Name: Analiza interakcji białek znakowanych fluorescencyjnie ze sztucznymi mikropęcherzykami fosfolipidowymi przy użyciu ilościowej cytometrii przepływowej (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-04-06T13:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 26 s
Description: Poznaj ilościową cytometrię przepływową do badania interakcji białek z fosfolipidowymi mikropęcherzykami. Ta metoda umożliwia obliczenie stałych kinetycznych i równowagowych oraz szacowanie liczby miejsc wiązania białek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy byli wspierani przez grant Rosyjskiej Fundacji Naukowej 20-74-00133.

<ol><li>Hoffman, M., Monroe, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+cell-based+model+of+hemostasis%5BTitle%5D)+AND+%22Thrombosis+and+haemostasis%22%5BJournal%5D)">A cell-based model of hemostasis.</a> Thrombosis and haemostasis. 85 (6), 958-965 (2001).</li>
<li>Roberts, H. R., Hoffman, M., Monroe, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+cell-based+model+of+thrombin+generation%5BTitle%5D)+AND+%22Seminars+in+Thrombosis+and+Hemostasis%22%5BJournal%5D)">A cell-based model of thrombin generation.</a> Seminars in Thrombosis and Hemostasis. 32, Suppl 1 32-38 (2006).</li>
<li>Panteleev, M. A., Dashkevich, N. M., Ataullakhanov, F. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hemostasis+and+thrombosis+beyond+biochemistry%3A+roles+of+geometry%2C+flow+and+diffusion%5BTitle%5D)+AND+%22Thrombosis+Research%22%5BJournal%5D)">Hemostasis and thrombosis beyond biochemistry: roles of geometry, flow and diffusion.</a> Thrombosis Research. 136 (4), 699-711 (2015).</li>
<li>Podoplelova, N. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hysteresis-like+binding+of+coagulation+factors+X%2FXa+to+procoagulant+activated+platelets+and+phospholipids+results+from+multistep+association+and+membrane-dependent+multimerization%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta%22%5BJournal%5D)">Hysteresis-like binding of coagulation factors X/Xa to procoagulant activated platelets and phospholipids results from multistep association and membrane-dependent multimerization.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1858 (6), 1216-1227 (2016).</li>
<li>Panteleev, M. A., Ananyeva, N. M., Greco, N. J., Ataullakhanov, F. I., Saenko, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two+subpopulations+of+thrombin-activated+platelets+differ+in+their+binding+of+the+components+of+the+intrinsic+factor+X-activating+complex%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Thrombosis+and+Haemostasis%22%5BJournal%5D)">Two subpopulations of thrombin-activated platelets differ in their binding of the components of the intrinsic factor X-activating complex.</a> Journal of Thrombosis and Haemostasis. 3 (11), 2545-2553 (2005).</li>
<li>Kotova, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Binding+of+coagulation+factor+XIII+zymogen+to+activated+platelet+subpopulations%3A+roles+of+integrin+%CE%B1IIb%CE%B23+and+fibrinogen%5BTitle%5D)+AND+%22Thrombosis+and+Haemostasis%22%5BJournal%5D)">Binding of coagulation factor XIII zymogen to activated platelet subpopulations: roles of integrin αIIbβ3 and fibrinogen.</a> Thrombosis and Haemostasis. 119 (6), 906-915 (2019).</li>
<li>Fay, S. P., Posner, R. G., Swann, W. N., Sklar, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-time+analysis+of+the+assembly+of+ligand%2C+receptor%2C+and+G+protein+by+quantitative+fluorescence+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Real-time analysis of the assembly of ligand, receptor, and G protein by quantitative fluorescence flow cytometry.</a> Biochemistry. 30 (20), 5066-5075 (2002).</li>
<li>Nolan, J. P., Shen, B., Park, M. S., Sklar, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kinetic+analysis+of+human+flap+endonuclease-1+by+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Kinetic analysis of human flap endonuclease-1 by flow cytometry.</a> Biochemistry. 35 (36), 11668-11676 (1996).</li>
<li>Sarvazyan, N. A., Lim, W. K., Neubig, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence+analysis+of+receptor%E2%88%92G+protein+interactions+in+cell+membranes%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Fluorescence analysis of receptor−G protein interactions in cell membranes.</a> Biochemistry. 41 (42), 12858-12867 (2002).</li>
<li>Sarvazyan, N. A., Neubig, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+molecular+assemblies+by+flow+cytometry%3A+determinants+of+Gi1+and+by+binding%5BTitle%5D)+AND+%22Advances+in+Optical+Biophysics%22%5BJournal%5D)">Analysis of molecular assemblies by flow cytometry: determinants of Gi1 and by binding.</a> Advances in Optical Biophysics. 3256, 122-131 (1998).</li>
<li>De Franceschi, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ProLIF+-+Quantitative+integrin+protein-protein+interactions+and+synergistic+membrane+effects+on+proteoliposomes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Science%22%5BJournal%5D)">ProLIF - Quantitative integrin protein-protein interactions and synergistic membrane effects on proteoliposomes.</a> Journal of Cell Science. 132 (4), (2018).</li>
</ol>

Autorzy nie mają do ujawnienia żadnych konfliktów interesów.

Proponowana metoda może być dostosowana do przybliżonej charakterystyki oddziaływania białek z błonami fosfolipidowymi z różnych źródeł i składów. Opisana tutaj ilościowa cytometria przepływowa poddaje się powierzchniowemu rezonansowi plazmonowemu (SPR) w kilku parametrach. W szczególności ma niższą czułość i rozdzielczość czasową oraz wymaga znakowania fluorescencyjnego białek. Znakowanie fluorescencyjne może prowadzić do zmiany konformacji i utraty aktywności wielu białek i dlatego wymaga starannej kontroli. Jednak ta ...

Biomembrany oddzielają wewnętrzną zawartość komórek zwierzęcych od przestrzeni pozakomórkowej. Należy pamiętać, że błony otaczają również mikropęcherzyki powstałe podczas cyklu życia komórki i organelle. Błona komórkowa składa się głównie z lipidów i białek. Białka błonowe pełnią funkcje sygnalizacyjne, strukturalne, transportowe i adhezyjne. Jednak dwuwarstwa lipidowa jest również niezbędna do wzajemnego powiązania komórki zwierzęcej z przestrzenią zewnątrzkomórkową. W pracy zaproponowano metodę badania obwodowych oddziaływań białek zewnętrznych z błoną lipidową.
Najbardziej uderzającym przykładem reakcji zachodzących na zewnętrznej warstwie błony komórki zwierzęcej jest reakcja krzepnięcia krwi. Ważną cechą krzepnięcia krwi jest to, że wszystkie główne reakcje zachodzą na błonach fosfolipidowych komórek i mikropęcherzykach powstających z tych komórek, a nie w plazmie1,2,3. Reakcje błonozależne obejmują proces rozpoczęcia krzepnięcia (na błonach komórkowych śródbłonka, śródbłonka w stanie zapalnym lub aktywowanych komórkach odpornościowych, z udziałem czynnika tkankowego), wszystkie reakcje głównej kaskadowej aktywacji czynników IX, X, protrombiny; aktywacja czynnika XI przez trombinę (na błonach aktywowanych płytek krwi, erytrocytów, lipoprotein i mikropęcherzyków); reakcje szlaku białka C; inaktywacja enzymów krzepnięcia (na błonach komórek śródbłonka z udziałem kofaktorów trombomodulinowych, receptora białka C śródbłonka, siarczanu heparanu); oraz reakcje szlaku kontaktowego (na błonach płytek krwi i niektórych mikropęcherzykach z udziałem nieznanych kofaktorów). W związku z tym niemożliwe jest zbadanie krzepnięcia krwi bez zbadania interakcji różnych białek osocza z błoną komórek krwi.
Ten artykuł opisuje metodę opartą na cytometrii przepływowej do charakteryzowania interakcji białek z błonami lipidowymi komórek lub mikropęcherzyków. Podejście to zostało początkowo zaproponowane do zbadania interakcji osocza krwi z płytkami krwi i sztucznymi pęcherzykami fosfolipidowymi. Co więcej, większość badanych białek oddziałuje bezpośrednio z ujemnie naładowanymi fosfolipidami błonowymi, szczególnie z fosfatydyloseryną4,5. Dodatkowo istnieją białka, w których interakcji z błoną pośredniczą specjalne receptory6.
Ważną umiejętnością cytometrii przepływowej jest rozróżnianie wolnych i związanych ligandów bez dodatkowego rozdzielania. Ta cecha cytometrii umożliwia badanie wiązania równowagi ligandów w punkcie końcowym i pomaga w wykonywaniu ciągłych pomiarów kinetycznych. Technika ta jest niewyrafinowana i nie wymaga skomplikowanego przygotowania próbki. Cytometria przepływowa jest aktywnie wykorzystywana do ilościowego badania dynamiki interakcji między fluorescencyjnymi peptydami, receptorami i białkami G w nienaruszonych i przepuszczalnych dla detergentów neutrofilach7. Podejście to ma również zastosowanie do badania interakcji białko-DNA i kinetyki aktywności endonukleazy w czasie rzeczywistym8. Z biegiem czasu metoda ta została wykorzystana do ilościowego badania interakcji białko-białko o wysokim powinowactwie z oczyszczonymi pęcherzykami lipidowymi9 lub, bardziej ogólnie, z białkami błonowymi ulegającymi ekspresji w wysoce wydajnym systemie ekspresji komórek Sf910. Opisano również metody ilościowe charakteryzujące interakcje białko-liposom za pomocą cytometrii przepływowej dla białek transbłonowych11.
Ta technika wykorzystuje samodzielnie wykonane koraliki kalibracyjne, aby uniknąć używania dostępnych na rynku koralików7. Kulki kalibracyjne używane wcześniej7 były przeznaczone do pracy z fluoresceiną, co znacznie ograniczało asortyment dostępnych ligandów fluorescencyjnych na białkach. Ponadto artykuł ten oferuje nowy sposób pozyskiwania i analizowania danych kinetycznych w celu uzyskania rozsądnej rozdzielczości czasowej. Chociaż metoda ta jest opisana dla sztucznych pęcherzyków fosfolipidowych, nie ma oczywistych ograniczeń co do jej zdolności adaptacyjnych do komórek, naturalnych pęcherzyków lub sztucznych pęcherzyków fosfolipidowych o innym składzie lipidowym. Opisana tu metoda pozwala na oszacowanie parametrów oddziaływania (kon, koff) i równowagi (Kd) oraz ułatwia ilościową charakterystykę liczby miejsc wiązania białek na błonie. Należy zauważyć, że ta technika zapewnia przybliżone oszacowanie liczby miejsc wiązania. Zaletami metody są jej względna prostota, dostępność i zdolność adaptacji do komórek natywnych oraz naturalnych i sztucznych mikropęcherzyków.

<table><tbody><tr><td>A23187</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C7522-10MG</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 647 NHS Ester (ester sukcynimidylu)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A37573</td><td>barwnik fluorescencyjny</td></tr><tr><td>Apyraza z ziemniaków</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A2230</td><td></td></tr><tr><td>BD FACSCantoII</td><td>BD Bioscience</td><td></td><td></td></tr><tr><td>albumina surowicy bydlęcej</td><td>VWR Nauki przyrodnicze AMRESCO</td><td>Am-O332-0.1</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek wapnia, bezwodny, w proszku, &ge; 97%</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C4901-100G</td><td></td></tr><tr><td>Spektrometr fluorescencyjny Cary Eclipse</td><td>Agilent</td><td></td><td></td></tr><tr><td>D-(+)-Glucose</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G7528-1KG</td><td></td></tr><tr><td>DiIC16(3) (1,1'-dihexadecyl-3,3,3',3'-Tetramethylindocarbocyanonine)</td> <td>Thermo Fisher Scientific</td><td>D384</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D8418</td><td></td></tr><tr><td>Sól disodowa EDTA</td><td>VWR Life Science AMRESCO</td><td>Am-O105B-0.1</td><td></td></tr><tr><td>FACSDiva</td><td>BD Bioscience</td><td></td><td>oprogramowanie do pozyskiwania danych cytometrycznych</td></tr><tr>Oprogramowanie <td>cytometru</td><td>FlowJo</td><td>Tree Star</td><td></td> do analizy danych</tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma Aldrich</td><td>H4034-500G</td><td></td></tr><tr><td>Badania enzymów ludzkiego czynnika X</td><td></td><td>HFX 1010</td><td></td></tr><tr><td>Chlorowodorek hydroksyloaminy</td><td>Panreac</td><td>141914.1209</td><td></td></tr><tr><td>L-&alfa;-fosfatydylocholina (mózg, świnia)</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>840053P</td><td></td></tr><tr><td>L-&alfa;-fosfatydyloseryna (mózg, świnia) (sól sodowa)</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>840032P</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek magnezu</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M8266-100G</td><td></td></tr><tr><td>Mini-ekstruder</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>610020-1EA</td><td></td></tr><tr><td>OriginPro 8 SR4 v8.0951</td><td>OriginLab Corporation</td><td></td><td>Oprogramowanie statystyczne</td></tr><tr><td>Tabletki soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS), klasa biotechnologiczna</td><td>VWR Nauki przyrodnicze AMRESCO</td><td>97062-732</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek potasu</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P9541-500G</td><td></td></tr><tr><td>Prostaglandyna E1</td><td>Cayman Chemical</td><td>13010</td><td></td></tr><tr><td>Sephadex G25</td><td>GE Healthcare</td><td>GE17-0033-01</td><td>żelowe medium filtracyjne do oczyszczania białek</td></tr><tr><td>Sepharose CL-2B</td><td>Sigma Aldrich</td><td>CL2B300-500ML</td><td>żelowe medium filtracyjne do oczyszczania płytek</td></tr><tr><td>krwi Wodorowęglan sodu</td><td>Corning</td><td>61-065-RO</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek sodu</td><td>Sigma</td><td>Aldrich S3014-500G</td><td></td></tr><tr><td>Fosforan sodu jednozasadowy</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S3139-250G</td><td></td></tr><tr><td>Kolumny wirowe z membraną 0,2 i mikro; m</td><td>Sartorius</td><td>VS0171</td><td></td></tr><tr><td>Cytrynian trisodowy dwuwodny</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S1804-1KG</td><td></td></tr></tbody></table>

analiza interakcji białek znakowanych fluorescencyjnie ze sztucznymi mikropęcherzykami fosfolipidowymi przy użyciu ilościowej cytometrii przepływowej

Analyzing the Interaction of Fluorescent-Labeled Proteins with Artificial Phospholipid Microvesicles using Quantitative Flow Cytometry

W ludzkim ciele większość głównych reakcji fizjologicznych związanych z odpowiedzią immunologiczną i krzepnięciem krwi zachodzi na błonach komórkowych. Ważnym pierwszym krokiem w każdej reakcji zależnej od błony jest wiązanie białka na błonie fosfolipidowej. Opracowano podejście do badania interakcji białek z błonami lipidowymi przy użyciu białek znakowanych fluorescencyjnie i cytometrii przepływowej. Metoda ta pozwala na badanie oddziaływań białko-błona z wykorzystaniem żywych komórek i naturalnych lub sztucznych pęcherzyków fosfolipidowych. Zaletą tej metody jest prostota i dostępność odczynników oraz sprzętu. W tej metodzie białka są znakowane za pomocą barwników fluorescencyjnych. Można jednak stosować zarówno samodzielnie wyprodukowane, jak i dostępne na rynku, znakowane fluorescencyjnie białka. Po koniugacji z barwnikiem fluorescencyjnym białka inkubuje się ze źródłem błony fosfolipidowej (mikropęcherzykami lub komórkami), a próbki analizuje się za pomocą cytometrii przepływowej. Uzyskane dane można wykorzystać do obliczenia stałych kinetycznych i równowagi Kd. Ponadto możliwe jest oszacowanie przybliżonej liczby miejsc wiązania białek na błonie fosfolipidowej za pomocą specjalnych kulek kalibracyjnych.

Opisana tutaj metoda cytometrii przepływowej jest stosowana do charakteryzacji wiązania białek krzepnięcia osocza do aktywowanych płytek krwi. Dodatkowo, jako system modelowy zastosowano pęcherzyki fosfolipidowe PS:PC 20:80. Niniejsza praca skupia się głównie na sztucznych pęcherzykach fosfolipidowych jako przykładzie. Parametry cytometru, w szczególności napięcie fotopowielacza (PMT) oraz kompensacja, muszą być dobrane do każdego konkretnego urządzenia, badanego obiektu (komórki, sztuczne lub naturalne mikropęcherzyki) ...

Tutaj opisujemy zestaw metod charakteryzujących interakcje białek z błonami komórkowymi lub mikropęcherzykami.

Analiza interakcji białek znakowanych fluorescencyjnie ze sztucznymi mikropęcherzykami fosfolipidowymi przy użyciu ilościowej cytometrii przepływowej

In the human body, most of the major physiologic reactions involved in the immune response and blood coagulation proceed on the membranes of cells. An ...

Korzystając z tej metody cytometrii przepływowej, naukowcy mogą obliczyć zwyczaje kinetyczne i równowagowe interakcji błonowej oraz oszacować liczbę białek wprowadzanych przez miejsca na błonie PPH. Zaletą tej metody jest prostota i dostępność odczynników oraz sprzętu. Ta metoda służy wyłącznie do badań podstawowych.Protokół został opracowany w celu badania interakcji lipidów białkowych w obliczeniach krwi i może być stosowany w innych obszarach do charakteryzowania interakcji białek z różnymi błonami lipidowymi. Metoda może być stosowana do ilościowej oceny dynamiki wiązania ligandów w różnych komórkach i typach ligandów. Rozpocznij eksperymenty z wiązaniem kinetycznym od rozcieńczenia pęcherzyków fosfolipidowych w buforze Tyrode'a do stężenia jednego mikromola i całkowitej objętości 250 mikrolitrów.Następnie wymieszać znakowany fluorescencyjnie czynnik krzepnięcia X lub FX FD i stężenie 500 nanomolowych z pęcherzykami fosfolipidowymi w stosunku jeden do jednego, aby uzyskać całkowitą objętość 500 mikrolitrów. Natychmiast wstrzyknąć 500 mikrolitrów zmieszanej zawiesiny do cytometru przepływowego. przy natężeniu przepływu o długości fali wzbudzenia 488 nanometrów i filtrze emisyjnym o długości 585 nanometrów; o szerokości 42 dla kanału FL dwa.Następnie zmierz średnią fluorescencję w kanale FL czwartym ze wzbudzeniem na 633 nanometrach i filtrze emisyjnym na 660 nanometrach o szerokości 20. Gdy nasycenie wiązania zostanie szybko osiągnięte, rozcieńczyć próbkę 20-krotnie buforem Tyrode'a i monitorować dysocjację aż do osiągnięcia podstawowej fluorescencji lub plateau. W celu przeprowadzenia eksperymentów z wiązaniem równowagi należy inkubować pięć mikromolowych sztucznych pęcherzyków fosfolipidowych o różnych stężeniach FX FD od zera do 1000 nanomolowców w buforze Tyrode'a przez 20 minut.Po inkubacji rozcieńczyć każdą próbkę 20-krotnie do końcowej objętości 200 mikrolitrów za pomocą buforu Tyrode, a następnie przeanalizować rozcieńczoną próbkę za pomocą cytometrii przepływowej w ciągu 30 sekund. Aby przeanalizować dane, wyeksportuj eksperymenty w formacie FSC z oprogramowania do akwizycji danych cytometrycznych do oprogramowania cytometrycznego w celu analizy danych. Wybierając plik, a następnie klikając zakładki eksport i Pliki FSC.Po zakończeniu otwórz pliki FCS w oprogramowaniu cytometru, wybierając pliki na komputerze i przeciągając je do obszaru roboczego programu. W celu bramkowania mikropęcherzyków zidentyfikuj obszar mikropęcherzyków za pomocą fluorescencji barwnika lipofilowego, DIC 16 trzy. Następnie użyj przycisku wykresu w arkuszu, aby utworzyć wykres punktowy SSC z FL dwa D I C 16 we współrzędnych logarytmicznych.Następnie wybierz prostokątny przycisk bramy, aby narysować region bramkowania. Aby przeanalizować eksperymenty kinetyczne, utwórz wykres punktowy, używając współrzędnych fluorescencji w czasie dla obszaru pęcherzyków. Następnie wyeksportuj dane dotyczące zmiany fluorescencji w czasie w formacie CSV; przechodząc do wyboru próbki i klikając prawym przyciskiem myszy zakładkę eksportu, a następnie wybierając FL cztery razy w parametrach, wybierz katalog do zapisania przed kliknięciem Wybierz format CSV i naciśnięciem zakładki Eksportuj.Po przeniesieniu otwórz plik CSV w oprogramowaniu statystycznym, aby obliczyć prostą fluorescencję i czas średniej ruchomej dla każdych 1000 zdarzeń, przybliżyć wykres zależności pojedynczej fluorescencji średniej ruchomej od czasu przy założeniu zależności wykładniczej i użyć tej wartości do obliczenia stałej asocjacji kinetycznej za pomocą równania. Następnie oblicz stałą dysocjacji kinetycznej, korzystając z równania opisanego wcześniej. Aby przeanalizować datę testu wiązania równowagowego, należy określić średnią fluorescencję FX FD w obszarze pęcherzyków dla każdego wybranego stężenia FX FD, a następnie przybliżyć zależność fluorescencji czynnika związanego od stężenia dodanego czynnika przy założeniu wiązania w jednym miejscu.Obliczyć średnie parametry wiązania, używając równania z co najmniej trzech niezależnych powtórzeń. Przystąp do przygotowania skalibrowanych kulek przez inkubację przefiltrowanych w żelu płytek krwi z wapniem IANA 4A dwadzieścia trzy, sto osiemdziesiąt siedem w obecności 2,5 milimolowego chlorku wapnia przez 10 minut w temperaturze pokojowej. Czy aktywowane płytki krwi dodaj różne stężenia FX FD i inkubuj płytki krwi z formaldehydem o dwóch procentach objętościowych.Po godzinie zatrzymaj reakcję, inkubując płytki krwi z trzema glicyną molową i 5% BSA przez 30 minut w temperaturze pokojowej. Następnie oczyść mieszaninę z nieprzereagowanego barwnika przez odwirowanie w temperaturze 400 razy G przez pięć minut. Usuń supernate przed ponownym wymieszaniem osadu w buforze Tyrode'a zawierającym 0,5% BSA.Następnie zmierz poziom fluorescencji kulek kalibracyjnych w każdej próbce za pomocą spektrofluorometru, a następnie za pomocą cytometru przepływowego. Określ liczbę koralików w każdej próbce za pomocą licznika komórek. Przeliczyć intensywność fluorescencji każdej odpowiedniej próbki kulki na stężenie rozpuszczalnego barwnika fluorescencyjnego za pomocą spektrofluorometru i ponownie obliczyć stężenie barwnika fluorescencyjnego dla liczby cząsteczek spektrofluorometru.Utwórz wykres zależności średniej fluorescencji kulek w cytometrze przepływowym od liczby cząsteczek fluroforu dla każdej próbki. Następnie przybliż zależność według proporcjonalności linii, korzystając z dopasowania analizy i dopasuj zakładki liniowe w kolejności. Z przybliżenia w równaniu oblicz współczynnik konwersji średniej fluorescencji na miejsca wiązania.Później oblicz pozorną liczbę miejsc wiązania na interesujący nas pęcherzyk. Reprezentatywna analiza wykazała bramkowanie sztucznych pęcherzyków lipidowych fosforu o wielkości jednego mikrometra z wbudowanym lipofilowym barwnikiem fluorescencyjnym, barwnikiem I C 16, bramkę ustawiono na podstawie próbki zawierającej tej samej wielkości sztuczne pęcherzyki lipidowe bez barwnika fluorescencyjnego. Kinetyka wiązania białka z pęcherzykami została przeanalizowana w pierwszym etapie poprzez ciągłe pobieranie próbki.Uzyskane dane analizowano za pomocą cytometrii przepływowej. Pomiary cytometrii przepływowej należy rozpocząć jak najszybciej po wymieszaniu roztworów i rozcieńczeniu buforem Tyrode. Proponowana metoda może być uzupełniona o rezonans plazmy powierzchniowej do badania oddziaływań błonowych wprowadzanych, który jest bardzo czuły z dobrą rozdzielczością czasową i nie wymaga dostarczania Główną zaletą tej metody jest jej dostępność i prostota.

analyzing-interaction-fluorescent-labeled-proteins-with-artificial

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemia

Ten film omawia test wycieku fluorescencji w celu zbadania interakcji peptydów penetrujących komórki z błonami komórkowymi za pomocą mimiki błony komórkowej - dużych pęcherzyków jednopłytkowych lub LUV, otoczonych barwnikiem fluorescencyjnym i gaszącym.

Test nieszczelności fluorescencji w celu zbadania interakcji peptydu przenikającego przez komórkę z błoną

W tym filmie pokazujemy interakcję między białkami a sztucznymi pęcherzykami fosfolipidowymi za pomocą ilościowej cytometrii przepływowej. Wiązanie białek znakowanych fluorescencyjnie z pęcherzykami fosfolipidowymi znakowanymi fluorescencyjnie zwiększa średnią intensywność fluorescencji, a wzrost ten jest wykrywany przez cytometr przepływowy.

Ilościowa cytometria przepływowa do badania znakowanych interakcji pęcherzyków białko-fosfolipid

W tym filmie demonstrujemy interakcje białko-fosfoinozytyd we wzorcu mikroprzepływowym za pomocą testu modulacji pH, używając wrażliwego na pH barwnika fluorescencyjnego oznaczonego lipidem fosfatydyloetanoloaminy w dwuwarstwie lipidowej, zwanej platformą mikroprzepływową. Modulacje pH po związaniu białka z fosfolipidem powodują wygaszanie fluorescencji.

Test modulacji pH na podpartych dwuwarstwach lipidowych w celu wykrycia interakcji białko-fosfoinozytyd

Analiza cytometryczna cytometrii dwucząsteczkowej komplementacji fluorescencji dostarcza wysokoprzepustową metodę ilościową do badania interakcji białko-białko. Metodologia ta może być stosowana do mapowania miejsc wiązania białek oraz do badań przesiewowych czynników regulujących interakcję białko-białko.

Analiza cytometryczna cytometrii dwucząsteczkowej komplementacji fluorescencji: wysokoprzepustowa metoda ilościowa do badania interakcji białko-białko

Prezentowany protokół opisuje analizę transportu za pośrednictwem białka błonowego na poziomie pojedynczego transportera przy użyciu dwuwarstw lipidowych bez rozpuszczalników rozciągających się na pore. Osiągnięto to poprzez stworzenie masowo produkowanych chipów z matrycami nanoporowymi, w połączeniu z wysoce równoległym pozyskiwaniem i analizą danych, co umożliwi w przyszłości tworzenie badań przesiewowych efektorów białek błonowych.

Procesy transportu błonowego analizowane przez wysoce równoległy system chipów nanoporowych w rozdzielczości pojedynczego białka

Tutaj prezentujemy protokół do wykrywania pojedynczych, zapośredniczonych przez SNARE zdarzeń fuzji między liposomami a wspieranymi dwuwarstwami w kanałach mikroprzepływowych za pomocą spolaryzowanego TIRFM, z czułością pojedynczej cząsteczki i rozdzielczością czasową ~15 ms. Uwalnianie lipidów i rozpuszczalnego ładunku może być wykrywane jednocześnie. Mierzy się wielkość liposomów, dyfuzyjność lipidów i właściwości porów fuzyjnych.

Fuzja pojedynczych proteoliposomów za pośrednictwem SNARE z dwuwarstwami na uwięzi w mikroprzepływowej komórce przepływowej monitorowanej za pomocą spolaryzowanej mikroskopii TIRF

Dziedziczne zaburzenia rytmu serca są często spowodowane mutacjami, które zmieniają powierzchniowe dostarczanie jednego lub więcej kanałów jonowych. Tutaj dostosowujemy testy cytometrii przepływowej, aby zapewnić ilościowe określenie względnej całkowitej i powierzchniowej ekspresji białek w rekombinowanych kanałach jonowych ulegających ekspresji w komórkach tsA-201.

Wyznaczanie względnej powierzchni komórki i całkowitej ekspresji rekombinowanych kanałów jonowych za pomocą cytometrii przepływowej

Znakowanie domeny zewnątrzkomórkowej białka błonowego za pomocą wrażliwego na pH fluoroforu, superekliptycznej pHluoryny (SEP), pozwala na określenie subkomórkowej lokalizacji, ekspresji i transportu. Obrazowanie białek znakowanych SEP za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej z całkowitym wewnętrznym odbiciem (TIRFM) umożliwia ilościowe określenie poziomów białek w obwodowej ER i błonie plazmatycznej.

Wykorzystanie receptorów znakowanych pHluoryną do monitorowania lokalizacji subkomórkowej i transportu

Protokół opisuje powtarzalną metodę przeznaczoną do użycia z supernatantami do hodowli komórkowych do wykrywania epitopów powierzchniowych na małych pęcherzykach zewnątrzkomórkowych (EV). Wykorzystuje specyficzną immunoprecypitację EV za pomocą kulek sprzężonych z przeciwciałami, które rozpoznają antygen powierzchniowy CD9, CD63 i CD81. Metoda jest zoptymalizowana pod kątem analizy za pomocą cytometrii przepływowej.

Analiza cytometryczna przepływowa pęcherzyków zewnątrzkomórkowych z pożywek kondycjonowanych komórkowo

Ten protokół opisuje wytwarzanie liposomów oraz sposób, w jaki można je unieruchomić na powierzchni i zobrazować indywidualnie w masowy równoległy sposób za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej. Pozwala to na ilościowe określenie wielkości i niejednorodności składu między pojedynczymi liposomami populacji.

Ilościowy test pojedynczego liposomu oparty na mikroskopii fluorescencyjnej do wykrywania niejednorodności składu między poszczególnymi liposomami

Tutaj opisujemy protokoły wykorzystujące fluorescencyjne czujniki lipidowe i liposomy do określenia, czy białko ekstrahuje i transportuje fosfatydyloserynę czy fosfatydyloinozytol 4-fosforan in vitro.

Oparte na fluorescencji pomiary wymiany fosfatydyloseryny/4-fosforanu fosfatydyloinozytolu między błonami

Poznaj ilościową cytometrię przepływową do badania interakcji białek z fosfolipidowymi mikropęcherzykami. Ta metoda umożliwia obliczenie stałych kinetycznych i równowagowych oraz szacowanie liczby miejsc wiązania białek.

Analiza interakcji białek znakowanych fluorescencyjnie ze sztucznymi mikropęcherzykami fosfolipidowymi przy użyciu ilościowej cytometrii przepływowej (Wideo) | JoVE Journal

Analiza interakcji białek znakowanych fluorescencyjnie ze sztucznymi mikropęcherzykami fosfolipidowymi przy użyciu ilościowej cytometrii przepływowej

Przeglądaj więcej filmów