Analiza interakcji białek znakowanych fluorescencyjnie ze sztucznymi mikropęcherzykami fosfolipidowymi przy użyciu ilościowej cytometrii przepływowej
April 6th, 2022
Tutaj opisujemy zestaw metod charakteryzujących interakcje białek z błonami komórkowymi lub mikropęcherzykami.
Korzystając z tej metody cytometrii przepływowej, naukowcy mogą obliczyć zwyczaje kinetyczne i równowagowe interakcji błonowej oraz oszacować liczbę białek wprowadzanych przez miejsca na błonie PPH. Zaletą tej metody jest prostota i dostępność odczynników oraz sprzętu. Ta metoda służy wyłącznie do badań podstawowych.
Protokół został opracowany w celu badania interakcji lipidów białkowych w obliczeniach krwi i może być stosowany w innych obszarach do charakteryzowania interakcji białek z różnymi błonami lipidowymi. Metoda może być stosowana do ilościowej oceny dynamiki wiązania ligandów w różnych komórkach i typach ligandów. Rozpocznij eksperymenty z wiązaniem kinetycznym od rozcieńczenia pęcherzyków fosfolipidowych w buforze Tyrode'a do stężenia jednego mikromola i całkowitej objętości 250 mikrolitrów.
Następnie wymieszać znakowany fluorescencyjnie czynnik krzepnięcia X lub FX FD i stężenie 500 nanomolowych z pęcherzykami fosfolipidowymi w stosunku jeden do jednego, aby uzyskać całkowitą objętość 500 mikrolitrów. Natychmiast wstrzyknąć 500 mikrolitrów zmieszanej zawiesiny do cytometru przepływowego. przy natężeniu przepływu o długości fali wzbudzenia 488 nanometrów i filtrze emisyjnym o długości 585 nanometrów; o szerokości 42 dla kanału FL dwa.
Następnie zmierz średnią fluorescencję w kanale FL czwartym ze wzbudzeniem na 633 nanometrach i filtrze emisyjnym na 660 nanometrach o szerokości 20. Gdy nasycenie wiązania zostanie szybko osiągnięte, rozcieńczyć próbkę 20-krotnie buforem Tyrode'a i monitorować dysocjację aż do osiągnięcia podstawowej fluorescencji lub plateau. W celu przeprowadzenia eksperymentów z wiązaniem równowagi należy inkubować pięć mikromolowych sztucznych pęcherzyków fosfolipidowych o różnych stężeniach FX FD od zera do 1000 nanomolowców w buforze Tyrode'a przez 20 minut.
Po inkubacji rozcieńczyć każdą próbkę 20-krotnie do końcowej objętości 200 mikrolitrów za pomocą buforu Tyrode, a następnie przeanalizować rozcieńczoną próbkę za pomocą cytometrii przepływowej w ciągu 30 sekund. Aby przeanalizować dane, wyeksportuj eksperymenty w formacie FSC z oprogramowania do akwizycji danych cytometrycznych do oprogramowania cytometrycznego w celu analizy danych. Wybierając plik, a następnie klikając zakładki eksport i Pliki FSC.
Po zakończeniu otwórz pliki FCS w oprogramowaniu cytometru, wybierając pliki na komputerze i przeciągając je do obszaru roboczego programu. W celu bramkowania mikropęcherzyków zidentyfikuj obszar mikropęcherzyków za pomocą fluorescencji barwnika lipofilowego, DIC 16 trzy. Następnie użyj przycisku wykresu w arkuszu, aby utworzyć wykres punktowy SSC z FL dwa D I C 16 we współrzędnych logarytmicznych.
Następnie wybierz prostokątny przycisk bramy, aby narysować region bramkowania. Aby przeanalizować eksperymenty kinetyczne, utwórz wykres punktowy, używając współrzędnych fluorescencji w czasie dla obszaru pęcherzyków. Następnie wyeksportuj dane dotyczące zmiany fluorescencji w czasie w formacie CSV; przechodząc do wyboru próbki i klikając prawym przyciskiem myszy zakładkę eksportu, a następnie wybierając FL cztery razy w parametrach, wybierz katalog do zapisania przed kliknięciem Wybierz format CSV i naciśnięciem zakładki Eksportuj.
Po przeniesieniu otwórz plik CSV w oprogramowaniu statystycznym, aby obliczyć prostą fluorescencję i czas średniej ruchomej dla każdych 1000 zdarzeń, przybliżyć wykres zależności pojedynczej fluorescencji średniej ruchomej od czasu przy założeniu zależności wykładniczej i użyć tej wartości do obliczenia stałej asocjacji kinetycznej za pomocą równania. Następnie oblicz stałą dysocjacji kinetycznej, korzystając z równania opisanego wcześniej. Aby przeanalizować datę testu wiązania równowagowego, należy określić średnią fluorescencję FX FD w obszarze pęcherzyków dla każdego wybranego stężenia FX FD, a następnie przybliżyć zależność fluorescencji czynnika związanego od stężenia dodanego czynnika przy założeniu wiązania w jednym miejscu.
Obliczyć średnie parametry wiązania, używając równania z co najmniej trzech niezależnych powtórzeń. Przystąp do przygotowania skalibrowanych kulek przez inkubację przefiltrowanych w żelu płytek krwi z wapniem IANA 4A dwadzieścia trzy, sto osiemdziesiąt siedem w obecności 2,5 milimolowego chlorku wapnia przez 10 minut w temperaturze pokojowej. Czy aktywowane płytki krwi dodaj różne stężenia FX FD i inkubuj płytki krwi z formaldehydem o dwóch procentach objętościowych.
Po godzinie zatrzymaj reakcję, inkubując płytki krwi z trzema glicyną molową i 5% BSA przez 30 minut w temperaturze pokojowej. Następnie oczyść mieszaninę z nieprzereagowanego barwnika przez odwirowanie w temperaturze 400 razy G przez pięć minut. Usuń supernate przed ponownym wymieszaniem osadu w buforze Tyrode'a zawierającym 0,5% BSA.
Następnie zmierz poziom fluorescencji kulek kalibracyjnych w każdej próbce za pomocą spektrofluorometru, a następnie za pomocą cytometru przepływowego. Określ liczbę koralików w każdej próbce za pomocą licznika komórek. Przeliczyć intensywność fluorescencji każdej odpowiedniej próbki kulki na stężenie rozpuszczalnego barwnika fluorescencyjnego za pomocą spektrofluorometru i ponownie obliczyć stężenie barwnika fluorescencyjnego dla liczby cząsteczek spektrofluorometru.
Utwórz wykres zależności średniej fluorescencji kulek w cytometrze przepływowym od liczby cząsteczek fluroforu dla każdej próbki. Następnie przybliż zależność według proporcjonalności linii, korzystając z dopasowania analizy i dopasuj zakładki liniowe w kolejności. Z przybliżenia w równaniu oblicz współczynnik konwersji średniej fluorescencji na miejsca wiązania.
Później oblicz pozorną liczbę miejsc wiązania na interesujący nas pęcherzyk. Reprezentatywna analiza wykazała bramkowanie sztucznych pęcherzyków lipidowych fosforu o wielkości jednego mikrometra z wbudowanym lipofilowym barwnikiem fluorescencyjnym, barwnikiem I C 16, bramkę ustawiono na podstawie próbki zawierającej tej samej wielkości sztuczne pęcherzyki lipidowe bez barwnika fluorescencyjnego. Kinetyka wiązania białka z pęcherzykami została przeanalizowana w pierwszym etapie poprzez ciągłe pobieranie próbki.
Uzyskane dane analizowano za pomocą cytometrii przepływowej. Pomiary cytometrii przepływowej należy rozpocząć jak najszybciej po wymieszaniu roztworów i rozcieńczeniu buforem Tyrode. Proponowana metoda może być uzupełniona o rezonans plazmy powierzchniowej do badania oddziaływań błonowych wprowadzanych, który jest bardzo czuły z dobrą rozdzielczością czasową i nie wymaga dostarczania Główną zaletą tej metody jest jej dostępność i prostota.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Przegląd
Ten artykuł opisuje metody charakteryzacji interakcji białek z błonami komórkowymi i mikrowezykulami. Skupia się na technice cytometrii przepływowej, która pozwala badaczom na ocenę dynamiki wiązania.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Biochemia
- Biologia komórki
- Interakcje białko-lipidowe
Tło
- Rozumienie interakcji białek z membranami jest kluczowe dla różnych procesów biologicznych.
- Cytometria przepływowa zapewnia ilościowe podejście do badania tych interakcji.
- Metoda jest stosowana w badaniach podstawowych w wielu dziedzinach.
- Została opracowana specjalnie do badania interakcji białko-lipidowych we krwi.
Cel badania
- Charakteryzowanie interakcji białek z membranami lipidowymi.
- Oszacowanie liczby białek współdziałających z określonymi miejscami na membranach.
- Dostarczenie prostego i dostępnego metodu dla badaczy.
Zastosowane metody
- Cytometria przepływowa do ilościowego określania interakcji białko-membrana.
- Rozcieńczanie wezykuł fosfolipidowych w buforze Tyrode'a.
- Ocena dynamiki wiązania ligandu.
- Zastosowanie stężenia jednego mikromolarnego do eksperymentów.
Główne wyniki
- Metoda pozwala na obliczenie stałych kinetycznych i równowagi.
- Simplifika proces badania interakcji białek.
- Badaczom umożliwia oszacowanie liczby białek przyniesionych przez miejsca na membranach.
- Podejście jest wszechstronne dla różnych membran lipidowych.
Wnioski
- Ta metoda cytometrii przepływowej jest skuteczna w badaniu interakcji białko-lipidowych.
- Oferuje prosty protokół dla zastosowań w badaniach podstawowych.
- Technika może być dostosowana do różnych typów komórek i ligandów.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
Quantitative flow cytometry of fluorescent-labeled proteins binding to artificial phospholipid microvesicles enables precise measurement of protein-membrane interactions, a critical step in early discovery and target validation. This approach provides kinetic and equilibrium binding data, supporting predictive confidence in membrane-associated targets and facilitating risk-adjusted portfolio decisions. Its accessibility and reproducibility make it a valuable capability for biopharma R&D teams focused on mechanistic de-risking and assay development.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables quantitative interrogation of protein-lipid binding kinetics and affinities.
- Supports mechanistic de-risking by clarifying membrane interaction pathways.
- Provides functional target validation data for membrane-associated proteins.
- Facilitates predictive confidence in target engagement and triage decisions.
Screening & Assay Development
- Prepares validated artificial vesicle systems for downstream screening workflows.
- Delivers standardized, reproducible, and quantitative binding measurements.
- Enables scalability and platform reuse for diverse ligand and membrane types.
- Supports reliable evaluation of compound effects on protein-membrane interactions.
Translational & Preclinical Research
- Aligns with disease-relevant systems where membrane interactions drive biological outcomes.
- Provides continuity from discovery through preclinical validation of membrane-targeted agents.
- Enables risk-adjusted advancement by quantifying binding site occupancy and kinetics.
- Supports translational biomarker development for membrane-associated processes.
Pipeline & Workflow Integration
This method integrates into the discovery continuum from early hypothesis testing through lead identification and preclinical validation, particularly for membrane-associated targets.
- Discovery Biology: Quantifies protein-membrane binding kinetics and site occupancy to clarify biological mechanisms.
- Screening: Provides assay-ready, reproducible vesicle systems with quantitative outputs for compound evaluation.
- Analytics: Generates kinetic and equilibrium constants, enabling direct comparison of binding conditions and ligands.
- Translational Research: Supports preclinical continuity by modeling disease-relevant membrane interactions.
- Enterprise Reuse: Offers a broadly applicable, standardized workflow for membrane interaction studies across programs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in membrane-targeted discovery.
- Operational Value: Delivers standardized, reproducible, and scalable quantitative assays.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions and capital efficiency by providing robust binding data early.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization and advancement of membrane-associated targets.
Implementation Considerations
- Requires expertise in flow cytometry and quantitative data analysis.
- Needs access to calibrated flow cytometers and fluorescent labeling reagents.
- Demands cross-team standardization for gating, calibration, and data interpretation.
- Adaptable to various artificial and natural membrane systems with appropriate controls.
- Limited to basic research applications; not validated for clinical or regulatory use.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:04
Introduction
0:58
Kinetic Binding Experiments
2:13
Equilibrium Binding Experiments
2:45
Analysis of Flow Cytometry Data
5:13
Converting Fluorescence Intensity to the Mean Number of Binding Sites
7:05
Results: Specific Binding of Fluorescent-Labeled Coagulation Factor X or fX to Artificial Phospholipid Vesicles
7:42
Conclusion
