Krojenie embrionalnego słuchowego pnia mózgu kurczaka w celu oceny gradientów tonotopowych i mikroobwodów

Metoda ta polega na pozyskiwaniu żywych wycinków słuchowego pnia mózgu kurczaka, który obejmuje większy gradient obszaru częstotliwości w tym samym wycinku. Plastry te nadają się do eksperymentów elektrofizjologicznych i anatomicznych z większą osią tonotopową. Metodologia ta pomoże zrozumieć rozwój mikroukładów w słuchowym pniu mózgu.

Chociaż anatomia jest specyficzna dla kurczaka, inne gatunki ptaków, takie jak przepiórki i ptaki śpiewające, mają podobną anatomię. Na początek wysterylizuj jaja 70% etanolem i inkubuj je w temperaturze 38 stopni Celsjusza i wilgotności 50%. Następnie ustaw szybkość bulgotania dla ACSF tak, aby pH wynosiło od 7,2 do 7,4 z osmolalnością od 300 do 310 miliosmolarów na litr.

Następnie wymieszaj pięć gramów agarozy w 100 mililitrach dACSF. Całkowicie rozpuść agarozę w łaźni wodnej lub kuchence mikrofalowej, aż agaroza zacznie bulgotać. Wlej stopioną agarozę na szalkę Petriego o grubości do pięciu milimetrów i trzymaj w temperaturze pokojowej do stężenia.

Po zastygnięciu zamknij szalkę Petriego i przechowuj w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Pokrój agarozę na bloki kabiny do użycia w czasie sekcji. Najpierw oczyść obszar sekcji za pomocą 70% etanolu.

Przyklej podtrzymujący lub ustawiony pod kątem blok agarozy do tacki na wibratomy. Umieść jajko w jasnym świetle i zlokalizuj wypełnioną powietrzem przestrzeń po większej lub bardziej okrągłej stronie jajka, a następnie rozbij skorupkę nad przestrzenią wypełnioną powietrzem i odsłoń worek membranowy. Wykonaj delikatne nacięcie w worku, aby odsłonić dziób.

Skalpelem delikatnie wyciągnij szyję i głowę z jajka. Po ścięciu głowy oczyść głowę schłodzonym dACSF. Trzymaj głowę stabilnie w schłodzonym dACSF i wykonaj nacięcie rostrocaudalne.

Rozpocznij nacięcie za oczami i między oczami i podążaj za długością zebranej szyi. Oddziel skórę, aby odsłonić czaszkę. Przetnij czaszkę za okiem w linii środkowej do bocznej.

Powtórz dla obu półkul. Pokrój rostralną część czaszki, umieszczając ostrze za oczami i wykonując szybkie cięcie. Następnie zanurz głowę w naczyniu ze schłodzonym dACSF.

Używając pary małych nożyczek, wykonaj nacięcia od środkowej do bocznej w okolicy ogonowej czaszki, aby oddzielić mózg bez powodowania uszkodzenia tkanek. Delikatnie odsłoń pień mózgu i móżdżek. Cofnij grzbietową część całej czaszki.

Usuń pień mózgu i odsłoń go delikatnym pędzlem za pomocą cienkiego pędzla. Użyj zakrzywionych kleszczy, aby oczyścić pień mózgu z tkanki łączącej i naczyń krwionośnych. Oddziel pień mózgu od móżdżku, przecinając szypułki i ostrożnie usuwając naczynia krwionośne.

Przytnij pień mózgu z dodatkowych naczyń krwionośnych. Najpierw umieść ostrze wibratomu wzdłuż osi poziomej. W przypadku plastrów koronalnych przyklej pień mózgu na tacy do krojenia po stronie rostralnej, utrzymując oś rostrocaudalną w pionie.

W przypadku plastrów strzałkowych utrzymuj boczną oś przyśrodkową w pionie. W przypadku plastrów poziomych przyklej stronę brzuszną, utrzymując grzbietową oś brzuszną pionowo. Aby uzyskać ostrą kątową strzałkową płaszczyznę poziomą, przyklej brzuszną stronę pnia mózgu tak, aby brzuszna oś grzbietowa była pionowa na bloku agarozy na powierzchni przeciwprostokątnej.

Przyklej przeciwległą powierzchnię bloku agarozy skierowaną w stronę tacki do krojenia i utrzymuj oś ostroogonową równolegle do krawędzi ostrza. Jako alternatywę dla krojenia wibratomem, zanurz izolowany pień mózgu w agarozie o niskiej temperaturze topnienia 40% w temperaturze 40 stopni Celsjusza na szalce Petriego o wymiarach 35 na 10 milimetrów. Po zastygnięciu agarozy odetnij blok agarozowy kabiny za pomocą ostrej żyletki.

Przyklej blok agarozy po jego stronie rostralnej, utrzymując oś ostrocaudalną pnia mózgu w pionie. Weź wycinki koronalne, aż zobaczysz obszar NM. Usuń blok agarozy z kleju ostrym ostrzem.

Za pomocą cienkiej igły delikatnie umieść 0,5 mikrolitra niebieskiego barwnika toluidynowego na NM, aby dostrzec jądra. Ponownie zamontuj ten blok na tacce do krojenia w plastry strzałkowe lub poziome. Zidentyfikuj jądra w odniesieniu do zabarwionego obszaru i przekrój pień mózgu.

Po pokrojeniu na sekcje umieść kolejno zebrane plastry o wielkości od 200 do 300 mikronów w komorze z plastrami zawierającej ACSF, aby zrównoważyć przez jedną godzinę w temperaturze pokojowej. Przekroje koronalne tkanki pnia mózgu z zarodka kurczaka od E19 do 21 reprezentują względne obszary izoczęstotliwości jąder słuchowych pnia mózgu od najniższego do najwyższego charakterystycznego obszaru słuchowego. Widoczne były doprowadzające włókna nerwowe słuchowe i rozwidlenie aksonów NM.

Zaobserwowano również jądro kątowe. W przekrojach rostralnych jądro oliwkowe górne znajduje się wzdłuż brzusznego bocznego obszaru wycinka koronalnego. W przekrojach strzałkowych zidentyfikowano NM i jądro blaszkowane lub NL w miejscu, w którym włókna nerwu słuchowego wchodziły do skupiska neuronów.

Jądro oliwki górne zidentyfikowano w okolicy rostrolateralnej. Zaobserwowano obszary słuchowe o niskiej i wysokiej częstotliwości charakterystycznej od NM i NL wzdłuż osi rostrocogonalnej. Najbardziej przyśrodkowy wycinek pokazywał ipsilateralne i przeciwległe kępki aksonalne oraz punkt końcowy okolicy słuchowej.

W warstwach poziomych NM i NL zidentyfikowano w kierunku linii środkowej, a neurony rozsiano wzdłuż bocznej osi przyśrodkowej. Wycinki tkanki pnia mózgu pod ostrym kątem od płaszczyzny poziomej pokazały słuchowe jądra pnia mózgu w poprzek dużej przekątnej. Powiększone obrazy ukazywały oś tonotopową jąder słuchowych wzdłuż osi rostroprzyśrodkowej do ogoniastej bocznej.

Upewnij się, że cały proces odbywa się w chłodzonym lodem dACSF stale bąbelkowanym tlenem węglowym. Protokół ten jest używany przez naukowców badających anatomiczne i biofizyczne właściwości rozwijających się mikroobwodów pnia mózgu, w szczególności związek między głównymi jądrami słuchowymi.