Pomiar zawartości żelaza niehemowego w tkankach za pomocą testu kolorymetrycznego na bazie batofenantroliny
31 stycznia 2022
Tutaj dostępny jest protokół pomiaru zawartości żelaza niehemowego w tkankach zwierzęcych, przy użyciu prostego, dobrze znanego testu kolorymetrycznego, który można łatwo wdrożyć w większości laboratoriów.
Tutaj przedstawiliśmy protokół pomiaru zawartości niehemowej w tkankach zwierzęcych. Korzystanie z prostego, sprawdzonego testu kolorymetrycznego, który można łatwo wdrożyć w większości laboratoriów. Test kolorymetryczny na bazie batofenantroliny nie wymaga wyrafinowanych umiejętności ani bardzo drogiego sprzętu i może być dostosowany do formatu mikropłytek w celu uzyskania większej przepustowości próbki i opłacalności.
Protokół ten nadaje się do wykrywania zmian w poziomach żelaza w tkankach w różnych eksperymentalnych modelach zwierzęcych dotyczących przeciążenia żelazem lub wydajności żelaza. Zacznij od przecięcia próbki tkanki o wadze od 10 do 100 gramów za pomocą ostrza skalpela. Zważ go dokładnie na wadze analitycznej na małym kawałku parafilmu.
Użyj plastikowej pęsety, aby umieścić kawałek tkanki na płytce 24-dołkowej. Pozostaw do wyschnięcia w standardowym inkubatorze w temperaturze 65 stopni Celsjusza przez 48 godzin. Alternatywnie umieść kawałek chusteczki za pomocą pęsety w teflonowym kubku bez żelazka i wysusz go w laboratoryjnej kuchence mikrofalowej do wytrawiania.
Umieść każdy wysuszony kawałek tkanki na małym kawałku paraformy wewnątrz wagi analitycznej i dokładnie go zważ. Przenieś każdy wysuszony kawałek tkanki do 1,5 mililitrowej mikroprobówki wirówkowej. Dodaj zapaloną mieszaninę kwasów do probówki i zamknij ją.
Przygotuj ślepą próbę kwasową w ten sam sposób, z wyjątkiem tego, że tutaj pominięto tkankę. Inkubuj probówki w temperaturze 65 stopni Celsjusza przez 20 godzin, aby strawić tkankę. Po schłodzeniu do temperatury pokojowej użyj mikropipety wyposażonej w plastikowe końcówki, aby przenieść 500 mikrolitrów klarownego ekstraktu kwasowego do nowej mikroprobówki wirówkowej o pojemności 1,5 mililitra.
Przygotować reakcje chromogenowe bezpośrednio na płaskich 96-dołkowych, przezroczystych, nieobrobionych mikropłytkach polistyrenowych. Inkubowana temperatura pokojowa przez 15 minut. Zmierz absorbancję próbki w czytniku płytek o długości fali 535 nanometrów w stosunku do wody referencyjnej dejonizowanej.
Oznaczanie żelaza niehemowego za pomocą kuwety i 96-dołkowych testów kolorymetrycznych opartych na mikropłytkach przedstawiono tutaj. Pokazano korelację między poziomami żelaza niehemowego na podstawie kuwet i mikropłytek w 55 próbkach tkanek od sześciomiesięcznych czarnych samców, sześciu myszy, w tym wątroby, śledziony, serca, płuc i szpiku kostnego. Wysoka korelacja między tymi dwiema metodologiami wskazuje, że metoda oparta na mikropłytkach jest ważną alternatywą dla oryginalnej metody opartej na kuwetach.
Na koniec określono ilościowo poziomy żelaza niehemowego metodą opartą na mikropłytkach po kwaśnym trawieniu próbki pochodzącej z tych samych tkanek za pomocą mieszaniny kwasu solnego i kwasu trichlorooctowego lub samego kwasu solnego. Wysoka korelacja pokazuje, że kwas trójchlorooctowy może być emitowany z trawienia kwasowego. Reprezentatywny obraz przedstawia poziomy żelaza niehemowego w wątrobie, śledzionie, sercu i trzustce samców sześciu czarnych myszy typu dzikiego i samców myszy z nokautem hepcydyny na czarnym tle genetycznym mierzonym za pomocą testu kolorymetrycznego opartego na batofenantrolinie.
Zaburzenie hepcydyny prowadzi do hemochromatozy, podobnie jak fenotyp odkładania się żelaza, z ciężką akumulacją żelaza w wątrobie, trzustce i sercu oraz niedoborem żelaza w śledzionie. Poziomy żelaza niehemowego w wątrobie u młodocianych samic labraksa morskiego po eksperymentalnej modulacji żelaza przedstawiono tutaj. Poziom żelaza w wątrobie znacznie wzrósł u zwierząt leczonych żelazem.
Natomiast niedokrwistość spowodowała łagodne zmniejszenie zapasów żelaza w wątrobie. Reprezentatywne obrazy pokazują poziomy żelaza niehemowego u miesięcznej Drosophila mierzone za pomocą testu kolorymetrycznego opartego na batofenantrolinie. Wyniki pokazują zawartość żelaza niehemowego w każdej puli 20 much lub szacowaną zawartość żelaza w każdej muchy.
Biorąc pod uwagę średnią wagę 0,64 miligrama na muchę. Podczas wykonywania tej procedury należy pamiętać o dokładnym oczyszczeniu wszystkich zużywanych szkieł i nie dopuszczać do kontaktu metalowych materiałów laboratoryjnych z jakimkolwiek odczynnikiem lub roztworem ze względu na ryzyko zanieczyszczenia.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejszy artykuł przedstawia protokół pomiaru zawartości żelaza niehemowego w tkankach zwierzęcych z wykorzystaniem analizy kolorymetrycznej. Metoda ta jest prosta i może zostać wdrożona w większości laboratoriów.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neuronauka
- Biochemia
- Fizjologia zwierząt
Wstęp
- Żelazo niehemowe jest kluczowe dla wielu procesów biologicznych.
- Pomiar poziomu żelaza może pomóc w zrozumieniu przeciążenia żelazem oraz jego niedoboru.
- Metoda ta jest dostosowalna do różnych warunków laboratoryjnych.
- Jest ona odpowiednia dla różnych eksperymentalnych modeli zwierzęcych.
Cel badania
- Zapewnienie wiarygodnej metody oceny poziomu żelaza w tkankach.
- Ułatwienie badań nad metabolizmem żelaza w modelach zwierzęcych.
- Umożliwienie wysokoprzepustowej analizy próbek tkanek.
Zastosowane metody
- Analiza kolorymetryczna z wykorzystaniem batofenantroliny.
- Przygotowano próbki tkanek o masie od 10 do 100 gramów.
- Próbki odważono precyzyjnie za pomocą wagi analitycznej.
- Metodę można dostosować do formatu mikropłytek.
Główne wyniki
- Analiza zapewnia dokładne pomiary żelaza niehemowego.
- Jest ona skuteczna w wykrywaniu zmian poziomu żelaza w tkankach.
- Protokół jest łatwy w obsłudze i ekonomiczny.
- Dzięki adaptacji do mikropłytek możliwe jest osiągnięcie wysokiej przepustowości próbek.
Wnioski
- Protokół ten stanowi cenne narzędzie dla badaczy zajmujących się metabolizmem żelaza.
- Można go wdrożyć w różnych warunkach laboratoryjnych.
- W przyszłych badaniach metodę tę można wykorzystać w szerszym zakresie zastosowań.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Ilościowy pomiar niehemowego żelaza w tkankach ma kluczowe znaczenie dla minimalizacji ryzyka w programach wczesnego etapu odkrywania leków, skoncentrowanych na metabolizmie żelaza i związanych z nim patologiach. Kolorymetryczny test oparty na batofenantrolinie umożliwia skalowalną i powtarzalną ocenę statusu żelaza w modelach przedklinicznych, wspierając walidację celów terapeutycznych oraz badania mechanistyczne. Jego dostępność i wysoka przepustowość ułatwiają rzetelną selekcję projektów w portfolio oraz zachowanie ciągłości translacyjnej w różnych systemach eksperymentalnych.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Umożliwia precyzyjną kwantyfikację żelaza niehemowego w celu zbadania mechanizmów homeostazy żelaza.
- Wspiera funkcjonalną walidację interwencji genetycznych lub farmakologicznych w modelach zwierzęcych.
- Ułatwia analizę mechanistyczną poprzez rozróżnienie pul żelaza niehemowego od hemowego.
- Dostarcza praktycznych danych służących do ustalania priorytetów dla celów terapeutycznych zaangażowanych w przeładowanie żelazem lub jego niedobór.
Przesiewy i opracowywanie analiz
- Zapewnia standaryzowane, powtarzalne wyniki odpowiednie dla procesów opracowywania testów.
- Adaptacja do mikropłytek zwiększa wydajność kampanii przesiewowych związków lub genetycznych.
- Ilościowe odczyty absorbancji umożliwiają wiarygodne porównanie różnych warunków eksperymentalnych.
- Elastyczność testu wspiera integrację z różnorodnymi platformami przesiewowymi.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Jest zgodne z modelami przeciążenia i niedoboru żelaza istotnymi dla danej choroby w badaniach nad biomarkerami translacyjnymi.
- Zapewnia ciągłość od etapu odkrycia po walidację przedkliniczną poprzez wsparcie analiz międzygatunkowych.
- Dostarcza ilościowych punktów końcowych dla decyzji o rozwoju programów związanych z żelazem, z uwzględnieniem analizy ryzyka.
- Wspiera badania mechanistyczne w modelach modyfikowanych genetycznie lub leczonych farmakologicznie.
Integracja potoku i przepływu pracy
Ten test kolorymetryczny wpisuje się w kontinuum od wczesnego etapu odkrywania do badań przedklinicznych, umożliwiając weryfikację hipotez, walidację celów oraz badania translacyjne w zakresie metabolizmu żelaza.
- Biologia odkrywcza: Wspiera weryfikację hipotez dotyczących szlaków regulacji żelaza w modelach zwierzęcych.
- Screening: Dostarcza gotowe do analizy, skalowalne wyniki dla skriningu związków chemicznych lub modyfikatorów genetycznych.
- Analityka: Generuje ilościowe dane o absorbancji, umożliwiając rzetelne porównania statystyczne poziomu żelaza w tkankach.
- Badania translacyjne: Ułatwia dopasowanie biomarkerów i walidację międzygatunkową w systemach istotnych dla przebiegu chorób.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Oferuje szeroko stosowaną, kosztowo efektywną platformę do kwantyfikacji żelaza w programach B+R.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorczy
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność predykcyjną w walidacji celów oraz w badaniach mechanistycznych metabolizmu żelaza.
- Wartość operacyjna: Standaryzuje pomiar żelaza w tkankach dzięki skalowalnym i powtarzalnym schematom postępowania.
- Wartość strategiczna: Umożliwia podejmowanie świadomych decyzji o kontynuacji lub przerwaniu badań (go/no-go) i redukuje późne ryzyko biologiczne w portfolio projektów związanych z żelazem.
- Wpływ na portfolio: Wspiera priorytetyzację skorygowaną o ryzyko oraz rozwój zasobów na etapie odkrywania i badań przedklinicznych.
Wskazówki dotyczące wdrożenia
- Wymaga podstawowych umiejętności laboratoryjnych oraz standardowej aparatury analitycznej, takiej jak czytniki mikropłytek.
- Wymaga rygorystycznego czyszczenia szkła laboratoryjnego i unikania zanieczyszczeń metalami w celu zapewnienia integralności danych.
- Umożliwia standaryzację międzyzespołową dzięki walidowanym protokołom i wynikom ilościowym.
- Możliwość adaptacji do różnych modeli zwierzęcych i typów tkanek przy minimalnych modyfikacjach protokołu.
- Przepustowość i skalowalność są ograniczone jedynie przez dostępną wydajność czytnika płytek oraz zasoby przygotowania próbek.
Najczęściej zadawane pytania (FAQ) dotyczące biofarmacji
Chapters in this video
0:04
Introduction
0:49
Sample Drying
1:33
Sample Acidic Digestion
2:11
Color Development and Absorbance Reading
2:36
Results: Cuvette Versus 96-Well Microplate Comparison, Measurement of Non-Heme Iron Levels in a Mouse Model of Genetic Hemochromatosis, in Sea Bass Liver, and Whole Drosophila melanogaster
4:41
Conclusion
