeryczną (NA) 25x/0,8 z niewielką kroplą olejku immersyjnego w obiektywie. UWAGA: Ten cel został użyty, aby jak najlepiej dopasować kondensator NA, który wynosił 0,55 (idealniewarunki NA≥ NAobj).</li>
</ol>
2. Wstępne kontrole pod mikroskopem
UWAGA: Wykonaj wstępne kontrole mikroskopu raz, chyba że konfiguracja zostanie zmodyfikowana.
<ol>
	<li>Obraz suchej skrobi kukurydzianej umieszczonej między szklanymi szkiełkami z parametrami SHG, aby wygenerować obrazy SHG, które ujawniają kierunek polaryzacji lasera. Postępuj zgodnie z krokami opisanymi w pliku uzupełniającym 2, z wyjątkiem mocy lasera, która wynosi mniej niż 5% w przypadku skrobi kukurydzianej.</li>
	<li>Zrób jedno zdjęcie rzadkich ziaren skrobi kukurydzianej i zaznacz orientację zrazików SHG w płaszczyźnie x-y. Orientacja ta odpowiada orientacji lasera (rysunek 2A).</li>
	<li>Jako kontrolę wykonaj kolejny obraz tej samej próbki, umieszczając w torze optycznym płytkę półfalową (pozycja pokazana na rysunku 1A), aby zmienić kierunek oscylacji lasera. Uzyskany obraz przedstawia obrócone zraziki sygnałowe SHG (rysunek 2B, C).</li>
	<li>W przypadku korzystania z innego typu filtra pasmowoprzepustowego dla SHG, upewnij się, że ma on optymalne właściwości transmisji, porównując obrazy (Rysunek 2D, E) i intensywność sygnału piksel po pikselu wzdłuż skanowania liniowego (Rysunek 2F).</li>
</ol>
3. Ekstrakcja tkanek
UWAGA: Do wykonywania zabiegów chirurgicznych należy zawsze używać czystych narzędzi.
<ol>
	<li>Użyj 6-12 miesięcznych szczurów taiep i dopasowanych do wieku kontrolek Sprague-Dawley (WT).</li>
	<li>Znieczulić zwierzęta wstrzyknięciem dożylnie mieszaniny ketaminy-ksylazyny (0,125 mg/kg i 5 mg/kg) rozcieńczonej w 0,9% sterylnym roztworze NaCl.<ol>
		<li>Sprawdź odruchy bólowe i kontynuuj tylko wtedy, gdy ich nie ma.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Złóż zwierzę w ofierze poprzez ścięcie głowy.</li>
	<li>Po odizolowaniu głowy ostrożnie otwórz kości sklepienia czaszki wzdłuż linii środkowej, zaczynając od najbardziej ogonowego punktu u góry w kierunku nosa, od jam oczodołowych w kierunku linii środkowej, a następnie od najbardziej ogonowego punktu poniżej mózgu i móżdżku. UWAGA: Obcinacze do kości i Rongeurs pozwalają na prawidłowe usunięcie kości głowy bez uszkadzania struktur mózgu.</li>
	<li>Uwolnij mózg i móżdżek od kości. Obie półkule można było rozdzielić. Jeśli półkule są podzielone, użyj jednej połowy do obrazowania SHG, a drugą połowę utrwal w 3,7% paraformaldehydzie w buforowanej fosforanie soli fizjologicznej (PBS) na 20 minut w kapturze chemicznym w celu późniejszego przekrojenia i barwienia.</li>
</ol>
4. Sekcja wibratomu
<ol>
	<li>Przygotuj tacę buforową z wibratomem wypełnioną ciepłym (37 °C) zrównoważonym roztworem soli Hanka (HBSS).</li>
	<li>Przymocuj mózg do płytki próbki za pomocą kleju cyjanoakrylowego za pomocą kawałka taśmy maskującej. Najbardziej ogonowa część/obszar styka się z klejem, dzięki czemu można przeciąć użyteczne odcinki koronalne z przeciwnej, rostralnej części.<ol>
		<li>Odczekaj ~10 s, aby klej uległ polimeryzacji, aby uzyskać skuteczne przyleganie próbki. UWAGA: Najlepsze wyniki uzyskuje się, gdy mózg jest zorientowany w taki sposób, że ostrze tnie "od góry do dołu", a nie "z boku na bok" (ryc. 1B).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przenieść płytkę próbki na jej wspornik magnetyczny wewnątrz tacki buforowej.</li>
	<li>Rozpocznij cięcie odcinków o grubości 300-500 μm, aż wytworzone plastry obejmą całą powierzchnię mózgu.</li>
	<li>W tym momencie zmniejsz grubość przekroju do 160 μm.</li>
	<li>Po przecięciu pełnego odcinka o wielkości 160 μm na poziomie ciała modzelowatego, odzyskaj go za pomocą zmodyfikowanej szklanej pipety Pasteura z dużym, płomieniowanym otworem (ryc. 1C).</li>
	<li>Przenieść go na czystą szalkę Petriego z nowym ciepłym HBSS lub bezpośrednio na szklany nośnik do mikroskopii (szkiełko nakrywkowe lub naczynie ze szklanym dnem). UWAGA: W opisanych warunkach eksperymentalnych dodanie szkiełka nakrywkowego powyżej próbki jest szkodliwe dla obrazowania.</li>
</ol>
5. Przeniesienie do mikroskopu
<ol>
	<li>Jeśli mikroskop znajduje się w innym pomieszczeniu, przygotuj izolowane pudełko z ocieplonymi okładami żelowymi do przenoszenia skrawków tkanki przy zachowaniu temperatury. Pudełko służy również do utrzymywania sekcji w cieple do momentu ich zobrazowania.</li>
	<li>Umieść próbkę pod mikroskopem i upewnij się, że jest prawidłowo umieszczona pod obiektywem, prowadząc bezpośrednią obserwację przez okulary ze światłem przechodzącym. UWAGA: Celem jest dostosowanie przewidywanych struktur emitujących do kierunku oscylacji lasera, aby zmaksymalizować emitowany (a tym samym wykryty) sygnał SHG.</li>
	<li>Usunąć nadmiar HBSS tak, aby cienka warstwa cieczy pokryła całą próbkę. Co kilka minut należy sprawdzać wzrokowo film cieczy, aby uniknąć nadmiernego parowania i wysuszenia próbki. UWAGA: W opisanych warunkach sekcja jest używana nie dłużej niż 20 minut. Wysuszenie próbki powoduje drastyczne efekty sztuczne (rysunek uzupełniający 1A). Zamiast dodawać więcej HBSS, zaleca się okresowe moczenie przekroju w ciepłym, świeżym podłożu, jeśli potrzebne jest dłuższe czasy obrazowania. Stosowanie komór perfuzyjnych i kleju lub niskotopliwej agarozy do unieruchomienia tkanki jest również zalecane, gdy mają być wykonywane dłuższe eksperymenty.</li>
	<li>Przygotuj stolik mikroskopowy do obrazowania bez deskanowania, które może obejmować zamknięcie wszystkich drzwi ciemnej komory inkubacyjnej lub przykrycie komory inkubacyjnej czarną nylonową tkaniną pokrytą poliuretanem.</li>
</ol>
6. Obrazowanie
<ol>
	<li>Wybierz tryb obrazowania "bez deskryptacji" wzdłuż ścieżki transmisji. W ten sposób wychwytywanie słabego sygnału SH tubuliny zostanie zoptymalizowane.</li>
	<li>Wybierz obiektyw LCI Plan-Neofluar 25x/0,8 NA.</li>
	<li>Ustaw moc lasera w zakresie od 13 mW do 26 mW, z czasem przebywania pikseli 12,6 μs. Rób zdjęcia nie większe niż 512 x 512 pikseli, z prędkością 5 i średnią 2, przez średni czas akwizycji około 15 s. UWAGA: Używanie większych mocy lasera i/lub dłuższych czasów przebywania może spowodować uszkodzenie próbki (rysunek uzupełniający 1B).</li>
	<li>Najpierw zrób zdjęcia za pomocą filtra krótkoprzepustowego 485 nm (SP485), a w drugim kroku dodaj ostry filtr pasmowoprzepustowy 405 nm (BP405; Rysunek 3). Postępuj zgodnie z krokami opisanymi w pliku uzupełniającym 2. UWAGA: Obrazy pseudo-jasnego pola mogą być wykonywane przez ten sam detektor przy użyciu szczątkowego światła laserowego linii widzialnej (najlepiej sprawdzają się lasery 405 nm lub 488 nm).</li>
</ol>
7. Przetwarzanie móżdżku
<ol>
	<li>Najpierw przetnij móżdżek skalpelem na dwie półkule, a następnie przyklej je do podpory wibratomu za środkową część (płaską część uzyskaną po cięciu).</li>
	<li>Przekrój i zobrazuj móżdżek w taki sam sposób, jak opisano dla mózgu (sekcje 160 μm, te same ustawienia wibratomu, ta sama łopatka, te same ustawienia mikroskopu itp.). UWAGA: Ze względu na anatomię móżdżku jego orientacja w momencie cięcia nie jest krytyczna; W większości plastrów wytworzonych z dala od powierzchni będą liście dobrze pocięte w istocie białej.</li>
</ol>

<ol><li>Palmiter, R. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+lineage+ablation+in+transgenic+mice+by+cell-specific+expression+of+a+toxin+gene%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Cell lineage ablation in transgenic mice by cell-specific expression of a toxin gene.</a> Cell. 50 (3), 435-443 (1987).</li>
<li>Banerjee, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+monoclonal+antibody+against+the+type+II+isotype+of+beta-tubulin.+Preparation+of+isotypically+altered+tubulin%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">A monoclonal antibody against the type II isotype of beta-tubulin. Preparation of isotypically altered tubulin.</a> The Journal of Biological Chemistry. 263 (6), 3029-3034 (1988).</li>
<li>Banerjee, A., Roach, M. C., Trcka, P., Luduena, R. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+a+monoclonal+antibody+specific+for+the+class+IV+isotype+of+beta-tubulin.+Purification+and+assembly+of+alpha+beta+II%2C+alpha+beta+III%2C+and+alpha+beta+IV+tubulin+dimers+from+bovine+brain%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Preparation of a monoclonal antibody specific for the class IV isotype of beta-tubulin. Purification and assembly of alpha beta II, alpha beta III, and alpha beta IV tubulin dimers from bovine brain.</a> The Journal of Biological Chemistry. 267 (8), 5625-5630 (1992).</li>
<li>Banerjee, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Localization+of+%CE%B2v+tubulin+in+the+cochlea+and+cultured+cells+with+a+novel+monoclonal+antibody%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Motility+and+the+Cytoskeleton%22%5BJournal%5D)">Localization of βv tubulin in the cochlea and cultured cells with a novel monoclonal antibody.</a> Cell Motility and the Cytoskeleton. 65 (6), 505-514 (2008).</li>
<li>Cross, A. R., Williams, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kinky+microtubules%3A+Bending+and+breaking+induced+by+fixation+in+vitro+with+glutaraldehyde+and+formaldehyde%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Motility+and+the+Cytoskeleton%22%5BJournal%5D)">Kinky microtubules: Bending and breaking induced by fixation in vitro with glutaraldehyde and formaldehyde.</a> Cell Motility and the Cytoskeleton. 20 (4), 272-278 (1991).</li>
<li>Van Steenbergen, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+understanding+of+label-free+second+harmonic+imaging+of+microtubules%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Molecular understanding of label-free second harmonic imaging of microtubules.</a> Nature Communications. 10 (1), 3530(2019).</li>
<li>Campagnola, P. J., Clark, H. A., Mohler, W. A., Lewis, A., Loew, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Second-harmonic+imaging+microscopy+of+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomedical+Optics%22%5BJournal%5D)">Second-harmonic imaging microscopy of living cells.</a> Journal of Biomedical Optics. 6 (3), 277(2001).</li>
<li>Campagnola, P. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+high-resolution+second-harmonic+generation+imaging+of+endogenous+structural+proteins+in+biological+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional high-resolution second-harmonic generation imaging of endogenous structural proteins in biological tissues.</a> Biophysical Journal. 82 (1), 493-508 (2002).</li>
<li>Yu, C. -H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measuring+microtubule+polarity+in+spindles+with+second-harmonic+generation%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Measuring microtubule polarity in spindles with second-harmonic generation.</a> Biophysical Journal. 106 (8), 1578-1587 (2014).</li>
<li>Bancelin, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Probing+microtubules+polarity+in+mitotic+spindles+in+situ+using+Interferometric+Second+Harmonic+Generation+Microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Probing microtubules polarity in mitotic spindles in situ using Interferometric Second Harmonic Generation Microscopy.</a> Scientific Reports. 7, 6758(2017).</li>
<li>Dombeck, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Uniform+polarity+microtubule+assemblies+imaged+in+native+brain+tissue+by+second-harmonic+generation+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Uniform polarity microtubule assemblies imaged in native brain tissue by second-harmonic generation microscopy.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (12), 7081-7086 (2003).</li>
<li>Psilodimitrakopoulos, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Estimation+of+the+effective+orientation+of+the+SHG+source+in+primary+cortical+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Optics+Express%22%5BJournal%5D)">Estimation of the effective orientation of the SHG source in primary cortical neurons.</a> Optics Express. 17 (16), 14418(2009).</li>
<li>Sharoukhov, D., Bucinca-Cupallari, F., Lim, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microtubule+imaging+reveals+cytoskeletal+deficit+predisposing+the+retinal+ganglion+cell+axons+to+atrophy+in+DBA%2F2J%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Opthalmology+%26+Visual+Science%22%5BJournal%5D)">Microtubule imaging reveals cytoskeletal deficit predisposing the retinal ganglion cell axons to atrophy in DBA/2J.</a> Investigative Opthalmology & Visual Science. 59 (13), 5292(2018).</li>
<li>Alata, M., Piazza, V., Eguibar, J. R., Cortes, C., Hernandez, V. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((H-ABC+tubulinopathy+revealed+by+label-free+second+harmonic+generation+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">H-ABC tubulinopathy revealed by label-free second harmonic generation microscopy.</a> Scientific Reports. 12, 14417(2022).</li>
<li>Duncan, I. D., Lunn, K. F., Holmgren, B., Urba-Holmgren, R., Brignolo-Holmes, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+taiep+rat%3A+A+myelin+mutant+with+an+associated+oligodendrocyte+microtubular+defect%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurocytology%22%5BJournal%5D)">The taiep rat: A myelin mutant with an associated oligodendrocyte microtubular defect.</a> Journal of Neurocytology. 21 (12), 870-884 (1992).</li>
<li>Duncan, I. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+mutation+in+the+Tubb4a+gene+leads+to+microtubule+accumulation+with+hypomyelination+and+demyelination%3A+Tubb4a+Mutation%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+Neurology%22%5BJournal%5D)">A mutation in the Tubb4a gene leads to microtubule accumulation with hypomyelination and demyelination: Tubb4a Mutation.</a> Annals of Neurology. 81 (5), 690-702 (2017).</li>
<li>Garduno-Robles, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MRI+features+in+a+rat+model+of+H-ABC+tubulinopathy%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">MRI features in a rat model of H-ABC tubulinopathy.</a> Frontiers in Neuroscience. 14, 555(2020).</li>
<li>Lopez-Juarez, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Auditory+impairment+in+H-ABC+tubulinopathy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Comparative+Neurology%22%5BJournal%5D)">Auditory impairment in H-ABC tubulinopathy.</a> Journal of Comparative Neurology. 529 (5), 957-968 (2021).</li>
<li>Alata, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Longitudinal+evaluation+of+cerebellar+signs+of+H-ABC+tubulinopathy+in+a+patient+and+in+the+taiep+model%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Neurology%22%5BJournal%5D)">Longitudinal evaluation of cerebellar signs of H-ABC tubulinopathy in a patient and in the taiep model.</a> Frontiers in Neurology. 12, 702039(2021).</li>
<li>Parodi, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nonlinear+optical+microscopy%3A+From+fundamentals+to+applications+in+live+bioimaging%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Bioengineering+and+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Nonlinear optical microscopy: From fundamentals to applications in live bioimaging.</a> Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 8, 585363(2020).</li>
<li>Lefort, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+review+of+biomedical+multiphoton+microscopy+and+its+laser+sources%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Physics+D%3A+Applied+Physics%22%5BJournal%5D)">A review of biomedical multiphoton microscopy and its laser sources.</a> Journal of Physics D: Applied Physics. 50 (42), 423001(2017).</li>
<li>Campagnola, P. J., Loew, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Second-harmonic+imaging+microscopy+for+visualizing+biomolecular+arrays+in+cells%2C+tissues+and+organisms%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Second-harmonic imaging microscopy for visualizing biomolecular arrays in cells, tissues and organisms.</a> Nature Biotechnology. 21 (11), 1356-1360 (2003).</li>
<li>vander Knaap, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+syndrome+characterized+by+hypomyelination+with+atrophy+of+the+basal+ganglia+and+cerebellum%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Neuroradiology%22%5BJournal%5D)">New syndrome characterized by hypomyelination with atrophy of the basal ganglia and cerebellum.</a> American Journal of Neuroradiology. 23 (9), 1466(2002).</li>
<li>Stoller, P., Kim, B. -M., Rubenchik, A. M., Reiser, K. M., Da Silva, L. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polarization-dependent+optical+second-harmonic+imaging+of+a+rat-tail+tendon%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomedical+Optics%22%5BJournal%5D)">Polarization-dependent optical second-harmonic imaging of a rat-tail tendon.</a> Journal of Biomedical Optics. 7 (2), 205(2002).</li>
<li>Brown, E. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+measurement+of+gene+expression%2C+angiogenesis+and+physiological+function+in+tumors+using+multiphoton+laser+scanning+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">In vivo measurement of gene expression, angiogenesis and physiological function in tumors using multiphoton laser scanning microscopy.</a> Nature Medicine. 7 (7), 864-868 (2001).</li>
<li>Chakraborti, S., Natarajan, K., Curiel, J., Janke, C., Liu, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+emerging+role+of+the+tubulin+code%3A+From+the+tubulin+molecule+to+neuronal+function+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Cytoskeleton%22%5BJournal%5D)">The emerging role of the tubulin code: From the tubulin molecule to neuronal function and disease.</a> Cytoskeleton. 73 (10), 521-550 (2016).</li>
</ol>

Autorzy nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Mikroskopia SHG należy do grupy technik optyki nieliniowej, która obejmuje mikroskopię wzbudzenia dwufotonowego, mikroskopię trzeciej generacji i koherentną mikroskopię rozpraszania Ramana anty-Stokesa, które przyczyniły się do rozszerzenia zakresu zastosowań konwencjonalnej mikroskopii optycznej na nauki przyrodnicze20.
W szczególności główne mocne i słabe strony mikroskopii SHG odnoszą się do tego samego warunku: generator sygnału jest niecentryczny2...

Obrazowanie optyczne struktur cytoszkieletu w preparatach tkanek i narządów nie jest łatwym zadaniem. Włókna cytoszkieletu są wszechobecne, więc jeśli przeprowadza się ogólne barwienie, na przykład przeciwko alfa-tubulinie lub beta-aktynie lub potencjalnie keratynie w próbce nabłonka, sygnał będzie prawdopodobnie rozprowadzany dość jednorodnie w całej próbce. Aby ograniczyć barwienie do bardziej znaczącego podzbioru składników komórkowych, można użyć myszy transgenicznych z ukierunkowaną ekspresją1 lub zaplanować użycie przeciwciał specyficznych dla izoformy. Chociaż bardzo niewiele z tych ostatnich jest dostępnych na rynku (i bardzo niewiele w ogóle istnieje 2,3,4), transgeniczny model zwierzęcy może być dostępny. Musi być jednak nabyty przez laboratorium i odpowiednio przechowywany, ze wszystkimi wydatkami związanymi z tym procesem. Niektóre przeciwciała lub substancje chemiczne, na przykład leki sprzężone z fluoroforem, takie jak falloidyna lub paklitaksel, mogą być częściowo lub całkowicie niezgodne ze stosowaniem w żywych komórkach lub tkankach, ograniczając w ten sposób ich zastosowanie tylko do badań na ustalonych próbkach.
W przypadku tubuliny należy wziąć pod uwagę dodatkowy aspekt, jakim jest wrażliwość polimeru na utrwalanie. Konwencjonalne wiązanie chemiczne za pomocą formaldehydu jest znane z tego, że nie jest wystarczające do optymalnego zachowania integralności mikrotubul5. Ponadto niedawny raport potwierdza, że sieciowanie formaldehydu indukuje subtelne zmiany w ultrastrukturze mikrotubul, podobnie jak dzieje się to z wiązaniem niektórych leków lub cząsteczek fizjologicznych, takich jak GTP6.
Bezpośrednia wizualizacja mikrotubul w niebarwionych, nieutrwalonych próbkach jest zatem często pożądana. Aby to osiągnąć, jednym z rozwiązań technicznych jest mikroskopia drugiej harmonicznej (SHG)7, która opiera się na zdolności wiązek równoległych mikrotubul do działania jako harmonofory i emitowania światła o podwójnej częstotliwości, gdy są odpowiednio oświetlone intensywnym, pulsacyjnym laserem w podczerwieni. Chociaż silniejszy i bardziej stabilny sygnał drugiej harmonicznej może być generowany z kolagenu i miozyny, które są jedynymi pozostałymi materiałami biologicznymi, o których wiadomo, że są zdolne do podwajania częstotliwości, sygnał z tubuliny był do tej pory wykorzystywany głównie do badania przegrupowań wrzeciona mitotycznego 8,9,10 i morfologii mikrotubul aksonalnych 11,12,13.
W niniejszej pracy przedstawiamy nowatorskie zastosowanie mikroskopii SHG jako narzędzia diagnostycznego do odróżniania tkanek ośrodkowego układu nerwowego (OUN) dotkniętych tubulinopatią beta 4 A (TUBB4A) od ich zdrowych odpowiedników14. Niektóre mutacje zachodzące w tej głównie neuronalnej izoformie tubuliny, takie jak te powodujące hipomielinizację i atrofię zwojów podstawy i móżdżku (H-ABC), indukują przepełnienie mikrotubul w oligodendrocytach15,16; Zmiany cytoszkieletu z kolei są związane z dalszymi efektami, takimi jak dysmielinizacja, z głębokim upośledzeniem szlaków motorycznych i czuciowych 16,17,18,19. Mysi model taiep zastosowany w tej pracy pokazuje nieprawidłową zawartość mikrotubul w oligodendrocytach i podsumowuje większość objawów czuciowo-motorycznych pacjentów z H-ABC17. Protokół wyjaśnia, w jaki sposób obrazować struktury takie jak ciało modzelowate i móżdżek, które są zwykle silnie zmielinizowane i które są poważnie dotknięte u ludzi, a także u szczura taiep 19, aby podkreślić różnice w sygnałach SH między zdrowymi i zmutowanymi tkankami.

<table><tbody><tr><td>Jednozakresowy filtr pasmowo-przepustowy BrightLine(R) 405/10 nm&nbsp;</td><td>Semrock</td><td>FF01-405/10-25</td><td>Średnica 32 mm, z pierścieniem obudowy</td></tr><tr><td>nylon, tkanina powlekana poliuretanem</td><td>Tholabs powiedział:</td><td>Zobacz materiał BK5</td><td>Grubość 5' x 9' (1,5 m x 2,7 m) x 0,005" (0,12 mm)&nbsp;</td></tr><tr><td>Ostrza do wibratomu</td><td>wszelkie komercyjne; np. miecz Wilkinsona</td><td></td><td>&nbsp; Klasyczne żyletki z podwójnymi krawędziami ze stali nierdzewnej</td></tr><tr><td>Szalki do hodowli komórkowych, 35 mm</td><td>wszelkie komercyjne; np. Sokół</td><td>351008</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop konfokalny</td><td>Zeiss</td><td>LSM710NLO AxioObserver Z1</td><td>Mikroskop odwrócony, zastosowany obiektyw to LCI Plan-Neofluar 25x/0,8 NA&nbsp;</td></tr><tr><td>Chłodnica</td><td>wszelkie komercyjne</td><td></td><td>Każde izolowane pudełko z polistyrenu może działać, aby utrzymać próbkę na poziomie około 37 stopni; C</td></tr><tr><td>Stojak na kukurydzę</td><td>np. Maizena</td><td></td><td>Z supermarketu</td></tr><tr><td>Szkiełka nakrywkowe #1.5</td><td>wszelkie komercyjne</td><td></td><td>Prostokątny</td></tr><tr><td>Klej cyjanoakrylowy</td><td>np. Loctite</td><td></td><td>Aby przykleić mózg do taśmy maskującej</td></tr><tr><td>Cienkie kleszcze</td><td>Narzędzia do nauki precyzyjnej</td><td>11412-11</td><td>Manipulowanie skrawkami tkanek poprzez obchodzenie się z oponami mózgowymi</td></tr><tr><td>Cienkie nożyczki</td><td>Narzędzia do nauki precyzyjnej</td><td>14370-22</td><td>Aby przeciąć skórę&nbsp;</td></tr><tr><td>Cienkie nożyczki z zakrzywioną końcówką</td><td>Narzędzia do nauki precyzyjnej</td><td>14061-09</td><td>Aby ciąć wzdłuż linii środkowej</td></tr><tr><td>Formaldehyd 37%</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>252549</td><td>Aby rozcieńczyć 1:10 w PBS</td></tr><tr><td>Friedman Rongeur</td><td>Narzędzia do nauki precyzyjnej</td><td>16000-14</td><td>Aby przeciąć kość</td></tr><tr><td>Wkłady żelowe</td><td>wszelkie komercyjne</td><td></td><td>Rozgrzany do 37 stopni Celsjusza; C, aby pomóc w utrzymaniu temperatury wewnątrz chłodnicy</td></tr><tr><td>Szklana pipeta Pasteura, modyfikowana</td><td>wszelkie komercyjne</td><td></td><td>Aby przenieść wycinek tkanki</td></tr><tr><td>Hanks&prime; Zrównoważony roztwór soli (HBSS)</td><td>Gibco (firma Gibco)</td><td>14025-076</td><td>Może być przygotowany z proszków</td></tr><tr><td>Hemostatyki Kelly'ego</td><td>Narzędzia do nauki precyzyjnej</td><td>13018-14</td><td>Aby oddzielić kość&nbsp;</td></tr><tr><td>Taśma maskująca</td><td>wszelkie komercyjne</td><td></td><td>Aby chronić powierzchnię płytki próbki</td></tr><tr><td>Moduł NDD, typ C</td><td>Zeiss</td><td>000000-1410-101</td><td>Aby wykryć sygnał, zmniejszając straty światła. Obudowa zestawu filtrów 000000-1935-163 z SP485</td></tr><tr><td>Obcęgi do kości z offsetem</td><td>Narzędzia do nauki precyzyjnej</td><td>16101-10</td><td>Aby przeciąć kość</td></tr><tr><td>Solanka fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS)</td><td>Gibco (firma Gibco)</td><td>10010-031</td><td>Może być przygotowany z proszków lub tabletek</td></tr><tr><td>Laser impulsowy</td><td>Spójne</td><td>Kameleon Vision II</td><td>680&ndash; Laser przestrajalny 1080 nm</td></tr><tr><td>Skalpel</td><td>wszelkie komercyjne</td><td></td><td>Ostrze proste z ostrym zakończeniem</td></tr><tr><td>Kleszcze o standardowym wzorze</td><td>Narzędzia do nauki precyzyjnej</td><td>11000-18</td><td></td></tr><tr><td>Nożyczki sprężynowe Vannas</td><td>Narzędzia do nauki precyzyjnej</td><td>15018-10</td><td>Do cięcia opon mózgowych, które pozostają połączone zarówno z plastrem uzyskanym z cięcia wibratomowego, jak i z sekcją przyklejoną do płytki próbki.</td></tr><tr><td>Wibratomizm</td><td>wszelkie komercyjne; np. Leica</td><td>Zobacz materiał VT1200</td><td></td></tr></tbody></table>

bezznacznikowa optyka nieliniowa do badania zależnych od tubuliny defektów w centralnej mielinie

Label-Free Non-Linear Optics for the Study of Tubulin-Dependent Defects in Central Myelin

Zadowalająca wizualizacja składników cytoszkieletu w mózgu jest wyzwaniem. Wszechobecne rozmieszczenie sieci mikrotubul, mikrowłókien i włókien pośrednich we wszystkich tkankach nerwowych, wraz ze zmiennością wyników strategii fuzji białek fluorescencyjnych i ograniczoną możliwością zastosowania do dynamicznych badań przeciwciał i leków jako nośników chromoforów, sprawiają, że klasyczne podejścia optyczne nie są tak skuteczne, jak w przypadku innych białek. Gdy konieczne jest zbadanie tubuliny, wytwarzanie drugiej harmonicznej bez znaczników jest bardzo odpowiednią opcją ze względu na niecentryczną organizację cząsteczki. Technika ta, po sprzężeniu z mikroskopią, może jakościowo opisać wolumetryczny rozkład równoległych wiązek mikrotubul w próbkach biologicznych, z dodatkową zaletą pracy ze świeżymi tkankami, które są nieutrwalone i nieprzepuszczalne. W tej pracy opisano, w jaki sposób obrazować tubulinę za pomocą komercyjnego zestawu mikroskopowego drugiej generacji w celu uwydatnienia mikrotubul w strukturach oligodendrocytów wzbogaconych w tubulinę, jak w hipomielinizacji z zanikiem zwojów podstawy i tubulinopatii móżdżku (H-ABC), niedawno opisanym zaburzeniu mielinowym.

Obrazy uzyskane za pomocą tej metodologii charakteryzują się naturalnie niskim poziomem tła ze względu na bardzo ograniczoną liczbę harmonoforów obecnych w tkankach biologicznych, co stanowi jedną z istotnych zalet tej metody.
Podczas obrazowania włókien ciała modzelowatego w mózgu taiep konsekwentnie można zaobserwować przypominające włókna krótkie struktury oraz elementy zaokrąglone (Rysunek 3B), podczas gdy ciało modzelowate mózgu kontrolnego wykazuje ...

W tym artykule przedstawiamy protokół wykrywania oligodendrocytów obciążonych mikrotubulami w modelu tubulinopatii za pomocą prostego, innowacyjnego podejścia do mikroskopii drugiej harmonicznej.

Bezznacznikowa optyka nieliniowa do badania zależnych od tubuliny defektów w centralnej mielinie

The satisfactory visualization of cytoskeletal components in the brain is challenging. The ubiquitous distribution of the networks of microtubules, ...

Obrazowanie próbek biologicznych drugiej generacji harmonicznej jest techniką optyczną, która umożliwia wizualizację cząsteczek niecentrosymetrycznych i ich zespołów bez konieczności stosowania znacznika lub barwnika. Obrazy wygenerowane tą metodą mają niskie tło, ponieważ bardzo niewiele cząsteczek biologicznych może działać jako siła harmoniczna. Protokół ten opisuje zastosowanie techniki obrazowania diagnostycznego tubuliny beta-4A w modelu zwierzęcym taiep.Tubulinopatie to niedawno opisane choroby. Z tego powodu dostępna jest ograniczona ilość informacji na temat podstawowych mechanizmów leżących u podstaw patofizjologii na poziomie komórkowym. Aby rozpocząć, włącz laser impulsowy, aby upewnić się, że będzie gotowy do pracy na optymalnym i stałym poziomie mocy.Do badania mikrotubul tissular wykorzystuje się od 10 do 20% dostępnej mocy lasera, co w opisywanym systemie odpowiada 13 do 26 miliwatom mierzonym w tylnej płaszczyźnie ogniskowej obiektywu. Przed obrazowaniem ustaw laser na 810 nanometrów. Następnie upewnij się, że mikroskop jest ustawiony w jednej linii Koehlera z obiektywem używanym do generowania drugiej harmonicznej lub obrazowania SHG.Usuń niechciane filtry ze ścieżki wykrywania optycznego i upewnij się, że membrana skraplacza jest całkowicie otwarta i żadne światło nie jest niepotrzebnie zatrzymywane. Przygotuj obiektyw immersyjny z olejkiem o aperturze numerycznej 25x x 0,8 z niewielką kroplą olejku immersyjnego w soczewce. Postępuj zgodnie z krokami przedstawionymi w podanej tabeli tutaj, z wyjątkiem mocy lasera, która wynosi mniej niż 5% w przypadku skrobi kukurydzianej.Obraz suchej skrobi kukurydzianej umieszczonej między szklanymi szkiełkami. z parametrami SHG do generowania obrazów SHG, ujawniają kierunek polaryzacji lasera. Zrób jeden obraz rzadkich ziaren skrobi kukurydzianej i zaznacz orientację zrazików SHG w płaszczyźnie XY odpowiadającą orientacji polaryzacji lasera.W celu kontroli wykonaj kolejny obraz tej samej próbki wprowadzającej płytkę półfalową do ścieżki optycznej, aby zmienić kierunek oscylacji lasera. Wynikowy obraz przedstawia obrócone zraziki sygnałowe SHG. Jeśli używasz innego filtra pasmowoprzepustowego dla SHG, upewnij się, że ma on optymalne właściwości transmisji, porównując obrazy i intensywność sygnału piksel po pikselu wzdłuż linii skanowania.Przygotuj tacę buforową wibratomu wypełnioną ciepłym roztworem soli Hanksa lub HBSS. Przymocuj mózg do płytki próbki za pomocą kleju cyjanoakrylowego za pomocą kawałka taśmy maskującej. Najbardziej ogonowa część styka się z klejem, dzięki czemu można przeciąć użyteczne odcinki koronalne z przeciwległej części rostralnej.Przenieść płytkę próbki na jej wspornik magnetyczny wewnątrz tacki buforowej. Zacznij ciąć odcinki o grubości od 300 do 500 mikronów, aż plastry obejmą całą powierzchnię mózgu. Następnie zmniejsz grubość przekroju do 160 mikronów.Po przecięciu odcinka o grubości 160 mikronów na poziomie ciała modzelowatego, odzyskaj go za pomocą zmodyfikowanej szklanej pipety Pasteura z dużym otworem kołnierzowym. Przenieść wycinek na czystą szalkę Petriego z nowym ciepłym HBSS lub bezpośrednio na szkiełko nakrywkowe lub szklane naczynie dolne do mikroskopii. Umieść próbkę pod mikroskopem i umieść ją odpowiednio pod obiektywem, prowadząc bezpośrednią obserwację przez okulary ze światłem przechodzącym.Usunąć nadmiar HBSS tak, aby cienka warstwa cieczy pokryła całą próbkę. Co kilka minut należy sprawdzać wzrokowo film cieczy, aby uniknąć nadmiernego parowania i wysuszenia próbki. Przygotuj stolik mikroskopowy do obrazowania bez deskanowania, które obejmuje zamknięcie wszystkich drzwi ciemnej komory inkubacyjnej lub przykrycie komory inkubacyjnej czarną nylonową tkaniną powlekaną poliuretanem.Wybierz tryb obrazowania bez deskancji wzdłuż ścieżki transmisji. W ten sposób wychwytywanie słabego sygnału SH tubuliny zostanie zoptymalizowane. Następnie wybierz cel.Następnie ustaw moc lasera na czas przebywania pikseli wynoszący 12,6 mikrosekundy. Rób zdjęcia nie większe niż 512 na 512 pikseli z szybkością pięć i średnio dwie, aby uzyskać średni czas akwizycji 15 sekund. Najpierw uchwyć obrazy za pomocą filtra krótkoprzepustowego 485 nanometrów, a w drugim kroku dodaj ostry filtr pasmowoprzepustowy 405 nanometrów.Przetnij móżdżek skalpelem na dwie półkule i przymocuj je do podpory wibratomu za środkową część. Przekrój i zobrazuj móżdżek przy użyciu tych samych ustawień wibratomu, ostrza i mikroskopu, jak opisano dla mózgu. Kiedy włókna ciała modzelowatego są obrazowane, w mózgu tajennika obserwuje się krótkie struktury przypominające włókna i zaokrąglone elementy.W przeciwieństwie do tego, ciało modzelowate mózgu kontrolnego wykazuje znacznie bardziej niejednorodny i izotropowy sygnał w całym obszarze mózgu. Pochodzenie sygnału różnicowego leży w szczególności w zjawisku generacji drugiej harmonicznej, ponieważ dodanie filtra wąskoprzepustowego zmniejsza tylko niespecyficzne natężenie sygnału z obrazów kontrolnych, jednocześnie selektywnie usuwając ten niski sygnał rozproszony z okolic soma-podobnych i krótkich wydłużonych struktur w obrazach taiep, które zawsze generują intensywne światło SH. W tkance kontrolnej istoty białej móżdżku zaobserwowano całkowity brak sygnału SH.Komórki Purkiniego są ledwo widoczne przy użyciu filtra krótkoprzepustowego, a wydłużone i zaokrąglone struktury utrzymują się w obrazie SH z tkanki taiep. Kluczowym krokiem do uzyskania najlepszego obrazu jest wycięcie jak najcieńszych skrawków tkanki. Co więcej, praca z ostrymi skrawkami tkanek wymaga szybkich protokołów, aby zapobiec pogorszeniu stanu tkanek.Dlatego tak ważne jest, aby wcześniej skonfigurować i sprawdzić układ optyczny. Sygnał drugiej harmonicznej z mikrotubul jest słabszy niż sygnał drugiej harmonicznej ze skrobi. W związku z tym do obrazowania mikrotubul należy użyć większej mocy lasera.Moc lasera należy zwiększać ostrożnie, ponieważ ponieważ do obrazowania używany jest obiektyw o dużej aperturze numerycznej, intensywność na próbce gwałtownie wzrosłaby Dzięki obrazowaniu generacji drugiej harmonicznej patologiczne zmiany w centralnej mielinomace modelu tubulinopatycznego są szybko i łatwo identyfikowane. Potencjalne zastosowania tej techniki obejmują jej zastosowanie do badania podstawowych mechanizmów tubulinopatii H-ABC oraz do oceny terapii farmakologicznych w leczeniu pacjentów. W dłuższej perspektywie technika ta ma potencjał, aby stać się uzupełniającym narzędziem diagnostycznym do stosowania wewnątrzczaszkowego lub w przypadku świeżych biopsji.

label-free-non-linear-optics-for-study-tubulin-dependent-defects

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

W tym filmie opisujemy technikę mikroskopii interferencyjnej (IRM) do wizualizacji mikrotubul rosnących na powierzchni szkiełka nakrywkowego w obecności odpowiedniego bufora. Po oświetleniu padającym światłem, interfejs szkiełko nakrywkowe-bufor i interfejs bufor-mikrotubula odbijają światło, które łączy się, tworząc wzór interferencyjny, umożliwiając wizualizację mikrotubul jako obrazów o wysokim kontraście na jasnym tle.

Interferencyjna mikroskopia refleksyjna do bezznacznikowej wizualizacji dynamiki mikrotubul

Źródło: Piazza, V., et al., Bezznacznikowa optyka nieliniowa do badania defektów zależnych od tubuliny w centralnej mielinie. J. Vis. Exp. (2023)Ten film przedstawia procedurę obrazowania nieprawidłowości mikrotubul w wycinku tkanki mózgowej szczura za pomocą mikroskopu wzbudzenia dwufotonowego. Wykorzystuje sygnały drugiej generacji harmonicznej (SHG) do wykrywania wad tubuliny i zmniejszonej produkcji mieliny.

Obrazowanie drugiej generacji harmonicznych w modelu szczurzym w celu zbadania wad tubuliny

Prezentujemy protokół wykorzystujący mikroskopię poklatkową z wzbudzeniem dwufotonowym do jednoczesnej wizualizacji dynamiki uszkodzeń aksonów i mielin w czasie rzeczywistym. Ten proponowany protokół pozwala na badanie zarówno wewnętrznych, jak i zewnętrznych czynników, które mogą wpływać na los centralnego mielinizowanego aksonu po urazie i przyczyniać się do trwałej niepełnosprawności klinicznej.

Model uszkodzenia rdzenia kręgowego indukowany laserem ex vivo do oceny mechanizmów zwyrodnienia aksonów w czasie rzeczywistym

Metody immunoznakowania do analizy różnych populacji mikrotubul w rozwijającym się mózgu danio pręgowanego są tutaj opisane, które mają szerokie zastosowanie do innych tkanek. Pierwszy protokół przedstawia zoptymalizowaną metodę znakowania immunologicznego stabilnych i dynamicznych mikrotubul. Drugi protokół zapewnia metodę obrazowania i ilościowego oznaczania powstających mikrotubul.

Zastosowanie znakowania immunologicznego do analizy stabilnych, dynamicznych i powstających mikrotubul w zarodku danio pręgowanego

Tutaj prezentujemy krok po kroku protokół obrazowania mielinowanych aksonów w ustalonym wycinku mózgu przy użyciu bezznacznikowej techniki obrazowania w nanoskali opartej na reflektometrii spektralnej.

Spektralna mikroskopia reflektometryczna na mielinizowanych aksonach in situ

Tutaj prezentujemy solidną i szczegółową metodę analizy dynamiki mikrotubul w komórkach zsynchronizowanych w prometafazie przy użyciu mikroskopii konfokalnej z żywym krążkiem komórkowym i przetwarzania obrazów opartego na MATLAB.

Pomiar dynamiki mikrotubul za pomocą mikroskopii wirujących dysków w monopolarnych wrzecionach mitotycznych

Przedstawiono protokół obrazowania dynamicznych mikrotubul in vivo przy użyciu fluorescencyjnie znakowanego białka wiążącego End. Opisaliśmy metody znakowania, obrazowania i analizowania dynamicznych mikrotubul w neuronie tylnej bocznej mikrotubuli (PLM) C. elegans.

In vivo (in vivo) Ocena dynamiki i orientacji mikrotubul w neuronach Caenorhabditis elegans

Ten protokół jest dedykowany do wizualizacji mikrotubul plus-end poprzez transfekcję białka EB3 w celu zbadania ich dynamicznych właściwości w pierwotnej hodowli komórkowej. Protokół został wdrożony na ludzkich pierwotnych fibroblastach skóry uzyskanych od pacjentów z chorobą Huntingtona.

Wizualizacja dynamiki plus-end mikrotubul w modelu choroby Huntingtona opartym na pierwotnych fibroblastach skóry człowieka

Tutaj przedstawiono test rekonstytucji in vitro oparty na mikroskopii TIRF, który jednocześnie określa ilościowo i porównuje dynamikę dwóch populacji mikrotubul. Opisano metodę jednoczesnego przeglądania zbiorowej aktywności wielu białek związanych z mikrotubulami na usieciowanych wiązkach mikrotubul i pojedynczych mikrotubulach.

Jednoczesna wizualizacja dynamiki mikrotubul usieciowanych i pojedynczych in vitro za pomocą mikroskopii TIRF

Tutaj prezentujemy protokół odtwarzania wiązek mikrotubul in vitro i bezpośredniego ilościowego określania sił wywieranych w ich obrębie za pomocą jednoczesnego pułapkowania optycznego i mikroskopii fluorescencyjnej z całkowitym wewnętrznym odbiciem. Test ten pozwala na pomiar sił i przemieszczeń generowanych przez zespoły białek w aktywnych sieciach mikrotubul na poziomie nanoskali.

Bezpośredni pomiar sił w odtworzonych wiązkach aktywnych mikrotubul

Ten artykuł przedstawia protokół tworzenia zespołów mikrotubul w kształcie taktoidów przy użyciu MAP65, roślinnego środka sieciującego mikrotubul, oraz PEG jako czynnika tłumiącego.

Samodzielny montaż taktoidów mikrotubul

Poznaj mikroskopię generacji drugiej harmonicznej do badania oligodendrocytów z mikrotubulami w modelu tubulinopatii. Ta metoda pozwala analizować dynamikę mikrotubul w chorobach neurologicznych.

Bezznacznikowa optyka nieliniowa do badania zależnych od tubuliny defektów w centralnej mielinie

Przeglądaj więcej filmów