Analiza interakcji białek znakowanych fluorescencyjnie ze sztucznymi mikropęcherzykami fosfolipidowymi przy użyciu ilościowej cytometrii przepływowej
6 kwietnia 2022
Tutaj opisujemy zestaw metod charakteryzujących interakcje białek z błonami komórkowymi lub mikropęcherzykami.
Korzystając z tej metody cytometrii przepływowej, naukowcy mogą obliczyć zwyczaje kinetyczne i równowagowe interakcji błonowej oraz oszacować liczbę białek wprowadzanych przez miejsca na błonie PPH. Zaletą tej metody jest prostota i dostępność odczynników oraz sprzętu. Ta metoda służy wyłącznie do badań podstawowych.
Protokół został opracowany w celu badania interakcji lipidów białkowych w obliczeniach krwi i może być stosowany w innych obszarach do charakteryzowania interakcji białek z różnymi błonami lipidowymi. Metoda może być stosowana do ilościowej oceny dynamiki wiązania ligandów w różnych komórkach i typach ligandów. Rozpocznij eksperymenty z wiązaniem kinetycznym od rozcieńczenia pęcherzyków fosfolipidowych w buforze Tyrode'a do stężenia jednego mikromola i całkowitej objętości 250 mikrolitrów.
Następnie wymieszać znakowany fluorescencyjnie czynnik krzepnięcia X lub FX FD i stężenie 500 nanomolowych z pęcherzykami fosfolipidowymi w stosunku jeden do jednego, aby uzyskać całkowitą objętość 500 mikrolitrów. Natychmiast wstrzyknąć 500 mikrolitrów zmieszanej zawiesiny do cytometru przepływowego. przy natężeniu przepływu o długości fali wzbudzenia 488 nanometrów i filtrze emisyjnym o długości 585 nanometrów; o szerokości 42 dla kanału FL dwa.
Następnie zmierz średnią fluorescencję w kanale FL czwartym ze wzbudzeniem na 633 nanometrach i filtrze emisyjnym na 660 nanometrach o szerokości 20. Gdy nasycenie wiązania zostanie szybko osiągnięte, rozcieńczyć próbkę 20-krotnie buforem Tyrode'a i monitorować dysocjację aż do osiągnięcia podstawowej fluorescencji lub plateau. W celu przeprowadzenia eksperymentów z wiązaniem równowagi należy inkubować pięć mikromolowych sztucznych pęcherzyków fosfolipidowych o różnych stężeniach FX FD od zera do 1000 nanomolowców w buforze Tyrode'a przez 20 minut.
Po inkubacji rozcieńczyć każdą próbkę 20-krotnie do końcowej objętości 200 mikrolitrów za pomocą buforu Tyrode, a następnie przeanalizować rozcieńczoną próbkę za pomocą cytometrii przepływowej w ciągu 30 sekund. Aby przeanalizować dane, wyeksportuj eksperymenty w formacie FSC z oprogramowania do akwizycji danych cytometrycznych do oprogramowania cytometrycznego w celu analizy danych. Wybierając plik, a następnie klikając zakładki eksport i Pliki FSC.
Po zakończeniu otwórz pliki FCS w oprogramowaniu cytometru, wybierając pliki na komputerze i przeciągając je do obszaru roboczego programu. W celu bramkowania mikropęcherzyków zidentyfikuj obszar mikropęcherzyków za pomocą fluorescencji barwnika lipofilowego, DIC 16 trzy. Następnie użyj przycisku wykresu w arkuszu, aby utworzyć wykres punktowy SSC z FL dwa D I C 16 we współrzędnych logarytmicznych.
Następnie wybierz prostokątny przycisk bramy, aby narysować region bramkowania. Aby przeanalizować eksperymenty kinetyczne, utwórz wykres punktowy, używając współrzędnych fluorescencji w czasie dla obszaru pęcherzyków. Następnie wyeksportuj dane dotyczące zmiany fluorescencji w czasie w formacie CSV; przechodząc do wyboru próbki i klikając prawym przyciskiem myszy zakładkę eksportu, a następnie wybierając FL cztery razy w parametrach, wybierz katalog do zapisania przed kliknięciem Wybierz format CSV i naciśnięciem zakładki Eksportuj.
Po przeniesieniu otwórz plik CSV w oprogramowaniu statystycznym, aby obliczyć prostą fluorescencję i czas średniej ruchomej dla każdych 1000 zdarzeń, przybliżyć wykres zależności pojedynczej fluorescencji średniej ruchomej od czasu przy założeniu zależności wykładniczej i użyć tej wartości do obliczenia stałej asocjacji kinetycznej za pomocą równania. Następnie oblicz stałą dysocjacji kinetycznej, korzystając z równania opisanego wcześniej. Aby przeanalizować datę testu wiązania równowagowego, należy określić średnią fluorescencję FX FD w obszarze pęcherzyków dla każdego wybranego stężenia FX FD, a następnie przybliżyć zależność fluorescencji czynnika związanego od stężenia dodanego czynnika przy założeniu wiązania w jednym miejscu.
Obliczyć średnie parametry wiązania, używając równania z co najmniej trzech niezależnych powtórzeń. Przystąp do przygotowania skalibrowanych kulek przez inkubację przefiltrowanych w żelu płytek krwi z wapniem IANA 4A dwadzieścia trzy, sto osiemdziesiąt siedem w obecności 2,5 milimolowego chlorku wapnia przez 10 minut w temperaturze pokojowej. Czy aktywowane płytki krwi dodaj różne stężenia FX FD i inkubuj płytki krwi z formaldehydem o dwóch procentach objętościowych.
Po godzinie zatrzymaj reakcję, inkubując płytki krwi z trzema glicyną molową i 5% BSA przez 30 minut w temperaturze pokojowej. Następnie oczyść mieszaninę z nieprzereagowanego barwnika przez odwirowanie w temperaturze 400 razy G przez pięć minut. Usuń supernate przed ponownym wymieszaniem osadu w buforze Tyrode'a zawierającym 0,5% BSA.
Następnie zmierz poziom fluorescencji kulek kalibracyjnych w każdej próbce za pomocą spektrofluorometru, a następnie za pomocą cytometru przepływowego. Określ liczbę koralików w każdej próbce za pomocą licznika komórek. Przeliczyć intensywność fluorescencji każdej odpowiedniej próbki kulki na stężenie rozpuszczalnego barwnika fluorescencyjnego za pomocą spektrofluorometru i ponownie obliczyć stężenie barwnika fluorescencyjnego dla liczby cząsteczek spektrofluorometru.
Utwórz wykres zależności średniej fluorescencji kulek w cytometrze przepływowym od liczby cząsteczek fluroforu dla każdej próbki. Następnie przybliż zależność według proporcjonalności linii, korzystając z dopasowania analizy i dopasuj zakładki liniowe w kolejności. Z przybliżenia w równaniu oblicz współczynnik konwersji średniej fluorescencji na miejsca wiązania.
Później oblicz pozorną liczbę miejsc wiązania na interesujący nas pęcherzyk. Reprezentatywna analiza wykazała bramkowanie sztucznych pęcherzyków lipidowych fosforu o wielkości jednego mikrometra z wbudowanym lipofilowym barwnikiem fluorescencyjnym, barwnikiem I C 16, bramkę ustawiono na podstawie próbki zawierającej tej samej wielkości sztuczne pęcherzyki lipidowe bez barwnika fluorescencyjnego. Kinetyka wiązania białka z pęcherzykami została przeanalizowana w pierwszym etapie poprzez ciągłe pobieranie próbki.
Uzyskane dane analizowano za pomocą cytometrii przepływowej. Pomiary cytometrii przepływowej należy rozpocząć jak najszybciej po wymieszaniu roztworów i rozcieńczeniu buforem Tyrode. Proponowana metoda może być uzupełniona o rezonans plazmy powierzchniowej do badania oddziaływań błonowych wprowadzanych, który jest bardzo czuły z dobrą rozdzielczością czasową i nie wymaga dostarczania Główną zaletą tej metody jest jej dostępność i prostota.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejszy artykuł opisuje metody charakteryzacji oddziaływań białek z błonami komórkowymi i mikropęcherzykami. Głównym przedmiotem opracowania jest technika cytometrii przepływowej, która umożliwia badaczom ocenę dynamiki wiązania.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Biochemia
- Biologia komórki
- Interakcje białko-lipid
Wprowadzenie
- Zrozumienie oddziaływań białek z błonami ma kluczowe znaczenie dla wielu procesów biologicznych.
- Cytometria przepływowa zapewnia ilościowe podejście do badania tych oddziaływań.
- Metoda ta znajduje zastosowanie w badaniach podstawowych w wielu dziedzinach.
- Została ona opracowana specjalnie do badania oddziaływań białko-lipid w krwi.
Cel badania
- Charakterystyka oddziaływań białek z błonami lipidowymi.
- Oszacowanie liczby białek oddziałujących ze specyficznymi miejscami w błonie.
- Zapewnienie prostego i dostępnego rozwiązania dla badaczy.
Zastosowane metody
- Cytometria przepływowa do ilościowego oznaczania oddziaływań białko-błona.
- Rozcieńczanie pęcherzyków fosfolipidowych w buforze Tyrode'a.
- Ocena dynamiki wiązania ligandów.
- Zastosowanie stężenia 1 µM w eksperymentach.
Główne wyniki
- Metoda ta umożliwia obliczenie stałych kinetycznych i równowagowych.
- Upraszcza ona proces badania oddziaływań białkowych.
- Badacze mogą oszacować liczbę białek przyciąganych przez miejsca błonowe.
- Podejście to jest uniwersalne dla różnych błon lipidowych.
Wnioski
- Ta metoda cytometrii przepływowej jest skuteczna w badaniu oddziaływań białko-lipidy.
- Oferuje ona prosty protokół do podstawowych zastosowań badawczych.
- Technikę tę można dostosować do różnych typów komórek i ligandów.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Ilościowa cytometria przepływowa białek znakowanych fluorescencyjnie, wiążących się z syntetycznymi fosfolipidowymi mikropęcherzykami, umożliwia precyzyjny pomiar oddziaływań białko-błona, co stanowi kluczowy etap we wczesnej fazie odkrywania leków i walidacji celu. Podejście to dostarcza danych dotyczących kinetyki i równowagi wiązania, co zwiększa pewność predykcyjną w odniesieniu do celów związanych z błonami i ułatwia podejmowanie decyzji portfelowych z uwzględnieniem ryzyka. Dostępność i powtarzalność tej metody sprawiają, że jest ona cennym narzędziem dla zespołów badawczo-rozwojowych w branży biofarmaceutycznej, koncentrujących się na ograniczaniu ryzyka mechanistycznego oraz opracowywaniu testów.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne etapy odkrywania leków i walidacja celu
- Umożliwia ilościową analizę kinetyki i powinowactwa wiązania białko-lipid.
- Wspiera ograniczanie ryzyka mechanistycznego poprzez wyjaśnienie szlaków oddziaływań z błoną.
- Dostarcza danych do funkcjonalnej walidacji celów dla białek związanych z błonami.
- Zwiększa pewność predykcyjną w zakresie angażowania celu oraz decyzji dotyczących selekcji cząsteczek.
Przesiewanie i opracowywanie testów
- Przygotowuje walidowane systemy sztucznych pęcherzyków do dalszych etapów przesiewowych.
- Zapewnia zestandaryzowane, powtarzalne i ilościowe pomiary wiązania.
- Umożliwia skalowalność oraz ponowne wykorzystanie platformy dla różnych typów ligandów i błon.
- Wspiera wiarygodną ocenę wpływu związków na oddziaływania białko-błona.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Jest spójne z systemami istotnymi w przebiegu chorób, w których oddziaływania błonowe determinują wyniki biologiczne.
- Zapewnia ciągłość procesu od etapu odkrycia po walidację przedkliniczną czynników celujących w błony.
- Umożliwia postęp z uwzględnieniem analizy ryzyka poprzez ilościowe określanie stopnia zajęcia miejsc wiązania oraz kinetyki.
- Wspiera rozwój biomarkerów translacyjnych dla procesów związanych z błonami.
Integracja potoku i przepływu pracy
Metoda ta integruje się z kontinuum procesu odkrywania leków, od wczesnego testowania hipotez, przez identyfikację związków wiodących, aż po walidację przedkliniczną, w szczególności w przypadku celów związanych z błonami.
- Biologia odkrywcza: Ilościowe określanie kinetyki wiązania białek z błoną oraz stopnia zajętości miejsc w celu wyjaśnienia mechanizmów biologicznych.
- Screening: Zapewnienie gotowych do analizy, powtarzalnych systemów pęcherzykowych z wynikami ilościowymi do oceny związków.
- Analityka: Wyznaczanie stałych kinetycznych i równowagowych, umożliwiające bezpośrednie porównanie warunków wiązania i ligandów.
- Badania translacyjne: Wspieranie ciągłości przedklinicznej poprzez modelowanie interakcji błonowych istotnych dla przebiegu chorób.
- Zastosowanie w przedsiębiorstwie: Oferowanie szeroko stosowalnego, zestandaryzowanego przepływu pracy dla badań nad interakcjami błonowymi w ramach różnych programów.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorczy
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność prognostyczną i redukuje niejednoznaczność mechanistyczną w odkrywaniu celów błonowych.
- Wartość operacyjna: Zapewnia ustandaryzowane, powtarzalne i skalowalne testy ilościowe.
- Wartość strategiczna: Poprawia proces podejmowania decyzji go/no-go oraz efektywność kapitałową poprzez dostarczenie wiarygodnych danych o wiązaniu na wczesnym etapie.
- Wpływ na portfolio: Umożliwia priorytetyzację skorygowaną o ryzyko oraz rozwój celów związanych z błonami.
Uwagi dotyczące wdrożenia
- Wymagana jest wiedza z zakresu cytometrii przepływowej i ilościowej analizy danych.
- Wymagany jest dostęp do skalibrowanych cytometrów przepływowych oraz odczynników do znakowania fluorescencyjnego.
- Wymagana jest standaryzacja międzyzespołowa w zakresie bramkowania, kalibracji i interpretacji danych.
- Metoda jest dostosowywalna do różnych systemów błon sztucznych i naturalnych przy zastosowaniu odpowiednich kontroli.
- Ograniczona do zastosowań w badaniach podstawowych; nie została zwalidowana do użytku klinicznego ani regulacyjnego.
Najczęściej zadawane pytania z zakresu biofarmacji
Chapters in this video
0:04
Introduction
0:58
Kinetic Binding Experiments
2:13
Equilibrium Binding Experiments
2:45
Analysis of Flow Cytometry Data
5:13
Converting Fluorescence Intensity to the Mean Number of Binding Sites
7:05
Results: Specific Binding of Fluorescent-Labeled Coagulation Factor X or fX to Artificial Phospholipid Vesicles
7:42
Conclusion
