Name: Podejście in vitro do badania dysfunkcji mitochondriów: model Cybrid (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-03-09T14:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 5 s
Description: Poznaj metodę cybrid do badania mutacji mtDNA i dysfunkcji mitochondriów. Technika ta pozwala ocenić aktywność biochemiczną oraz związek heteroplazmii z ciężkością choroby w kontrolowanym środowisku jądrowym.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

To badanie zostało przeprowadzone w Centrum Badań nad Mitochondrialnymi Chorobami Pediatrycznymi (http://www.mitopedia.org), finansowanym przez Fundację Mariani. VT jest członkiem Europejskiej Sieci Referencyjnej ds. Rzadkich Chorób Nerwowo-Mięśniowych (ERN EURO-NMD).

UWAGA: Użycie ludzkich fibroblastów może wymagać zgody etycznej. Fibroblasty użyte w tym badaniu pochodziły od pacjentów z MD i były przechowywane w biobanku Institutional zgodnie z wymogami etycznymi. Udzielono świadomej zgody na wykorzystanie komórek. Wszystkie procedury hodowli komórkowej należy wykonywać w sterylnej komorze laminarnej w temperaturze pokojowej (RT, 22-25 °C). Używaj sterylnie przefiltrowanych roztworów odpowiednich do hodowli komórkowych i sterylnego sprzętu. Hoduj wszystkie linie komórkowe w wilgotnym inkubatorze w temperaturze 37 °C z 5% CO2 . Testy na obecność mykoplazmy powinny być wykonywane co tydzień, aby upewnić się, że hodowle są wolne od mykoplazmy. 143BTK- rho0 komórek można wygenerować zgodnie z wcześniejszym opisem5.
1. Hodowla komórek
<ol>
	<li>Przed rozpoczęciem jakiejkolwiek procedury należy sprawdzić obecność mutacji w fibroblastach pochodzących od pacjenta (pacjentów) z MD i określić ilościowo procent heteroplazmii lub homoplazmii za pomocą polimorfizmu długości fragmentu restrykcyjnego (RFLP) i/lub analiz sekwencjonowania całego mtDNA14.</li>
	<li>Fibroblasty nasienne na czterech 35-milimetrowych szalkach Petriego, z których każda zawiera 2 ml kompletnej pożywki hodowlanej (tabela 1). Pozwól komórkom rosnąć do 80% zlewania się (48 godzin).</li>
	<li>Hodować 143BTK-rho0 komórek w 8 ml uzupełnionej pożywki hodowlanej (Tabela 1) na 100 mm szalce Petriego.</li>
	<li>Utrzymać komórki w inkubatorze w temperaturze 37 °C z 5% CO2 .</li>
	<li>Sprawdź brak mtDNA w komórkach rho0 za pomocą technik sekwencjonowania14.</li>
</ol>
2. Wyłuszczenie fibroblastów
<ol>
	<li>Wysterylizuj cztery butelki o pojemności 250 ml nadające się do wirówki przez sterylizację w autoklawie w temperaturze 121 °C przez cykl 20 minut. Wysuszyć je w piecu laboratoryjnym lub w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Rozgrzać wirówkę w temperaturze 37 °C.</li>
	<li>Umyj 35 mm szalki zawierające fibroblasty dwukrotnie, używając 2 ml 1x soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) bez (w/o) wapnia i magnezu.</li>
	<li>Oczyść zewnętrzną powierzchnię naczyń 70% etanolem i poczekaj, aż alkohol odparuje.</li>
	<li>Zdejmij pokrywki z naczyń i zakrętki z butelek. Umieść każde naczynie, bez pokrywki, do góry nogami na dnie każdej butelki wirówki o pojemności 250 ml.</li>
	<li>Powoli dodawać 32 ml pożywki wyłuszczającej do każdej butelki (Tabela 1), pozwalając pożywce dostać się do naczynia i wejść w kontakt z komórkami. Usuń wszelkie bąbelki z naczyń za pomocą długiej szklanej pipety Pasteura, zakrzywiając końcówkę w płomieniu Bunsena. 
	UWAGA: Ważne jest, aby usunąć pęcherzyki, aby pożywka mogła dostać się do naczynia i zetknąć się z komórkami.</li>
	<li>Zamknij każdą butelkę zakrętką i przenieś je do wirówki.</li>
	<li>Wirować przez 20 minut w temperaturze 37 °C i 8 000 × g, maksymalne przyspieszenie, powolne zwalnianie. Zwróć uwagę, aby zrównoważyć wirówkę: przeciwwagę dla każdej butelki. W razie potrzeby dostosuj wagę, dodając odpowiednią objętość pożywki wyłuszczającej.</li>
	<li>Podczas wirowania należy użyć próżni lub pipety serologicznej o pojemności 10 ml w celu odessania i odrzucenia pożywki z płytek hodowlanych 143BTK-rho0 i dwukrotnego przemycia ich przy użyciu 4 ml 1x PBS bez wapnia i magnezu.</li>
	<li>Dodaj 2 ml trypsyny, aby całkowicie pokryć monowarstwę komórek.</li>
	<li>Umieść naczynia w inkubatorze o temperaturze 37 °C na ~2 min.</li>
	<li>Wyjąć szalki z inkubatora, obserwować odrywanie komórek za pomocą odwróconego mikroskopu dla żywych komórek (obiektywy 4x lub 10x) i zahamować aktywność enzymu poprzez dodanie 2 ml uzupełnionej pożywki hodowlanej.</li>
	<li>Odessać 4 ml zawiesiny komórek w naczyniu za pomocą pipety o pojemności 10 ml i przenieść ją do stożkowej probówki o pojemności 15 ml.</li>
	<li>Policz komórki za pomocą komory hemocytometru Burkera lub automatycznego licznika.</li>
	<li>Pod koniec wirowania (etap 2.8) odessać pożywkę z butelek i wyrzucić ją.</li>
	<li>Wyjmij naczynia, odwracając butelki na sterylnej gazie uprzednio spryskanej 70% etanolem. Oczyść zewnętrzną powierzchnię naczyń i ich pokrywki 70% etanolem. Poczekaj, aż alkohol odparuje, a następnie zamknij naczynia.</li>
	<li>Zanim przejdziesz dalej, sprawdź, czy nie tworzy się cytoplast (duch) za pomocą odwróconego mikroskopu dla żywych komórek (obiektyw 4x lub 10x). Szukaj ekstremalnie wydłużonych fibroblastów ze względu na wytłaczanie ich jąder indukowane przez cytochalazynę B.</li>
	<li>Do każdej płytki o średnicy 35 mm dodać 1 ×10 6 komórek 143BTK-rho0 zawieszonych w 2 ml pożywki hodowlanej 143BTKrho0 uzupełnionej 5% płodową surowicą bydlęcą (FBS).</li>
	<li>Pozostaw naczynia na 3 godziny w nawilżanym inkubatorze w temperaturze 37 °C i 5% CO2 i pozwól komórkom 143BTK- rho0 osiąść na duchach. Nie przeszkadzaj w zmywaniu naczyń.</li>
</ol>
3. Fuzja wyłuszczonych fibroblastów z komórkami rho 0
<ol>
	<li>Po 3 godzinach inkubacji odessać i wyrzucić pożywkę z szalek.</li>
	<li>Przemyć przylegające komórki dwukrotnie 2 ml zmodyfikowanego podłoża Eagle Medium (DMEM) firmy Dulbecco o wysokiej zawartości glukozy bez surowicy lub minimalną pożywką niezbędną (MEM).</li>
	<li>Zassać i wyrzucić pożywkę.</li>
	<li>Dodać 500 μl roztworu PEG (patrz tabela materiałów) do komórek i inkubować dokładnie przez 1 minutę.</li>
	<li>Odessać i wyrzucić roztwór PEG.</li>
	<li>Umyj komórki trzykrotnie za pomocą 2 ml DMEM o wysokiej zawartości glukozy bez surowicy lub za pomocą MEM.</li>
	<li>Dodać 2 ml pożywki termojądrowej (tabela 1) i inkubować przez noc w inkubatorze w temperaturze 37 °C z 5% CO2 .</li>
</ol>
4. Wybór i ekspansja Cybrid
<ol>
	<li>Po całonocnej inkubacji wyjąć płytki z inkubatora, trypsynizować komórki zgodnie z powyższym opisem (kroki 2.9-2.13) i przenieść zawartość każdej szalki o średnicy 35 mm do szalki o średnicy 100 mm.</li>
	<li>Dodać 8 ml pożywki selekcyjnej (Tabela 1) i umieścić płytki w inkubatorze w temperaturze 37 °C z 5% CO2 .</li>
	<li>Zmieniaj podłoże co 2-3 dni.</li>
	<li>Poczekaj ~10-15 dni selekcji, aż pojawią się kolonie komórek.</li>
	<li>Zamroź jedną z czterech szalek Petriego, zbierając wszystkie klony i generując "masową" kulturę jako kopię zapasową cybrydów, którą można ostatecznie odizolować i wykorzystać do dalszych badań.</li>
	<li>Trypsynizować komórki w pozostałych szalkach hodowlanych, policzyć i wysiać na jedną lub więcej szalek Petriego w ilości 50-100 komórek/szalkę w pożywce z dodatkiem (Tabela 1), aż pojawią się klony. Pozwól im rosnąć przez kilka dni.</li>
	<li>Pozostałe komórki osadzać przez odwirowanie w temperaturze 1 200 × g przez 3 minuty w temperaturze pokojowej i odrzucić supernatant.</li>
	<li>Ekstrahować DNA z osadu (patrz Tabela Materiałów).</li>
	<li>Przeprowadź genotypowanie za pomocą zmiennej liczby tandemowo powtórzonych analiz (VNTR), jak wcześniej podano15.</li>
	<li>Pobrać klony z szalki Petriego za pomocą cylindrów klonujących lub końcówki pipety, używając mikroskopu stereoskopowego, aby uniknąć gromadzenia się różnych klonów, i przenieść je na 96-dołkową płytkę, z których każda zawiera 200 μl uzupełnionej pożywki hodowlanej (Tabela 1).</li>
	<li>Rozwijaj każdy klon, aż będzie wystarczająca liczba komórek do zamrożenia i ekstrakcji DNA.</li>
	<li>Sprawdź procent mutacji każdego klonu za pomocą RFLP lub innych metod sekwencjonowania. Najlepiej byłoby spróbować uzyskać zarówno klony z mtDNA typu dzikiego (mutacja 0%), jak i klony z różnymi procentami mutacji, oba sumujące się do mtDNA z mutacją homoplazmatyczną (mutacja 100%). Zobacz Rysunek 1 dla schematu ideowego protokołu generowania cybridów.</li>
</ol>

<ol><li>Gorman, G. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews.+Disease+Primers%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial diseases.</a> Nature Reviews. Disease Primers. 2, (2016).</li>
<li>DiMauro, S., Davidzon, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+DNA+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial DNA and disease.</a> Annals of Medicine. 37 (3), 222-232 (2005).</li>
<li>El-Hattab, A. W., Craigen, W. J., Scaglia, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+DNA+maintenance+defects%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta+%28BBA%29+-+Molecular+Basis+of+Disease%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial DNA maintenance defects.</a> Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Molecular Basis of Disease. 1863 (6), 1539-1555 (2017).</li>
<li>Stewart, J. B., Chinnery, P. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+dynamics+of+mitochondrial+DNA+heteroplasmy%3A+implications+for+human+health+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Genetics%22%5BJournal%5D)">The dynamics of mitochondrial DNA heteroplasmy: implications for human health and disease.</a> Nature Reviews Genetics. 16 (9), 530-542 (2015).</li>
<li>King, M. P., Attardi, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+cells+lacking+mtDNA%3A+repopulation+with+exogenous+mitochondria+by+complementation%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Human cells lacking mtDNA: repopulation with exogenous mitochondria by complementation.</a> Science. 246 (4929), 500-503 (1989).</li>
<li>Trounce, I., Neill, S., Wallace, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytoplasmic+transfer+of+the+mtDNA+nt+8993+T--%3EG+%28ATP6%29+point+mutation+associated+with+Leigh+syndrome+into+mtDNA-less+cells+demonstrates+cosegregation+with+a+decrease+in+state+III+respiration+and+ADP%2FO+ratio%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Cytoplasmic transfer of the mtDNA nt 8993 T-->G (ATP6) point mutation associated with Leigh syndrome into mtDNA-less cells demonstrates cosegregation with a decrease in state III respiration and ADP/O ratio.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 91 (18), 8334-8338 (1994).</li>
<li>Jun, A. S., Trounce, I. A., Brown, M. D., Shoffner, J. M., Wallace, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+transmitochondrial+cybrids+to+assign+a+complex+I+defect+to+the+mitochondrial+DNA-encoded+NADH+dehydrogenase+subunit+6+gene+mutation+at+nucleotide+pair+14459+that+causes+Leber+hereditary+optic+neuropathy+and+dystonia%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cellular+Biology%22%5BJournal%5D)">Use of transmitochondrial cybrids to assign a complex I defect to the mitochondrial DNA-encoded NADH dehydrogenase subunit 6 gene mutation at nucleotide pair 14459 that causes Leber hereditary optic neuropathy and dystonia.</a> Molecular and Cellular Biology. 16 (3), 771-777 (1996).</li>
<li>Dunbar, D. R., Moonie, P. A., Zeviani, M., Holt, I. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Complex+I+deficiency+is+associated+with+3243G%3AC+mitochondrial+DNA+in+osteosarcoma+cell+cybrids%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Molecular+Genetics%22%5BJournal%5D)">Complex I deficiency is associated with 3243G:C mitochondrial DNA in osteosarcoma cell cybrids.</a> Human Molecular Genetics. 5 (1), 123-129 (1996).</li>
<li>Pye, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+of+transmitochondrial+cybrids+containing+naturally+occurring+pathogenic+mtDNA+variants%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Production of transmitochondrial cybrids containing naturally occurring pathogenic mtDNA variants.</a> Nucleic Acids Research. 34 (13), 95(2006).</li>
<li>Bacman, S. R., Nissanka, N., Moraes, C. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chapter+18+-+Cybrid+technology%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Chapter 18 - Cybrid technology.</a> Methods in Cell Biology. 155, 415-439 (2020).</li>
<li>Rucheton, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Homoplasmic+deleterious+MT-ATP6%2F8+mutations+in+adult+patients%5BTitle%5D)+AND+%22Mitochondrion%22%5BJournal%5D)">Homoplasmic deleterious MT-ATP6/8 mutations in adult patients.</a> Mitochondrion. 55, 64-77 (2020).</li>
<li>Xu, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+a+novel+variant+in+MT-CO3+causing+MELAS%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Genetics%22%5BJournal%5D)">Identification of a novel variant in MT-CO3 causing MELAS.</a> Frontiers in Genetics. 12, 638749(2021).</li>
<li>Habbane, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+Mitochondrial+DNA%3A+Particularities+and+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Biomedicines%22%5BJournal%5D)">Human Mitochondrial DNA: Particularities and diseases.</a> Biomedicines. 9 (10), 1364(2021).</li>
<li>Legati, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Current+and+new+Next-Generation+Sequencing+approaches+to+study+mitochondrial+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Molecular+Diagnostics%22%5BJournal%5D)">Current and new Next-Generation Sequencing approaches to study mitochondrial DNA.</a> The Journal of Molecular Diagnostics. 23 (6), 732-741 (2021).</li>
<li>Boerwinkle, E., Xiong, W. J., Fourest, E., Chan, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+typing+of+tandemly+repeated+hypervariable+loci+by+the+polymerase+chain+reaction%3A+application+to+the+apolipoprotein+B+3%27+hypervariable+region%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Rapid typing of tandemly repeated hypervariable loci by the polymerase chain reaction: application to the apolipoprotein B 3' hypervariable region.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 86 (1), 212-216 (1989).</li>
<li>Lawless, C., Greaves, L., Reeve, A. K., Turnbull, D. M., Vincent, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+rise+and+rise+of+mitochondrial+DNA+mutations%5BTitle%5D)+AND+%22Open+Biology%22%5BJournal%5D)">The rise and rise of mitochondrial DNA mutations.</a> Open Biology. 10 (5), 200061(2020).</li>
<li>Wallace, D. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+DNA+mutation+associated+with+Leber%27s+hereditary+optic+neuropathy%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial DNA mutation associated with Leber's hereditary optic neuropathy.</a> Science. 242 (4884), 1427-1430 (1988).</li>
<li>Holt, I. J., Harding, A. E., Morgan-Hughes, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deletions+of+muscle+mitochondrial+DNA+in+patients+with+mitochondrial+myopathies%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Deletions of muscle mitochondrial DNA in patients with mitochondrial myopathies.</a> Nature. 331 (6158), 717-719 (1988).</li>
<li>Chomyn, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Platelet-mediated+transformation+of+human+mitochondrial+DNA-less+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">Platelet-mediated transformation of human mitochondrial DNA-less cells.</a> Methods in Enzymology. 264, 334-339 (1996).</li>
<li>Sazonova, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cybrid+models+of+pathological+cell+processes+in+different+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Oxidative+Medicine+and+Cellular+Longevity%22%5BJournal%5D)">Cybrid models of pathological cell processes in different diseases.</a> Oxidative Medicine and Cellular Longevity. 2018, 4647214(2018).</li>
<li>Tarrago-Litvak, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+inhibition+of+mitochondrial+DNA+polymerase+gamma+from+animal+cells+by+intercalating+drugs%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">The inhibition of mitochondrial DNA polymerase gamma from animal cells by intercalating drugs.</a> Nucleic Acids Research. 5 (6), 2197-2210 (1978).</li>
<li>Swerdlow, R. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondria%2C+cybrids%2C+aging%2C+and+Alzheimer%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Progress+in+Molecular+Biology+and+Translational+Science%22%5BJournal%5D)">Mitochondria, cybrids, aging, and Alzheimer's disease.</a> Progress in Molecular Biology and Translational Science. 146, 259-302 (2017).</li>
<li>Ghosh, S. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+cytoplasmic+hybrid+cell+lines+for+elucidating+the+role+of+mitochondrial+dysfunction+in+Alzheimer%27s+disease+and+Parkinson%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+the+New+York+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Use of cytoplasmic hybrid cell lines for elucidating the role of mitochondrial dysfunction in Alzheimer's disease and Parkinson's disease.</a> Annals of the New York Academy of Sciences. 893, 176-191 (1999).</li>
<li>Buneeva, O., Fedchenko, V., Kopylov, A., Medvedev, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+dysfunction+in+Parkinson%27s+disease%3A+focus+on+mitochondrial+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Biomedicines%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial dysfunction in Parkinson's disease: focus on mitochondrial DNA.</a> Biomedicines. 8 (12), 591(2020).</li>
<li>Weidling, I. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+DNA+manipulations+affect+tau+oligomerization%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Alzheimer%27s+disease%3A+JAD%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial DNA manipulations affect tau oligomerization.</a> Journal of Alzheimer's disease: JAD. 77 (1), 149-163 (2020).</li>
<li>Ferreira, I. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bioenergetic+dysfunction+in+Huntington%27s+disease+human+cybrids%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Neurology%22%5BJournal%5D)">Bioenergetic dysfunction in Huntington's disease human cybrids.</a> Experimental Neurology. 231 (1), 127-134 (2011).</li>
<li>Cruz-Bermúdez, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spotlight+on+the+relevance+of+mtDNA+in+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+%26+Translational+Oncology%22%5BJournal%5D)">Spotlight on the relevance of mtDNA in cancer.</a> Clinical & Translational Oncology. 19 (4), 409-418 (2017).</li>
<li>Patel, T. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((European+mtDNA+variants+are+associated+with+differential+responses+to+cisplatin%2C+an+anticancer+drug%3A+implications+for+drug+resistance+and+side+effects%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Oncology%22%5BJournal%5D)">European mtDNA variants are associated with differential responses to cisplatin, an anticancer drug: implications for drug resistance and side effects.</a> Frontiers in Oncology. 9, 640(2019).</li>
</ol>

Autorzy nie mają do ujawnienia żadnych konfliktów interesów.

mtDNA ma bardzo wysoki współczynnik mutacji w porównaniu z nDNA ze względu na brak ochronnych histonów i jego położenie w pobliżu łańcucha oddechowego, co naraża cząsteczkę na szkodliwe efekty oksydacyjne, którym skutecznie nie przeciwdziałają systemy naprawcze16. Pierwsze patogenne mutacje mtDNA zostały zidentyfikowane w 1988 roku 17,18 i od tego czasu opisano dużą liczbę mutacji. Technologia NGS jest odpowiednim podejściem do badań przes...

Zaburzenia mitochondrialne (MDs) to grupa zespołów wieloukładowych spowodowanych upośledzeniem funkcji mitochondriów spowodowanym mutacjami w DNA jądrowym (nDNA) lub mitochondrialnym (mtDNA)1. Są to jedne z najczęstszych dziedzicznych chorób metabolicznych, z częstością występowania 1:5 000. Choroby związane z mtDNA są zgodne z zasadami genetyki mitochondrialnej: dziedziczenie matczyne, heteroplazmia i efekt progowy oraz segregacja mitotyczna<klasa sup="xref">2. Ludzki mtDNA to dwuniciowy krąg DNA o wielkości 16,6 kb, który zawiera krótki region kontrolny z sekwencjami potrzebnymi do replikacji i transkrypcji, 13 genów kodujących białka (wszystkie podjednostki łańcucha oddechowego), 22 geny tRNA i 2 geny rRNA3.
U zdrowych osób występuje jeden genotyp mtDNA (homoplazmia), podczas gdy więcej niż jeden genotyp współistnieje (heteroplazmia) w stanach patologicznych. Szkodliwe mutacje heteroplazmatyczne muszą przekroczyć krytyczny próg, aby zakłócić działanie OXPHOS i spowodować choroby, które mogą dotknąć każdy narząd w każdym wieku4. Podwójna genetyka OXPHOS dyktuje dziedziczenie: autosomalne recesywne lub dominujące i sprzężone z chromosomem X w przypadku mutacji nDNA, matczyne w przypadku mutacji mtDNA oraz sporadyczne przypadki zarówno nDNA, jak i mtDNA.
Na początku ery medycyny mitochondrialnej, przełomowy eksperyment Kinga i Attardi5 stworzył podstawy do zrozumienia pochodzenia mutacji odpowiedzialnej za MD poprzez tworzenie hybrydowych komórek zawierających jądra z linii komórek nowotworowych, w których mtDNA było całkowicie zubożone (komórki rho0) i mitochondria od pacjentów z MDs. Techniki sekwencjonowania nowej generacji (NGS) nie były wówczas dostępne, Nie było też łatwo ustalić, czy mutacja jest obecna w genomie jądrowym, czy mitochondrialnym. Metoda, opisana w 1989 roku, była następnie stosowana przez kilku badaczy zajmujących się medycyną mitochondrialną6,7,8,9; Szczegółowy protokół został niedawno opublikowany10, ale nie nakręcono jeszcze żadnego filmu. Dlaczego taki protokół miałby być istotny w dzisiejszych czasach, skoro NGS może precyzyjnie i szybko zidentyfikować, gdzie znajduje się mutacja? Odpowiedź jest taka, że generacja cybrydów jest nadal najnowocześniejszym protokołem pozwalającym zrozumieć patogenną rolę każdej nowej mutacji mtDNA, skorelować procent heteroplazmii z ciężkością choroby i przeprowadzić badanie biochemiczne w jednorodnym układzie jądrowym, w którym udział autochtonicznego tła jądrowego pacjenta jest nieobecny11, 12,13.
Ten protokół opisuje, jak uzyskać cytoplasty z konfluentnych, pochodzących od pacjenta fibroblastów hodowanych na 35 mm szalkach Petriego. Odwirowanie szalek w obecności cytochalazyny B pozwala na wyizolowanie wyłuszczonych cytoplastów, które są następnie łączone z komórkami rho0 w obecności glikolu polietylenowego (PEG). Powstałe cybrydy są następnie hodowane w selektywnym podłożu, aż do powstania klonów. Reprezentatywna sekcja wyników przedstawia przykład charakterystyki molekularnej otrzymanych cybrydów w celu udowodnienia, że mtDNA jest identyczne z fibroblastami pacjentów dawcy i że nDNA jest identyczne z jądrowym DNA linii komórkowej guza rho0.

<table><tbody><tr><td>5-Bromo-2'-Deoxyuridine</td><td>Sigma-Aldrich (Merck)</td><td>B5002-500MG</td><td></td></tr><tr><td>Płytki 6-dołkowe</td><td>Corning</td><td>3516</td><td></td></tr><tr><td>96-dołkowe Płytki</td><td>Corning</td><td>3596</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw do ekstrakcji DNA do hodowli krwi i komórek</td><td>QIAGEN</td><td>13323</td><td></td></tr><tr><td>Wirówka</td><td>Beckman Coulter</td><td>Avanti J-25</td><td>7,200 rcf, 37 &deg; C</td></tr><tr><td>Butelki wirówkowe, 250 ml</td><td>Beckman Coulter</td><td>356011</td><td></td></tr><tr><td>Cytochalazyna B z Drechslera dematioidea</td><td>Sigma-Aldrich (Merck)</td><td>C2743-200UL</td><td></td></tr><tr><td>Dializowany FBS</td><td>Gibco</td><td>26400-036 100 ml</td><td></td></tr><tr><td>DMEM Wysoki poziom glukozy (bez L-glutaminy z pirogronianem sodu)</td> <td>EuroClone</td><td>ECB7501L</td><td></td></tr><tr><td>Sól fizjologiczna buforowana fosforanem Dulbecco - PBS (w/ o Wapń bez magnezu)</td><td>EuroClone</td><td>ECB4004L</td><td></td></tr><tr><td>Etanol Absolutny bezwodny</td><td>Carlo Erba</td><td>414601</td><td></td></tr><tr><td>FetalClone III (produkt z surowicy bydlęcej)</td><td>Cytiva - HyClone Laboratories</td><td>SH30109.03</td><td></td></tr><tr><td>Szklane pipety Pasteura</td><td>VWR</td><td>M4150NO250SP4</td><td></td></tr><tr><td>Odwrócony mikroskop badawczy do mikroskopii żywych komórek</td><td>Nikon</td><td>ECLIPSE TE200</td><td></td></tr><tr><td>JA-14 Aluminiowy rotor o stałym kącie nachylenia</td><td>Beckman Coulter</td><td>339247</td><td></td></tr><tr><td>Autoklaw laboratoryjny Vapormatic 770</td><td>Labotech</td><td>29960014</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamina 200 mM (100x)</td><td>EuroClone</td><td>ECB 3000D</td><td></td></tr><tr><td>Minimum Essential Medium MEM</td><td>Euroclone</td><td>ECB2071L</td><td></td></tr><tr><td>MycoAlert Zestaw do wykrywania Mycoplazmy</td><td>Lonza</td><td>LT07-318</td><td></td></tr><tr><td>PEG (roztwór glikolu polietylenowego)</td><td>Sigma-Aldrich (Merck)</td><td>P7181-5X5ML</td><td></td></tr><tr><td>Penicylina-Streptomycyna (roztwór 100x)</td><td>EuroClone</td><td>ECB3001D</td><td></td></tr><tr><td>Primo TC Naczynia 100 mm</td><td>EuroClone</td><td>ET2100</td><td></td></tr><tr><td>Primo TC Szalki 35 mm</td><td>EuroClone</td><td>ET2035</td><td></td></tr><tr><td>Pirogronian sodu 100 mM</td><td>EuroClone</td><td>ECM0542D</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop stereoskopowy</td><td>Nikon</td><td>SMZ1000</td><td></td></tr><tr><td>trypsyna 2,5% w HBSS</td><td>EuroClone</td><td>ECB3051D</td><td></td></tr><tr><td>Uridine</td><td>Sigma-Aldrich (Merck)</td><td>U3003-5G</td><td></td></tr></tbody></table>

podejście in vitro do badania dysfunkcji mitochondriów: model cybrid

An In Vitro Approach to Study Mitochondrial Dysfunction: A Cybrid Model

Niedobór kompleksów mitochondrialnych łańcuchów oddechowych, które przeprowadzają fosforylację oksydacyjną (OXPHOS), jest biochemicznym markerem ludzkich zaburzeń mitochondrialnych. Z genetycznego punktu widzenia OXPHOS stanowi wyjątkowy przykład, ponieważ wynika z komplementarności dwóch odrębnych systemów genetycznych: jądrowego DNA (nDNA) i mitochondrialnego DNA (mtDNA). Dlatego defekty OXPHOS mogą być spowodowane mutacjami wpływającymi na geny kodowane jądrowo i mitochondrialnie.
Przełomowa praca Kinga i Attardiego, opublikowana w 1989 roku, pokazała, że ludzkie linie komórkowe pozbawione mtDNA (nazwane rho0) mogą być ponownie zasiedlone przez egzogenne mitochondria w celu uzyskania tak zwanych "transmitochondrialnych cybrydów." Dzięki tym cybrydom zawierającym mitochondria pochodzące od pacjentów z zaburzeniami mitochondrialnymi (MDs) oraz jądra z rho0 komórek, możliwe jest sprawdzenie, czy defekt jest związany z mtDNA lub nDNA. Cybrydy te są również potężnym narzędziem do walidacji patogenności mutacji i badania jej wpływu na poziomie biochemicznym. W artykule przedstawiono szczegółowy protokół opisujący powstawanie, selekcję i charakterystykę cybrydów.

Tworzenie cybryd wymaga 3 dni pracy laboratoryjnej oraz okresu selekcji (~2 tygodnie) i dodatkowych 1-2 tygodni na wzrost klonów. Kluczowymi etapami są jakość cytoplastów oraz okres selekcji. Morfologia cybryd przypomina morfologię komórek dawców rho0. Przypisanie odpowiedniego mtDNA i nDNA w cybrydach jest niezbędne do potwierdzenia tożsamości komórek. Przykład przedstawiono na Rysunku 2. W tym przypadku wygenerowano cybrydy z fibroblastów pochodzących od pacjenta z heteroplastyc...

Cybrydy transcyondryjne to hybrydowe komórki uzyskane przez fuzję komórek zubożonych w mitochondrialne DNA (mtDNA) (komórki rho0) z cytoplastami (komórkami wyłuszczonymi) pochodzącymi od pacjentów dotkniętych zaburzeniami mitochondrialnymi. Pozwalają one na określenie jądrowego lub mitochondrialnego pochodzenia choroby, ocenę aktywności biochemicznej oraz potwierdzenie patogenetycznej roli wariantów związanych z mtDNA.

Podejście in vitro do badania dysfunkcji mitochondriów: model Cybrid

Deficiency of the mitochondrial respiratory chain complexes that carry out oxidative phosphorylation (OXPHOS) is the biochemical marker of human ...

Cybergeneracja jest nadal najnowocześniejszym protokołem pozwalającym zrozumieć patogenną rolę każdej nowej mutacji mitochondrialnego DNA i skorelować procent atriplazmii z ciężkością choroby. Technika ta pozwala na przeprowadzenie badań biochemicznych w jednorodnym układzie jądrowym, w którym nie ma udziału tła jądrowego pacjenta. Technika ta pozwala na walidację patogenności mutacji mitochondrialnego DNA.i umożliwia zbadanie jego wpływu na poziomie biochemicznym Umyj 35-milimetrowe naczynia zawierające fibroblasty dwukrotnie, używając dwóch mililitrów 1X PBS bez wapnia i magnezu. Oczyść zewnętrzną powierzchnię naczyń 70% etanolem i poczekaj, aż alkohol odparuje. Zdejmij pokrywki z naczyń i zakrętki z butelek.Umieść każde naczynie bez pokrywki do góry nogami na dnie każdej 250-mililitrowej butelki wirówki. Powoli dodawaj 32 mililitry pożywki zarodkowej do każdej butelki, pozwalając pożywce dostać się do naczynia i wejść w kontakt z komórkami. Usuń wszelkie bąbelki z naczyń za pomocą długiej szklanej pipety pastewnej, zakrzywiając końcówkę w płomieniu Bunsena.Zamknij każdą butelkę zakrętką i przenieś je do wirówki. Wirować przez 20 minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 8 000 x G. Odessać pożywkę z butelek i wyrzucić. Wyjmij naczynia, odwracając butelki na sterylnej gazie uprzednio spryskanej 70% etanolem.Oczyść zewnętrzną powierzchnię naczyń i ich pokrywki 70% etanolem i zamknij naczynia po odparowaniu etanolu. Przed kontynuowaniem sprawdź, czy nie tworzy się cytoplastów za pomocą odwróconego mikroskopu dla żywych komórek. Szukaj ekstremalnie wydłużonych fibroblastów z powodu wytłaczania ich jąder indukowanego przez cytochalazynę.Do każdej 35-milimetrowej szalki dodaj 1 000, 143 rzędy komórek zero. Ponownie zawieszony w dwóch mililitrach pożywki hodowlanej uzupełnionej 5% FBS. Pozostaw naczynia na trzy godziny w nawilżonym inkubatorze dwutlenku węgla, aby osadzić 143 komórki w rzędzie zerowym na duchach.Po trzech godzinach inkubacji odessać i wyrzucić pożywkę. Umyj przylegające komórki dwukrotnie dwoma mililitrami pożywki DMEM o wysokiej zawartości glukozy bez surowicy lub MEM, a następnie odessać i wyrzucić pożywkę. Dodaj 500 mikrolitrów roztworu glikolu polietylenowego do komórek i inkubuj dokładnie przez minutę.Odessać i wyrzucić roztwór glikolu polietylenowego. Umyj komórki trzykrotnie dwoma mililitrami DMEM o wysokiej zawartości glukozy bez surowicy lub MEM. Dodaj dwa mililitry pożywki termojądrowej i inkubuj przez noc w inkubatorze w temperaturze 37 stopni Celsjusza z 5% dwutlenkiem węgla.Trypsynizuj komórki w pozostałych szalkach hodowlanych Policz je i zasiej na jednej lub więcej szalkach Petriego Dodaj od 50 do 100 komórek na szalkę w uzupełnionej kulturze, aż pojawią się klony. Następnie pozwól im rosnąć przez kilka dni. Za pomocą mikroskopu stereoskopowego pobierz klony z szalki Petriego za pomocą cylindrów klonujących lub końcówki do pipet.Staraj się unikać łączenia różnych klonów i przenieś je na 96-dołkową płytkę, z których każda zawiera 200 mikrolitrów uzupełnionej pożywki hodowlanej. Cybrydy zostały wygenerowane z fibroblastów pochodzących od pacjenta z heteroplazmatycznym M2343A2G Jedną z najczęstszych mutacji mitochondrialnego DNA związanych z miopatią mitochondrialną, encefalopatią, kwasicą mleczanową i epizodami podobnymi do udaru. Analiza zmiennej liczby powtórzeń tandemowych wykazała, że cyber DNA jest identyczne z komórkami rzędu zero, co potwierdza zastąpienie cyber DNA pacjenta genomem 143 B.Polimorfizm długości fragmentów restrykcyjnych lub analizy sekwencjonowania można wykorzystać do oceny obecności mutacji mitochondrialnego DNA i procentu heteroplazmii. Podczas prób zastosowania tego protokołu ważne jest, aby zweryfikować prawidłowe aktywa genetyczne nukleonu i mitochondrialnego DNA, a także ilość mitochondrialnego DNA w ponownie zasiedlonych cybrydach.

an-in-vitro-approach-to-study-mitochondrial-dysfunction-a-cybrid-model

Research

JoVE Journal

Genetics

Genetyka

Porównanie potencjału błony mitochondrialnej między próbkami dostarcza cennych informacji o stanie komórek. Opisano szczegółowe etapy izolacji mitochondriów i oceny odpowiedzi na inhibitory i rozprzęgacze za pomocą fluorescencji. Metoda i użyteczność tego protokołu są zilustrowane przez zastosowanie hodowli komórkowej i zwierzęcego modelu stresu komórkowego.

Izolacja i analiza funkcjonalna mitochondriów z hodowanych komórek i tkanek myszy

Protokół jest opisany do wykrywania in vivo efektów inhibitorów mitochondrialnych w organizmie modelowym Caenorhabditis elegans oraz do identyfikacji potencjalnych związków wzmacniających. Protokół ten może być używany do badań przesiewowych bibliotek leków pod kątem związków modulujących funkcję mitochondriów.

Przesiewowy test in vivo dla modulatorów mitochondrialnych przy użyciu transgenicznych bioluminescencyjnych Caenorhabditis elegans

Analiza zależności między strukturą a funkcją mitochondriów jest niezbędna do dokładnego zrozumienia mechanizmów regulacyjnych funkcjonalności mitochondriów. W artykule opisano i zademonstrowano specyficzne metody badania struktury i funkcji mitochondriów w żywych i utrwalonych jajnikach Drosophila.

Badanie struktury i funkcji mitochondriów w jajnikach Drosophila

Mitofagia, proces oczyszczania uszkodzonych mitochondriów, jest niezbędny do homeostazy mitochondriów i utrzymania zdrowia. W tym artykule przedstawiono niektóre z najnowszych metod wykrywania mitofagii w komórkach ludzkich, Caenorhabditis elegans i myszach.

Wykrywanie mitofagii in vitro i in vivo w komórkach ludzkich, C. elegans i myszach

Fuzja mitochondriów jest ważną reakcją homeostatyczną leżącą u podstaw dynamiki mitochondriów. Opisano tutaj system rekonstytucji in vitro do badania fuzji mitochondrialnej błony wewnętrznej, która może rozwiązać problem wiązania błony, dokowania, heminacji i otwierania porów. Omówiono wszechstronność tego podejścia w badaniu systemów błon komórkowych.

Modelowa platforma membranowa do odtwarzania dynamiki błon mitochondrialnych

Opisujemy szczegółowy protokół generowania ludzkich organoidów mózgowych pochodzących z pluripotencjalnych komórek macierzystych i ich wykorzystania w modelowaniu chorób mitochondrialnych.

Generowanie organoidów ludzkiego mózgu do modelowania chorób mitochondrialnych

Przygotowanie wzbogaconych o mitochondria próbek z wcześniej zamrożonych zarchiwizowanych tkanek stałych pozwoliło badaczom na przeprowadzenie zarówno funkcjonalnych, jak i analitycznych ocen mitochondriów w różnych eksperymentalnych modalnościach. Badanie to pokazuje, jak przygotować preparaty wzbogacone w mitochondria z zamrożonej tkanki serca i przeprowadzić ocenę analityczną mitochondriów.

Pomiar mitochondrialnych kompleksów przenoszenia elektronów w wcześniej zamrożonej tkance serca od potomstwa lochy: model do oceny zmian bioenergetyki mitochondrialnej wywołanych wysiłkiem fizycznym

Ten protokół opisuje technikę generowania cybrydów z komórek nowotworowych rosnących w zawiesinie jako narzędzie do badania roli mitochondriów w procesie nowotworowym.

Wytwarzanie cybridów transmiscyjnych przy użyciu linii komórek rakowych

Tutaj prezentujemy protokół respirometrii o wysokiej rozdzielczości do analizy bioenergetyki u zmutowanych muszek owocowych PINK1B9-null. W metodzie wykorzystuje się protokół SUIT (Substrate-Uncouplingr-Inhibitor-Titration).

Analiza funkcji mitochondriów u Drosophila melanogaster PINK1B9-Null mutant przy użyciu respirometrii o wysokiej rozdzielczości

Organoidy mózgowe stanowią cenny model dla badań nad encefalomiopatią mitochondrialną, kwasicą mlekową oraz epizodami podobnymi do udaru (MELAS), oferując wgląd w ich podstawową patofizjologię i stanowiąc platformę do badań przesiewowych leków. Organoidy pochodzące z linii komórkowych o różnym poziomie heteroplazmy genów wywołujących chorobę wykazują istotne różnice fenotypowe.

Modelowanie chorób mitochondrialnych za pomocą organoidów mózgowych: Skupienie się na encefalomiopatii mitochondrialnej, kwasicy mlekowej oraz epizodach podobnych do udaru

Poznaj metodę cybrid do badania mutacji mtDNA i dysfunkcji mitochondriów. Technika ta pozwala ocenić aktywność biochemiczną oraz związek heteroplazmii z ciężkością choroby w kontrolowanym środowisku jądrowym.

Podejście in vitro do badania dysfunkcji mitochondriów: model Cybrid

Przeglądaj więcej filmów