Bezznacznikowa optyka nieliniowa do badania zależnych od tubuliny defektów w centralnej mielinie

Obrazowanie próbek biologicznych drugiej generacji harmonicznej jest techniką optyczną, która umożliwia wizualizację cząsteczek niecentrosymetrycznych i ich zespołów bez konieczności stosowania znacznika lub barwnika. Obrazy wygenerowane tą metodą mają niskie tło, ponieważ bardzo niewiele cząsteczek biologicznych może działać jako siła harmoniczna. Protokół ten opisuje zastosowanie techniki obrazowania diagnostycznego tubuliny beta-4A w modelu zwierzęcym taiep.

Tubulinopatie to niedawno opisane choroby. Z tego powodu dostępna jest ograniczona ilość informacji na temat podstawowych mechanizmów leżących u podstaw patofizjologii na poziomie komórkowym. Aby rozpocząć, włącz laser impulsowy, aby upewnić się, że będzie gotowy do pracy na optymalnym i stałym poziomie mocy.

Do badania mikrotubul tissular wykorzystuje się od 10 do 20% dostępnej mocy lasera, co w opisywanym systemie odpowiada 13 do 26 miliwatom mierzonym w tylnej płaszczyźnie ogniskowej obiektywu. Przed obrazowaniem ustaw laser na 810 nanometrów. Następnie upewnij się, że mikroskop jest ustawiony w jednej linii Koehlera z obiektywem używanym do generowania drugiej harmonicznej lub obrazowania SHG.

Usuń niechciane filtry ze ścieżki wykrywania optycznego i upewnij się, że membrana skraplacza jest całkowicie otwarta i żadne światło nie jest niepotrzebnie zatrzymywane. Przygotuj obiektyw immersyjny z olejkiem o aperturze numerycznej 25x x 0,8 z niewielką kroplą olejku immersyjnego w soczewce. Postępuj zgodnie z krokami przedstawionymi w podanej tabeli tutaj, z wyjątkiem mocy lasera, która wynosi mniej niż 5% w przypadku skrobi kukurydzianej.

Obraz suchej skrobi kukurydzianej umieszczonej między szklanymi szkiełkami. z parametrami SHG do generowania obrazów SHG, ujawniają kierunek polaryzacji lasera. Zrób jeden obraz rzadkich ziaren skrobi kukurydzianej i zaznacz orientację zrazików SHG w płaszczyźnie XY odpowiadającą orientacji polaryzacji lasera.

W celu kontroli wykonaj kolejny obraz tej samej próbki wprowadzającej płytkę półfalową do ścieżki optycznej, aby zmienić kierunek oscylacji lasera. Wynikowy obraz przedstawia obrócone zraziki sygnałowe SHG. Jeśli używasz innego filtra pasmowoprzepustowego dla SHG, upewnij się, że ma on optymalne właściwości transmisji, porównując obrazy i intensywność sygnału piksel po pikselu wzdłuż linii skanowania.

Przygotuj tacę buforową wibratomu wypełnioną ciepłym roztworem soli Hanksa lub HBSS. Przymocuj mózg do płytki próbki za pomocą kleju cyjanoakrylowego za pomocą kawałka taśmy maskującej. Najbardziej ogonowa część styka się z klejem, dzięki czemu można przeciąć użyteczne odcinki koronalne z przeciwległej części rostralnej.

Przenieść płytkę próbki na jej wspornik magnetyczny wewnątrz tacki buforowej. Zacznij ciąć odcinki o grubości od 300 do 500 mikronów, aż plastry obejmą całą powierzchnię mózgu. Następnie zmniejsz grubość przekroju do 160 mikronów.

Po przecięciu odcinka o grubości 160 mikronów na poziomie ciała modzelowatego, odzyskaj go za pomocą zmodyfikowanej szklanej pipety Pasteura z dużym otworem kołnierzowym. Przenieść wycinek na czystą szalkę Petriego z nowym ciepłym HBSS lub bezpośrednio na szkiełko nakrywkowe lub szklane naczynie dolne do mikroskopii. Umieść próbkę pod mikroskopem i umieść ją odpowiednio pod obiektywem, prowadząc bezpośrednią obserwację przez okulary ze światłem przechodzącym.

Usunąć nadmiar HBSS tak, aby cienka warstwa cieczy pokryła całą próbkę. Co kilka minut należy sprawdzać wzrokowo film cieczy, aby uniknąć nadmiernego parowania i wysuszenia próbki. Przygotuj stolik mikroskopowy do obrazowania bez deskanowania, które obejmuje zamknięcie wszystkich drzwi ciemnej komory inkubacyjnej lub przykrycie komory inkubacyjnej czarną nylonową tkaniną powlekaną poliuretanem.

Wybierz tryb obrazowania bez deskancji wzdłuż ścieżki transmisji. W ten sposób wychwytywanie słabego sygnału SH tubuliny zostanie zoptymalizowane. Następnie wybierz cel.

Następnie ustaw moc lasera na czas przebywania pikseli wynoszący 12,6 mikrosekundy. Rób zdjęcia nie większe niż 512 na 512 pikseli z szybkością pięć i średnio dwie, aby uzyskać średni czas akwizycji 15 sekund. Najpierw uchwyć obrazy za pomocą filtra krótkoprzepustowego 485 nanometrów, a w drugim kroku dodaj ostry filtr pasmowoprzepustowy 405 nanometrów.

Przetnij móżdżek skalpelem na dwie półkule i przymocuj je do podpory wibratomu za środkową część. Przekrój i zobrazuj móżdżek przy użyciu tych samych ustawień wibratomu, ostrza i mikroskopu, jak opisano dla mózgu. Kiedy włókna ciała modzelowatego są obrazowane, w mózgu tajennika obserwuje się krótkie struktury przypominające włókna i zaokrąglone elementy.

W przeciwieństwie do tego, ciało modzelowate mózgu kontrolnego wykazuje znacznie bardziej niejednorodny i izotropowy sygnał w całym obszarze mózgu. Pochodzenie sygnału różnicowego leży w szczególności w zjawisku generacji drugiej harmonicznej, ponieważ dodanie filtra wąskoprzepustowego zmniejsza tylko niespecyficzne natężenie sygnału z obrazów kontrolnych, jednocześnie selektywnie usuwając ten niski sygnał rozproszony z okolic soma-podobnych i krótkich wydłużonych struktur w obrazach taiep, które zawsze generują intensywne światło SH. W tkance kontrolnej istoty białej móżdżku zaobserwowano całkowity brak sygnału SH.

Komórki Purkiniego są ledwo widoczne przy użyciu filtra krótkoprzepustowego, a wydłużone i zaokrąglone struktury utrzymują się w obrazie SH z tkanki taiep. Kluczowym krokiem do uzyskania najlepszego obrazu jest wycięcie jak najcieńszych skrawków tkanki. Co więcej, praca z ostrymi skrawkami tkanek wymaga szybkich protokołów, aby zapobiec pogorszeniu stanu tkanek.

Dlatego tak ważne jest, aby wcześniej skonfigurować i sprawdzić układ optyczny. Sygnał drugiej harmonicznej z mikrotubul jest słabszy niż sygnał drugiej harmonicznej ze skrobi. W związku z tym do obrazowania mikrotubul należy użyć większej mocy lasera.

Moc lasera należy zwiększać ostrożnie, ponieważ ponieważ do obrazowania używany jest obiektyw o dużej aperturze numerycznej, intensywność na próbce gwałtownie wzrosłaby Dzięki obrazowaniu generacji drugiej harmonicznej patologiczne zmiany w centralnej mielinomace modelu tubulinopatycznego są szybko i łatwo identyfikowane. Potencjalne zastosowania tej techniki obejmują jej zastosowanie do badania podstawowych mechanizmów tubulinopatii H-ABC oraz do oceny terapii farmakologicznych w leczeniu pacjentów. W dłuższej perspektywie technika ta ma potencjał, aby stać się uzupełniającym narzędziem diagnostycznym do stosowania wewnątrzczaszkowego lub w przypadku świeżych biopsji.