Wykorzystanie spektrometru cyklicznej ruchliwości jonów do eksperymentów z ruchliwością jonów w tandemie
January 20th, 2022
Spektrometria ruchliwości jonów (IMS) jest interesującym uzupełnieniem spektrometrii mas do charakterystyki biomolekuł, szczególnie dlatego, że jest wrażliwa na izomerię. Protokół ten opisuje tandemowy eksperyment IMS (IMS/IMS), który pozwala na izolację cząsteczki i wygenerowanie profili ruchliwości jej fragmentów.
Protokół opisuje, w jaki sposób rejestrować profil ruchliwości jonów dla fragmentów powstałych po aktywacji cząsteczki w spektrometrze mas oraz rozróżniać struktury izomeryczne. Protokół pozwala na klasyfikację glikanów w 11 grupach ze względu na niektóre z ich kluczowych cech strukturalnych, a tym samym dostarczanie informacji, które w inny sposób są trudne do uzyskania. Może służyć do budowania sieci molekularnych, które są niezwykle ogólne i dostosowane do wielu rodzin molekularnych, takich jak metabolity lub leki będące przedmiotem zainteresowania w wielu obszarach badawczych.
Podejście to w pełni wykorzystuje nową koncepcję spektrometrii ruchliwości jonów i będzie przydatne tam, gdzie sama spektrometria mas nie będzie w stanie rozróżnić dwóch struktur. Eksperyment wymaga dobrej znajomości spektrometrii mas i ruchliwości jonów. Jednak eksperymentator powinien odnieść sukces we wdrożeniu metody, jeśli dokładnie wykona każdy z kroków.
Procedurę zademonstruje Simon Ollivier, doktorant z mojego laboratorium. Aby rozpocząć, skonfiguruj jednoprzebiegową sekwencję IMS na stronie Tune, przełącz instrument w tryb mobilności i otwórz okno Cyclic Sequence Control. Wybierz tryb zaawansowany z zakładki Funkcje cykliczne w tym nowym oknie, wybierz Dodaj pakiet, a następnie Pojedynczy/wieloprzebiegowy.
Poczekaj na wyświetlenie sekwencji zdarzeń mobilności na karcie Sekwencja w tym samym oknie. Dostosuj sekwencję tak, aby wszystkie jony kalibru wykonały jeden przejazd wokół cyklicznego toru wyścigowego IMS. Nie zmieniaj czasu wstrzykiwania ani czasu wysuwania i pobierania, jednak skróć czas oddzielny do jednej milisekundy.
Jeśli niektóre jony mieszaniny kalibracyjnej nie mieszczą się w wyświetlonym oknie czasu przybycia, zmień synchronizację IMS z popychaczem analizatora TOF przyspieszenia ortogonalnego, zwiększając liczbę naciśnięć na pojemnik w zakładce Ustawienia ADC. Aby nagrać dwuminutową akwizycję w oknie Cykliczna kontrola sekwencji, kliknij Nabierz, aby otworzyć wyskakujące okno Ustawienia akwizycji, wprowadź nazwę pliku, opis i długość akwizycji, minuty i kliknij Zapisz. Przełącz instrument w tryb TOF ze strony MS Tune, aby sprawdzić stabilność sygnału.
Rejestruj pełne pobranie próbki przez MS przez jedną minutę, co będzie przydatne do sprawdzenia wzorca izotopowego i obecności potencjalnych zanieczyszczeń. Przełącz instrument w tryb MSMS z zakładki Quad/MS profile na głównej stronie Tune. Wybierz masę docelowego żelaza w polu masy MSMS do izolacji w kwadrupolu.
Nagraj jednominutową akwizycję, aby sprawdzić izolację prekursora podczas przetwarzania danych. Aby dokonać wyboru interesującego izomeru na podstawie mobilności, przełącz instrument w tryb mobilności w oknie Cykliczna kontrola sekwencji, na karcie Funkcje cykliczne wybierz Dodaj pakiet, a następnie Krojenie. Poczekaj, aż złożona sekwencja zdarzeń mobilności pojawi się na karcie Sekwencja.
Umieść zdarzenie Eject and Acquire (Wysuń i uzyskaj) bezpośrednio po pierwszym zdarzeniu Separate, a następnie kliknij przycisk Run (Uruchom). Szukaj wyników początkowej separacji, które są wyświetlane w czasie rzeczywistym. Wydłużyć czas trwania pierwszego oddzielnego zdarzenia dla separacji wieloprzebiegowej, zmieniając wartość czasu dla tego zdarzenia w sekwencji, aż rozdzielczość szczytów IMS będzie zadowalająca.
Nagraj jednominutowe pobieranie w celach informacyjnych. Kliknij przycisk Wstrzymaj, umieść zdarzenie Wysuń i Pobierz poniżej zdarzeń Wysuń, Wysuń do wstępnego przechowywania oraz Wstrzymaj i Wysuń. Dostosuj czas trwania zdarzeń tak, aby docelowy szczyt znajdował się w regionie Wysuń do wcześniejszego przechowywania, a każdy inny jon znajdował się w obszarze Wysuń lub Wstrzymaj i wysuń.
Umieść zdarzenie Eject and Acquire na końcu sekwencji poniżej zdarzenia Reinject from Pre-Store i drugiego oddzielnego zdarzenia. Kliknij przycisk Uruchom, aby wyświetlić wybraną populację. Sprawdź jakość izolacji.
Nagraj jednominutowe pobieranie w celach informacyjnych. Na karcie Sekwencja, w kolumnie obok czasów zdarzeń zdefiniowanych przez użytkownika, poszukaj zsumowanych czasów wszystkich zdarzeń. Zwróć uwagę na czas Abs znajdujący się na linii zdarzenia Reinject from Pre-Store w celu przeprowadzenia kalibracji CCS.
Ustaw czas trwania zdarzenia Separate bezpośrednio poprzedzającego Eject and Acquire na jedną milisekundę. W wierszu Reinject from Pre-Store (Wstrzyknij ponownie ze sklepu) zaznacz pole Enable Activation (Włącz aktywację) i zoptymalizuj fragmentację za pomocą wbudowanej kontrolki. Jeśli fragmentacja nie jest zadowalająca przy wbudowanym sterowaniu, odznacz pole Włącz aktywację i przystąp do ręcznej optymalizacji napięć ponownego wtrysku, zwiększ gradient wstępny i obniż napięcie przesunięcia matrycy, aż wyniki będą zadowalające.
Aby zarejestrować dwuminutową akwizycję w wyskakującym oknie Akwizycja, zaznacz opcję Zachowaj czas dryftu, aby wygenerować plik zawierający tylko czasy przybycia, a nie M przez Z oznaczone jako _dt.raw. Po przeprowadzeniu analizy MS mieszaniny pentasacharydów arabinoksylanu, widmo wykazało wzór izotopowy z pojedynczym pikiem na M powyżej Z 685.24, co sugeruje, że te dwa związki mają charakter izomeryczny. Addukty pentasacharydów zostały oddzielone przez cykliczną komórkę IMS, a trzy piki zostały oddzielone o różnych czasach przybycia.
Czysty XA3XX pokazuje szczyty po 83 i 90 milisekundach, podczas gdy XA2XX wykazuje szczyt po 94 milisekundach. Po pierwszym etapie separacji IMS jony należące do XA3XX zostały wyrzucone, a do analizy IMS-IMS wybrano pik po 94 milisekundach. Trzyprzebiegową separację przeprowadzono po ponownym wstrzyknięciu jonu bez aktywacji, a pik dla XA2XX uzyskano po 199 milisekundach.
Wygenerowane dane IMS-IMS MS zostały zdekonwolucjonizowane przy użyciu czasu przybycia i wymiarów M przez Z, generując widma IMS-IMS. Piki powyżej 0,2% intensywności względnej zostały wyeksportowane do kalibracji CCS, w wyniku czego uzyskano skalibrowane centralnie widmo IMS-IMS skalibrowane przez CCS. Zawsze ważne jest, aby sprawdzić izolację jonu prekursorowego, w przeciwnym razie widmo może pochodzić z mieszaniny związku będącego przedmiotem zainteresowania i zanieczyszczeń.
Wcześniej używaliśmy widm IMS-IMS do budowania sieci i klasyfikowania związków, ale można je również wykorzystać do wyszukiwania w bazach danych w celu identyfikacji związków. Technika ta została wprowadzona od niedawna, ale spodziewamy się, że będzie niezwykle przydatna w glikomice, a także w każdym kontekście, w którym analitycy mają do czynienia z cząsteczkami izomerycznymi.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Przegląd
Ten protokół opisuje eksperyment tandemowej spektrometrii ruchliwości jonów (IMS/IMS) do charakteryzacji biomolekuł, szczególnie skupiając się na dyskryminacji izomerów. Umożliwia klasyfikację glikanów w różne grupy strukturalne, ułatwiając budowę sieci molekularnych.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Charakteryzacja biomolekul
- Spektrometria ruchliwości jonów
- Spektrometria mas
Tło
- Spektrometria ruchliwości jonów uzupełnia spektrometrię mas.
- Jest wrażliwa na izomeryzm, pomagając w analizie strukturalnej.
- Metoda ma zastosowanie do różnych rodzin molekularnych.
- Glikany można klasyfikować na podstawie kluczowych cech strukturalnych.
Cel badania
- Izolacja cząsteczek i analiza ich profili ruchliwości fragmentów.
- Skuteczna dyskryminacja struktur izomerycznych.
- Dostarczanie informacji trudnych do uzyskania wyłącznie za pomocą spektrometrii mas.
Stosowane metody
- Rejestrowanie profili ruchliwości jonów aktywowanych cząsteczek.
- Dyskryminacja struktur izomerycznych na podstawie danych ruchliwości.
- Klasyfikowanie glikanów w 11 grup.
- Budowanie sieci molekularnych dla różnych zastosowań badawczych.
Główne wyniki
- Protokół skutecznie izoluje i analizuje fragmenty molekularne.
- Umożliwia efektywną klasyfikację glikanów.
- Metoda poprawia zdolność dyskryminacji między podobnymi strukturami.
- Jest przystosowana do wielu rodzin molekularnych, w tym metabolitów i leków.
Wnioski
- Tandemowe podejście IMS/IMS jest cennym narzędziem w analizie biomolekularnej.
- Dostarcza informacji, które tradycyjna spektrometria mas może pominąć.
- Metoda jest dostępna przy szczegółowym przestrzeganiu kroków protokołu.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
Cyclic ion mobility spectrometry (IMS/IMS) enables high-resolution structural discrimination of isomeric biomolecules, addressing a critical gap in analytical confidence for glycomics and complex metabolite profiling. This capability strengthens early discovery and target validation by providing molecular fingerprints that mass spectrometry alone cannot resolve, supporting risk-adjusted portfolio decisions. The method's reproducibility and structural specificity position it as a strategic asset for biopharma R&D pipelines confronting isomeric complexity.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables precise structural classification of isomeric glycans and metabolites, supporting mechanistic de-risking.
- Provides molecular fingerprints for pathway clarification and target validation in complex biological samples.
- Facilitates confident triage of candidate molecules based on structural features not accessible by MS alone.
Screening & Assay Development
- Delivers reproducible, CCS-calibrated spectra for assay standardization and downstream screening workflows.
- Supports the development of validated reference datasets for high-throughput compound evaluation.
- Improves screening readiness by enabling discrimination of structurally similar compounds.
Translational & Preclinical Research
- Aligns molecular classification with disease-relevant biomarker discovery when isomeric resolution is required.
- Ensures continuity from discovery to preclinical validation by providing robust structural data for candidate selection.
- Reduces translational risk by confirming molecular identity in complex biological matrices.
Pipeline & Workflow Integration
Cyclic IMS/IMS integrates into the analytical discovery continuum, bridging early discovery, lead identification, and preclinical workflows where isomeric discrimination is essential.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and biological de-risking by resolving isomeric structures in candidate pools.
- Screening: Provides quantitative, reproducible mobility profiles and CCS-calibrated outputs for assay development.
- Analytics: Enables multidimensional data analysis, including molecular networking and database searching for structural annotation.
- Translational Research: Facilitates biomarker alignment and molecular identity confirmation in translational studies.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable analytical platform for diverse molecular families, including glycans, metabolites, and drugs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in molecular characterization.
- Operational Value: Delivers standardized, reproducible workflows for high-resolution structural analysis.
- Strategic Value: Enables informed go/no-go decisions and capital-efficient advancement of structurally complex candidates.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization by providing robust structural evidence for candidate selection.
Implementation Considerations
- Requires expertise in mass spectrometry and ion mobility operation and data interpretation.
- Demands access to advanced cyclic IMS instrumentation and CCS calibration standards.
- Necessitates rigorous cross-team standardization for reproducible acquisition and analysis.
- Adaptation across molecular classes may require protocol optimization for specific sample types.
- Isolation quality and contaminant control are critical for reliable structural assignments.
