Name: Naturalna przemiana, ekspresja białek i kriokonserwacja nitkowatego Cyanobacterium Phormidium lacuna (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-02-01T14:30:00.000+00:00
Duration: 11 min 47 s
Description: Poznaj naturalną transformację i analizę ruchliwości u nitkowatego sinicobakterium Phormidium lacuna. Metoda umożliwia modyfikacje genetyczne i badanie ekspresji białek w organizmach z rzędu Oscillatoriales.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Prace były wspierane przez Karlsruher Institute of Technology.

<ol><li>Brasil, B., de Siqueira, F. G., Salum, T. F. C., Zanette, C. M., Spier, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microalgae+and+cyanobacteria+as+enzyme+biofactories%5BTitle%5D)+AND+%22Algal+Research-Biomass+Biofuels+and+Bioproducts%22%5BJournal%5D)">Microalgae and cyanobacteria as enzyme biofactories.</a> Algal Research-Biomass Biofuels and Bioproducts. 25, 76-89 (2017).</li>
<li>Gundolf, R., Oberleitner, S., Richter, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+New+Genetic+Toolkits+and+Their+Role+for+Ethanol+Production+in+Cyanobacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Energies%22%5BJournal%5D)">Evaluation of New Genetic Toolkits and Their Role for Ethanol Production in Cyanobacteria.</a> Energies. 12 (18), 3515(2019).</li>
<li>Wendt, K. E., Pakrasi, H. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genomics+approaches+to+deciphering+natural+transformation+in+cyanobacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Genomics approaches to deciphering natural transformation in cyanobacteria.</a> Frontiers in Microbiology. 10, 1259(2019).</li>
<li>Tandeau de Marsac, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+approach+for+molecular+cloning+in+cyanobacteria%3A+cloning+of+an+Anacystis+nidulans+met+gene+using+a+Tn901-induced+mutant%5BTitle%5D)+AND+%22Gene%22%5BJournal%5D)">A new approach for molecular cloning in cyanobacteria: cloning of an Anacystis nidulans met gene using a Tn901-induced mutant.</a> Gene. 20 (1), 111-119 (1982).</li>
<li>Porter, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transformation+in+cyanobacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Critical+Reviews+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Transformation in cyanobacteria.</a> Critical Reviews in Microbiology. 13 (2), 111-132 (1986).</li>
<li>Joset, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transformation+in+Synechocystis+PCC+6714+and+6803%3A+preparation+of+chromosomal+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">Transformation in Synechocystis PCC 6714 and 6803: preparation of chromosomal DNA.</a> Methods in Enzymology. 167, 712-714 (1988).</li>
<li>Tsinoremas, N. F., Kutach, A. K., Strayer, C. A., Golden, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+gene+transfer+in+Synechococcus+sp+strains+PCC-7942+and+PCC-6301+by+interspecies+conjugation+and+chromosomal+recombination%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Bacteriology%22%5BJournal%5D)">Efficient gene transfer in Synechococcus sp strains PCC-7942 and PCC-6301 by interspecies conjugation and chromosomal recombination.</a> Journal of Bacteriology. 176 (21), 6764-6768 (1994).</li>
<li>Matsunaga, T., Takeyama, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+engineering+in+marine+cyanobacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Applied+Phycology%22%5BJournal%5D)">Genetic engineering in marine cyanobacteria.</a> Journal of Applied Phycology. 7 (1), 77-84 (1995).</li>
<li>Frigaard, N. U., Sakuragi, Y., Bryant, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+inactivation+in+the+cyanobacterium+Synechococcus+sp.+PCC+7002+and+the+green+sulfur+bacterium+Chlorobium+tepidum+using+in+vitro-made+DNA+constructs+and+natural+transformation%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Gene inactivation in the cyanobacterium Synechococcus sp. PCC 7002 and the green sulfur bacterium Chlorobium tepidum using in vitro-made DNA constructs and natural transformation.</a> Methods in Molecular Biology. 274, 325-340 (2004).</li>
<li>Iwai, M., Katoh, H., Katayama, M., Ikeuchi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+genetic+transformation+of+the+thermophilic+cyanobacterium%2C+Thermosynechococcus+elongatus+BP-1%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+and+Cell+Physiology%22%5BJournal%5D)">Improved genetic transformation of the thermophilic cyanobacterium, Thermosynechococcus elongatus BP-1.</a> Plant and Cell Physiology. 45 (2), 171-175 (2004).</li>
<li>Vioque, A. Transformation of cyanobacteria. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aVioque%2C+A+%22Transgenic+Microalgae+as+Green+Cell%22">Transgenic Microalgae as Green Cell</a>. Leon, R., Galvan, A., Fernandez, E. , Springer. 12-22 (2007).</li>
<li>Nies, F., Mielke, M., Pochert, J., Lamparter, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Natural+transformation+of+the+filamentous+cyanobacterium+Phormidium+lacuna%5BTitle%5D)+AND+%22Plos+One%22%5BJournal%5D)">Natural transformation of the filamentous cyanobacterium Phormidium lacuna.</a> Plos One. 15 (6), 0234440(2020).</li>
<li>Ravindran, C. R. M., Suguna, S., Shanmugasundaram, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electroporation+as+a+tool+to+transfer+the+plasmid+pRL489+in+Oscillatoria+MKU+277%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Microbiological+Methods%22%5BJournal%5D)">Electroporation as a tool to transfer the plasmid pRL489 in Oscillatoria MKU 277.</a> Journal of Microbiological Methods. 66 (1), 174-176 (2006).</li>
<li>El Semary, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimized+electroporation-induced+transformation+in+Microcystis+aeruginosa+PCC7806%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnologie+Agronomie+Societe+et+Environnement%22%5BJournal%5D)">Optimized electroporation-induced transformation in Microcystis aeruginosa PCC7806.</a> Biotechnologie Agronomie Societe et Environnement. 14 (1), 149-152 (2010).</li>
<li>Nies, F., Mielke, M., Pochert, J., Lamparter, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Natural+transformation+of+the+filamentous+cyanobacterium+Phormidium+lacuna%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Natural transformation of the filamentous cyanobacterium Phormidium lacuna.</a> PLoS One. 15 (6), 0234440(2020).</li>
<li>Sode, K., Tatara, M., Takeyama, H., Burgess, J. G., Matsunaga, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conjugative+gene-transfer+in+marine+cyanobacteria+-+Synechococcus+Sp%2C+Synechocystis+Sp+and+Pseudanabaena+Sp%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+Microbiology+and+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Conjugative gene-transfer in marine cyanobacteria - Synechococcus Sp, Synechocystis Sp and Pseudanabaena Sp.</a> Applied Microbiology and Biotechnology. 37 (3), 369-373 (1992).</li>
<li>Stucken, K., Ilhan, J., Roettger, M., Dagan, T., Martin, W. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transformation+and+conjugal+transfer+of+foreign+gGenes+into+the+filamentous+multicellular+cyanobacteria+%28Subsection+V%29+Fischerella+and+Chlorogloeopsis%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Transformation and conjugal transfer of foreign gGenes into the filamentous multicellular cyanobacteria (Subsection V) Fischerella and Chlorogloeopsis.</a> Current Microbiology. 65 (5), 552-560 (2012).</li>
<li>Bellali, S., Khalil, J. B., Fontanini, A., Raoult, D., Lagier, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+protectant+medium+preserving+bacterial+viability+after+freeze+drying%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiological+Research%22%5BJournal%5D)">A new protectant medium preserving bacterial viability after freeze drying.</a> Microbiological Research. 236, 126454(2020).</li>
<li>Wallner, T., Pedroza, L., Voigt, K., Kaever, V., Wilde, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+cyanobacterial+phytochrome+2+regulates+the+expression+of+motility-related+genes+through+the+second+messenger+cyclic+di-GMP%5BTitle%5D)+AND+%22Photochemical+%26+Photobiological+Sciences%22%5BJournal%5D)">The cyanobacterial phytochrome 2 regulates the expression of motility-related genes through the second messenger cyclic di-GMP.</a> Photochemical & Photobiological Sciences. 19 (5), 631-643 (2020).</li>
<li>Wilde, A., Fiedler, B., Borner, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+cyanobacterial+phytochrome+Cph2+inhibits+phototaxis+towards+blue+light%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Microbiology%22%5BJournal%5D)">The cyanobacterial phytochrome Cph2 inhibits phototaxis towards blue light.</a> Molecular Microbiology. 44 (4), 981-988 (2002).</li>
<li>Bhaya, D., Takahashi, A., Grossman, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Light+regulation+of+type+IV+pilus-dependent+motility+by+chemosensor-like+elements+in+Synechocystis+PCC6803%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Light regulation of type IV pilus-dependent motility by chemosensor-like elements in Synechocystis PCC6803.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 98 (13), 7540-7545 (2001).</li>
<li>Guillard, R. R., Ryther, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Studies+of+marine+planktonic+diatoms.+I.+Cyclotella+nana+Hustedt%2C+and+Detonula+confervacea+%28cleve%29+Gran%5BTitle%5D)+AND+%22Canadian+Journal+of+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Studies of marine planktonic diatoms. I. Cyclotella nana Hustedt, and Detonula confervacea (cleve) Gran.</a> Canadian Journal of Microbiology. 8, 229-239 (1962).</li>
<li>Kester, D. R., Duedall, I. W., Connors, D. N., Pytkowicz, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+artificial+seawater%5BTitle%5D)+AND+%22Limnology+and+Oceanography%22%5BJournal%5D)">Preparation of artificial seawater.</a> Limnology and Oceanography. 12 (1), 176-179 (1967).</li>
<li>Sambrook, J., Russell, D. W. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSambrook%2C+J+%22Molecular+Cloning.+A+Laboratory+Manual.+3rd+edition%22">Molecular Cloning. A Laboratory Manual. 3rd edition</a>. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. (2001).</li>
<li>Cold Spring Harbor Protocols. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CTAB+DNA+extraction+buffer%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Protocols%22%5BJournal%5D)">CTAB DNA extraction buffer.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2009 (3), (2009).</li>
<li>Singh, S. P., Rastogi, R. P., Häder, D. -P., Sinha, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+improved+method+for+genomic+DNA+extraction+from+cyanobacteria%5BTitle%5D)+AND+%22World+Journal+of+Microbiology+%26+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">An improved method for genomic DNA extraction from cyanobacteria.</a> World Journal of Microbiology & Biotechnology. 27, 1225-1230 (2011).</li>
<li>French, C. S., Milner, H. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disintegration+of+bacteria+and+small+particles+by+high-pressure+extrusion%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">Disintegration of bacteria and small particles by high-pressure extrusion.</a> Methods in Enzymology. 1, 64-67 (1955).</li>
<li>Sambrook, J., Fritsch, E. F., Maniatis, T. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSambrook%2C+J+%22Molecular+cloning%2C+a+laboratory+manual.+2nd+ed%22">Molecular cloning, a laboratory manual. 2nd ed</a>. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. (1989).</li>
<li>Lamparter, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+involvement+of+type+IV+pili+and+phytochrome+in+gliding+motility%2C+lateral+motility+and+phototaxis+of+the+cyanobacterium+Phormidium+lacuna%5BTitle%5D)+AND+%22bioRxiv%22%5BJournal%5D)">The involvement of type IV pili and phytochrome in gliding motility, lateral motility and phototaxis of the cyanobacterium Phormidium lacuna.</a> bioRxiv. , (2021).</li>
<li>Nies, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+Phormidium+lacuna+strains+from+the+North+Sea+and+the+Mediterranean+Sea+for+biotechnological+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Process+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Characterization of Phormidium lacuna strains from the North Sea and the Mediterranean Sea for biotechnological applications.</a> Process Biochemistry. 59, 194-206 (2017).</li>
<li>Kachel, B., Mack, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+of+Synechococcus+sp.+strain+PCC+7002+for+the+photoautotrophic+production+of+light-sensitive+riboflavin+%28vitamin+B2%29%5BTitle%5D)+AND+%22Metabolic+Engineering%22%5BJournal%5D)">Engineering of Synechococcus sp. strain PCC 7002 for the photoautotrophic production of light-sensitive riboflavin (vitamin B2).</a> Metabolic Engineering. 62, 275-286 (2020).</li>
<li>Lukavsky, J., Cepak, V., Komarek, J., Kasparkova, M., Takacova, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Catalogue+of+algal+and+cyanobacterial+strains+of+culture+collection+of+autotrophic+organisms+at+Trebon%5BTitle%5D)+AND+%22Algological+Studies%22%5BJournal%5D)">Catalogue of algal and cyanobacterial strains of culture collection of autotrophic organisms at Trebon.</a> Algological Studies. 63, 59-112 (1992).</li>
<li>Philbrick, J. B., Diner, B. A., Zilinskas, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Construction+and+characterization+of+cyanobacterial+mutants+lacking+the+manganese-stabilizing+polypeptide+of+photosystem-ii%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Construction and characterization of cyanobacterial mutants lacking the manganese-stabilizing polypeptide of photosystem-ii.</a> Journal of Biological Chemistry. 266 (20), 13370-13376 (1991).</li>
<li>Pinevich, A. V., Veprritskii, A. A., Gromov, B. V., Krautvald, K., Titova, N. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+and+cultural+properties+and+characterization+of+the+pigment+in+Nostoc+sp%2C+a+cyanobacterium+unusually+rich+in+c-phycoerythrin%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiology%22%5BJournal%5D)">Cellular and cultural properties and characterization of the pigment in Nostoc sp, a cyanobacterium unusually rich in c-phycoerythrin.</a> Microbiology. 63 (5), 481-485 (1994).</li>
<li>Schlosser, U. G., Friedl, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Additions+to+the+culture+collection+of+algae+at+Gottingen+since+1997%5BTitle%5D)+AND+%22Nova+Hedwigia%22%5BJournal%5D)">Additions to the culture collection of algae at Gottingen since 1997.</a> Nova Hedwigia. 71 (1-2), 243-262 (2000).</li>
<li>Takano, H., Arai, T., Hirano, M., Matsunaga, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+intensity+and+quality+of+light+on+phycocyanin+production+by+a+marine+cyanobacterium+Synechococcus+sp.+042902%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+Microbiology+and+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Effects of intensity and quality of light on phycocyanin production by a marine cyanobacterium Synechococcus sp. 042902.</a> Applied Microbiology and Biotechnology. 43 (6), 1014-1018 (1995).</li>
<li>Carrer, H., Hockenberry, T. N., Svab, Z., Maliga, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kanamycin+resistance+as+a+selectable+marker+for+plastid+transformation+in+tobacco%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+General+Genetics%3A+MGG%22%5BJournal%5D)">Kanamycin resistance as a selectable marker for plastid transformation in tobacco.</a> Molecular and General Genetics: MGG. 241 (1-2), 49-56 (1993).</li>
<li>Kaulen, H., Schell, J., Kreuzaler, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Light-induced+expression+of+the+chimeric+chalcone+synthase-NptII+gene+in+tobacco+cells%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Journal%22%5BJournal%5D)">Light-induced expression of the chimeric chalcone synthase-NptII gene in tobacco cells.</a> EMBO Journal. 5 (1), 1-8 (1986).</li>
<li>Cotlet, M., Goodwin, P. M., Waldo, G. S., Werner, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+comparison+of+the+fluorescence+dynamics+of+single+molecules+of+a+green+fluorescent+protein%3A+One-+versus+two-photon+excitation%5BTitle%5D)+AND+%22Chemphyschem%22%5BJournal%5D)">A comparison of the fluorescence dynamics of single molecules of a green fluorescent protein: One- versus two-photon excitation.</a> Chemphyschem. 7 (1), 250-260 (2006).</li>
<li>Taton, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+circadian+clock+and+darkness+control+natural+competence+in+cyanobacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">The circadian clock and darkness control natural competence in cyanobacteria.</a> Nature Communications. 11 (1), 1688(2020).</li>
</ol>

Autorzy nie mają do ujawnienia żadnych konfliktów interesów.

Chociaż wiele szczepów sinic jest dostępnych w kolekcjach kultur 32,33,34,35,36, nadal istnieje zapotrzebowanie na nowe cyjanobakterie ze środowiska naturalnego, ponieważ gatunki te są przystosowane do określonych właściwości. P. lacuna został zebrany z basenów skalnych i jest przystosowany do zmian stężenia soli i temperatury30</sup...

Cyjanobakterie to organizmy prokariotyczne, które wykorzystują fotosyntezę jako źródło energii1,2. Badania coraz częściej koncentrują się na gatunkach sinic. Kilka cyjanobakterii może zostać przekształconych za pomocą DNA3. Geny mogą być znokautowane lub nadmiernie eksprymowane u tych gatunków. Transformacja jest jednak ograniczona do kilku gatunków4,5,6,7,8,9,10,11, a ustalenie transformacji w szczepach z kolekcji kultur lub dzikich może być trudne8. Szczepy nitkowatego gatunku Phormidium lacuna (<silna klasa="xfig">Ryc. 1) wyizolowano z morskich basenów skalnych, w których warunki środowiskowe, takie jak stężenie soli lub temperatura, zmieniają się w czasie. Te nitkowate cyjanobakterie mogą być używane jako organizmy modelowe dla rzędu Oscillatoriales12, do którego należą.
Podczas prób testowania transferu genów za pomocą elektroporacji13,14 stwierdzono, że P. lacuna może zostać przekształcony przez naturalną transformację15. W tym procesie DNA jest naturalnie pobierane przez niektóre komórki. W porównaniu z innymi metodami transformacji16,17, naturalna transformacja ma tę zaletę, że nie wymaga dodatkowych narzędzi, które mogłyby skomplikować procedurę. Na przykład elektroporacja wymaga odpowiednich kuwet, nienaruszonych przewodów i doboru odpowiedniego napięcia. P. lacuna jest obecnie jedynym członkiem oscylatoryjnym podatnym na naturalną transformację. Ponieważ oryginalny protokół opiera się na protokołach elektroporacji, nadal zawierał kilka etapów mycia, które mogą być niepotrzebne. Przetestowano różne podejścia w celu uproszczenia protokołu, co doprowadziło do powstania przedstawionego tutaj protokołu transformacji.
Sekwencja genomu jest niezbędna do dalszych badań molekularnych opartych na nokaucie lub nadekspresji genów. Chociaż sekwencje genomu można uzyskać za pomocą maszyn do sekwencjonowania nowej generacji w krótkim czasie, ekstrakcja DNA może być trudna i zależy od gatunku. W przypadku P. lacuna przetestowano kilka protokołów. Następnie ustalono zmodyfikowaną metodę opartą na bromku cetylu trimetyloamoniowym (CTAB), która pozwoliła uzyskać akceptowalną czystość DNA i wydajność DNA w każdym cyklu oczyszczania do kontynuowania prac w laboratorium. Genom pięciu szczepów można zsekwencjonować za pomocą tego protokołu. Kolejnym krokiem transformacji logicznej było ustalenie ekspresji białka u P. lacuna.
SfGFP używany jako białko markerowe w tym protokole może być wykryty za pomocą dowolnego mikroskopu fluorescencyjnego. Wszystkie testowane promotory można było wykorzystać do ekspresji P. lacuna sfGFP. Rosnąca liczba szczepów powstałych w wyniku transformacji spowodowała potrzebę opracowania metody przechowywania kultur. Takie metody są stosowane dla Escherichia coli i wielu innych bakterii18. W standardowych protokołach kultury glicerolu są przygotowywane, przenoszone w ciekłym azocie i przechowywane w temperaturze -80 °C. Ta metoda wymaga tylko kilku kroków i jest wysoce niezawodna dla tych gatunków, dla których została ustalona. Standardowy protokół nie był wykonalny w przypadku P. lacuna, ponieważ nie we wszystkich przypadkach można było odzyskać żywe komórki. Jednak gdy glicerol został usunięty po rozmrożeniu, komórki wszystkich prób przeżyły. Przedstawiono proste metody analizy ruchliwości P. lacuna, które można połączyć z mutagenezą nokautową w celu zbadania pilusów typu IV lub roli fotoreceptorów. Testy te różnią się od testów jednokomórkowych sinic19,20,21 i mogą być również przydatne dla innych oscylatoriów.

<table><tbody><tr><td>Autoklaw 3870 ELV</td><td>Tuttnauer</td><td>3870 ELV</td><td></td></tr><tr><td>Bacto Agar</td><td>OttoNorwald</td><td>214010</td><td></td></tr><tr><td>BG-11 Roztwór słodkowodny</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C3061</td><td></td></tr><tr><td>BG-11 średni</td><td>Merck</td><td>73816-250ML</td><td></td></tr><tr><td>Kwas borowy</td><td>Merck</td><td>10043-35-3</td><td>H3BO3</td></tr><tr><td>Chlorek wapnia dwuwodny</td><td>Carl Roth</td><td>10035-04-8</td><td>CaCl2 &middot; 2 H2O</td></tr><tr><td>Kolby do hodowli komórkowych Cellstar z filtrem nakrętka, sterylne, 250 mL</td><td>Greiner</td><td>658190</td><td></td></tr><tr><td>Kolby do hodowli komórkowych Cellstar z zakrętką filtra, sterylne, 50 mL</td><td>Wirówka do</td><td>601975</td><td></td>Greiner</tr><tr><td>LYNX 4000</td><td>Thermo Scientific</td><td>75006580</td><td>i wirnik</td></tr><tr><td>Wirówka microstar 17</td><td>VWR International</td><td>N/A</td><td>do 13 000 obr./min</td></tr><tr><td>Bromek cetylotrimetyloamoniowy (CTAB)</td><td>PanReac AppliChem</td><td>57-09-0</td><td>C19H42BrN</td></tr><tr><td>Chloroform: Alkohol izoamylowy 24 : 1</td><td>PanReac AppliChem</td><td> A1935</td><td></td></tr><tr><td>Sześciowodny chlorek kobaltu(II)</td><td>Merck</td><td>7791-13-1</td><td>CoCl2 &middot; 6 H2O</td></tr><tr><td>Pięciowodny siarczan miedzi(II)</td><td>Merck</td><td>7758-99-8</td><td>&nbsp; CuSO4 &middot; 5 H2O</td></tr><tr><td>D(+)-Biotyna</td><td>Carl Roth</td><td>58-85-5</td><td>&nbsp; C10H16N2O3S</td></tr><tr><td>Drabinka DNA 1 kb</td><td>New England Biolabs</td><td>N3232</td><td></td></tr><tr><td>Drabinka DNA 100 pz</td><td>New England Biolabs</td><td>N3231</td><td></td></tr><tr><td>Pomoc w pipetowaniu elektrycznym accujet-pro S</td><td>Brand GmbH</td><td>26360</td><td>do pipetowania 1-25 ml</td></tr><tr><td>etanolu</td><td>VWR</td><td>64-17-5</td><td>C2H6O</td></tr><tr><td>Dwuwodian soli disodowej kwasu etylenodiaminowego tetraoctowego</td><td>Carl Roth</td><td>6381-92-6</td><td>EDTA-Na2 &middot; 2 H2O</td></tr><tr><td>Mikroskop fluorescencyjny ApoTome</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop fluorescencyjny Axio Imager 2</td><td>Francuska</td> prasa ciśnieniowa Zeiss <td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>American Instrument Company</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>System dokumacji żelu Saffe Image</td><td>Invitrogen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>System gelelctrophorezy Mupid-One/-exu</td><td>ADVANCED</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Wyroby szklane, różne</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Glicerol</td><td>Carl Roth</td><td>56-81-5</td><td>C3H8O3</td></tr><tr><td>Sześciowodny chlorek żelaza(III)</td><td>Merck</td><td>Numer katalogowy: 10025-77-1</td><td>&nbsp; FeCl3 &middot; 6 H2O</td></tr><tr><td>Kanamycyna</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>25389-94-0</td><td></td></tr><tr><td>Siarczan kanamycyny</td><td>Carl Roth</td><td>25389-94-0</td><td>C18H36N4O11 &middot; H2SO4</td></tr><tr><td>Lauroilsarkozyna, sól sodowa (sarkozylo)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>137-16-6</td><td>C15H28NO3 &middot; Na</td></tr><tr><td>LB Bulion (Lennox)</td><td>Carl Roth</td><td>X964.4</td><td></td></tr><tr><td>Źródło światła, świetlówka L18W/954 światło dzienne</td><td>OSRAM</td><td></td><td>hodowla sinic</td></tr><tr><td>Źródło światła, panel LED XL 6500K 140 W</td><td>Bloom Star</td><td>N/A</td><td>hodowla sinic, do 1,000 i mikro; mol m-2 s-1</td></tr><tr><td>Sześciowodny chlorek magnezu</td><td>Carl Roth</td><td>7791-18-6</td><td>MgCl2 &middot; 6 H2O</td></tr><tr><td>Czterowodny chlorek manganu(II)</td><td>Serva</td><td>13446-34-9</td><td>MnCl2 &middot; 4 H2O</td></tr><tr><td>Mikroskop DM750</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Zestaw do ekstrakcji plazmidu preparacyjnego Midi Zestaw NucleoBond Xtra Midi</td><td>Macherey-NAGEL GmbH & Co. KG</td><td>REF740410.50</td><td></td></tr><tr><td>Minikomputer Raspberry Pi 4 +</td><td>Conrad Electronics</td><td>2138863-YD</td><td>do nagrywania poklatkowego</td></tr><tr><td>Kamera okularowa EC3</td><td>Leica</td><td></td><td>do ciągłego nagrywania do 30 s</td></tr><tr><td>Kamera okularowa MikrOkular Full HD</td><td>Bresser</td><td></td><td>do nagrań poklatkowych, sprzężony z minikomputerem Raspberry Pi</td></tr><tr><td>szalki Petriego polistyrol, 100 mm x 20 mm</td><td>Merck</td><td>P5606-400EA</td><td></td></tr><tr><td>Polistyur szalek Petriego, 60 mm x 15 mm</td><td>Merck</td><td>P5481-500EA</td><td></td></tr><tr><td>Fotometr Nanodrop ND-1000</td><td>Peqlab Biotechnologie</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fotometr Uvikon XS</td><td>Goebel Instrumentelle Analytik GmbH</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pipetman 100-1,000 &mikro; L</td><td>Gilson</td><td>SKU: FA10006M</td><td></td></tr><tr><td>Pipetman 10-100 &mikro; L</td><td>Gilson</td><td>SKU: FA10004M</td><td></td></tr><tr><td>Pipety plastikowe 10 mL, sterylne</td><td>Greiner</td><td>607107</td><td></td></tr><tr><td>Plastikowa tuba, sterylna, 15 mL</td><td>Greiner</td><td>188271</td><td></td></tr><tr><td>Plastikowa probówka, sterylna, 50 mL</td><td>Greiner</td><td>227261</td><td></td></tr><tr><td>Bromek potasu</td><td>Carl Roth</td><td>7758-02-3</td><td>KBr</td></tr><tr><td>Chlorek potasu</td><td>Carl Roth</td><td>7447-40-7</td><td>KCl</td></tr><tr><td>Zasilacz Statron 3252-1</td><td>Statron Ger&auml; tetechnik GmbH</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Zasilacz Voltcraft PPS 16005</td><td>Conrad Electronics</td><td></td><td>do LED</td></tr><tr><td>Proteinaza K</td><td>Promega</td><td>MC500C</td><td>od Maxwell 16 miRNA Tissue Kit AS1470</td></tr><tr><td>Q5 polimeraza</td><td>New England Biolabs</td><td>M0491S</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw do sekwencjonowania NextSeq 500/550 v2.5</td> System sekwencjonowania <td>Illumina</td><td></td><td></td></tr><tr><td>NextSeq 550 SY-415-1002</td><td>Illumina</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Shaker Unimax 2010</td><td>Heidolph Instrumenty</td><td></td><td>do uprawy</td></tr><tr><td>Octan sodu</td><td>Carl Roth</td><td>127-09-3</td><td>NaCH3COO</td></tr><tr><td>Chlorek sodu</td><td>Carl Roth</td><td>7647-14-5</td><td>NaCl</td></tr><tr><td>Diwodorofosforan sodu jednowodny</td><td>Carl Roth</td><td>10049-21-5</td><td>NaH2PO4 &middot; H2O</td></tr><tr><td>Fluorek sodu</td><td>Carl Roth</td><td>7681-49-4</td><td>NaF</td></tr><tr><td>Wodorowęglan sodu</td><td>Carl Roth</td><td>144-55-8</td><td>NaHCO3</td></tr><tr><td>Dwuwodny molibdenian sodu</td><td>Serva</td><td>10102-40-6</td><td>Na2MoO4 &middot; 2 H2O</td></tr><tr><td>Azotan sodu</td><td>Merck</td><td>7631-99-4</td><td>NaNO3</td></tr><tr><td>Siarczan sodu</td><td>Carl Roth</td><td>7757-82-6</td><td>Na2SO4</td></tr><tr><td>Chlorek strontu sześciowodny</td><td>Carl Roth</td><td>10025-70-4</td><td>SrCl2 &middot; 6 H2O</td></tr><tr><td>Chlorowodorek tiaminy</td><td>Merck</td><td>67-03-8</td><td>C12H17ClN4OS &middot; HCl</td></tr><tr><td>TRIS</td><td>Carl Roth</td><td>77-86-1</td><td>C4H11NO3</td></tr><tr><td>Urządzenie ultradźwiękowe UP100H z sonotrodą MS3</td><td>Hielscher Ultrasound Technology</td><td>UP100H</td><td></td></tr><tr><td>Ultraturrax Silent Crusher M</td><td>Heidolph Instruments</td><td></td><td>homogenizator</td></tr><tr><td>Mocznik</td><td>Carl Roth</td><td>57-13-6</td><td>CH4N2O</td></tr><tr><td>Witamina B12</td><td>Sigma</td><td>68-19-9</td><td>C63H88CoN14O14P</td></tr><tr><td>Roztwór</td><td></td><td></td> witamin <td>0,3 i mikro; M tiamina-HCl, 2,1 nM biotyna, 0,37 nM cyjanokobalamina</td></tr><tr><td>Destylatory wodne, Uzdatnianie wody</td><td>VEOLIA technologie wodne</td><td>ELGA_21001</td><td></td></tr><tr><td>Siarczan siedmiowodny</td><td>Sigma</td><td>7446-20-0</td><td>ZnSO4 &middot; 7 H2O</td></tr><tr><td>software, URL</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>gatb-minia program do składania</td> <td>DNAhttps://github.com/GATB/gatb-minia-pipeline</td><td>tworzy duże rusztowania z krótkich odczytów DNA, oprogramowanie</td> ImageJ oparte na <td></td>systemie Linux</tr><tr><td></td><td>do przetwarzania obrazów (intensywność pikseli, średnica koła)</td><td></td>Serwer adnotacji RAST https://rast.nmpdr.org wejście: sekwencja DNA genomu, wykrywa otwarte ramki odczytu, wymienia sekwencje białek i ich funkcjePożywka hodowlana</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sztuczna woda morska</td><td>0,41 M NaCl , 53 mM MgCl2,28 mM Na2SO4, 10 mM CaCl2 , 9 mM&nbsp; KCl , 2.4 mM NaHCO3 ,0.84 mM KBr, 0.49 mM H3BO3, 90 &mikro; M SrCl2, 72 &mikro; M NaF</td><td></td><td></td></tr><tr><td>f/2 -ciekła pożywka</td><td>sztuczna woda morska, 0,1 % (v/v) roztwór pierwiastków śladowych, 0,05 % (v/v) roztwór witaminy, 0,88 mM NaNO3, 36 &mikro; M NaH2PO4&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>f/2+ płynny medium</td><td>f/2-średnie, z 10-krotnie zwiększonym NaNO3 i NaH2PO4 (0,88 mM NaNO3, 36 i mikro; M NaH2PO4</td><td></td><td></td></tr><tr><td>f/2+-agar</td><td>3 % (w/v) agar bakto, sztuczna woda morska, 0,1 % (v/v) roztwór pierwiastków śladowych, 0,05 % (v/v) roztwór witaminy, 8,8 mM NaNO3, 0,36 mM NaH2PO4</td><td></td><td></td></tr><tr><td>f/2-agar</td><td>3 % (w/v) agar baktowy, sztuczna woda morska, 0,1 % (v/v) roztwór pierwiastków śladowych, 0,05 % (v/v) roztwór witaminy, 0,88 mM NaNO3, 36 i mikro; M NaH2PO4</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Roztwór pierwiastków śladowych</td><td>0,36 mM NaH2PO4, 12 &mikro; M Na2EDTA, 39 nM CuSO4, 26 nM Na2MoO4 , 77 nM ZnSO4, 42 nM CoCl2, 0,91 &mikro; M MnCl2</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Roztwór witaminowy</td><td>0,3 i mikro; M tiamina-HCl, 2,1 nM biotyna, 0,37 nM cyjanokobalamina</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

naturalna przemiana, ekspresja białek i kriokonserwacja nitkowatego cyanobacterium phormidium lacuna

Natural Transformation, Protein Expression, and Cryoconservation of the Filamentous Cyanobacterium Phormidium lacuna

Cyjanobakterie są przedmiotem badań podstawowych i projektów biotechnologicznych, w których energia słoneczna jest wykorzystywana do produkcji biomasy. Phormidium lacuna to nowo wyizolowana nitkowata sinica. W artykule opisano, w jaki sposób można wyizolować nowe nitkowate sinice z morskich basenów skalnych. Opisano również, w jaki sposób DNA można ekstrahować z włókien i jak można sekwencjonować genomy. Chociaż transformacja jest ustalona dla wielu gatunków jednokomórkowych, rzadziej zgłasza się ją w przypadku sinic nitkowatych. Uproszczona metoda naturalnej przemiany P. lacuna jest opisana tutaj. P. lacuna jest jedynym członkiem rzędu Oscillatoriales, dla którego ustanowiono naturalną transformację. W artykule pokazano również, w jaki sposób naturalna transformacja jest wykorzystywana do ekspresji białka zielonej fluorescencji superfolderu (sfGFP). Endogenny promotor cpcB indukował około 5 razy silniejszą ekspresję niż promotory cpc560, A2813 lub psbA2 z Synechocystis sp. PCC6803. Ponadto ustalono metodę kriokonserwacji P. lacuna i Synechocystis sp. CPP 6803 oraz opisano metody oceny ruchliwości w pożywce ciekłej oraz na powierzchniach agarowych i plastikowych.

Zgodnie z powyższymi metodami, z jeziorek skalnych wyizolowano i zsekwencjonowano 5 różnych szczepów P. lacuna (Rysunek 1 oraz Tabela 1). Wszystkie kultury stały się sterylne po około 1 roku pasażowania, z wyjątkiem P. lacuna HE10JO. Szczep ten jest nadal zanieczyszczony Marivirga atlantica, bakterią morską. Podczas kolejnych wypraw na Helgoland z jeziorek skalnych wyizolowano inne nitkowate cyjanobakterie, które różnią się od P. lacuna i ...

Phormidium lacuna to nitkowata cyjanobakteria, która została wyizolowana z morskich basenów skalnych. W artykule opisano izolację włókien ze źródeł naturalnych, ekstrakcję DNA, sekwencjonowanie genomu, naturalną transformację, ekspresję sfGFP, kriokonserwację i metody ruchliwości.

Naturalna przemiana, ekspresja białek i kriokonserwacja nitkowatego Cyanobacterium Phormidium lacuna

Cyanobacteria are the focus of basic research and biotechnological projects in which solar energy is utilized for biomass production. Phormidium lacuna is ...

Protokół ten opisuje, w jaki sposób nitkowate cyjanobakterie, które należą do oscylatorów, mogą zostać przekształcone przez naturalną transformację. Pokazuje również, w jaki sposób można badać różne rodzaje ruchu. Naturalna transformacja jest najprostszą techniką transformacji, jeśli działa.Wymagane jest tylko DNA, komórki i pożywka wzrostowa. Jak dotąd, żaden inny członek oscylatorów nie mógł zostać przekształcony przez naturalną transformację. Mamy nadzieję, że nasze badania zachęcą inne grupy do wypróbowania innych oscylatoriów.Aby dokonać transformacji, stwórz dobrą, zdrowo wyglądającą kulturę i dobry preparat DNA. Do badań ruchu zawsze używaj posiewu poddanego działaniu ultradźwięków. Leczenie powinno być świeże.Procedurę zademonstruje Nora Weber, technik z mojego laboratorium. Zacznij od zaszczepienia 50 mililitrów płynnej pożywki F2 do każdej z dwóch 250-mililitrowych kolb jednym mililitrem włókien P.lacuna z działającej kultury. Uprawiaj w białym świetle pod mieszaniem przez około pięć dni w temperaturze 25 stopni Celsjusza.Po pięciu dniach homogenizuj 100 mililitrów zawiesiny komórek P.lacuna przy 10 000 obr./min przez trzy minuty i zmierz gęstość optyczną przy 750 nanometrach. Następnie odwirować zawiesinę komórek przez 15 minut w temperaturze 6 000 razy G. Usunąć supernatant i zawiesić osad w 800 mikrolitrach pozostałej cieczy i dodatkowym F2 + pożywce. Weź osiem płytek agarowych F2 + Bacto zawierających 120 mikrogramów na mililitr kanamycyny i odpipetuj 10 mikrogramów DNA na środek każdej płytki agarowej.Natychmiast odpipetować 100 mikrolitrów zawiesiny komórkowej na wierzch DNA. Trzymaj płytkę agarową bez pokrywki na czystej ławce, aby nadmiar płynu odparował. Zamknij płytkę i uprawiaj ją w białym świetle w temperaturze 25 stopni Celsjusza przez dwa dni.Po dwóch dniach rozprowadzić filamenty każdej płytki agarowej na kilku świeżych płytkach agarowych F2 + Bacto zawierających 120 mikrogramów na mililitr kanamycyny z pętlą inokulacyjną. Hoduj płytki w białym świetle w temperaturze 25 stopni Celsjusza i regularnie sprawdzaj kultury pod mikroskopem. Po 14 do 28 dniach zidentyfikuj martwe brązowawe włókna i poszukaj przekształconych włókien pod mikroskopem.Przekształcone włókna wyglądają zdrowo i zielono i różnią się od większości włókien. Przenieś każdy pojedynczy przekształcony filament do 50-mililitrowych kolb z 10 mililitrami F2 + pożywki z 250 mikrogramami na mililitr kanamycyny. Uprawiaj w białym świetle w temperaturze 25 stopni Celsjusza na shakerze i obserwuj wzrost do czterech tygodni.Przenieś filamenty z powrotem do podłoża agarowego zawierającego 250 mikrogramów na mililitr kanamycyny i poczekaj, aż włókna wyrosną. Następnie ponownie zwiększ stężenie kanamycyny, aby przyspieszyć segregację. W celu ekspresji GFP obserwuje pojedyncze włókna za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego przy powiększeniu 40X lub 63X i rejestruje obraz transmisyjny w jasnym polu oraz obraz fluorescencyjny.Uprawiaj P.lacuna w podłożu F2 pod 50 obr./min mieszanie poziome w białym świetle przez około pięć dni, aż szacowana gęstość optyczna przy 750 nanometrach osiągnie 0,35. Przechowywać próbkę w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Homogenizować włókna za pomocą ultradźwięków przez jedną minutę przy maksymalnej mocy i cyklu jednego.Zmierz gęstość optyczną przy 750 nanometrach i przenieś osiem mililitrów pożywki zawierającej P. lacuna na sześciocentymetrową szalkę Petriego. Odczekać kilka minut, aż próbka osiągnie temperaturę pokojową, a następnie przykryć szalkę Petriego folią celofanową. Umieść szkiełko mikroskopowe na stole X-Y standardowego mikroskopu z kamerą.Włącz światło mikroskopu i przesuń obiektyw 4X lub 10X w kierunku ścieżki światła. Następnie umieść szalkę Petriego na szkiełku. Dostosuj pojedyncze filamenty lub wiązki filamentów za pomocą ruchów X, Y i Z tabeli.Obserwuj ruchy pojedynczych włókien lub wiązek i rejestruj je za pomocą standardowej kamery mikroskopowej. Upewnij się, że soczewka obiektywu nie dotyka cieczy. Odmierzyć pipetą 0,5 mililitra roztworu zawierającego P.lacuna na powierzchni agaru Bacto sześciocentymetrowej szalki Petriego.Pozwól, aby płyn dostał się na powierzchnię. Po około 20 minutach zamknij szalkę Petriego i obserwuj ruch włókien na powierzchni za pomocą obiektywu 4X lub 10X. Uchwyć nagrania poklatkowe za pomocą kamery okularowej i minikomputera.Włókna muszą być najpierw zogniskowane przez oko, a następnie przez kamerę oczywistą. Upewnij się, że odstęp czasu między kolejnymi obrazami wynosi od pięciu sekund do jednej minuty. Zaprogramuj skrypt Linux minikomputera, aby sterować nagrywaniem poklatkowym.Przygotuj oprawki LED, w których zamontowane są pięciomilimetrowe diody LED, aby naświetlić obszar 20 milimetrów kwadratowych od dołu do góry. Zmierz i dostosuj intensywność diod LED. Upewnij się, że całe ustawienie odbywa się w ciemnym pomieszczeniu lub zamkniętym, ciemnym pojemniku.Umieść osiem mililitrów pożywki zawierającej P.lacuna na sześciocentymetrowej szalce Petriego, zamknij szalkę Petriego pokrywką i umieść ją na uchwycie LED tak, aby dioda LED znajdowała się w środku szalki Petriego. Zazwyczaj po dwóch dniach należy wykonać zdjęcie szalki Petriego za pomocą aparatu w smartfonie skierowanego bezpośrednio na pozycję zabiegu świetlnego. Użyj uchwytu i białego arkusza jako tła, aby zapewnić taką samą odległość i warunki oświetleniowe dla każdego zdjęcia.Otwórz oprogramowanie ImageJ, kliknij Plik, Otwórz i wybierz plik. Następnie kliknij Enter. Wybierz prosty przycisk i naciśnij lewy przycisk myszy, aby narysować linię od jednego końca szalki Petriego do przeciwległego końca.Upewnij się, że linia przechodzi przez środek okręgu włókien. Kliknij Analizuj i mierz, aby zobaczyć długość szalki Petriego. Następnie kliknij Analizuj i drukuj profil w menu ImageJ.Oszacuj średnią wartość intensywności pikseli na zewnątrz okręgu i inną średnią wartość intensywności pikseli wewnątrz okręgu. Wskaż myszą pozycję Y między tymi wartościami, aby oszacować wartości X po obu stronach okręgu. Zanotuj obie wartości i oblicz różnicę.Następnie wybierz prosty przycisk i narysuj linię o średniej maksymalnej wartości intensywności pikseli. Na koniec kliknij Analizuj, a następnie Zmierz, aby uzyskać długość wewnętrznego okręgu komórki. Integracja i segregacja insertu po przekształceniu P.lacuna z PAK1 jest pokazana tutaj.Test PCR z zewnętrznymi starterami około tygodnia po przemianie zazwyczaj ma dwa pasma na żelu do elektroforezy, jedno o rozmiarze pasma typu dzikiego i jedno wolniej migrujące pasmo, które wskazuje na wprowadzenie kasety rezystancyjnej. W tym przypadku pasy od 1 do 4 reprezentują produkty PCR filamentów po siedmiu dniach, 11 dniach, 14 dniach i 17 dniach izolacji opornego filamentu, a pas 5 reprezentuje produkt PCR typu dzikiego. W próbce siedmiodniowej wstawka jest obecna w niewielkiej części chromosomów.Frakcja ta zwiększa się do 17 dni, kiedy nie jest widoczne pasmo typu dzikiego; Oznacza to, że segregacja jest zakończona. Ten obraz przedstawia wektor pMH1 do ekspresji sfGHP pod kontrolą endogennego promotora beta fikocyjaniny. Sekwencja homologiczna P.lacuna, szkielet wektora pUC19 i wstawka z opornością na sfGFP i kanamycynę są pokazane tutaj.W pMH1 gen sfGHP jest umieszczony na trzech pierwszych miejscach genu fikocyjaniny beta; Dlatego jest napędzany przez endogenny promotor CPC beta. Pokazano tutaj obrazy fluorescencyjne włókien typu dzikiego P.lacuna oraz po transformacji z PAK1, PAK2, PAK3 i pMH1. Ekspresja sfGFP jest napędzana przez promotor cpc 560, promotor a2813, promotor psbA2S lub endogenny promotor cpc beta.Przedstawione tutaj połączone obrazy pokazują ruchliwość Phormidium lacuna. Ruch na powierzchni agaru jest pokazany tutaj. Interwał czasowy wynosił jedną minutę.Ruch w ciekłym ośrodku jest przedstawiony tutaj. Interwał czasowy wynosił 10 sekund. Naturalna transformacja to prosta metoda.Wystarczy zmieszać plazmidowe DNA z kasetą oporności w sekwencjach homologicznych z komórkami i pozwolić komórkom rosnąć na pożywce z antybiotykami. Geny mogą być inaktywowane, a białka mogą ulegać nadekspresji. Jest to ważne dla wszelkich badań podstawowych i biotechnicznych.W przypadku jednokomórkowych sinic, u których również dochodzi do naturalnej transformacji, zajęto się badaniami molekularnymi nad fotosyntezą lub fotoreceptorami i tak dalej.

natural-transformation-protein-expression-cryoconservation

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Źródło: Weber, N. i wsp., Naturalna transformacja, ekspresja białek i kriokonserwacja nitkowatego Cyanobacterium Phormidium lacuna. J. Vis. Exp. (2022)Ten film przedstawia skoncentrowany test oparty na diodach LED do badania fototaksji u sinic nitkowatych. Bakterie migrują w kierunku źródła światła, tworząc gęstą akumulację w oświetlonym środku, która jest wizualizowana i określana ilościowo poprzez analizę intensywności pikseli przechwyconego obrazu.

Test fototaksji sinic nitkowatych przy użyciu skupionego oświetlenia świetlnego

Źródło: Weber, N., et al., Naturalna transformacja, ekspresja białek i kriokonserwacja nitkowatego Cyanobacterium Phormidium lacuna. J. Vis. Exp. (2022)Ten film opisuje procedurę przeprowadzania naturalnej transformacji w nitkowatych sinicach przy użyciu plazmidowego DNA w celu uzyskania stabilnej ekspresji GFP i oporności na antybiotyki poprzez rekombinację homologiczną.

Naturalna przemiana i ekspresja GFP w nitkowatych Cyanobacterium Phormidium lacuna

Źródło: Weber, N., et al., Naturalna transformacja, ekspresja białek i kriokonserwacja nitkowatego Cyanobacterium Phormidium lacuna. J. Vis. Exp. (2022)Ten film przedstawia procedurę oceny ruchliwości ślizgu w Phormidium lacuna poprzez homogenizację kultur włókien w celu uzyskania jednolitej zawiesiny, przygotowanie zestawu do testu na płytce Petriego na szkiełku mikroskopowym i wizualizację ruchu filamentu.

Ruchliwość ślizgowa we włóknach Phormidium lacuna

Biologia syntetyczna umożliwia inżynierię białek o niespotykanych dotąd właściwościach przy użyciu kotranslacyjnej insercji aminokwasów niekanonicznych. Tutaj przedstawiliśmy, w jaki sposób spektralnie przesunięty ku czerwieni wariant fluoroforu typu GFP o nowych właściwościach spektroskopowych fluorescencji, określany jako "złote" białko fluorescencyjne (GdFP), jest wytwarzany w E. coli poprzez selektywne włączenie ciśnienia (SPI).

Inżynieria "złotej" fluorescencji poprzez selektywne wprowadzanie ciśnieniowe aminokwasów niekanonicznych oraz analiza białek za pomocą spektrometrii mas i fluorescencji

Ten protokół opisuje, jak wizualizować przejściowe zagęszczenie DNA u cyjanobakterii. Stosuje się hodowlę synchroniczną, monitorowanie za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej, szybkie zamrażanie i wysokonapięciową kriotomografię elektronową. Przedstawiono protokół dla tych metodologii oraz omówiono przyszłe zastosowania i rozwój.

Wizualizacja zagęszczenia DNA u sinic za pomocą wysokonapięciowej krioelektronowej tomografii

Ten protokół opisuje techniki używane do określania struktur kanałów jonowych za pomocą mikroskopii krioelektronowej, w tym system bakulowirusa używany do efektywnej ekspresji genów w komórkach ssaków przy minimalnym wysiłku i toksyczności, ekstrakcję białek, oczyszczanie i kontrolę jakości, przygotowanie siatki próbek i badanie przesiewowe, a także zbieranie i przetwarzanie danych.

Ekspresja i oczyszczanie ludzkiego wrażliwego na lipidy kanału kationowego TRPC3 do oznaczania strukturalnego za pomocą mikroskopii krioelektronowej pojedynczych cząstek

Tutaj prezentujemy protokół opisujący, jak i) złożyć samoreplikujący się wektor za pomocą modułowego zestawu narzędzi do klonowania CyanoGate, ii) wprowadzić wektor do sinicowego gospodarza przez koniugację, oraz iii) scharakteryzować transgeniczne szczepy sinic za pomocą czytnika płytek lub cytometrii przepływowej.

Modyfikacja genetyczna cyjanobakterii przez koniugację przy użyciu modułowego zestawu narzędzi do klonowania CyanoGate

Obrazowanie komórek bakteryjnych to nowe podejście do biologii systemowej, skoncentrowane na definiowaniu statycznych i dynamicznych procesów, które dyktują funkcjonowanie dużych maszyn makromolekularnych. W tym przypadku integracja ilościowego obrazowania żywych komórek i tomografii krioelektronowej jest wykorzystywana do badania architektury i funkcji systemu wydzielania Legionella pneumophila typu IV.

Zastosowanie obrazowania żywych komórek i tomografii krioelektronowej w celu określenia czasoprzestrzennych cech systemu wydzielania kropk/icm Legionella pneumophila

Ten protokół opisuje metodę, materiały, sprzęt i kroki do oddolnego przygotowania RNA i komórek syntetycznych produkujących białka. Wewnętrzna komora wodna komórek syntetycznych zawierała lizat bakteryjny S30 zamknięty w dwuwarstwie lipidowej (tj. stabilnych liposomach), przy użyciu metody przenoszenia emulsji woda w oleju.

Przygotowanie syntetycznych komórek wytwarzających białka przy użyciu ekstraktów bakteryjnych wolnych od komórek, liposomów i transferu emulsji

Prezentujemy prostą i przystępną metodę wizualizacji nitkowatych sinic w płaszczyźnie XY. Zastosowano matrycę agarozową o niskiej temperaturze topnienia, która pozwoliła na uzyskanie obrazów białek biorących udział w podziale, w orientacji pionowej. Dlatego metodologię tę można zastosować do dowolnego organizmu nitkowatego i różnych rodzajów białek.

Metoda immobilizacji pionowej do analizy mikroskopii poklatkowej u sinic nitkowatych

Poznaj naturalną transformację i analizę ruchliwości u nitkowatego sinicobakterium Phormidium lacuna. Metoda umożliwia modyfikacje genetyczne i badanie ekspresji białek w organizmach z rzędu Oscillatoriales.

Naturalna przemiana, ekspresja białek i kriokonserwacja nitkowatego Cyanobacterium Phormidium lacuna

Przeglądaj więcej filmów