Name: Krojenie embrionalnego słuchowego pnia mózgu kurczaka w celu oceny gradientów tonotopowych i mikroobwodów (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-07-12T12:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 24 s
Description: Poznaj metodę krojenia embrionalnego słuchowego pnia mózgu kurczaka w celu oceny gradientów tonotopowych i mikroobwodów. Ta technika umożliwia badanie większych regionów tonotopowych w jednym plastrze.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca jest wspierana przez grant NIH/NIDCD R01 DC017167. Dziękujemy Kristine McLellan za komentarze redakcyjne do wcześniejszej wersji rękopisu.

Wszystkie procedury zostały zatwierdzone przez Northwestern University Institutional Animal Care and Use Committees (IACUC) i zostały przeprowadzone zgodnie z wytycznymi National Institutes of Health dotyczącymi opieki i użytkowania zwierząt laboratoryjnych. Protokoły preparacji i przygotowania tkanki pnia mózgu są zgodne z poprzednimi protokołami5,13.
1. Postępowanie z jajami
<ol>
	<li>Kupuj zapłodnione jaja (Gallus gallus domesticus) od zatwierdzonego przez IACUC lokalnego dostawcy zwierząt.</li>
	<li>Jaja należy przechowywać natychmiast po przybyciu w lodówce w temperaturze 14 °C i inkubować w ciągu 5 dni. 
	UWAGA: Żywotność zarodków znacznie spada po 1 tygodniu.</li>
	<li>Wysterylizuj jaja 70% etanolem przed inkubacją w temperaturze 38 ± 1 °C i wilgotności ~50%.</li>
</ol>
2. Skład i przygotowanie sztucznego płynu mózgowo-rdzeniowego (ACSF)
<ol>
	<li>Wymieszać następujące substancje chemiczne w 1 l 18,2 MΩcm dH2O, aby uzyskać 10 x roztwór podstawowy ACSF: NaCl (chlorek sodu) 130 mM, NaHCO3 (wodorowęglan sodu) 26 mM, KCl (chlorek potasu) 2,5 mM, NaH2PO4 (diwodorofosforan sodu) 1,25 mM, dekstroza (D-(+)-glukoza) 10 mM. Roztwór podstawowy należy przechowywać w lodówce.</li>
	<li>Przygotować oddzielnie roztwory MgCl2 (chlorek magnezu) 1 M i CaCl2 (chlorek wapnia) 1 M w 18,2 MΩcmdH2O i przechowywać w lodówce.</li>
	<li>Bezpośrednio przed użyciem rozcieńczyć 10x ACSF do 1x i bąbelkować w sposób ciągły 95% O2/5% CO2 przez 15-20 min i dodać MgCl2 i CaCl2. Aby przygotować ACSF i dACSF (rozwarstwianie ACSF), dostosuj do końcowego stężenia Mg2+ 1 mM, Ca2+ 3 mM i Mg2+ 3 mM, Ca2+ 1 mM, odpowiednio.</li>
	<li>Ustaw szybkość bulgotania dla ACSF tak, aby pH wynosiło 7,2-7,4 z osmolalnością między 300 a 310 mOsm/L. 
	UWAGA: Umieszczenie ACSF w łaźni lodowej podczas bulgotania jest korzystne dla utrzymania niskiej temperatury roztworu, co wspiera integralność strukturalną tkanek podczas preparowania.</li>
</ol>
3. Przygotowanie bloku agarozy (5%)
<ol>
	<li>Wymieszaj 5 g agarozy w 100 ml dACSF. Używaj łaźni wodnej o temperaturze 100 °C lub kuchenki mikrofalowej przez 2-3 minuty, mieszając co 30 sekund, aby zapobiec grudkom, aż agaroza całkowicie się rozpuści i zacznie bulgotać.</li>
	<li>Wlej rozpuszczoną agarozę do pustej szalki Petriego o grubości do 5 mm i przechowuj w temperaturze pokojowej do stężenia. Po związaniu zamknąć szalkę Petriego za pomocą parafilmu i przechowywać w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Pokrój agarozę na sześcienne bloki ostrym ostrzem i użyj ich w czasie sekcji.</li>
</ol>
4. Protokół sekcji i izolacja słuchowego pnia mózgu
<ol>
	<li>Oczyść obszar sekcji za pomocą sprayu z 70% roztworem alkoholu etylowego.</li>
	<li>Przyklej podtrzymujący lub ustawiony pod kątem blok agarozy do tacki na wibratomy.</li>
	<li>Wybierz jaja w pożądanym wieku (E20 i E21 w niniejszym protokole). Obchodzić się z jajami i inkubować je zgodnie z protokołami wymienionymi powyżej, jak w kroku 1.</li>
	<li>Zlokalizuj przestrzeń wypełnioną powietrzem, umieszczając jajko w jasnym świetle (świecowanie) i szukając tej przestrzeni po większej lub bardziej okrągłej stronie jajka.</li>
	<li>Zaaklimatyzuj jaja do temperatury pokojowej, rozbij skorupkę nad przestrzenią wypełnioną powietrzem i odsłoń worek membranowy.</li>
	<li>Wykonaj delikatne nacięcie w worku, aby odsłonić dziób.</li>
	<li>Skalpelem delikatnie wyciągnij szyję i głowę z jajka.</li>
	<li>Szybko odetnij głowę ostrymi nożyczkami.</li>
	<li>Po dekapitacji oczyść głowę lodowatym dACSF, aby usunąć nadmiar krwi z podkładki preparcyjnej.</li>
	<li>Trzymaj głowę stabilnie w chłodzonym lodem dACSF i wykonaj nacięcie rostro-ogonowe. Rozpocznij nacięcie za oczami i między oczami i podążaj wzdłuż długości zebranej szyi. 
	UWAGA: Młodsze zarodki mogą wymagać mniejszego nacisku podczas wykonywania nacięcia.</li>
	<li>Oddziel skórę, aby odsłonić czaszkę.</li>
	<li>Przetnij czaszkę za okiem w kierunku od środkowego do bocznego. Zrób to dla obu półkul. 
	UWAGA: Ten krok pomaga oddzielić rostralną część czaszki od przyczepionego mózgu, zachowując nienaruszoną tkankę mózgową5.</li>
	<li>Pokrój rostralną część czaszki. Umieść ostrze za oczami i wykonaj szybkie cięcie. 
	UWAGA: Czyste przecięcie dołączonej czaszki może wymagać wysiłku.</li>
	<li>Zanurz głowę w naczyniu z zimnym dACSF.</li>
	<li>Używając małej pary nożyczek, wykonaj nacięcia od środkowej do bocznej w okolicy ogonowej czaszki, aby spróbować oddzielić mózg od czaszki bez powodowania uszkodzenia tkanek.</li>
	<li>Delikatnie odsłoń pień mózgu i móżdżek. Cofnij grzbietową część całej czaszki, ostrożnie usuń pień mózgu i odsłoń go za pomocą cienkiego pędzla z łagodnym jazdem na sankach. Użyj zakrzywionych kleszczy, aby oczyścić pień mózgu z tkanki łączącej i naczyń krwionośnych. Zwróć szczególną uwagę na 8. obszar nerwu czaszkowego i pamiętaj, aby pozostawić krótki odcinek nienaruszonych włókien nerwowych po obu stronach.</li>
	<li>Oddziel pień mózgu od móżdżku, przecinając szypułki i ostrożnie usuwając naczynia krwionośne. Przytnij pień mózgu z dodatkowych naczyń krwionośnych. 
	UWAGA: Upewnij się, że cała procedura jest wykonywana w chłodzonym lodem dACSF w sposób ciągły bąbelkowany karbtlenem (95% O2/5% CO2).</li>
</ol>
5. Krojenie wibratomu
UWAGA: W kolejnych krokach, tył tkanki musi być podparty sześciennym kawałkiem agarozy.
<ol>
	<li>Umieść ostrze wibratomu wzdłuż osi poziomej i przyklej pień mózgu na tacy do krojenia. Przyklej stronę rostralną, utrzymując oś rostralno-ogonową w pionie dla plastrów koronalnych.
	<ol>
		<li>Utrzymuj oś boczną-przyśrodkową w pionie dla plastrów strzałkowych.</li>
		<li>Przyklej stronę brzuszną, utrzymując oś grzbietowo-brzuszną pionowo dla poziomych plastrów.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Aby uzyskać ostrą płaszczyznę kątową strzałkowo-poziomą, przyklej brzuszną stronę pnia mózgu, utrzymując oś brzuszno-grzbietową pionowo na przeciwprostokątnej bloku agarozy, która jest cięta pod kątem 45°. Przyklej przeciwległą powierzchnię bloku agarozy skierowaną w stronę tacki do krojenia i utrzymuj oś rostralno-ogonową równolegle do krawędzi ostrza.</li>
</ol>
6. Obchodzenie się z delikatnymi lub dużymi kawałkami tkanki pnia mózgu
<ol>
	<li>W alternatywnym podejściu do kroku 5 zanurz izolowany pień mózgu w 4% agarozie o niskiej temperaturze topnienia (LMP) w temperaturze ~40 °C na szalce Petriego o wymiarach 35 mm x 10 mm.
	<ol>
		<li>Po wylaniu agarozy na zanurzony pień mózgu, umieść szalkę Petriego na lodzie do zestalenia. Przetnij sześcienny blok agarozy z osadzonym pniem mózgu za pomocą ostrej żyletki.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przyklej blok agarozy LMP po jego stronie rostralnej, utrzymując oś rostralno-ogonową pnia mózgu w pionie.
	<ol>
		<li>Weź wycinki koronalne, aż będzie można uwidocznić obszar NM.</li>
		<li>Usuń blok agarozy z kleju ostrym ostrzem. Aby dostrzec jądra, delikatnie umieść 0,5 μl barwnika (toluidyna niebieska lub pomarańczowa G) na NM za pomocą cienkiej igły.</li>
		<li>Ponownie zamontuj ten blok na tacce do krojenia w przypadku plastrów strzałkowych lub poziomych i zidentyfikuj jądra w odniesieniu do zabarwionego obszaru.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Aby uzyskać najlepszą wydajność, ustaw prędkość krojenia wibratomu na 4 - 5 (~30 ± 4 mm/min), częstotliwość wibracji na 85-87 Hz i amplitudę krojenia na 4-6 (~1 ± 0,2 mm).</li>
	<li>Po wycięciu pnia mózgu umieść sekwencyjnie zebrane plastry o wielkości 200-300 μm w dostępnej w handlu komorze na plastry, aby zrównoważyć przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej w ACSF, stale bąbelkując mieszaniną 95% O2/5% CO2 (pH 7,2-7,4, osmolarność 300-310 mOsm / L). W tych warunkach plastry zachowują żywotność do 5-6 godzin.</li>
</ol>
7. Elektrofizjologia: procedura zaciskania łatki
<ol>
	<li>Przenieś wycinek pnia mózgu do komory rejestracyjnej z ciągłą perfuzją karbotlenowego ACSF ~1,5 ± 0,5 ml / min.</li>
	<li>Wyciągać pipety krosowe za pomocą ściągacza do mikropipet o średnicy końcówki 1-2 μm i rezystancji w zakresie 3-6 MΩ.
	<ol>
		<li>Napełnij pipety wewnętrznym roztworem na bazie glukonianu K (do rejestracji cęgów prądowych).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Aby przetestować właściwości neuronalne w różnych regionach tonotopowych w wycinku, zlokalizuj neurony na obu końcach płaszczyzny wycinka i zbliż się do niego z elektrodą rejestrującą.</li>
	<li>Utrzymuj dodatnie ciśnienie powietrza na końcówce pipety, zbliżając się do neuronu.</li>
	<li>Poruszaj się w kierunku somy, aż na neuronie zostanie uwidocznione wgłębienie. Szybko wykonaj kolejne dwa kroki.</li>
	<li>Wykonaj uszczelnienie gigaomowe (1 GΩ), uwalniając dodatnie ciśnienie powietrza.</li>
	<li>Utrzymuj ustawienie wzmacniacza w trybie voltage-clamp i skoryguj przesunięcie pipety na zero pA. Przeprowadzić test szczelności (impuls testowy 10 mV przy 100 Hz). Zastosuj ujemne ciśnienie powietrza, aby rozerwać mały fragment błony neuronalnej.</li>
	<li>Aby przetestować aktywne wewnętrzne właściwości neuronów słuchowych, zastosuj hiperpolaryzujące i depolaryzujące zastrzyki prądu somatycznego. 
	UWAGA: Przykłady tej procedury można zilustrować na filmie uzupełniającym S1, S2. Szczegóły tej procedury znajdują się w legendach wideo.</li>
</ol>

<ol><li>Rubel, E. W., Parks, T. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organization+and+development+of+brain+stem+auditory+nuclei+of+the+chicken%3A+tonotopic+organization+of+n.+magnocellularis+and+n.+laminaris%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Comparative+Neurology%22%5BJournal%5D)">Organization and development of brain stem auditory nuclei of the chicken: tonotopic organization of n. magnocellularis and n. laminaris.</a> Journal of Comparative Neurology. 164 (4), 411-433 (1975).</li>
<li>Rubel, E. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organization+and+development+of+brain+stem+auditory+nuclei+of+the+chicken%3A+ontogeny+of+n.+magnocellularis+and+n.+laminaris%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Comparative+Neurology%22%5BJournal%5D)">Organization and development of brain stem auditory nuclei of the chicken: ontogeny of n. magnocellularis and n. laminaris.</a> Journal of Comparative Neurology. 166 (4), 469-489 (1976).</li>
<li>Shao, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spontaneous+synaptic+activity+in+chick+vestibular+nucleus+neurons+during+the+perinatal+period%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Spontaneous synaptic activity in chick vestibular nucleus neurons during the perinatal period.</a> Neuroscience. 127 (1), 81-90 (2004).</li>
<li>Fukui, I., Ohmori, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tonotopic+gradients+of+membrane+and+synaptic+properties+for+neurons+of+the+chicken+nucleus+magnocellularis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Tonotopic gradients of membrane and synaptic properties for neurons of the chicken nucleus magnocellularis.</a> Journal of Neuroscience. 24 (34), 7514-7523 (2004).</li>
<li>Sanchez, J. T., Seidl, A. H., Rubel, E. W., Barria, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+and+culture+of+chicken+auditory+brainstem+slices%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Preparation and culture of chicken auditory brainstem slices.</a> Journal of Visualized Experiments. (49), e2527(2011).</li>
<li>Sanchez, J. T., Lu, Y. Glutamate signaling in the auditory brainstem. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSanchez%2C+JT+%22Auditory+Development+and+Plasticity%3A+Springer+Handbook+of+Auditory+Research%22">Auditory Development and Plasticity: Springer Handbook of Auditory Research</a>. Fay, R. R., Popper, A. N., Cramer, K., Coffin, A. 64 (4), Springer. New York, NY. 75-108 (2017).</li>
<li>Parks, T. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Morphology+of+axosomatic+endings+in+an+avian+cochlear+nucleus%3A+nucleus+magnocellularis+of+the+chicken%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Comparative+Neurology%22%5BJournal%5D)">Morphology of axosomatic endings in an avian cochlear nucleus: nucleus magnocellularis of the chicken.</a> Journal of Comparative Neurology. 203 (3), 425-440 (1981).</li>
<li>Jhaveri, S., Morest, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sequential+alterations+of+neuronal+architecture+in+nucleus+magnocellularis+of+the+developing+chicken%3A+a+Golgi+study%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Sequential alterations of neuronal architecture in nucleus magnocellularis of the developing chicken: a Golgi study.</a> Neuroscience. 7 (4), 837-853 (1982).</li>
<li>Carr, C. E., Boudreau, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Central+projections+of+auditory+nerve+fibers+in+the+barn+owl%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Comparative+Neurology%22%5BJournal%5D)">Central projections of auditory nerve fibers in the barn owl.</a> Journal of Comparative Neurology. 314 (2), 306-318 (1991).</li>
<li>Köppl, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Auditory+nerve+terminals+in+the+cochlear+nucleus+magnocellularis%3A+differences+between+low+and+high+frequencies%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Comparative+Neurology%22%5BJournal%5D)">Auditory nerve terminals in the cochlear nucleus magnocellularis: differences between low and high frequencies.</a> Journal of Comparative Neurology. 339 (3), 438-446 (1994).</li>
<li>Fukui, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improvement+of+phase+information+at+low+sound+frequency+in+nucleus+magnocellularis+of+the+chicken%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurophysiology%22%5BJournal%5D)">Improvement of phase information at low sound frequency in nucleus magnocellularis of the chicken.</a> Journal of Neurophysiology. 96 (2), 633-641 (2006).</li>
<li>Wang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Postsynaptic+FMRP+regulates+synaptogenesis+in+vivo+in+the+developing+cochlear+nucleus%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Postsynaptic FMRP regulates synaptogenesis in vivo in the developing cochlear nucleus.</a> Journal of Neuroscience. 38 (29), 6445-6460 (2018).</li>
<li>Lu, T., Cohen, A. L., Sanchez, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+ovo+electroporation+in+the+chicken+auditory+brainstem%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">In ovo electroporation in the chicken auditory brainstem.</a> Journal of Visualized Experiments. (124), e55628(2017).</li>
<li>Hong, H., Sanchez, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Need+for+speed+and+precision%3A+structural+and+functional+specialization+in+the+cochlear+nucleus+of+the+avian+auditory+system%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Need for speed and precision: structural and functional specialization in the cochlear nucleus of the avian auditory system.</a> Journal of Experimental Neuroscience. (12), 1-16 (2018).</li>
<li>Hong, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diverse+intrinsic+properties+shape+functional+phenotype+of+low-frequency+neurons+in+the+auditory+brainstem%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Cellular+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Diverse intrinsic properties shape functional phenotype of low-frequency neurons in the auditory brainstem.</a> Frontiers in Cellular Neuroscience. 12, 1-24 (2018).</li>
<li>Wang, X., Hong, H., Brown, D. H., Sanchez, J. T., Wang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+neural+properties+in+the+low-frequency+region+of+the+chicken+cochlear+nucleus+magnocellularis%5BTitle%5D)+AND+%22eNeuro%22%5BJournal%5D)">Distinct neural properties in the low-frequency region of the chicken cochlear nucleus magnocellularis.</a> eNeuro. 4 (2), 1-26 (2017).</li>
<li>Tabor, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tonotopic+organization+of+the+superior+olivary+nucleus+in+the+chicken+auditory+brainstem%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Comparative+Neurology%22%5BJournal%5D)">Tonotopic organization of the superior olivary nucleus in the chicken auditory brainstem.</a> Journal of Comparative Neurology. 520 (7), 1493-1508 (2012).</li>
<li>Lipovsek, M., Wingate, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conserved+and+divergent+development+of+brainstem+vestibular+and+auditory+nuclei%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">Conserved and divergent development of brainstem vestibular and auditory nuclei.</a> Elife. 7, 40232(2018).</li>
<li>Passetto, M. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Morphometric+analysis+of+the+AMPA-type+neurons+in+the+Deiter%27s+vestibular+complex+of+the+chick+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Chemical+Neuroanatomy%22%5BJournal%5D)">Morphometric analysis of the AMPA-type neurons in the Deiter's vestibular complex of the chick brain.</a> Journal of Chemical Neuroanatomy. 35 (4), 334-345 (2008).</li>
<li>Curry, R. J., Lu, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intrinsic+properties+of+avian+interaural+level+difference+sound+localizing+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Research%22%5BJournal%5D)">Intrinsic properties of avian interaural level difference sound localizing neurons.</a> Brain Research. 1752, 147258(2021).</li>
<li>Aleksandrowicz, E., Herr, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ethical+euthanasia+and+short-term+anesthesia+of+the+chick+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22ALTEX+-+Alternatives+to+Animal+Experimentation%22%5BJournal%5D)">Ethical euthanasia and short-term anesthesia of the chick embryo.</a> ALTEX - Alternatives to Animal Experimentation. 32 (2), 143-147 (2015).</li>
<li>Palkovits, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolated+removal+of+hypothalamic+or+other+brain+nuclei+of+the+rat%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Research%22%5BJournal%5D)">Isolated removal of hypothalamic or other brain nuclei of the rat.</a> Brain Research. 14 (59), 449-450 (1973).</li>
</ol>

Wszyscy autorzy oświadczają, że badanie zostało przeprowadzone bez jakiegokolwiek interesu komercyjnego lub finansowego oraz że nie mają żadnego konfliktu interesów.

Przekroje koronalne embrionalnej tkanki pnia mózgu kurczaka pozwoliły na badanie względnej indywidualnej blaszki o częstotliwości izoseksualnejprzez dziesięciolecia 1,2,5. Jednak tonotopowa (tj. częstotliwościowa) organizacja słuchowego pnia mózgu kurczaka jest topologicznie zawiła i może być bardziej dostępna w innych osiach anatomicznych w zależności od konkretnego pytania badawczego. Chociaż jest to wystarczające do zbadania anatomicznych i fizjologicznych kwestii odnoszących się do poszczególnych regionów o częstotliwości izoczęstotliwości, badanie zmian tonotopowych i ich rozwoju w większych obszarach słuchowych pnia mózgu jest nieco ograniczone przez przekroje koronalne. Aby przezwyciężyć to ograniczenie, protokół ten opisuje podejścia w płaszczyźnie strzałkowej, poziomej i poziomej/poprzecznej, aby dostarczyć dodatkowych przykładów słuchowej tkanki pnia mózgu, która wykazuje maksymalne właściwości tonotopowe i gradienty w pojedynczym odcinku pnia mózgu.
Strzałkowe odcinki słuchowych obszarów pnia mózgu pokazują, że różne obszary tonotopowe są rozmieszczone w większym regionie w obrębie wycinka w porównaniu z odcinkami koronalnymi (strzałkowy obszar słuchowy = ~ 300-600 μm, obszar słuchowy koronalny = ~ 200-350 μm). Na przykład regiony NM i NL uwidoczniono na większym obszarze wzdłuż osi ostro-ogonowej w przekrojach strzałkowych (np. Ryc. 2B), a funkcjonalny gradient tonotopowy, który biegnie wzdłuż tej osi anatomicznej, był w dużej mierze zawarty w pojedynczym wycinku strzałkowym. Zostało to dodatkowo potwierdzone zapisami cęgów prądowych wewnętrznych różnic neuronalnych, które zmieniają się wzdłuż gradientu rostralno-ogonowego, jak wcześniej zgłoszono 14,15 (np. Figura 3C, D). Przyszłe eksperymenty, które podkreślą właściwości anatomiczne i immunohistochemiczne wzdłuż osi tonotopowej, mogą dokładniej zbadać znane gradienty właściwości słuchowych w obrębie pojedynczej strzałkowej płaszczyzny warstwy. Należą do nich między innymi barwienie MAP2 i wzorce ekspresji kanału potasowego, które są znanymi gradientami architektury dendrytycznej i wewnętrznych właściwości NM i NL, które zostały wcześniej wykazane w kolejnych sekcjach koronalnych16.
Poziome odcinki słuchowych obszarów pnia mózgu pokazują, że NM i NL znajdują się w kierunku linii środkowej. Część słuchowych włókien aksonalnych biegnie po przekątnej lub prostopadle do płaszczyzny poziomej (ryc. 4). Za tymi włóknami można podążać, wykonując ostry kątowy plaster pod kątem 45° do płaszczyzny strzałkowej. Powstałe poziome/poprzeczne warstwy były większe niż plastry strzałkowe lub poziome, a długie włókna aksonalne przebiegały przez oś ostro-ogonową zarówno po stronie ipsilateralnej, jak i przeciwległej. Zarówno NM, jak i NL można wizualizować w większym obszarze przekątnej (~400-700 μm), dzięki czemu połączenia kontralateralne można wizualizować wzdłuż osi boczno-przyśrodkowej. Dodatkowo, pozioma/poprzeczna płaszczyzna przekroju pokazuje również, w jaki sposób obszary słuchowe i wynikający z tego gradient tonotopowy dokonują zwrotu kątowego (ryc. 5). Kątowa ekspozycja połączeń kontralateralnych na większym obszarze sprawia, że wycinki te są bardziej odpowiednie do stymulacji elektrofizjologicznej i badań mikroobwodów niż tradycyjne plastry koronalne.
Dodatkowe atuty Tworzenie mikroobwodów słuchowych wymaga czasoprzestrzennej koordynacji sygnałów, które sprzyjają przetrwaniu neuronów, synaptogenezie, różnicowaniu aksonów, architekturze dendrytycznej i dojrzewaniu. W ten sposób alternatywne sekcje pnia mózgu mikroukładu słuchowego zarodka kurzego mogą być wykorzystane do następujących tematów badawczych: morfologiczna organizacja neuronów w topograficznie różnych wymiarach; organizowanie i mapowanie konektomów wszystkich jąder słuchowych i przedsionkowych; identyfikacja i charakterystyka wzorców aktywności składników obwodów w płaszczyznach izoczęstotliwości i tonotopów; topograficzna organizacja mikroobwodów pobudzających i hamujących oraz relacje z wyspecjalizowanymi populacjami neuronów (jądrami); lokalizacja przestrzenna neuronów jąder słuchowych i ich predykcyjna mukowiscydoza17; systematyczne celowanie w określone tonotopowe typy neuronów; śledzenie komórek progenitorowych i ich rozwoju w konserwatywne jądra; genetyczna linia komórek do ewolucji obwodów neuronalnych18; porównawcza anatomia pnia mózgu między gatunkami; badanie obwodów przedsionkowych, takich jak kompleks przedsionkowy Deitera (DC)19; oraz synchronizacja i przesłuch między jądrami przedsionkowymi.
Wieloaspektowe podejście wykorzystujące różne płaszczyzny warstw może pomóc w znalezieniu odpowiedzi na fundamentalne pytania dotyczące nieznanych właściwości anatomicznych i biofizycznych mikroobwodów pnia mózgu. Dobrym przykładem jest związek między głównymi jądrami słuchowymi (NM, NA, NL i SON) a jądrami przedsionkowymi, w tym jądrem grzbietowym lemniscusa bocznego (LLDp), jądrem półksiężycowatym (SLu)20 i jądrem stycznym (TN)3. Jednak ten protokół i te badania oparte na wycinkach mają pewne ograniczenia.
Środki ostrożności i ograniczenia W zależności od instytucji przeprowadzającej eksperymenty, wytyczne etyczne i postępowanie z zarodkami kurczaków mogą się różnić. Podczas gdy wytyczne National Institutes of Health dotyczące opieki i wykorzystywania zwierząt laboratoryjnych zezwalają na szybkie ścięcie głowy, istnieją alternatywne metody eutanazji zarodkówkurczaków. Wcześnie rozwijająca się tkanka pnia mózgu zarodka kurczaka jest miękka i delikatna w porównaniu ze starszymi zarodkami. Ma kilka połączeń i naczyń krwionośnych na powierzchni, które wymagają szczególnej ostrożności podczas ich usuwania. Tkanka powinna być przechowywana w lodowatym dACSF i perfuzji z 95% O2/5% CO2 w celu zwiększenia żywotności.
Metoda krojenia strzałkowego jest przydatna tylko w tonotopii ipsilateralnej. Ta metoda krojenia zapewnia większe plasterki niż plastry koronalne, których obsługa może być niepewna. Można jednak przycinać plastry za pomocą metod krzyżowych opisanych szczegółowo w innym miejscu22. Użycie 4% bloku agarozy LMP osadzonego w pniu mózgu może uratować delikatne struktury w plastrach, ale należy uważać, aby nie wlać zbyt gorącej agarozy. Szybkie ustawienie poprzez umieszczenie zablokowanego przez agarozę pnia mózgu w chłodnym środowisku na ~1 minutę sprawia, że plasterki są bardziej opłacalne w przypadku nagrań elektrofizjologicznych.
Nakładanie superglue w nadmiernych ilościach może być toksyczne. Należy go nakładać w minimalnym stopniu, a nadmiar należy natychmiast zmyć poprzez wymianę dACSF. W przypadku plastrów o ostrym kącie (45°) cięcie kąta bloku agarozy ma kluczowe znaczenie; Można użyć lustra, aby zobaczyć przedni kąt podczas cięcia bloku agarozy ostrym ostrzem. Dostępne w handlu ostrza mogą mieć powłokę woskową, którą należy zetrzeć alkoholem i wysuszyć przed użyciem. Wymagana jest optymalizacja szybkości i częstotliwości cięcia wibratomu, ponieważ kępki włókien aksonalnych są twardsze niż tkanka korowa lub macierzowa. Utrzymanie wysokiej amplitudy i stosowanie schłodzonego roztworu preparacyjnego może zapobiec uszkodzeniu tkanek.
Wszystkie roztwory powinny być przygotowane świeże, a Ca2+ i Mg2+ należy dodać do ACSF po bulgotaniu 95% O2/5% CO2 . W przeciwnym razie mogą wystąpić opady Ca2+. Do delikatnego obchodzenia się z plastrami w wibratomie należy użyć pędzla. Jeśli to możliwe, utrzymuj całkowity czas krojenia poniżej 15 minut. Szklana pipeta Pasteura może być używana do manewrowania plasterkami pnia mózgu.
Nie używaj detergentów ani środków piorących do szkła i sprzętu, który ma kontakt z plastrami stosowanymi w elektrofizjologii. Wykonane zdjęcia przedstawiają wygląd tkanki o grubości 200-300 μM w optyce z kontrastem interferencyjnym (DIC). Jakość wizualna będzie gorsza niż immunohistochemia czy mikroskopia elektronowa, ale dokładnie oddaje to, co zobaczy eksperymentator podczas wykonywania zapisów elektrofizjologicznych.
Badania dotyczące wczesnego rozwoju mikroobwodów wzdłuż alternatywnej osi anatomicznej, niezależnie od tego, czy są one grzbietowo-brzuszne, rostralno-ogonowe, czy ipsilateralno-przeciwstronne, są ograniczone w słuchowym pniu mózgu kurczaka. Jednym z powodów takiego stanu rzeczy jest to, że rola kodów transkrypcyjnych i regulacja rozwoju tonotopowego w pniu mózgu wciąż nie jest w pełni poznana. Zjawiska funkcjonalne, takie jak modulacja odgórna i spontaniczna aktywność, są często tracone podczas obserwacji aktywności in vitro. Jednak badania in vivo są uzupełniane specyficznymi i bezpośrednimi zapisami pojedynczych neuronów, które są możliwe tylko w tych warunkach warstwowych. Udoskonalenie metody pozyskiwania tkanki pnia mózgu w różnych orientacjach może dostarczyć wnikliwych informacji na temat rozwoju i złożoności gradientów tonotopowych w mikroobwodach słuchowych pnia mózgu kurczaków.

Embrion kurczaka jest cennym modelem badawczym do badania podstawowych zagadnień biologicznych w licznych i różnorodnych dziedzinach naukowych, takich jak biologia komórki, immunologia, patologia i neurobiologia rozwojowa. Mikroobwody słuchowego pnia mózgu kurczaka są doskonałym przykładem wysoce wyspecjalizowanego obwodu, który można zrozumieć pod względem morfologii słuchowej i fizjologii. Na przykład Rubel i Parks (1975) po raz pierwszy opisali orientację tonotopową (tj. gradient częstotliwości) jądra magnocellularis kurczaka (NM) i jądra blaszkowego (NL) jako funkcję liniową w poprzek osi jąder, zorientowaną pod kątem ~30° w stosunku do płaszczyzny strzałkowej. Poszczególne neurony w NM i NL kodują swoją najlepszą częstotliwość dźwiękową - znaną jako częstotliwość charakterystyczna (CF) - wzdłuż płaszczyzny rostralno-przyśrodkowej do obszaru ogonowo-bocznego. Neurony wrażliwe na wysoką częstotliwość znajdują się w obszarze rostralno-przyśrodkowym, a neurony wrażliwe na niską częstotliwość są zlokalizowane ogonowo-bocznie. W związku z tym tradycyjne metody preparacji słuchowej tkanki pnia mózgu w celu zbadania właściwości tonotopowych wykorzystywały kolejne wycinki koronalne. Rzeczywiście, mikroukłady słuchowe rozwijających się zarodków kurczaków zostały stworzone jako modelowy system do badania przetwarzania sygnałów tonotopowych funkcji słuchowych poprzez kolejne wycinki pnia mózgu od ogona do rostralu w płaszczyźnie koronalnej od dziesięcioleci1,2,3,4,5,6.
Jednak organizacja tonotopowa NM i NL jest topologicznie i morfologicznie zawiła. Sygnały wejściowe nerwu słuchowego są rozprowadzone w taki sposób, że sygnały wejściowe o wysokiej mukowiscydozie kończą się strukturami podobnymi do cebulek, które pokrywają co najmniej jedną czwartą obwodu somatycznego komórki przydatkowej NM. I odwrotnie, wejścia o niskiej CF nie są zorganizowane z końcówkami przypominającymi bańki, ale z wieloma synapsami bouton na dendrytach neuronów NM. Środkowe wejścia CF kończą się zarówno jako synapsy przypominające żarówkę końcową, jak i bulion4,7,8,9,10,11,12. W Holandii wysoce stereotypowy gradient dendrytyczny jest widoczny nie tylko w długości dendrytycznej, ale także w szerokości dendrytycznej. Ten unikalny gradient dendrytyczny ściśle przylega do osi tonotopowej. Dendryty ulegają 11-krotnemu wzrostowi długości i pięciokrotnemu wzrostowi szerokości odpowiednio od neuronów o wysokiej i niskiej CF6. Aby przezwyciężyć tak zawiłe rozmieszczenie tych jąder w warstwach koronalnych, protokół ten opisuje podejścia do preparacji w płaszczyźnie strzałkowej, poziomej i poziomej/poprzecznej. Te techniki krojenia dostarczają przykładów słuchowej tkanki pnia mózgu, która wykazuje maksymalne właściwości tonotopowe w pojedynczej płaszczyźnie warstwy.

<table><tbody><tr><td>Adobe Photoshop 2021</td><td>Adobe</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Stół antywibracyjny 30"x 36" - OTMC - 63533</td><td>TMC</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Standardowe oprogramowanie Cell sens</td><td>URZĄDZENIA</td> MOLEKULARNE OLYMPUS <td></td><td></td></tr><tr><td>Digidata 1440A Wzmacniacz</td><td></td> cyfrowy&nbsp; Multiclamp 700B Urządzenia molekularne Linia DSK <td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> linearslicer pro7</td><td>TED PELLA, INC</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mikromanipulator MPC-385 / OSI-MPC-385-2</td><td>OLYMPUS AMERICA INC</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ściągacz do mikropipet P-97</td><td>SUTTER INSTRUMENTS Mikroskop</td><td></td><td></td></tr><tr><td>BX51W1</td><td>OLYMPUS AMERICA INC</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MS ICE oprogramowanie</td><td>Microsoft Corporation</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ohaus model wagi AV212</td><td>Ohaus Kamera Adventurer</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Olympus DPSI0 / DPS80</td><td>Oprogramowanie do</td> akwizycji danych OLYMPUS <td></td><td></td></tr><tr><td>pClamp i Axoclamp</td><td>URZĄDZENIA MOLEKULARNE</td><td></td><td></td></tr><tr><td>pH-metr lab 850 stacjonarne</td><td>SCHOTT INSTRUMENTS</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ostre ostrze ze stali nierdzewnej</td><td>Dorco/Personna</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Osmometr ciśnienia pary model 5600</td><td>WESCOR INC</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Systemy uzdatniania wody Smart2pure 6UV/UF</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Chemicals- lista</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Agrose Niskotopliwy IB70051</td><td>IBI SCIENTIFIC</td><td></td><td></td></tr><tr><td>CaCl2 (Chlorek wapnia)</td><td>ACROS organics</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cynergy klej błyskawiczny CA6001</td><td>Resinlab</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dekstroza (D-(+)-glukoza)</td><td>VWR Life Science</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Alkohol etylowy</td><td>IBI SCIENTIFIC</td><td></td><td></td></tr><tr><td>KCl (chlorek potasu)</td><td>Amresco.Inc</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MgCl2 (Chlorek magnezu)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>NaCl (Chlorek sodu)</td><td>Amresco.Inc</td><td></td><td></td></tr><tr><td>NaH2PO4 (Diwodorofosforan sodu)</td><td>Amresco.Inc</td><td></td><td></td></tr><tr><td>NaHCO3 (wodorowęglan sodu)</td><td>Amresco.Inc</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

krojenie embrionalnego słuchowego pnia mózgu kurczaka w celu oceny gradientów tonotopowych i mikroobwodów

Slicing the Embryonic Chicken Auditory Brainstem to Evaluate Tonotopic Gradients and Microcircuits

Zarodek kurczaka jest powszechnie akceptowanym modelem zwierzęcym do badania słuchowego pnia mózgu, składającym się z wysoce wyspecjalizowanych mikroobwodów i topologii neuronalnej zorientowanych różnie wzdłuż osi tonotopowej (tj. częstotliwości). Oś tonotopowa umożliwia segregowane kodowanie dźwięków o wysokiej częstotliwości w płaszczyźnie rostralno-przyśrodkowej i kodowanie niskich częstotliwości w obszarach ogonowo-bocznych. Tradycyjnie, koronalne wycinki pnia mózgu tkanki embrionalnej pozwalają na badanie względnej indywidualnej blaszki o częstotliwości izotypowej. Chociaż jest to wystarczające do zbadania anatomicznych i fizjologicznych pytań dotyczących poszczególnych regionów o częstotliwości izoczęstotliwości, badanie zmienności tonotopowej i jej rozwoju w większych obszarach słuchowych pnia mózgu jest nieco ograniczone. Protokół ten opisuje techniki krojenia pnia mózgu z zarodków kurczaków, które obejmują większe gradienty obszarów częstotliwości w dolnym słuchowym pniu mózgu. Wykorzystanie różnych metod krojenia tkanki słuchowej pnia mózgu kurczaka pozwala na eksperymenty elektrofizjologiczne i anatomiczne w obrębie jednego wycinka pnia mózgu, gdzie większe gradienty właściwości tonotopowych i trajektorii rozwojowych są lepiej zachowane niż przekroje koronalne. Wiele technik krojenia pozwala na lepsze badanie różnorodnych właściwości anatomicznych, biofizycznych i tonotopowych słuchowych mikroobwodów pnia mózgu.

Tutaj prezentujemy protokół uzyskiwania niekoronalnych warstw słuchowych pnia mózgu zarodka kurczaka w celu zbadania właściwości tonotopowych i trajektorii rozwojowych w obrębie jednego wycinka pnia mózgu. Przekroje te obejmują przekroje strzałkowe, poziome i poziome/poprzeczne obejmujące większe obszary tonotopowe w pojedynczej płaszczyźnie przekroju niż tradycyjne sekcje koronalne.

Krojenie embrionalnego słuchowego pnia mózgu kurczaka w celu oceny gradientów tonotopowych i mikroobwodów

The chicken embryo is a widely accepted animal model to study the auditory brainstem, composed of highly specialized microcircuitry and neuronal topology ...

Metoda ta polega na pozyskiwaniu żywych wycinków słuchowego pnia mózgu kurczaka, który obejmuje większy gradient obszaru częstotliwości w tym samym wycinku. Plastry te nadają się do eksperymentów elektrofizjologicznych i anatomicznych z większą osią tonotopową. Metodologia ta pomoże zrozumieć rozwój mikroukładów w słuchowym pniu mózgu.Chociaż anatomia jest specyficzna dla kurczaka, inne gatunki ptaków, takie jak przepiórki i ptaki śpiewające, mają podobną anatomię. Na początek wysterylizuj jaja 70% etanolem i inkubuj je w temperaturze 38 stopni Celsjusza i wilgotności 50%. Następnie ustaw szybkość bulgotania dla ACSF tak, aby pH wynosiło od 7,2 do 7,4 z osmolalnością od 300 do 310 miliosmolarów na litr.Następnie wymieszaj pięć gramów agarozy w 100 mililitrach dACSF. Całkowicie rozpuść agarozę w łaźni wodnej lub kuchence mikrofalowej, aż agaroza zacznie bulgotać. Wlej stopioną agarozę na szalkę Petriego o grubości do pięciu milimetrów i trzymaj w temperaturze pokojowej do stężenia.Po zastygnięciu zamknij szalkę Petriego i przechowuj w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Pokrój agarozę na bloki kabiny do użycia w czasie sekcji. Najpierw oczyść obszar sekcji za pomocą 70% etanolu.Przyklej podtrzymujący lub ustawiony pod kątem blok agarozy do tacki na wibratomy. Umieść jajko w jasnym świetle i zlokalizuj wypełnioną powietrzem przestrzeń po większej lub bardziej okrągłej stronie jajka, a następnie rozbij skorupkę nad przestrzenią wypełnioną powietrzem i odsłoń worek membranowy. Wykonaj delikatne nacięcie w worku, aby odsłonić dziób.Skalpelem delikatnie wyciągnij szyję i głowę z jajka. Po ścięciu głowy oczyść głowę schłodzonym dACSF. Trzymaj głowę stabilnie w schłodzonym dACSF i wykonaj nacięcie rostrocaudalne.Rozpocznij nacięcie za oczami i między oczami i podążaj za długością zebranej szyi. Oddziel skórę, aby odsłonić czaszkę. Przetnij czaszkę za okiem w linii środkowej do bocznej.Powtórz dla obu półkul. Pokrój rostralną część czaszki, umieszczając ostrze za oczami i wykonując szybkie cięcie. Następnie zanurz głowę w naczyniu ze schłodzonym dACSF.Używając pary małych nożyczek, wykonaj nacięcia od środkowej do bocznej w okolicy ogonowej czaszki, aby oddzielić mózg bez powodowania uszkodzenia tkanek. Delikatnie odsłoń pień mózgu i móżdżek. Cofnij grzbietową część całej czaszki.Usuń pień mózgu i odsłoń go delikatnym pędzlem za pomocą cienkiego pędzla. Użyj zakrzywionych kleszczy, aby oczyścić pień mózgu z tkanki łączącej i naczyń krwionośnych. Oddziel pień mózgu od móżdżku, przecinając szypułki i ostrożnie usuwając naczynia krwionośne.Przytnij pień mózgu z dodatkowych naczyń krwionośnych. Najpierw umieść ostrze wibratomu wzdłuż osi poziomej. W przypadku plastrów koronalnych przyklej pień mózgu na tacy do krojenia po stronie rostralnej, utrzymując oś rostrocaudalną w pionie.W przypadku plastrów strzałkowych utrzymuj boczną oś przyśrodkową w pionie. W przypadku plastrów poziomych przyklej stronę brzuszną, utrzymując grzbietową oś brzuszną pionowo. Aby uzyskać ostrą kątową strzałkową płaszczyznę poziomą, przyklej brzuszną stronę pnia mózgu tak, aby brzuszna oś grzbietowa była pionowa na bloku agarozy na powierzchni przeciwprostokątnej.Przyklej przeciwległą powierzchnię bloku agarozy skierowaną w stronę tacki do krojenia i utrzymuj oś ostroogonową równolegle do krawędzi ostrza. Jako alternatywę dla krojenia wibratomem, zanurz izolowany pień mózgu w agarozie o niskiej temperaturze topnienia 40% w temperaturze 40 stopni Celsjusza na szalce Petriego o wymiarach 35 na 10 milimetrów. Po zastygnięciu agarozy odetnij blok agarozowy kabiny za pomocą ostrej żyletki.Przyklej blok agarozy po jego stronie rostralnej, utrzymując oś ostrocaudalną pnia mózgu w pionie. Weź wycinki koronalne, aż zobaczysz obszar NM. Usuń blok agarozy z kleju ostrym ostrzem.Za pomocą cienkiej igły delikatnie umieść 0,5 mikrolitra niebieskiego barwnika toluidynowego na NM, aby dostrzec jądra. Ponownie zamontuj ten blok na tacce do krojenia w plastry strzałkowe lub poziome. Zidentyfikuj jądra w odniesieniu do zabarwionego obszaru i przekrój pień mózgu.Po pokrojeniu na sekcje umieść kolejno zebrane plastry o wielkości od 200 do 300 mikronów w komorze z plastrami zawierającej ACSF, aby zrównoważyć przez jedną godzinę w temperaturze pokojowej. Przekroje koronalne tkanki pnia mózgu z zarodka kurczaka od E19 do 21 reprezentują względne obszary izoczęstotliwości jąder słuchowych pnia mózgu od najniższego do najwyższego charakterystycznego obszaru słuchowego. Widoczne były doprowadzające włókna nerwowe słuchowe i rozwidlenie aksonów NM.Zaobserwowano również jądro kątowe. W przekrojach rostralnych jądro oliwkowe górne znajduje się wzdłuż brzusznego bocznego obszaru wycinka koronalnego. W przekrojach strzałkowych zidentyfikowano NM i jądro blaszkowane lub NL w miejscu, w którym włókna nerwu słuchowego wchodziły do skupiska neuronów.Jądro oliwki górne zidentyfikowano w okolicy rostrolateralnej. Zaobserwowano obszary słuchowe o niskiej i wysokiej częstotliwości charakterystycznej od NM i NL wzdłuż osi rostrocogonalnej. Najbardziej przyśrodkowy wycinek pokazywał ipsilateralne i przeciwległe kępki aksonalne oraz punkt końcowy okolicy słuchowej.W warstwach poziomych NM i NL zidentyfikowano w kierunku linii środkowej, a neurony rozsiano wzdłuż bocznej osi przyśrodkowej. Wycinki tkanki pnia mózgu pod ostrym kątem od płaszczyzny poziomej pokazały słuchowe jądra pnia mózgu w poprzek dużej przekątnej. Powiększone obrazy ukazywały oś tonotopową jąder słuchowych wzdłuż osi rostroprzyśrodkowej do ogoniastej bocznej.Upewnij się, że cały proces odbywa się w chłodzonym lodem dACSF stale bąbelkowanym tlenem węglowym. Protokół ten jest używany przez naukowców badających anatomiczne i biofizyczne właściwości rozwijających się mikroobwodów pnia mózgu, w szczególności związek między głównymi jądrami słuchowymi.

slicing-embryonic-chicken-auditory-brainstem-to-evaluate-tonotopic

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Słuchowy pień mózgu kurczaka składa się z jąder odpowiedzialnych za binauralne przetwarzanie dźwięku. Pojedyncza preparacja w przekroju wieńcowym zachowuje cały układ obwodów, podczas gdy podejście z wykorzystaniem kultur komórkowych zapewnia unikalną możliwość badania rozwoju struktury neuronalnej i funkcji słuchowej na poziomach molekularnym, komórkowym i sieciowym.

Przygotowanie i hodowla skrawków pnia mózgu słuchowego kurczaka

Ten film pokazuje proces przygotowywania wycinków mózgu w kształcie klina w warunkach laboratoryjnych. Za pomocą wibratomu wytwarzany jest plasterek w kształcie klina z mózgu myszy o różnej grubości. Ten wycinek zawiera korzeń nerwu słuchowego umieszczony na grubszym końcu, podczas gdy neurony związane ze słuchem znajdują się na cieńszym końcu.

Przygotowanie klinowych wycinków mózgu do wizualizacji neuronów słuchowych

Jak sieci neuronowe są tworzone w embrionalnym mózgu, jest fundamentalnym pytaniem w neurobiologii rozwojowej. Połączyliśmy technikę elektroporacji z nowatorskimi narzędziami genetycznymi, takimi jak plazmidy Cre/Lox i system transpozycji DNA za pośrednictwem PiggyBac w tyłomózgowiu ptaków, aby oznaczyć interneurony grzbietowe i śledzić ich projekcje aksonalne i cele synaptyczne na różnych etapach rozwoju.

Elektroporacja tyłomózgowia w celu śledzenia trajektorii aksonów i celów synaptycznych w zarodku pisklęcia

Kultury Slice ułatwiają manipulowanie rozwojem zarodka za pomocą zaburzeń genowych i farmakologicznych. Jednakże warunki hodowli muszą zapewniać, że normalny rozwój może przebiegać w ograniczonym środowisku wycinka. Ilustrujemy protokół, który ułatwia prawidłowy rozwój rdzenia kręgowego, aby przebiegał przez co najmniej 24 godziny.

Protokół hodowli plastrów rdzenia kręgowego zarodków kurczaka

Tutaj opisujemy technikę mikrodysekcji, po której następuje wstrzyknięcie barwnika fluorescencyjnego do zwoju akustycznego wczesnych zarodków piskląt w celu selektywnego śledzenia włókien aksonu słuchowego w nerwie i tyłomózgowiu.

Selektywne śledzenie włókien słuchowych w ptasim embrionalnym nerwie przedsionkowo-ślimakowym

Narząd słuchowy pośredniczy w słyszeniu. W niniejszej pracy przedstawiono zmodyfikowaną metodę mikroelektroporacji in ovo zoptymalizowaną do badania proliferacji i różnicowania słuchowych komórek progenitorowych w rozwijającym się narządzie słuchowym kurcząt.

Transfer genów do narządu słuchowego kurczaka za pomocą mikroelektroporacji in ovo

Neurony słuchowe pnia mózgu ptaków i ssaków są wyspecjalizowane w szybkim kodowaniu neuronalnym, podstawowym procesie dla normalnych funkcji słuchowych. Neurony te powstają z odrębnych prekursorów embrionalnego tyłomózgowia. Przedstawiamy techniki wykorzystujące elektroporację do ekspresji genów w tyłomózgowiu zarodków kurczaków w celu zbadania funkcji genów podczas rozwoju słuchowego.

In Ovo Elektroporacja w słuchowym pniu mózgu kurczaka

Integracja różnych wejść synaptycznych do neuronów jest najlepiej mierzona w preparacie, który zachowuje wszystkie jądra presynaptyczne dla naturalnego wyczucia czasu i plastyczności obwodów, ale wycinki mózgu zazwyczaj zrywają wiele połączeń. Opracowaliśmy zmodyfikowany wycinek mózgu, aby naśladować aktywność obwodów in vivo, zachowując jednocześnie możliwość eksperymentowania in vitro.

Przygotowanie In Vitro Wedge Slice do naśladowania połączeń obwodów neuronalnych in vivo

Użyliśmy standardowych technik słuchowej reakcji pnia mózgu (ABR) i zastosowaliśmy je do piskląt piskląt, przedwcześnie rozwiniętego ptasiego modelu funkcji słuchowych. Protokół szczegółowo opisuje techniki przygotowania zwierząt i pozyskiwania ABR, wraz z krokami, które mogą przełożyć się na inne modele ptaków lub gryzoni.

Ocena słuchowej odpowiedzi pnia mózgu u piskląt kurcząt

Pisklę jest opłacalnym, dostępnym i szeroko dostępnym organizmem modelowym do różnych badań. W tym miejscu szczegółowo opisano szereg protokołów, aby zrozumieć mechanizmy molekularne leżące u podstaw rozwoju i regeneracji ucha wewnętrznego ptaków.

Metody in ovo i ex ovo do badania rozwoju ucha wewnętrznego ptaków

Korzystając z elektroporacji in ovo, opracowaliśmy metodę selektywnego transfekowania wewnętrznego ucha słuchowego i jądra ślimakowego w zarodkach kurczaków, aby osiągnąć specyficzne dla danej grupy komórek eliminację delikatnego białka X w upośledzeniu umysłowym podczas dyskretnych okresów składania obwodów.

Analiza autonomicznej funkcji białka upośledzenia umysłowego Fragile X w obwodzie słuchowym za pomocą elektroporacji in ovo

Poznaj metodę krojenia embrionalnego słuchowego pnia mózgu kurczaka w celu oceny gradientów tonotopowych i mikroobwodów. Ta technika umożliwia badanie większych regionów tonotopowych w jednym plastrze.

Krojenie embrionalnego słuchowego pnia mózgu kurczaka w celu oceny gradientów tonotopowych i mikroobwodów

Przeglądaj więcej filmów