Naturalna przemiana, ekspresja białek i kriokonserwacja nitkowatego Cyanobacterium Phormidium lacuna

Protokół ten opisuje, w jaki sposób nitkowate cyjanobakterie, które należą do oscylatorów, mogą zostać przekształcone przez naturalną transformację. Pokazuje również, w jaki sposób można badać różne rodzaje ruchu. Naturalna transformacja jest najprostszą techniką transformacji, jeśli działa.

Wymagane jest tylko DNA, komórki i pożywka wzrostowa. Jak dotąd, żaden inny członek oscylatorów nie mógł zostać przekształcony przez naturalną transformację. Mamy nadzieję, że nasze badania zachęcą inne grupy do wypróbowania innych oscylatoriów.

Aby dokonać transformacji, stwórz dobrą, zdrowo wyglądającą kulturę i dobry preparat DNA. Do badań ruchu zawsze używaj posiewu poddanego działaniu ultradźwięków. Leczenie powinno być świeże.

Procedurę zademonstruje Nora Weber, technik z mojego laboratorium. Zacznij od zaszczepienia 50 mililitrów płynnej pożywki F2 do każdej z dwóch 250-mililitrowych kolb jednym mililitrem włókien P.lacuna z działającej kultury. Uprawiaj w białym świetle pod mieszaniem przez około pięć dni w temperaturze 25 stopni Celsjusza.

Po pięciu dniach homogenizuj 100 mililitrów zawiesiny komórek P.lacuna przy 10 000 obr./min przez trzy minuty i zmierz gęstość optyczną przy 750 nanometrach. Następnie odwirować zawiesinę komórek przez 15 minut w temperaturze 6 000 razy G. Usunąć supernatant i zawiesić osad w 800 mikrolitrach pozostałej cieczy i dodatkowym F2 + pożywce. Weź osiem płytek agarowych F2 + Bacto zawierających 120 mikrogramów na mililitr kanamycyny i odpipetuj 10 mikrogramów DNA na środek każdej płytki agarowej.

Natychmiast odpipetować 100 mikrolitrów zawiesiny komórkowej na wierzch DNA. Trzymaj płytkę agarową bez pokrywki na czystej ławce, aby nadmiar płynu odparował. Zamknij płytkę i uprawiaj ją w białym świetle w temperaturze 25 stopni Celsjusza przez dwa dni.

Po dwóch dniach rozprowadzić filamenty każdej płytki agarowej na kilku świeżych płytkach agarowych F2 + Bacto zawierających 120 mikrogramów na mililitr kanamycyny z pętlą inokulacyjną. Hoduj płytki w białym świetle w temperaturze 25 stopni Celsjusza i regularnie sprawdzaj kultury pod mikroskopem. Po 14 do 28 dniach zidentyfikuj martwe brązowawe włókna i poszukaj przekształconych włókien pod mikroskopem.

Przekształcone włókna wyglądają zdrowo i zielono i różnią się od większości włókien. Przenieś każdy pojedynczy przekształcony filament do 50-mililitrowych kolb z 10 mililitrami F2 + pożywki z 250 mikrogramami na mililitr kanamycyny. Uprawiaj w białym świetle w temperaturze 25 stopni Celsjusza na shakerze i obserwuj wzrost do czterech tygodni.

Przenieś filamenty z powrotem do podłoża agarowego zawierającego 250 mikrogramów na mililitr kanamycyny i poczekaj, aż włókna wyrosną. Następnie ponownie zwiększ stężenie kanamycyny, aby przyspieszyć segregację. W celu ekspresji GFP obserwuje pojedyncze włókna za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego przy powiększeniu 40X lub 63X i rejestruje obraz transmisyjny w jasnym polu oraz obraz fluorescencyjny.

Uprawiaj P.lacuna w podłożu F2 pod 50 obr./min mieszanie poziome w białym świetle przez około pięć dni, aż szacowana gęstość optyczna przy 750 nanometrach osiągnie 0,35. Przechowywać próbkę w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Homogenizować włókna za pomocą ultradźwięków przez jedną minutę przy maksymalnej mocy i cyklu jednego.

Zmierz gęstość optyczną przy 750 nanometrach i przenieś osiem mililitrów pożywki zawierającej P. lacuna na sześciocentymetrową szalkę Petriego. Odczekać kilka minut, aż próbka osiągnie temperaturę pokojową, a następnie przykryć szalkę Petriego folią celofanową. Umieść szkiełko mikroskopowe na stole X-Y standardowego mikroskopu z kamerą.

Włącz światło mikroskopu i przesuń obiektyw 4X lub 10X w kierunku ścieżki światła. Następnie umieść szalkę Petriego na szkiełku. Dostosuj pojedyncze filamenty lub wiązki filamentów za pomocą ruchów X, Y i Z tabeli.

Obserwuj ruchy pojedynczych włókien lub wiązek i rejestruj je za pomocą standardowej kamery mikroskopowej. Upewnij się, że soczewka obiektywu nie dotyka cieczy. Odmierzyć pipetą 0,5 mililitra roztworu zawierającego P.lacuna na powierzchni agaru Bacto sześciocentymetrowej szalki Petriego.

Pozwól, aby płyn dostał się na powierzchnię. Po około 20 minutach zamknij szalkę Petriego i obserwuj ruch włókien na powierzchni za pomocą obiektywu 4X lub 10X. Uchwyć nagrania poklatkowe za pomocą kamery okularowej i minikomputera.

Włókna muszą być najpierw zogniskowane przez oko, a następnie przez kamerę oczywistą. Upewnij się, że odstęp czasu między kolejnymi obrazami wynosi od pięciu sekund do jednej minuty. Zaprogramuj skrypt Linux minikomputera, aby sterować nagrywaniem poklatkowym.

Przygotuj oprawki LED, w których zamontowane są pięciomilimetrowe diody LED, aby naświetlić obszar 20 milimetrów kwadratowych od dołu do góry. Zmierz i dostosuj intensywność diod LED. Upewnij się, że całe ustawienie odbywa się w ciemnym pomieszczeniu lub zamkniętym, ciemnym pojemniku.

Umieść osiem mililitrów pożywki zawierającej P.lacuna na sześciocentymetrowej szalce Petriego, zamknij szalkę Petriego pokrywką i umieść ją na uchwycie LED tak, aby dioda LED znajdowała się w środku szalki Petriego. Zazwyczaj po dwóch dniach należy wykonać zdjęcie szalki Petriego za pomocą aparatu w smartfonie skierowanego bezpośrednio na pozycję zabiegu świetlnego. Użyj uchwytu i białego arkusza jako tła, aby zapewnić taką samą odległość i warunki oświetleniowe dla każdego zdjęcia.

Otwórz oprogramowanie ImageJ, kliknij Plik, Otwórz i wybierz plik. Następnie kliknij Enter. Wybierz prosty przycisk i naciśnij lewy przycisk myszy, aby narysować linię od jednego końca szalki Petriego do przeciwległego końca.

Upewnij się, że linia przechodzi przez środek okręgu włókien. Kliknij Analizuj i mierz, aby zobaczyć długość szalki Petriego. Następnie kliknij Analizuj i drukuj profil w menu ImageJ.

Oszacuj średnią wartość intensywności pikseli na zewnątrz okręgu i inną średnią wartość intensywności pikseli wewnątrz okręgu. Wskaż myszą pozycję Y między tymi wartościami, aby oszacować wartości X po obu stronach okręgu. Zanotuj obie wartości i oblicz różnicę.

Następnie wybierz prosty przycisk i narysuj linię o średniej maksymalnej wartości intensywności pikseli. Na koniec kliknij Analizuj, a następnie Zmierz, aby uzyskać długość wewnętrznego okręgu komórki. Integracja i segregacja insertu po przekształceniu P.lacuna z PAK1 jest pokazana tutaj.

Test PCR z zewnętrznymi starterami około tygodnia po przemianie zazwyczaj ma dwa pasma na żelu do elektroforezy, jedno o rozmiarze pasma typu dzikiego i jedno wolniej migrujące pasmo, które wskazuje na wprowadzenie kasety rezystancyjnej. W tym przypadku pasy od 1 do 4 reprezentują produkty PCR filamentów po siedmiu dniach, 11 dniach, 14 dniach i 17 dniach izolacji opornego filamentu, a pas 5 reprezentuje produkt PCR typu dzikiego. W próbce siedmiodniowej wstawka jest obecna w niewielkiej części chromosomów.

Frakcja ta zwiększa się do 17 dni, kiedy nie jest widoczne pasmo typu dzikiego; Oznacza to, że segregacja jest zakończona. Ten obraz przedstawia wektor pMH1 do ekspresji sfGHP pod kontrolą endogennego promotora beta fikocyjaniny. Sekwencja homologiczna P.lacuna, szkielet wektora pUC19 i wstawka z opornością na sfGFP i kanamycynę są pokazane tutaj.

W pMH1 gen sfGHP jest umieszczony na trzech pierwszych miejscach genu fikocyjaniny beta; Dlatego jest napędzany przez endogenny promotor CPC beta. Pokazano tutaj obrazy fluorescencyjne włókien typu dzikiego P.lacuna oraz po transformacji z PAK1, PAK2, PAK3 i pMH1. Ekspresja sfGFP jest napędzana przez promotor cpc 560, promotor a2813, promotor psbA2S lub endogenny promotor cpc beta.

Przedstawione tutaj połączone obrazy pokazują ruchliwość Phormidium lacuna. Ruch na powierzchni agaru jest pokazany tutaj. Interwał czasowy wynosił jedną minutę.

Ruch w ciekłym ośrodku jest przedstawiony tutaj. Interwał czasowy wynosił 10 sekund. Naturalna transformacja to prosta metoda.

Wystarczy zmieszać plazmidowe DNA z kasetą oporności w sekwencjach homologicznych z komórkami i pozwolić komórkom rosnąć na pożywce z antybiotykami. Geny mogą być inaktywowane, a białka mogą ulegać nadekspresji. Jest to ważne dla wszelkich badań podstawowych i biotechnicznych.

W przypadku jednokomórkowych sinic, u których również dochodzi do naturalnej transformacji, zajęto się badaniami molekularnymi nad fotosyntezą lub fotoreceptorami i tak dalej.