Wykorzystanie spektrometru cyklicznej ruchliwości jonów do eksperymentów z ruchliwością jonów w tandemie

Protokół opisuje, w jaki sposób rejestrować profil ruchliwości jonów dla fragmentów powstałych po aktywacji cząsteczki w spektrometrze mas oraz rozróżniać struktury izomeryczne. Protokół pozwala na klasyfikację glikanów w 11 grupach ze względu na niektóre z ich kluczowych cech strukturalnych, a tym samym dostarczanie informacji, które w inny sposób są trudne do uzyskania. Może służyć do budowania sieci molekularnych, które są niezwykle ogólne i dostosowane do wielu rodzin molekularnych, takich jak metabolity lub leki będące przedmiotem zainteresowania w wielu obszarach badawczych.

Podejście to w pełni wykorzystuje nową koncepcję spektrometrii ruchliwości jonów i będzie przydatne tam, gdzie sama spektrometria mas nie będzie w stanie rozróżnić dwóch struktur. Eksperyment wymaga dobrej znajomości spektrometrii mas i ruchliwości jonów. Jednak eksperymentator powinien odnieść sukces we wdrożeniu metody, jeśli dokładnie wykona każdy z kroków.

Procedurę zademonstruje Simon Ollivier, doktorant z mojego laboratorium. Aby rozpocząć, skonfiguruj jednoprzebiegową sekwencję IMS na stronie Tune, przełącz instrument w tryb mobilności i otwórz okno Cyclic Sequence Control. Wybierz tryb zaawansowany z zakładki Funkcje cykliczne w tym nowym oknie, wybierz Dodaj pakiet, a następnie Pojedynczy/wieloprzebiegowy.

Poczekaj na wyświetlenie sekwencji zdarzeń mobilności na karcie Sekwencja w tym samym oknie. Dostosuj sekwencję tak, aby wszystkie jony kalibru wykonały jeden przejazd wokół cyklicznego toru wyścigowego IMS. Nie zmieniaj czasu wstrzykiwania ani czasu wysuwania i pobierania, jednak skróć czas oddzielny do jednej milisekundy.

Jeśli niektóre jony mieszaniny kalibracyjnej nie mieszczą się w wyświetlonym oknie czasu przybycia, zmień synchronizację IMS z popychaczem analizatora TOF przyspieszenia ortogonalnego, zwiększając liczbę naciśnięć na pojemnik w zakładce Ustawienia ADC. Aby nagrać dwuminutową akwizycję w oknie Cykliczna kontrola sekwencji, kliknij Nabierz, aby otworzyć wyskakujące okno Ustawienia akwizycji, wprowadź nazwę pliku, opis i długość akwizycji, minuty i kliknij Zapisz. Przełącz instrument w tryb TOF ze strony MS Tune, aby sprawdzić stabilność sygnału.

Rejestruj pełne pobranie próbki przez MS przez jedną minutę, co będzie przydatne do sprawdzenia wzorca izotopowego i obecności potencjalnych zanieczyszczeń. Przełącz instrument w tryb MSMS z zakładki Quad/MS profile na głównej stronie Tune. Wybierz masę docelowego żelaza w polu masy MSMS do izolacji w kwadrupolu.

Nagraj jednominutową akwizycję, aby sprawdzić izolację prekursora podczas przetwarzania danych. Aby dokonać wyboru interesującego izomeru na podstawie mobilności, przełącz instrument w tryb mobilności w oknie Cykliczna kontrola sekwencji, na karcie Funkcje cykliczne wybierz Dodaj pakiet, a następnie Krojenie. Poczekaj, aż złożona sekwencja zdarzeń mobilności pojawi się na karcie Sekwencja.

Umieść zdarzenie Eject and Acquire (Wysuń i uzyskaj) bezpośrednio po pierwszym zdarzeniu Separate, a następnie kliknij przycisk Run (Uruchom). Szukaj wyników początkowej separacji, które są wyświetlane w czasie rzeczywistym. Wydłużyć czas trwania pierwszego oddzielnego zdarzenia dla separacji wieloprzebiegowej, zmieniając wartość czasu dla tego zdarzenia w sekwencji, aż rozdzielczość szczytów IMS będzie zadowalająca.

Nagraj jednominutowe pobieranie w celach informacyjnych. Kliknij przycisk Wstrzymaj, umieść zdarzenie Wysuń i Pobierz poniżej zdarzeń Wysuń, Wysuń do wstępnego przechowywania oraz Wstrzymaj i Wysuń. Dostosuj czas trwania zdarzeń tak, aby docelowy szczyt znajdował się w regionie Wysuń do wcześniejszego przechowywania, a każdy inny jon znajdował się w obszarze Wysuń lub Wstrzymaj i wysuń.

Umieść zdarzenie Eject and Acquire na końcu sekwencji poniżej zdarzenia Reinject from Pre-Store i drugiego oddzielnego zdarzenia. Kliknij przycisk Uruchom, aby wyświetlić wybraną populację. Sprawdź jakość izolacji.

Nagraj jednominutowe pobieranie w celach informacyjnych. Na karcie Sekwencja, w kolumnie obok czasów zdarzeń zdefiniowanych przez użytkownika, poszukaj zsumowanych czasów wszystkich zdarzeń. Zwróć uwagę na czas Abs znajdujący się na linii zdarzenia Reinject from Pre-Store w celu przeprowadzenia kalibracji CCS.

Ustaw czas trwania zdarzenia Separate bezpośrednio poprzedzającego Eject and Acquire na jedną milisekundę. W wierszu Reinject from Pre-Store (Wstrzyknij ponownie ze sklepu) zaznacz pole Enable Activation (Włącz aktywację) i zoptymalizuj fragmentację za pomocą wbudowanej kontrolki. Jeśli fragmentacja nie jest zadowalająca przy wbudowanym sterowaniu, odznacz pole Włącz aktywację i przystąp do ręcznej optymalizacji napięć ponownego wtrysku, zwiększ gradient wstępny i obniż napięcie przesunięcia matrycy, aż wyniki będą zadowalające.

Aby zarejestrować dwuminutową akwizycję w wyskakującym oknie Akwizycja, zaznacz opcję Zachowaj czas dryftu, aby wygenerować plik zawierający tylko czasy przybycia, a nie M przez Z oznaczone jako _dt.raw. Po przeprowadzeniu analizy MS mieszaniny pentasacharydów arabinoksylanu, widmo wykazało wzór izotopowy z pojedynczym pikiem na M powyżej Z 685.24, co sugeruje, że te dwa związki mają charakter izomeryczny. Addukty pentasacharydów zostały oddzielone przez cykliczną komórkę IMS, a trzy piki zostały oddzielone o różnych czasach przybycia.

Czysty XA3XX pokazuje szczyty po 83 i 90 milisekundach, podczas gdy XA2XX wykazuje szczyt po 94 milisekundach. Po pierwszym etapie separacji IMS jony należące do XA3XX zostały wyrzucone, a do analizy IMS-IMS wybrano pik po 94 milisekundach. Trzyprzebiegową separację przeprowadzono po ponownym wstrzyknięciu jonu bez aktywacji, a pik dla XA2XX uzyskano po 199 milisekundach.

Wygenerowane dane IMS-IMS MS zostały zdekonwolucjonizowane przy użyciu czasu przybycia i wymiarów M przez Z, generując widma IMS-IMS. Piki powyżej 0,2% intensywności względnej zostały wyeksportowane do kalibracji CCS, w wyniku czego uzyskano skalibrowane centralnie widmo IMS-IMS skalibrowane przez CCS. Zawsze ważne jest, aby sprawdzić izolację jonu prekursorowego, w przeciwnym razie widmo może pochodzić z mieszaniny związku będącego przedmiotem zainteresowania i zanieczyszczeń.

Wcześniej używaliśmy widm IMS-IMS do budowania sieci i klasyfikowania związków, ale można je również wykorzystać do wyszukiwania w bazach danych w celu identyfikacji związków. Technika ta została wprowadzona od niedawna, ale spodziewamy się, że będzie niezwykle przydatna w glikomice, a także w każdym kontekście, w którym analitycy mają do czynienia z cząsteczkami izomerycznymi.