Podejście in vitro do badania dysfunkcji mitochondriów: model Cybrid
9 marca 2022
Cybrydy transcyondryjne to hybrydowe komórki uzyskane przez fuzję komórek zubożonych w mitochondrialne DNA (mtDNA) (komórki rho0) z cytoplastami (komórkami wyłuszczonymi) pochodzącymi od pacjentów dotkniętych zaburzeniami mitochondrialnymi. Pozwalają one na określenie jądrowego lub mitochondrialnego pochodzenia choroby, ocenę aktywności biochemicznej oraz potwierdzenie patogenetycznej roli wariantów związanych z mtDNA.
Cybergeneracja jest nadal najnowocześniejszym protokołem pozwalającym zrozumieć patogenną rolę każdej nowej mutacji mitochondrialnego DNA i skorelować procent atriplazmii z ciężkością choroby. Technika ta pozwala na przeprowadzenie badań biochemicznych w jednorodnym układzie jądrowym, w którym nie ma udziału tła jądrowego pacjenta. Technika ta pozwala na walidację patogenności mutacji mitochondrialnego DNA.
i umożliwia zbadanie jego wpływu na poziomie biochemicznym Umyj 35-milimetrowe naczynia zawierające fibroblasty dwukrotnie, używając dwóch mililitrów 1X PBS bez wapnia i magnezu. Oczyść zewnętrzną powierzchnię naczyń 70% etanolem i poczekaj, aż alkohol odparuje. Zdejmij pokrywki z naczyń i zakrętki z butelek.
Umieść każde naczynie bez pokrywki do góry nogami na dnie każdej 250-mililitrowej butelki wirówki. Powoli dodawaj 32 mililitry pożywki zarodkowej do każdej butelki, pozwalając pożywce dostać się do naczynia i wejść w kontakt z komórkami. Usuń wszelkie bąbelki z naczyń za pomocą długiej szklanej pipety pastewnej, zakrzywiając końcówkę w płomieniu Bunsena.
Zamknij każdą butelkę zakrętką i przenieś je do wirówki. Wirować przez 20 minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 8 000 x G. Odessać pożywkę z butelek i wyrzucić. Wyjmij naczynia, odwracając butelki na sterylnej gazie uprzednio spryskanej 70% etanolem.
Oczyść zewnętrzną powierzchnię naczyń i ich pokrywki 70% etanolem i zamknij naczynia po odparowaniu etanolu. Przed kontynuowaniem sprawdź, czy nie tworzy się cytoplastów za pomocą odwróconego mikroskopu dla żywych komórek. Szukaj ekstremalnie wydłużonych fibroblastów z powodu wytłaczania ich jąder indukowanego przez cytochalazynę.
Do każdej 35-milimetrowej szalki dodaj 1 000, 143 rzędy komórek zero. Ponownie zawieszony w dwóch mililitrach pożywki hodowlanej uzupełnionej 5% FBS. Pozostaw naczynia na trzy godziny w nawilżonym inkubatorze dwutlenku węgla, aby osadzić 143 komórki w rzędzie zerowym na duchach.
Po trzech godzinach inkubacji odessać i wyrzucić pożywkę. Umyj przylegające komórki dwukrotnie dwoma mililitrami pożywki DMEM o wysokiej zawartości glukozy bez surowicy lub MEM, a następnie odessać i wyrzucić pożywkę. Dodaj 500 mikrolitrów roztworu glikolu polietylenowego do komórek i inkubuj dokładnie przez minutę.
Odessać i wyrzucić roztwór glikolu polietylenowego. Umyj komórki trzykrotnie dwoma mililitrami DMEM o wysokiej zawartości glukozy bez surowicy lub MEM. Dodaj dwa mililitry pożywki termojądrowej i inkubuj przez noc w inkubatorze w temperaturze 37 stopni Celsjusza z 5% dwutlenkiem węgla.
Trypsynizuj komórki w pozostałych szalkach hodowlanych Policz je i zasiej na jednej lub więcej szalkach Petriego Dodaj od 50 do 100 komórek na szalkę w uzupełnionej kulturze, aż pojawią się klony. Następnie pozwól im rosnąć przez kilka dni. Za pomocą mikroskopu stereoskopowego pobierz klony z szalki Petriego za pomocą cylindrów klonujących lub końcówki do pipet.
Staraj się unikać łączenia różnych klonów i przenieś je na 96-dołkową płytkę, z których każda zawiera 200 mikrolitrów uzupełnionej pożywki hodowlanej. Cybrydy zostały wygenerowane z fibroblastów pochodzących od pacjenta z heteroplazmatycznym M2343A2G Jedną z najczęstszych mutacji mitochondrialnego DNA związanych z miopatią mitochondrialną, encefalopatią, kwasicą mleczanową i epizodami podobnymi do udaru. Analiza zmiennej liczby powtórzeń tandemowych wykazała, że cyber DNA jest identyczne z komórkami rzędu zero, co potwierdza zastąpienie cyber DNA pacjenta genomem 143 B.
Polimorfizm długości fragmentów restrykcyjnych lub analizy sekwencjonowania można wykorzystać do oceny obecności mutacji mitochondrialnego DNA i procentu heteroplazmii. Podczas prób zastosowania tego protokołu ważne jest, aby zweryfikować prawidłowe aktywa genetyczne nukleonu i mitochondrialnego DNA, a także ilość mitochondrialnego DNA w ponownie zasiedlonych cybrydach.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Transmitochondrialne cybridy to komórki hybrydowe powstałe poprzez fuzję komórek pozbawionych mtDNA z cytoplastami pochodzącymi od pacjentów z chorobami mitochondrialnymi. Podejście to pomaga określić pochodzenie schorzeń oraz ocenić aktywności biochemiczne.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neuronauka
- Biologia komórki
- Genetyka mitochondrialna
Wstęp
- Transmitochondrialne cybrydy są niezbędne do badania schorzeń mitochondrialnych.
- Umożliwiają one analizę udziału genomu jądrowego i mitochondrialnego w patogenezie chorób.
- Technika ta jest kluczowa dla walidacji patogenności mutacji mtDNA.
- Zrozumienie biochemicznego wpływu mutacji jest niezbędne dla procesu leczenia chorób.
Cel badania
- Badanie patogennej roli nowych mutacji mitochondrialnego DNA.
- Korelacja poziomu heteroplazmii z ciężkością choroby.
- Przeprowadzenie badań biochemicznych w kontrolowanym środowisku jądrowym.
Zastosowane metody
- Fuzja komórek rho 0 z enukleowanymi cytoplastami.
- Analizy biochemiczne w celu oceny funkcji mitochondriów.
- Walidacja mutacji mtDNA poprzez analizę cybridów.
- Zastosowanie PBS i etanolu do przygotowania komórek.
Główne wyniki
- Pomyślne stworzenie transmitochondrialnych cybryd.
- Identyfikacja aktywności biochemicznych powiązanych z mutacjami mtDNA.
- Ustanowienie korelacji między poziomami heteroplazmii a przebiegiem choroby.
- Potwierdzenie patogennej roli specyficznych wariantów mtDNA.
Wnioski
- Cybrydy transmitochondrialne są skuteczne w badaniu chorób mitochondrialnych.
- Metoda ta pozwala na lepsze zrozumienie mutacji mtDNA oraz ich skutków.
- Przyszłe badania mogą opierać się na tych odkryciach w celu opracowania terapii celowanych.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Modele hybryd mitochondrialnych (cybryd) umożliwiają precyzyjną analizę wkładu genetycznego mitochondriów w przeciwieństwie do jądra komórkowego w dysfunkcję OXPHOS, co stanowi kluczowy punkt zwrotny w badaniach nad chorobami mitochondrialnymi. Podejście to pozwala na mechanistyczną redukcję ryzyka i walidację celów w przypadku mutacji mitochondrialnego DNA, co zwiększa wiarygodność predykcyjną we wczesnych etapach odkrywania leków oraz w badaniach translacyjnych. Zdolność systemu cybryd do izolowania i charakteryzowania patogenności stanowi podstawę decyzji portfelowych skorygowanych o ryzyko w programach dotyczących zaburzeń mitochondrialnych.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne etapy odkrywania i walidacja celu
- Umożliwia bezpośrednią analizę patogenności mutacji w mitochondrialnym DNA w kontrolowanym tle jądrowym.
- Wspiera funkcjonalną walidację celu poprzez rozróżnienie defektów OXPHOS wywołanych przez mtDNA od tych wywołanych przez nDNA.
- Ułatwia ograniczanie ryzyka mechanistycznego w przypadku nowych wariantów mitochondrialnych przed dalszymi inwestycjami.
- Zapewnia platformę do korelacji poziomów heteroplazmii z fenotypami istotnymi dla przebiegu choroby.
Przesiewy i opracowywanie testów
- Ustanawia zwalidowane linie cybryd do powtarzalnych analiz biochemicznych i genetycznych.
- Umożliwia ilościowy pomiar aktywności OXPHOS oraz wpływu mutacji.
- Wspiera standaryzację testów i odtwarzalność między laboratoriami w badaniach nad mitochondriami.
- Przygotowuje stabilne systemy komórkowe do screeningu związków celujących w dysfunkcję mitochondrialną.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Umożliwia dopasowanie modeli cybryd istotnych dla danej jednostki chorobowej do opracowywania biomarkerów translacyjnych.
- Zapewnia ciągłość procesu od odkryć genetycznych do walidacji przedklinicznej celów mitochondrialnych.
- Umożliwia dostosowane do ryzyka wdrażanie potencjalnych interwencji w oparciu o dowody mechanistyczne.
- Wspiera predykcyjną redukcję ryzyka w portfelach projektów dotyczących chorób mitochondrialnych.
Integracja potoku i przepływu pracy
Model cybrydowy integruje się z kontinuum od odkrycia do fazy przedklinicznej, umożliwiając testowanie hipotez, walidację celów oraz wyjaśnienie mechanizmów w chorobach mitochondrialnych.
- Biologia odkrywcza: Wspiera testowanie hipotezy zerowej w zakresie patogenności mutacji mtDNA i wyjaśnia genetyczne uwarunkowania dysfunkcji OXPHOS.
- Przesiew: Zapewnia zestandaryzowane, powtarzalne linie cybryd do ilościowych analiz biochemicznych.
- Analityka: Dostarcza ilościowe odczyty heteroplazmii i aktywności OXPHOS do analiz porównawczych.
- Badania translacyjne: Łączy odkrycia genetyczne z walidacją modeli przedklinicznych i dopasowaniem biomarkerów.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Oferuje platformę wielokrotnego użytku do ciągłego odkrywania celów mitochondrialnych i biomarkerów.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorczy
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność prognostyczną i zmniejsza niejednoznaczność mechanistyczną w badaniach nad chorobami mitochondrialnymi.
- Wartość operacyjna: Standaryzuje generowanie i charakterystykę cybryd w celu zapewnienia powtarzalności i skalowalności.
- Wartość strategiczna: Umożliwia podejmowanie świadomych decyzji o kontynuacji lub przerwaniu badań oraz efektywne zarządzanie portfelem kapitałowym.
- Wpływ na portfolio: Wspiera priorytetyzację dostosowaną do ryzyka oraz rozwój programów dotyczących zaburzeń mitochondrialnych.
Uwagi dotyczące wdrożenia
- Wymaga doświadczenia w zakresie fuzji komórek, genetyki mitochondrialnej oraz opracowywania testów biochemicznych.
- Wymaga dostępu do specjalistycznej infrastruktury do hodowli komórkowych, wirowania i analiz molekularnych.
- Konieczna jest rygorystyczna standaryzacja protokołów generowania i walidacji cybryd pomiędzy zespołami.
- Może wymagać adaptacji dla różnych typów komórek lub tła genetycznego istotnego dla danej choroby.
- Weryfikacja zasobów genetycznych jądra i mitochondriów jest niezbędna dla zapewnienia wierności modelu.
