Name: Ocena słuchowej odpowiedzi pnia mózgu u piskląt kurcząt (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-04-01T14:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 32 s
Description: Poznaj metodę ABR do oceny słuchu u piskląt kurcząt. Nieinwazyjna technika elektrofizjologiczna pozwala badać funkcje słuchowe i wpływ czynników genetycznych na rozwój słuchu.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca jest wspierana przez NIH/NIDCD R01 DC017167

Opisane tutaj eksperymenty zostały zatwierdzone przez Komitety ds. Opieki nad Zwierzętami i Użytkowania Zwierząt Uniwersytetu Northwestern (IACUC) i przeprowadzone zgodnie z Przewodnikiem National Institutes of Health dotyczącym opieki i użytkowania zwierząt laboratoryjnych.
1. Hodowla kurczaków
<ol>
	<li>Zdobądź zapłodnione białe jaja kurze leghorn. 
	UWAGA: W badaniach naukowych wykorzystuje się kilka ras kurczaków, ale przedstawione tutaj wyniki pochodzą od białego kurczaka leghorn (Gallus gallus domesticus). Chociaż zmienność ABR między rasami jest nieznana, stwierdzono pewne różnice podczas porównywania dorosłych kurcząt znoszących jaja z brojlerami produkującymi mięso24,25.</li>
	<li>Jaja wysiadywać w temperaturze 38 °C, wilgotności 50%, przez 21 dni przed pożądaną datą badania. 
	UWAGA: Jeśli jaja nie są natychmiast inkubowane w temperaturze 38 °C, można je przechowywać w temperaturze 14 °C, przy wilgotności 40%. Jednak im dłużej jaja są trzymane w temperaturze 14 °C, tym mniejsze prawdopodobieństwo, że wykształcą się w zdolne do życia pisklęta. Po 7 dniach żywotność jaj może spaść nawet do 50%, w zależności od tego, jak długo jaja są przechowywane w temperaturze 14 °C. Żywotność jaj spada również w miesiącach zimowych.</li>
	<li>Okresowo obracaj jajka 2-3 razy dziennie. Większość inkubatorów jest wyposażona w mechanizm, który wykonuje to automatycznie.</li>
	<li>W przypadku korzystania z inkubatora styropianowego lub inkubatora zawierającego więcej niż 6 jaj, jaja należy przenieść do małego inkubatora w temperaturze 38 °C dzień przed wykluciem, w 20. dniu zarodkowym (E20). Jaja powinny wykluć się 21 dni (E21) po umieszczeniu w inkubatorze. 
	UWAGA: W procesie wylęgu zwierzę zacznie "wyciskać" się z jaja, tworząc mały otwór, który ostatecznie otacza całe jajo. Jeśli warunki są zbyt suche, jajo może wyschnąć, a zwierzę nie będzie w stanie się wykluć. Wilgotność powinna być utrzymywana na poziomie około 50%, w oparciu o wcześniejsze badania dotyczące żywotności wylęgu jaj26,27,28,29.</li>
	<li>Określ wiek zwierzęcia. Jeśli wylęg nie jest obserwowany osobiście, jedyną wskazówką wieku są 2-3 godziny potrzebne do wyschnięcia płynu owodniowego. 
	UWAGA: Inkubator piskląt należy codziennie dokładnie czyścić 70% alkoholem izopropylowym w zależności od liczby przetworzonych piskląt. Pisklęta kurczaków często pozostawiają w inkubatorze odchody, pióra i płyn owodniowy, które mogą zanieczyszczać warunki i jakość powietrza.</li>
</ol>
2. Przygotowanie leku
<ol>
	<li>Zważ zwierzę, umieszczając je w dużej łodzi wagowej. Przy wystarczająco delikatnym ułożeniu zwierzę nie powinno się ruszać. 
	UWAGA: Masa może wynosić od 30 do 45 g. Młodsze zwierzęta są często cięższe ze względu na zapasy żółtka i nie wydalają jeszcze odpadów. Starsze zwierzęta zbliżające się do 24 h wieku i P2 zwykle ważą mniej.</li>
	<li>Przygotuj koktajl znieczulający składający się z ketaminy (100 mg/ml) i ksylazyny (20 mg/ml) tak, aby dawka wynosiła 50 mg/kg ketaminy i 16,68 mg/kg ksylazyny w przeliczeniu na masę ciała zwierzęcia. 
	UWAGA: Ten koktajl leków można przygotować z 1 ml ketaminy (100 mg / ml), 1,5 ml ksylazyny (20 mg / ml) i 2,5 ml H2O. Zastrzyki koktajlowe znieczulające będą się wahać od 0,05 do 0,1 ml w oparciu o zakres 30-45 g masy ciała zwierzęcia.</li>
</ol>
3. Wstrzykiwanie narkotyków i przygotowanie zwierząt
<ol>
	<li>Trzymaj zwierzę w jednej ręce, upewniając się, że nogi są opuszczone.</li>
	<li>Poczuj mostek zwierzęcia, stępkę. Po obu stronach stępki będzie mięsień piersiowy.</li>
	<li>Za pomocą igły i strzykawki 29-G wniknąć na głębokość 5 mm w skórę i wstrzyknąć koktajl ketaminy/ksylazyny do mięśnia piersiowego. Wstrzykiwać od 0,05 do 0,1 ml w zależności od masy ciała zwierzęcia.</li>
	<li>Po wstrzyknięciu zwierzę należy umieścić z powrotem w inkubatorze. Utrzymuj temperaturę ciała zwierzęcia przez kilka minut, gdy środek znieczulający zacznie działać.
	<ol>
		<li>Użyj kleszczy, aby uszczypnąć palec zwierzęcia i sprawdź, czy szyja jest bezwładna. Jeśli nie ma odruchu i bezwładna szyja, zwierzę jest nieprzytomne.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Określ płeć kurczaka za pomocą piór skrzydeł. Jeśli wszystkie pióra są tej samej długości, zwierzę jest samcem. Jeśli pióra różnią się długością, zwierzę to samica30. 
	UWAGA: Inną metodą określania płci zwierzęcia jest wentylacja. Męskie genitalia można zobaczyć w cloaca31. Ta metoda jest bardzo trudna i może zaszkodzić zwierzęciu, jeśli nie zostanie wykonana prawidłowo. Zaleca się stosowanie metody piór skrzydłowych.</li>
	<li>Nałóż krem do depilacji za pomocą aplikatora z bawełnianą końcówką na głowę i szyję, szczególnie w pobliżu otworu na uszy ptaka.</li>
	<li>Użyj chusteczek nasączonych 70% alkoholem izopropylowym, aby zetrzeć pióra, pozostały krem do depilacji oraz skórę głowy i szyi.</li>
	<li>Użyj chusteczki nasączonej 70% alkoholem izopropylowym, aby wysterylizować elektrody podskórne i sondę doodbytniczą.</li>
	<li>Umieść zwierzę w komorze dźwiękochłonnej i ekranowanej elektrycznie. Upewnij się, że w otoczeniu występuje minimalny szum elektryczny i akustyczny, aby uzyskać najlepsze nagrania. 
	UWAGA: Eksperymenty tutaj zostały przeprowadzone w niestandardowej, izolowanej obudowie dźwiękoszczelnej o wymiarach 24 x 24 x 25 cali. Wystarczy każda komora lub pomieszczenie, które eliminuje hałas akustyczny, a także szum elektryczny spowodowany zmiennym prądem elektrycznym (60 Hz w Stanach Zjednoczonych).</li>
	<li>Użyj poduszki grzewczej lub systemu kontroli temperatury, aby utrzymać temperaturę ciała zwierzęcia.</li>
	<li>Włóż nasmarowaną sondę doodbytniczą, aby upewnić się, że temperatura zwierzęcia jest utrzymywana w zakresie 37-41 °C (98.6-105 °F)32,33. 
	UWAGA: Jeśli sonda ma nieprawidłowy rozmiar, zwierzę może położyć się na sondzie temperatury.</li>
	<li>Zamocuj głowę zwierzęcia na miejscu lub oprzyj dziób o przedmiot, aby uniknąć niepożądanego ruchu. Można to zrobić za pomocą plasteliny, jeśli oddychanie nie jest utrudnione.</li>
	<li>Podać dodatkowe wstrzyknięcie koktajlu znieczulającego, który stanowi połowę pierwotnej dawki, jeśli zwierzę zacznie odzyskiwać przytomność podczas badania. 
	UWAGA: Każdy ruch ciała lub wokalizacja jest znakiem, że należy podać dawkę suplementu. Niewielkie ruchy dzioba wskazują na oddychanie i są dopuszczalne.</li>
</ol>
4. Umiejscowienie elektrod
<ol>
	<li>Użyj trzech elektrod igłowych ze stali nierdzewnej z chlorkiem srebra o następujących oznaczeniach: elektroda odniesienia, elektroda czynna i elektroda uziemiająca. 
	UWAGA: Elektroda referencyjna jest również określana jako odwracająca lub "-". Elektroda aktywna jest również określana jako nieodwracająca lub "+".</li>
	<li>Umieść każdą elektrodę podskórnie 2-3 mm w głowie, ale nie na tyle głęboko, aby przebić czaszkę. Używaj elektrod o długości 7 mm i średnicy 0,4 mm.</li>
	<li>Wysuń elektrodę ze skóry, odsłaniając końcówkę. Pomaga to zminimalizować kontakt ze skórą i zapewnić stałą głębokość wsunięcia u zwierząt34. 
	UWAGA: Drut elektrody powinien mieć wystarczający luz, aby po umieszczeniu elektrody nie było naprężenia, które ją wyciągnie lub naciągnie skórę.</li>
	<li>W przypadku nagrywania jednokanałowego umieść aktywną elektrodę nad czaszką w linii środkowej, aż do kanału słuchowego.
	<ol>
		<li>Umieść elektrodę odniesienia za uchem, w miejscu, w którym będzie dostarczany bodziec, a elektrodę masową umieść za przeciwległym kanałem słuchowym na szyi. 
		UWAGA: Jeśli wykonujesz operację na czaszce lub przewodzie słuchowym zwierzęcia, umieść elektrodę referencyjną w szyi na linii środkowej zwierzęcia. Zarówno to, jak i krok 4.4.1 są uważane za montaże nagrywania na elektrodach poziomych.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Do nagrywania dwukanałowego należy użyć dwóch elektrod ujemnych i połączonej elektrody dodatniej, która wymaga adaptera. Umieść elektrodę uziemiającą podskórnie na szyi i jedną elektrodę odniesienia za każdym kanałem słuchowym.</li>
	<li>Sprawdź impedancję elektrody. Upewnij się, że całkowita impedancja elektrody nie przekracza 5.0 kΩ. Utrzymuj impedancję międzyelektrodową poniżej 3,0 kΩ.</li>
</ol>
5. Nagrywanie ABR
<ol>
	<li>W zależności od sprzętu i oprogramowania do akwizycji, należy przeprowadzić kalibrację w celu uzyskania prawidłowych poziomów dźwięku dla wszystkich używanych częstotliwości bodźców. 
	UWAGA: Techniki kalibracji będą się różnić w zależności od sprzętu (patrz dyskusja). W przypadku niektórych programów tłumienie dźwięku można edytować w oprogramowaniu. Procedury kalibracji przeprowadzone w tym przypadku polegały na użyciu mikrofonu pojemnościowego B&K 4138 o średnicy 1/8 cala do rejestrowania bodźców częstotliwościowych w zamkniętym systemie sprzęgającym, który był zbliżony do kanału słuchowego pisklęcia (~5 mm). Tabela kalibracji piskląt kurcząt jest dostarczana jako tabela uzupełniająca.</li>
	<li>Przesuń przetwornik dźwięku w kierunku aktywnego ucha zwierzęcia. Umieść przetwornik dźwięku na płytkiej głębokości 2 mm w przewodzie słuchowym. 
	UWAGA: W zależności od przetwornika dźwięku można przymocować plastikowy wziernik i włożyć go do kanału słuchowego. Umieszczenie wziernika ma kluczowe znaczenie. Jeśli dźwięk jest blokowany przez ścianę kanału lub kanał słuchowy jest zaciśnięty, ABR będą nieobecne lub będą przypominać przesunięcie progu o ~40 dB.</li>
	<li>Sprawdź zwierzę podczas testów, czy wyniki wyglądają na nieprawidłowe lub nieobecne. Jeśli tak, zmień położenie przetwornika dźwięku w przewodzie słuchowym. 
	UWAGA: Ponieważ skóra jest luźna i możliwy jest ruch zwierzęcia, umiejscowienie wziernika może się zmienić podczas nagrywania. Jednak przy prawidłowym wstrzyknięciu środka znieczulającego, gdy zwierzę jest całkowicie nieprzytomne, nagrywanie może trwać nieprzerwanie przez 30-45 minut.</li>
</ol>
6. Akwizycja danych
<ol>
	<li>Wykorzystaj odpowiedni sprzęt/oprogramowanie do generowania bodźców dźwiękowych i nagrywania/pozyskiwania nagrań ABR. 
	UWAGA: Istnieje wiele dostępnych na rynku lub niestandardowych systemów do pozyskiwania ABR. Do tych eksperymentów wykorzystano dostępną na rynku platformę USB SmartEP Intelligent Hearing Systems (IHS). Możliwość manipulowania parametrami nagrywania ma kluczowe znaczenie; Należą do nich między innymi intensywność bodźca, długość bodźca, częstotliwość bodźca, szybkość prezentacji bodźca, filtr górnoprzepustowy i dolnoprzepustowy, odrzucenie artefaktów, liczba przemiatań, częstotliwość próbkowania, kształt obwiedni i polaryzacja bodźca.</li>
	<li>Ustaw górną i dolną granicę odrzucania artefaktów (AR) na ±25 μV, tak aby ruch zwierzęcia lub hałas podczas przemiatania wykluczył to przemiatanie z analizy. W całej badanej populacji mniej niż 1% wszystkich operacji zostało odrzuconych z powodu artefaktów.</li>
	<li>Zbierz co najmniej 1024 przeciągnięcia, aby uzyskać uśrednioną odpowiedź. Można to zrobić w dwóch nagraniach po 512 przebiegów każde. Zapewnia to również, że reakcja jest wywołana bodźcem i powtarzalna.</li>
	<li>Ustaw wzmocnienie na 100 000, filtr dolnoprzepustowy na 100 Hz, a filtr górnoprzepustowy na 3000 Hz. 
	UWAGA: Ustawienia filtra dolno- i górnoprzepustowego były optymalne dla nagrań z wykorzystaniem systemu IHS. Dlatego te parametry są zaleceniami. Nagrania ABR u innych gatunków ptaków za pomocą oprogramowania BIOSIG filtrowały sygnał w zakresie od 30 do 3000 Hz 5,13,14,16,22.</li>
	<li>Ustaw częstotliwość prezentacji bodźców w zakresie od 10 do 20 bodźców na sekundę. Wysokie tempo prezentacji spowoduje przesunięcie szczytowego opóźnienia ABR, szczególnie w przypadku późniejszych szczytów13. Niskie wskaźniki prezentacji wydłużą czas potrzebny na uzyskanie ABR.</li>
	<li>Ustaw czas trwania bodźca kliknięcia na 100 μs.
	<ol>
		<li>Jeśli używasz bodźca impulsowego tonalnego, edytuj częstotliwość i czas trwania bodźca w oparciu o pożądany efekt. Zakres 100-4000 Hz został użyty dla bodźców tonalnych, chociaż zakres słuchu behawioralnego u dorosłych kurczaków waha się od 2-9000 Hz35. 
		UWAGA: W systemie IHS czas narastania i opadania bodźca impulsu tonalnego może być modyfikowany tylko wtedy, gdy kształt obwiedni widmowej jest trapezem. Jednak obwiednia cosinus kwadrat i obwiednia Blackmana zapewniają wstępnie ustawiony czas narastania i opadania, który jest powszechnie stosowany w eksperymentach ABR na zwierzętach. System IHS może wyświetlać obwiednię spektralną wybuchu tonu, aby zapewnić odpowiednie czasy narastania i opadania. Czas narastania i opadania bodźca kliknięcia nie może być edytowany w IHS.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Ustaw częstotliwość próbkowania na najwyższą dopuszczalną wartość (zwykle 40 kHz), aby uzyskać dane o najlepszej rozdzielczości. 
	UWAGA: Niektóre systemy, w tym IHS, używają ograniczonej liczby punktów próbkowania i zmieniają długość okna nagrywania. Częstotliwość próbkowania 40 kHz (okres 25 μs) może pozwolić na okno nagrywania tylko 12 ms, więc aby uchwycić impuls tonów ABR, użyto częstotliwości próbkowania 20 kHz (okres 50 μs), aby umożliwić okno nagrywania 24 ms. W przypadku bezpośredniego porównywania ABR kliknięć i serii tonów, utrzymuj stałą częstotliwość próbkowania, aby utrzymać tę samą rozdzielczość.</li>
	<li>Ustaw polaryzację bodźca na zmienną. Ma to na celu wyeliminowanie wizualizacji mikrofonu ślimakowego z nagrań ABR. Aby zobrazować mikrofon ślimakowy, użyj rozrzedzenia lub kondensacji w celu polaryzacji bodźca. 
	UWAGA: Wiele ustawień można zmienić podczas wybierania bodźców. Podane ustawienia wzmocnienia i filtra mogą nie być optymalne dla innych konfiguracji sprzętu. Domyślne ustawienia fabryczne na większości maszyn ABR nie są ustawione na nagrywanie u wykluwających się kurczaków.</li>
	<li>Jeśli rejestrujesz 512 przemiatań, połącz dwa oddzielne testy, aby utworzyć średnią 1024 przeciągnięć.</li>
	<li>W przypadku bodźca typu "click" lub "tone burst" uzyskaj ABR o intensywności ponadprogowej.</li>
	<li>Kontynuuj nagrywanie z coraz mniejszą intensywnością, aż nie będzie można zidentyfikować wywołanej reakcji.</li>
	<li>Zdefiniuj próg ABR jako najniższą intensywność bodźca, która wywołuje wykrywalną reakcję wywołaną. Zmniejsz intensywność bodźca o kroki co 5 dBSPL, aby znaleźć najniższą intensywność bodźca, która wywołuje wykrywalny szczyt.</li>
</ol>
7. Koniec eutanazji i eksperymentu
<ol>
	<li>Po uzyskaniu ABR należy przygotować nadmiarkę (0,1 ml) roztworu do eutanazji (Pentobarbital Sód 390 mg/ml Fenytoina Sód 50 mg/ml).</li>
	<li>Po uszczypnięciu palca u nogi w celu potwierdzenia, że nie ma odruchu, wstrzyknąć roztwór do eutanazji w mięsień piersiowy za pomocą igły 29-G na głębokości 5 mm. Technika iniekcji jest taka sama jak w przypadku wstrzyknięcia znieczulającego. 
	UWAGA: Zwierzę umrze po kilku minutach. Nie manipuluj zwierzęciem ani nie odcinaj mu głowy, dopóki nie zostanie wykryty żaden ruch. Alternatywną techniką eutanazji jest wykonanie iniekcji dożylnej w żyłę ramienną pod skrzydłem.</li>
	<li>Gdy tylko zwierzę przestanie się odruchywać i ustanie oddychanie i bicie serca, szybko odetnij głowę ostrymi nożyczkami lub nożycami.</li>
	<li>Wyczyść poduszkę grzewczą, sondę doodbytniczą i elektrody chlorku srebra chusteczkami nasączonymi 70% alkoholem izopropylowym.</li>
	<li>Upewnij się, że wszystkie pozyskane ślady zostały zapisane. W celu dalszej analizy wyeksportuj pliki jako .txt pliki, które można przeglądać w notatniku lub importować do arkusza kalkulacyjnego.</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Słuchowy pień mózgu ptaków jest dobrze zbadany, a wiele struktur jest analogicznych do ścieżki słuchowej ssaków. Nerw słuchowy dostarcza bodźce pobudzające do dwóch centralnych jąder pierwszego rzędu, jądra ślimakowego wielkokomórkowego (NM) i kątowego (NA). NM wysyła obustronnie projekcję pobudzającą do swojego celu słuchowego, jądra blaszkowego (NL)7. NL rzutuje do jądra śródmózgowia bocznego, pars dorsalis (MLd)40,41. NL rzutuje również do górnego jądra oliwki (SON), które zapewnia hamowanie sprzężenia zwrotnego do NM, NA i NL42. Ten dolny słuchowy mikroobwód pnia mózgu jest znakomicie zachowany ze względu na funkcję, którą pełni, lokalizację dźwięku i słyszenie obuuszne33. Górne słuchowe obszary pnia mózgu ptaka mają również jądra analogiczne do bocznego lemniscusa ssaków i dolnego wzgórka w śródmózgowiu. Biorąc pod uwagę te podobieństwa, skład ptasiego ABR aż do słuchowego śródmózgowia jest porównywalny u wszystkich kręgowców.
Podczas gdy wiele gatunków ptaków wykazuje trzy dodatnie piki w ciągu 6 ms po nadejściu bodźca, korelacja pików ABR z centralnymi strukturami słuchowymi ma pewną zmienność. Można rozsądnie założyć, że fala I jest pierwszą reakcją neuronalną z obwodowej brodawki podstawnej i nerwu słuchowego i wykazuje niewielką zmienność wśród osób (ryc. 1C). Późniejsza identyfikacja Wave jest mniej pewna i może się różnić w zależności od gatunku. Kuokkanen i wsp.17 ustalili niedawno, że III fala ABR płomykówki jest generowana przez NL; w związku z tym uzasadnione jest twierdzenie, że fala II pochodzi z NM i NA jądra ślimaka20. Jednak fala sowa III została zdefiniowana jako dodatni szczyt wygenerowany 3 ms po nadejściu bodźca. Odpowiada to fali, jak określono w ABR dla kurcząt wykluciach. W płomykówce ABR połączono fale I i II.
Podczas gdy pisklę kurczaka zwykle wykazywało trzy piki w ciągu 6 ms, czasami obserwowano czwarty pik (np. patrz rysunek 1A). Dane populacyjne, większa próba i dodatkowe paradygmaty eksperymentalne byłyby potrzebne do wsparcia czwartej fali, a w niektórych przypadkach pięciofalowej ABR. Najbardziej spójnym odkryciem były trzy przedstawione tutaj reprezentacje szczytów.
Ponieważ ABR jest definiowany jako miara synchronizacji neuronalnej, główne jądra w szlaku słuchowym mogą reprezentować każdy dodatni pik w ABR. Sygnał przekazywany z nerwu słuchowego do NM/NA, a następnie do NL może definiować odpowiednio fale I, II i III u wykluwającego się kurczątka ABR. Dodatkowo, występujący później czwarty pik ABR kurczaka może reprezentować strukturę słuchową górnego pnia mózgu lub śródmózgowia. Charakterystyka ptasich ABR powinna również uwzględniać różnicę między ptakami przedwcześnie zagniazdownikowymi i altrycznymi. Dojrzewanie reakcji słuchowych będzie się różnić w zależności od gatunku i zależy od innych krytycznych cech, takich jak zachowanie drapieżnika i/lub uczenie się głosu4. Niezależnie od tego, opisane metody i techniki można łatwo zastosować do różnych gatunków ptaków i kręgowców.
Znaczenie utrzymania temperatury ciała zwierzęcia zilustrowano na rysunku 2. Wraz ze spadkiem wewnętrznej temperatury ciała opóźnienie odpowiedzi ABR wzrosło dla tego samego poziomu intensywności bodźca. Jest to bardziej widoczne, gdy temperatura ciała spada poniżej 32 °C36,37. Wzrost opóźnienia ABR o około 1 ms jest mniejszy niż wcześniej zgłaszano u kurczaka23. Jednak23-letni Katayama używał 12-dniowego pisklęcia, które było chłodzone, a następnie ogrzewane przez 4 godziny. Dane na rysunku 2 zostały zarejestrowane podczas procesu chłodzenia w okresie 20 minut. Aby uzyskać najlepszą jakość i najbardziej spójne nagrania, temperatura ciała zwierzęcia musi być utrzymywana, a wszystkie nagrania powinny być wykonywane w tej samej temperaturze fizjologicznej u zwierząt.
Wpływ wieku na ABR jest niewielki, ale należy go wziąć pod uwagę. Chociaż tylko opóźnienie fal I i II ABR było znacząco różne, jest to częściowo spowodowane tym, że na rysunku 3 wykorzystano tylko trzy młode pisklęta; w pozostałych trzech nie wystąpiły trzy możliwe do zidentyfikowania piki ABR. Przesunięcia amplitudy i progu ABR mogą być również widoczne w przypadku korzystania z dużych prób lub porównywania ABR specyficznych dla częstotliwości. Ten efekt związany z wiekiem może być spowodowany płynem w środkowym uchu kurczaka. Takie zmiany przewodzące prowadzą do znacznego wzrostu progów ABR zarówno dla modeli ludzkich, jak i innych ssaków38,39.
Korzystając z dwóch różnych montaży nagraniowych, zaobserwowano podobne reakcje (ryc. 4A). Podczas gdy najczęstszy montaż umieszcza elektrodę referencyjną za uchem odbierającym bodziec, elektroda referencyjna w tkance szyi może być przydatna, jeśli towarzyszy mu interwencja chirurgiczna. Jeśli jednak stosowane są dwukanałowe nagrania ABR, elektrody odniesienia powinny być umieszczone oddzielnie i symetrycznie, co jest trudne w przypadku umieszczenia elektrody odniesienia w szyjce. Pozycja wyrostka sutkowatego dla elektrody odniesienia jest zalecana w celu ujednolicenia jak największej liczby aspektów nagrywania. Dwukanałowe nagrywanie ABR jest skutecznym narzędziem wymagającym niewielkiego dodatkowego przygotowania i skutkuje podobnymi reakcjami między uszami. Niewielkie różnice w amplitudzie były prawdopodobnie spowodowane ustawieniem słuchawek. Nagrywanie dwukanałowe pozwala na łatwe porównanie eksperymentalnie zmanipulowanej półkuli ucha lub mózgu z grupą kontrolną. Ta konfiguracja byłaby również wymagana do testowania obuusznych ABR. Przyszłe eksperymenty z użyciem ABR kurczaka mogą odwoływać się do wcześniejszej literatury na temat konfiguracji nagrywania i montaży34.
Ta metodologia wiąże się z kilkoma ograniczeniami. Jak wspomniano w kroku 5.1, złe umiejscowienie wziernika może prowadzić do przesunięcia odpowiedzi o 40 dBSPL. Może to spowodować błędną interpretację zmanipulowanego lub zmodyfikowanego zwierzęcia. Zalecane są następujące środki ostrożności: należy pobrać dużą próbkę danych kontrolnych przed uzyskaniem ABR zmanipulowanych lub zmutowanych modeli. Nie zmniejszaj intensywności bodźca o więcej niż 20 dBSPL między nagraniami. Jeśli amplituda lub opóźnienie zmieni się bardziej niż oczekiwano, sprawdź położenie zwierzęcia i wziernika. Powtórz ten bodziec ABR, aby zaobserwować zmiany. Jeśli wziernik się przesunął, ponownie uzyskaj poprzednie testy. Kolejnym ograniczeniem jest kalibracja ABR. Bez odpowiedniej kalibracji w celu zarejestrowania poziomu ciśnienia akustycznego, intensywność prezentowana zwierzęciu jest nieznana. Do pomiaru dźwięku wyjściowego należy używać tego samego wziernika, co w nagraniu eksperymentalnym, oraz małego mikrofonu wewnątrz jamy, która w przybliżeniu odpowiada długości kanału słuchowego zwierzęcia (~5 mm). Zmierz te same częstotliwości tonów, które są używane w eksperymentach, ponieważ kalibracje są specyficzne dla częstotliwości. Instrukcja obsługi zarówno systemów sprzętowych, jak i programowych może zawierać wskazówki dotyczące kalibracji. Istnieją również dodatkowe filtry, takie jak filtry fazy liniowej i filtry fazy minimalnej, które mogą poprawić ABR serii kliknięć i tonów43. Filtry te nie były używane w niniejszym badaniu. Nie zbadano również dodatkowych czynników, takich jak czas narastania i opadania obwiedni widmowej wybuchu tonu zmieniającej się w funkcji częstotliwości lub zmiana czasu narastania i opadania bodźców klikających. Są to dobre badania na przyszłość, gdy uda się uzyskać wiarygodne i spójne ABR.
Porównanie wykluwającego się kurczaka z innymi modelami ptaków jest obiecujące. Papużki faliste i sowy skrzeczące wykazują również trzy dodatnie piki mikrowoltów w ciągu pierwszych 6 ms ABR13,22. U różnych gatunków dzięciołów również obserwuje się trzy szczyty, ale ich opóźnienie następuje później w czasie. Dodatkowo zakres najlepszej czułości częstotliwościowej u dzięciołów wynosi od 1500 do 4000 Hz, czyli nieco wyżej niż najlepszy próg kurczaka przy 1000 Hz. U dorosłego kurczaka najlepsza czułość wynosi 2000 Hz35, więc może nastąpić poprawa słyszenia wysokich częstotliwości, gdy pisklęta kurcząt rozwijają się w dorosłe osobniki. Rozwój ten będzie różny w zależności od gatunku ptaków, biorąc pod uwagę altryczny lub przedwczesny rozwój zwierzęcia4.
Przedstawione tutaj metody eksperymentalne mogą pomóc w ustaleniu, jakie czynniki prowadzą do uszkodzeń lub zmian w reakcjach słuchowych i progach, a także badania na różnych etapach rozwoju embrionalnego. Manipulacje genetyczne, starzenie się i narażenie na hałas są znanymi manipulacjami u zwierząt i innych modeli ptaków 24,25,44,45. Metody te powinny zostać rozszerzone na model kurczaka teraz, gdy techniki takie jak elektroporacja in-ovo pozwalają na ekspresję białek, które są kontrolowane ogniskowo i czasowo po jednej stronie słuchowego pnia mózgu12,46. Pozwala to na bezpośrednie porównanie ABR z genetycznie zmodyfikowanego ucha z kontralateralnym uchem kontrolnym przy użyciu paradygmatu nagrywania dwukanałowego.
Ogólnie rzecz biorąc, ABR piskląt jest użyteczną metodą badawczą, prawie identyczną z pomiarami funkcji słuchu w modelach ludzi i innych ssaków. Jest to również nieinwazyjna metodologia in-vivo . Oprócz wstrzyknięcia środka znieczulającego i umieszczenia elektrody podskórnej na kilka milimetrów, nie jest wymagana żadna inna fizyczna manipulacja. Pisklę może być teoretycznie testowane wiele razy w ciągu kilku dni lub tygodni, jeśli jest trzymane w odpowiednim środowisku. Protokół ten nie tylko określa niezbędne kroki i parametry rejestrowania ABR dla kurcząt wykluwających, ale także proponuje cechy ABR u ptaków, które mogą dostarczyć informacji na temat dalszych badań funkcji słuchowego pnia mózgu.

Badania nad wywołanymi reakcjami neuronalnymi na bodźce dźwiękowe sięgają ponad pół wieku1. Słuchowa odpowiedź pnia mózgu (ABR) jest potencjałem wywołanym, który od dziesięcioleci jest wykorzystywany jako miara funkcji słuchowych zarówno u zwierząt, jak i u ludzi. Ludzki ABR ma od pięciu do siedmiu szczytów przebiegu konwencjonalnie oznaczonych cyframi rzymskimi (I-VII)2. Piki te są analizowane na podstawie ich opóźnienia (czas wystąpienia w milisekundach) i amplitudy (wielkość od szczytu do dołka w mikrowoltach) odpowiedzi neuronalnych. ABR odgrywa zasadniczą rolę w ocenie funkcji i integralności nerwu słuchowego, a także wrażliwości pnia mózgu i progu słyszenia. Deficyty w układzie słuchowym skutkują nieobecnymi, zmniejszonymi, przedłużonymi lub nieprawidłowymi opóźnieniami i amplitudami ABR. Co ciekawe, parametry te są prawie identyczne u ludzi i innych zwierząt, co sprawia, że jest to spójny obiektywny test funkcji słuchowych w modelach kręgowców3.
Jednym z takich modelowych systemów jest kurczak, który jest szczególnie przydatny z różnych powodów. Ptaki można sklasyfikować jako altryczne lub przedgniazdowe4. Ptaki altryczne wykluwają się z wciąż rozwijającymi się zmysłami; na przykład płomykówki nie wykazują stałego ABR do czterech dni po wykluciu5. Przedwcześnie rozwinięte zwierzęta, takie jak kurczak, wykluwają się z prawie dojrzałymi zmysłami. Początek słuchu następuje w rozwoju embrionalnym, tak że na kilka dni przed wykluciem (21 dzień embrionalny) układ słuchowy jest bliski funkcjonalnego dojrzewania6,7,8. Ptaki altryczne i większość modeli ssaków są podatne na czynniki zewnętrzne, które wpływają na rozwój i wymagają hodowli zwierząt do czasu osiągnięcia dojrzałości słuchu. Zabiegi ABR dla kurczaków można przeprowadzić tego samego dnia, w którym wylęg, rezygnując z konieczności karmienia lub wzbogaconego środowiska.
Embrionalny kurczak był dobrze zbadanym modelem dla fizjologii i rozwoju, szczególnie w słuchowym pniu mózgu. Specyficzne struktury obejmują jądro ślimaka kurczaka, podzielone na jądro magnocellularis (NM) i jądro kątowe (NA), oraz ptasi korelat przyśrodkowej oliwki górnej, znany jako jądro laminaris (NL)6,7. ABR jest idealny do skupiania się na centralnej funkcji słuchowej przed poziomem przodomózgowia i kory mózgowia. Translacja między pomiarami ABR in vivo a badaniami neuronalnymi in vitro rozwoju8, physiology9, tonotopy10, and genetics11,12 zapewnia idealne możliwości badawcze, które wspierają badania nad ogólnymi funkcjami słuchu.
Chociaż ABR był intensywnie badany na modelach ssaków, mniej uwagi poświęcono ptakom. Poprzednie badania ABR ptaków obejmują charakterystykę papużki falistej13, woodpecker14, seagull15, ptaki nurkujące16, zebrowiec zebry17, dzienne raptory18, canary19, trzy gatunki sów5,20,21,22 oraz chicken23. Biorąc pod uwagę prawie cztery dekady, które upłynęły od ostatniej dokładnej charakterystyki ABR kurczaka, wiele wcześniej stosowanych urządzeń i technik uległo zmianie. Wnioski z badań przeprowadzonych na innych modelach ptaków mogą pomóc w opracowaniu nowoczesnej metodologii ABR u kurcząt, a jednocześnie służyć jako porównanie z ABR u kurcząt. W niniejszym artykule przedstawiono konfigurację i konstrukcję eksperymentalną, aby umożliwić rejestrację ABR u piskląt kurcząt, które można również zastosować do embrionalnych etapów rozwoju oraz innych małych modeli gryzoni i ptaków. Dodatkowo, biorąc pod uwagę przedwczesny rozwój kurczaka, manipulacje rozwojowe można przeprowadzać bez ekstensywnej hodowli zwierząt. Manipulacje na rozwijającym się zarodku można ocenić już kilka godzin po wykluciu się zwierzęcia z prawie dojrzałymi zdolnościami słuchowymi.

<table><tbody><tr><td>1/8 cala B& K Mikrofon</td><td>Br&uuml; el & Kj&aelig; r</td><td>4138</td><td>Typ 4138-A-015 działa również</td></tr><tr><td>Słuchowy potencjał wywołany Uniwersalny Smart Box</td><td>Inteligentne systemy słuchowe</td><td>M011110</td><td></td></tr><tr><td>Niestandardowa komora izolacji akustycznej</td><td>GK Soundbooth Inc</td> Nie <td>dotyczy</td><td>Niestandardowy</td></tr><tr><td>zasilacz prądu stałego</td><td>CSI/Speco</td><td>PSV-5</td><td></td></tr><tr><td>ER3 Włóż słuchawki</td><td>Inteligentne systemy słuchowe</td><td>M015302</td><td>Używany jako dźwięk przetwornik</td></tr><tr><td>Euthasol</td><td>Virbac</td><td>710101</td><td>substancja kontrolowana; roztwór do eutanazji</td></tr><tr><td>Strzykawka insulinowa (29 g)</td><td>Punkt komfortu</td><td>26028</td><td></td></tr><tr><td>Ketamina</td><td>Covetrus</td><td>11695-0703-1</td><td>Zasilacz substancji kontrolowanej</td></tr><tr><td></td><td>Powervar</td><td>93051-55R</td><td></td></tr><tr><td>Sonda doodbytnicza</td><td>YSI</td><td>401 (10-09010)</td><td>Każda sonda serii 400 będzie współpracować z monitorem temperatury YSI</td></tr><tr><td>Igły podskórne</td><td>Monitor temperatury Rhythmlink</td><td>RLSND107-1,5</td><td></td></tr><tr><td></td><td>YSI</td><td>73ATA 7651</td><td>Współpracuje z dowolną sondą doodbytniczą serii 400</td></tr><tr><td>Ksylazyna</td><td>Anazed</td><td>59399-110-20</td><td>Używany z ketaminą i wodą do znieczulenia</td></tr></tbody></table>

ocena słuchowej odpowiedzi pnia mózgu u piskląt kurcząt

Evaluation of Auditory Brainstem Response in Chicken Hatchlings

Słuchowa odpowiedź pnia mózgu (ABR) jest nieocenionym testem w audiologii klinicznej, badaniach na zwierzętach innych niż ludzie i badaniach na ludziach. Pomimo powszechnego stosowania ABR w pomiarze słuchowej synchronizacji neuronalnej i szacowaniu czułości słuchu w innych modelowych systemach kręgowców, metody rejestrowania ABR u kurcząt nie zostały zgłoszone od prawie czterech dekad. Kurczaki stanowią solidny model badań na zwierzętach, ponieważ ich układ słuchowy jest bliski funkcjonalnej dojrzałości w późnych stadiach embrionalnych i wczesnych wyklucia. Pokazaliśmy metody stosowane do wywoływania jedno- lub dwukanałowych zapisów ABR za pomocą podskórnych układów elektrod igłowych u piskląt kurcząt. Niezależnie od konfiguracji zapisu elektrod (tj. montażu), nagrania ABR obejmowały 3-4 dodatnie przebiegi szczytowe w ciągu pierwszych 6 ms ponadprogowego bodźca kliknięcia. Amplitudy przebiegów od szczytu do doliny wahały się od 2 do 11 μV przy wysokich poziomach intensywności, przy czym dodatnie piki wykazywały oczekiwane funkcje opóźnienia-intensywności (tj. wzrost opóźnienia w funkcji zmniejszonej intensywności). Ustandaryzowana pozycja słuchawek miała kluczowe znaczenie dla optymalnych nagrań, ponieważ luźna skóra może zasłaniać kanał słuchowy, a ruchy zwierząt mogą przesunąć przetwornik bodźca. Amplitudy szczytów były mniejsze, a opóźnienia wydłużały się wraz ze spadkiem temperatury ciała zwierzęcia, co potwierdzało potrzebę utrzymania fizjologicznej temperatury ciała. Dla młodych piskląt (<3 godziny po wykluciu w 1. dniu) progi zostały podwyższone o ~5 dB, opóźnienia szczytowe wzrosły ~1-2 ms, a amplitudy od szczytu do dołka zmniejszyły się ~1 μV w porównaniu ze starszymi pisklętami. Sugeruje to potencjalny problem związany z przewodzeniem (tj. płyn w jamie ucha środkowego) i powinien być brany pod uwagę w przypadku młodych piskląt. Ogólnie rzecz biorąc, przedstawione tutaj metody ABR pozwalają na dokładne i powtarzalne rejestrowanie funkcji słuchowych in vivo u piskląt kurcząt, które można zastosować na różnych etapach rozwoju. Takie odkrycia można łatwo porównać z ludzkimi i ssaczymi modelami ubytku słuchu, starzenia się lub innych manipulacji związanych ze słuchem.

Reprezentatywne zapisy ABR dla piskląt jednodniowych 
Poniższe wyniki reprezentatywne i populacyjne pochodzą z zapisów ABR wykonanych u 43 zwierząt. W odpowiedzi na nadprogowy bodziec typu click (75 dBSPL) u wszystkich piskląt konsekwentnie obserwowano trzy dodatnie piki. Piki te występowały w ciągu 6 ms od momentu rozpoczęcia bodźca. Rzadko obserwowano również czwarty pik w okolicach 6 ms. Chociaż identyfikacja pików ABR u ptaków różniła się między osobnikami (patrz dyskusja), piki oznaczono i zidentyfikowano jako fale I-IV (cyfry rzymskie). Reprezentatywny przebieg ABR z oznaczonymi pikami przedstawiono na ryc. 1A (górny ślad). Ryc. 1B przedstawia funkcję latencja-intensywność dla fal I i III oznaczonych na reprezentatywnym śladzie. Latencja piku fali I zwiększała się o ~0,3 ms przy każdym spadku intensywności bodźca o 20 dB. Średnio fale I-III występowały odpowiednio w 1,50 ms (±0,02 ms), 3,00 ms (±0,06 ms) i 4,13 ms (±0,09 ms) przy 75 dBSPL (ryc. 1C). Fala I i fala III&#160;zawsze występowały jako pojedynczy pik. Okazjonalnie w przypadku fali II między 2,5 a 3,2 ms obserwowano wiele małych pików. Każdy pik miał odpowiadający mu dołek, a amplituda pik-dołek fali I – największej ze wszystkich pików – wynosiła średnio 7 µV i osiągała maksymalną amplitudę 11 µV przy 75 dB SPL.
Oprócz największej amplitudy, fala I w ABR kurcząt wykazywała najmniejszą zmienność latencji szczytu pomiędzy zwierzętami. Dlatego szczyt ten został wykorzystany do oszacowania czułości progu słyszenia. Progi ABR zdefiniowano jako najniższe natężenie bodźca, które wywołało możliwy do zidentyfikowania i powtarzalny szczyt fali. Zostało to określone subiektywnie przez eksperymentatora i zweryfikowane przez drugiego eksperymentatora w celu potwierdzenia zgodności progów. Szczyty były lepiej zdefiniowane i łatwiejsze do zidentyfikowania przy użyciu bodźców typu click, jednak impulsy tonalne (tone bursts) również generowały wyraźne i możliwe do zidentyfikowania szczyty, które różniły się w zależności od częstotliwości bodźca i jego parametrów&#160;(Rycina 1D, n = 4 kurcząt). Próg ABR wywołany bodźcem typu click był niższy niż próg wywołany impulsem tonalnym, z wyjątkiem częstotliwości 1000 Hz. Progi dla bodźców typu click wahały się w granicach 10-30 dBSPL. Rejestracje ABR wywołane bodźcem typu click, które nie wykazały możliwych do zidentyfikowania szczytów przy natężeniu &#62;30 dBSPL, były często wynikiem wysunięcia się wziernika z kanału słuchowego na skutek ruchu zwierzęcia.
Obniżenie temperatury ciała zwiększa latencje ABR 
Wiadomo, że szybkość aktywności neuronalnej – mierzona jako czas wystąpienia szczytu amplitudy fali (tj. latencja) – spada przy niższych temperaturach ciała36,37. Zjawisko to zaobserwowano w badaniach ABR u nowo wyklutych kurcząt przy użyciu bodźca klikowego o natężeniu 75 dBSPL. Reprezentatywny zapis przedstawiono na Rysunku 2A. Wraz ze spadkiem temperatury ciała poniżej 39 °C, latencja szczytów ABR następowała później, mimo zachowania tego samego poziomu natężenia bodźca. Rysunek 2B przedstawia latencję fal I i III w funkcji obniżania temperatury ciała dla reprezentatywnego zapisu. Stwierdzono silną korelację (R2 = 0,89) między niższymi temperaturami ciała a czasem wystąpienia latencji szczytu fali I (Rysunek 2C, n = 5 kurcząt). Wyniki te wskazują na konieczność utrzymywania temperatury ciała bliskiej normie podczas rejestracji ABR. W przypadku braku utrzymania prawidłowej temperatury ciała, funkcje latencja-natężenie oraz pomiary amplitudy ABR są bardzo zmienne i często niedokładne.
Różnice w latencji i amplitudzie u wczesnych piskląt 
Badania wykazały, że aktywność neuronalna związana z początkiem słyszenia u kurcząt osiąga niemal pełną dojrzałość w późnych etapach rozwoju embrionalnego8. Jednak w podgrupie bardzo wczesnych piskląt (&lt;3 h po wykluciu) zaobserwowano przesunięcie latencji szczytów fal ABR (n = 4) w odpowiedzi na bodziec klikowy 75 dB SPL lub potencjały wywołane były nieidentyfikowalne (n = 2 kurczęta). U 2 młodych piskląt nie udało się wywołać ABR w odpowiedzi na sygnały tonowe, a progi dla kliknięć były podwyższone o 50 dBSPL. Może to wynikać z problemów przewodzenia, gdy w kanale słuchowym/jamie bębenkowej zwierzęcia wciąż znajduje się płyn, lub z niedorozwoju komponentu neuronalnego. W badaniach na ssakach zgłaszano przesunięcia progów o 50 dB u noworodków38,39. Reprezentatywne zwierzęta użyte w niniejszej pracy miały &gt;3 h, co zbiegało się z czasem potrzebnym na wyschnięcie pierza. Rysunek 3A przedstawia ABR zarejestrowane u młodych (P1, &lt;3 h) i starszych piskląt (P2). Do analizy wzięto tylko 3 młode pisklęta, u których wystąpiły wszystkie trzy szczyty ABR. Latencje szczytów fal były znacznie wydłużone, a amplitudy fal lekko zmniejszone w porównaniu ze starszymi pisklętami (Rysunek 3B-C, odpowiednio).
Umiejscowienie elektrody referencyjnej i dwukanałowe zapisy ABR 
Na rysunku 4 umiejscowienie elektrody referencyjnej zmieniono pomiędzy 2 różnymi lokalizacjami, co nadal pozwoliło na uzyskanie porównywalnych zapisów ABR. Porównanie przebiegów kliknięć 75 dBSPL u tego samego zwierzęcia przy dwóch różnych pozycjach elektrody referencyjnej wykazało minimalne różnice w amplitudach fali od szczytu do dołka oraz w latencjach szczytów fal (rysunek 4A). Umiejscowienie na wyrostku sutkowatym było metodologicznie zbliżone do eksperymentów ABR u ssaków, w których elektrodę referencyjną umieszcza się na wyrostku sutkowatym lub małżowinie usznej. Umiejscowienie elektrody referencyjnej na szyi byłoby korzystne w przypadku manipulacji lub zabiegu chirurgicznego na którymkolwiek z uszu. Co ciekawe, amplituda szczytu fali II dla umiejscowienia na wyrostku sutkowatym (ślad czerwony) wystąpiła 1 ms po szczycie fali II dla umiejscowienia na szyi (ślad czarny). Ta różnica czasu prawdopodobnie odzwierciedla miejsca generowania sygnałów neuronowych ABR w stosunku do położenia elektrody.
W układzie dwukanałowym zastosowano jedną aktywną elektrodę rejestrującą (umieszczoną na szczycie głowy) oraz dwie elektrody referencyjne (umieszczone na wyrostkach sutkowatych), aby uzyskać ABR dla lewego i prawego ucha (Rycyna 4B). Odpowiedzi obu uszu były podobne, z niewielkimi różnicami w amplitudach szczytów, co prawdopodobnie wynikało z ułożenia słuchawek. Równa latencja dla lewego i prawego ucha potwierdziła prawidłowe funkcjonowanie obu uszu oraz półkul pnia mózgu u wylęgu kurczaka. Montaż rejestracji dwukanałowej mógłby zostać wykorzystany również do binauralnych ABR, jednak w przypadku takich pomiarów konieczne byłoby uwzględnienie dodatkowych czynników.
<img alt="Rycina 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63477/63477fig01.jpg" /> 
Rycina 1: Reprezentatywne zapisy odpowiedzi kurcząt w pierwszym dniu życia na bodźce klikowe i tonowe. (A) Reprezentatywne zapisy ABR od kurczęcia (P2) w funkcji różnych poziomów natężenia bodźca. W ciągu 6 ms od rozpoczęcia bodźca (czas = 0 ms) można zidentyfikować od trzech do czterech dodatnich pików wyrażonych w mikrowoltach (µV). Fale oznaczono cyframi rzymskimi. Amplitudy od szczytu do dołka maleją przy niższych poziomach natężenia bodźca. (B) Funkcje latencji-natężenia dla Fal I i III dla reprezentatywnego zapisu pokazanego w (A). Analizie poddano tylko te piki, ponieważ Fala II zazwyczaj nie była obserwowana przy natężeniach &#60;45 dBSPL. (C) Latencja kształtów falowych pików ABR wywołanych kliknięciem (n = 43 kurcząt). Słupki błędów oznaczają błąd standardowy średniej (SEM). (D) Uśrednione ABR wywołane tonami (czarne linie) dla czterech kurcząt w trzech różnych częstotliwościach. Czerwone linie = błąd standardowy średniej (SEM). Bodźce = 75 dBSPL. Na tej i kolejnych rycina słupki błędów oznaczają SEM, a uchem stymulowanym było prawe ucho (wyjątek stanowi Rycina 4B, gdzie stymulowano oba uszy). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63477/63477fig01large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Rycina 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63477/63477fig02.jpg" /> 
Rycina 2: Wpływ temperatury ciała na rejestrację ABR. (A) Reprezentatywne zapisy ABR z nowo wyklutego kurczęcia (P2) w zależności od temperatury ciała. W niższych temperaturach ciała latencje szczytów fali wzrastały, podczas gdy amplitudy od szczytu do doliny pozostawały stosunkowo niezmienione. (B) Funkcja latencja-temperatura dla fal I i III dla reprezentatywnych śladów przedstawionych w (A). (C) Dane populacyjne wykazujące zależność między latencją a zmianami temperatury dla 5 kurcząt (p &#60; 0.01, R2 = 0.89). Podobna tendencja została zaobserwowana dla fal II i III (dane nie przedstawiono). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63477/63477fig02large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Rysunek 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63477/63477fig03.jpg" /> 
Rysunek 3: Różnice związane z wiekiem w zapisach ABR. (A) Reprezentatywne zapisy ABR (nałożone na siebie) reprezentatywnego pisklęcia w P2 (linia czarna) i P1 (&lt;3 h po wykluciu, linia czerwona). (B) Latencje szczytów przebiegu dla fal I, II i III w funkcji wieku. Latencje fal I-III różniły się istotnie w zależności od wieku (P &lt; 0.05, n = 6 piskląt). (C) Amplitudy szczyt-do-dołka przebiegu fal I, II i III w funkcji wieku. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63477/63477fig03large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Rycina 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63477/63477fig04.jpg" /> 
Rycina 4: Rozmieszczenie elektrod i dwukanałowe zapisy ABR: (A) Reprezentatywne zapisy ABR (nałożone) od tego samego pisklęcia (P2) z elektrodą referencyjną umieszczoną w karku (ślad czarny) lub w wyrostku sutkowym (ślad czerwony). W obu konfiguracjach zapisu aktywną elektrodę umieszczono w linii środkowej czaszki. Latencja fal I i III oraz amplituda fal I i III są niemal identyczne w obu warunkach. Latencja fali II jest krótsza, a amplituda większa przy elektrodzie umieszczonej w tkance karku. (B) Zapis dwukanałowy podczas sekwencyjnej stymulacji prawego i lewego ucha. Reprezentatywne zapisy ABR (nałożone) od tego samego pisklęcia (P2) z elektrodami referencyjnymi umieszczonymi w wyrostku sutkowym lewego ucha (ślady niebieskie) i prawego ucha (ślady czerwone) przy trzech różnych poziomach natężenia. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63477/63477fig04large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.</a>
Tabela uzupełniająca: Tabela kalibracyjna dla piskląt kurcząt. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63477/Hatchling Chicken Calibration Table.zip" target="_blank">Kliknij tutaj, aby pobrać tę tabelę.</a>

Użyliśmy standardowych technik słuchowej reakcji pnia mózgu (ABR) i zastosowaliśmy je do piskląt piskląt, przedwcześnie rozwiniętego ptasiego modelu funkcji słuchowych. Protokół szczegółowo opisuje techniki przygotowania zwierząt i pozyskiwania ABR, wraz z krokami, które mogą przełożyć się na inne modele ptaków lub gryzoni.

Ocena słuchowej odpowiedzi pnia mózgu u piskląt kurcząt

The auditory brainstem response (ABR) is an invaluable assay in clinical audiology, non-human animals, and human research. Despite the widespread use of ...

Protokół ten łączy klinicznie istotną metodologię z dobrze ugruntowanym modelem badań na zwierzętach. Pomoże odpowiedzieć na pytania dotyczące rozwoju i wydoskonalenia słuchu oraz funkcjonalnych zmian w słuchu po manipulacji genetycznej. Technika ta jest nieinwazyjna, więc nie wymaga operacji i może być łączona z dodatkowymi eksperymentami.Ponadto wykonanie zajmuje tylko około godziny. Ta metoda może być stosowana na każdym małym gatunku ptaków. Tak więc fizjologia porównawcza jest stosunkowo łatwa.ABR kurczaka może również ocenić wpływ manipulacji genetycznej na funkcjonalny słuch. Zacznij od zdobycia zapłodnionych jaj kurzych z białego leghornu. Następnie wysiaduj jajo w temperaturze 38 stopni Celsjusza i wilgotności 50% przez 21 dni przed pożądaną datą testu.Po wykluciu się z jaja zważ zwierzę, delikatnie umieszczając je w dużej łodzi wagowej. Po wstrzyknięciu znieczulenia umieść zwierzę z powrotem w inkubatorze. Następnie sprawdź, czy szyja jest bezwładna i uszczypnij palec u nogi zwierzęcia za pomocą kleszczy.W następnym kroku określ płeć kurczaka za pomocą piór skrzydeł. Później nałóż krem do depilacji za pomocą aplikatora z bawełnianą końcówką na głowę i szyję, szczególnie w pobliżu otworu ucha ptaka. Teraz użyj chusteczek nasączonych 70% alkoholem izopropylowym, aby zetrzeć pióra, pozostały krem do depilacji oraz skórę głowy i szyi.Wysterylizuj również elektrody podskórne i sondę doodbytniczą za pomocą chusteczki nasączonej 70% alkoholem izopropylowym. Umieść zwierzę w izolacji akustycznej i elektrycznie ekranowanej komorze, zapewniając, że w otoczeniu występuje minimalny hałas elektryczny i akustyczny, aby uzyskać najlepsze nagrania. Użyj poduszki grzewczej, aby utrzymać temperaturę ciała zwierzęcia.Teraz włóż sondę doodbytniczą i przymocuj głowę zwierzęcia na miejscu lub oprzyj dziób o przedmiot, aby uniknąć niepożądanego ruchu. Następnie upewnij się, że komora kontroli temperatury utrzymuje temperaturę zwierzęcia w zakresie od 37 do 41 stopni Celsjusza. Użyj trzech elektrod igłowych ze stali nierdzewnej z chlorkiem srebra jako elektrod referencyjnych, aktywnych i wspólnych elektrod uziemiających.Umieść każdą elektrodę podskórnie od dwóch do trzech milimetrów w głowie, ale nie na tyle głęboko, aby przeniknąć do czaszki, a następnie wysuń elektrodę ze skóry, odsłaniając końcówkę. W przypadku nagrywania jednokanałowego umieść aktywną elektrodę nad czaszką na linii środkowej aż do kanału słuchowego. Umieść elektrodę odniesienia za uchem, w którym będzie dostarczany bodziec, a elektrodę masową umieść za uchem przeciwległym na szyi.Teraz sprawdź impedancję elektrody. Upewnij się, że całkowita impedancja elektrody nie przekracza pięciu kiloomów. Utrzymuj również impedancję międzyelektrodową poniżej trzech kiloomów.W przypadku nagrywania ABR, w zależności od sprzętu i oprogramowania do akwizycji, należy skalibrować prawidłowe poziomy dźwięku dla używanych częstotliwości bodźców. Teraz przesuń aparat przetwornika dźwięku w kierunku aktywnego ucha zwierzęcia i umieść go na płytkiej głębokości dwóch milimetrów w przewodzie słuchowym. Na koniec sprawdź, co się dzieje ze zwierzęciem podczas testów.Jeśli wyniki wyglądają nieprawidłowo lub nie ma ich wcale, zmień położenie przetwornika dźwięku w przewodzie słuchowym. Najpierw otwórz oprogramowanie, aby pobrać nagrania ABR. Ustaw górną i dolną granicę odrzucania artefaktów na około 25 mikrowoltów, tak aby zwierzę, ruch lub hałas podczas przemiatania wykluczyły to przemiatanie z analizy.Zbierz co najmniej 1024 przebiegi, aby uzyskać uśrednioną odpowiedź, którą można wykonać w dwóch nagraniach po 512 przebiegów każde. Dzięki temu odpowiedź jest wywołana bodźcem i powtarzalna. W ustawieniach wzmacniacza w oprogramowaniu ustaw wzmocnienie na 100 000, filtr dolnoprzepustowy na 3 000 Hz, a filtr górnoprzepustowy na 100 Hz.Ustaw częstotliwość prezentacji bodźca w zakresie od 10 do 20 bodźców na sekundę, a czas trwania bodźca kliknięcia na 100 mikrosekund. Następnie ustaw częstotliwość próbkowania na 40 kiloherców, 25 mikrosekund, aby uzyskać dane o najlepszej rozdzielczości i ustaw polaryzację bodźca na naprzemienną. Jeśli rejestrujesz 512 przemiatań, połącz dwa oddzielne testy, aby utworzyć średnią przemiatania 1 024 i kontynuuj nagrywanie z coraz niższą intensywnością, aż nie będzie można już zidentyfikować wywołanego potencjału.Zmniejsz intensywność bodźca o kroki co pięć decybeli poziomu ciśnienia akustycznego, aby znaleźć najniższą intensywność bodźca, która wywołuje wywołaną reakcję. Zdefiniuj próg ABR jako najniższą intensywność bodźca, która wywołuje wykrywalną reakcję wywołaną. Po eutanazji i odcięciu głowy zwierzęcia oraz eksperymencie poprzez oczyszczenie poduszki grzewczej, sondy doodbytniczej i elektrod chlorku srebra chusteczkami nasączonymi 70% alkoholem izopropylowym, upewnij się, że wszystkie nabyte ślady zostały zachowane.Ta liczba reprezentuje kliknięcie ABR. Szczytowe opóźnienie fali I zwiększa się o około 0,3 milisekundy na każde 20 decybeli spadku intensywności bodźca. Fala I prezentowała również największą amplitudę piku i najniższą zmienność opóźnienia piku spośród wszystkich szczytów formy falowej.Wykres przedstawia wybuch tonu wywołany ABR. Najlepszą odpowiedź zaobserwowano przy częstotliwości 1 000 Hz. Rysunek pokazuje, że jeśli temperatura ciała nie jest utrzymywana, funkcje intensywności opóźnień ABR są bardzo zmienne i często niedokładne.Rysunek pokazuje, że ABR zarejestrowane od piskląt w wieku poniżej trzech godzin, oznaczonych jako P1, mają znacznie wydłużone opóźnienia szczytowe i zmniejszone amplitudy pików w porównaniu ze starszymi pisklętami, oznaczonymi jako P2. Na rysunku porównano ślady kliknięć poziomu ciśnienia akustycznego 75 decybeli u tego samego zwierzęcia z różnymi rozmieszczeniami elektrod referencyjnych. Szczytowa amplituda fali II dla umiejscowienia wyrostka sutkowatego wystąpiła jedną milisekundę po szczycie fali II dla umiejscowienia szyi. Ta różnica czasu prawdopodobnie odzwierciedla miejsca generowania neuronów ABR w stosunku do umieszczenia elektrody.Odpowiedzi między oboma uszami były podobne, z niewielkimi zmianami amplitudy szczytów, prawdopodobnie spowodowanymi ustawieniem słuchawek. Opóźnienie lewego i prawego ucha, które jest równe, wspiera równie zdrowe funkcjonowanie zarówno uszu, jak i półkul pnia mózgu u piskląt. Prawidłowe rozmieszczenie przetwornika dźwięku może odróżnić dobre wyniki od ich braku.ABR kurczaka powinien być wytrzymały z dobrym stosunkiem sygnału do szumu. Wszystkie pytania, na które odniesiono się w badaniach ABR na innych gatunkach ptaków, można zastosować do kurczaka. Również badania nad fizjologią molekularną na embrionalnych kurczakach mogą obejmować tę metodologię in vivo.

evaluation-of-auditory-brainstem-response-in-chicken-hatchlings

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Słuchowy pień mózgu kurczaka składa się z jąder odpowiedzialnych za binauralne przetwarzanie dźwięku. Pojedyncza preparacja w przekroju wieńcowym zachowuje cały układ obwodów, podczas gdy podejście z wykorzystaniem kultur komórkowych zapewnia unikalną możliwość badania rozwoju struktury neuronalnej i funkcji słuchowej na poziomach molekularnym, komórkowym i sieciowym.

Przygotowanie i hodowla skrawków pnia mózgu słuchowego kurczaka

Ten film demonstruje metodę rejestrowania słuchowych reakcji pnia mózgu (ABR) u szczurzych szczeniąt. Przedstawiono w nim etapy umieszczania elektrod, stosowania bodźców dźwiękowych i analizy przetwarzania sygnału w pniu mózgu w celu oceny odpowiedzi neuronalnych.

Rejestrowanie słuchowych reakcji pnia mózgu u szczeniaka szczura

Źródło: Lee, D., et. al. Zmodyfikowane warunki eksperymentalne dla ubytku słuchu wywołanego hałasem u myszy oraz ocena funkcji słuchu i uszkodzenia zewnętrznych komórek rzęsatych. J. Vis. Exp. (2023)Ten film pokazuje pomiar słuchowej odpowiedzi pnia mózgu (ABR) u myszy. Elektrody umieszcza się na głowie, za uchem i w pobliżu ogona znieczulonej myszy. Dostarczane są bodźce akustyczne o różnym natężeniu, a generowane sygnały elektryczne są rejestrowane jako przebiegi.

Pomiar słuchowej odpowiedzi pnia mózgu u myszy

Tutaj opisujemy technikę mikrodysekcji, po której następuje wstrzyknięcie barwnika fluorescencyjnego do zwoju akustycznego wczesnych zarodków piskląt w celu selektywnego śledzenia włókien aksonu słuchowego w nerwie i tyłomózgowiu.

Selektywne śledzenie włókien słuchowych w ptasim embrionalnym nerwie przedsionkowo-ślimakowym

Narząd słuchowy pośredniczy w słyszeniu. W niniejszej pracy przedstawiono zmodyfikowaną metodę mikroelektroporacji in ovo zoptymalizowaną do badania proliferacji i różnicowania słuchowych komórek progenitorowych w rozwijającym się narządzie słuchowym kurcząt.

Transfer genów do narządu słuchowego kurczaka za pomocą mikroelektroporacji in ovo

Neurony słuchowe pnia mózgu ptaków i ssaków są wyspecjalizowane w szybkim kodowaniu neuronalnym, podstawowym procesie dla normalnych funkcji słuchowych. Neurony te powstają z odrębnych prekursorów embrionalnego tyłomózgowia. Przedstawiamy techniki wykorzystujące elektroporację do ekspresji genów w tyłomózgowiu zarodków kurczaków w celu zbadania funkcji genów podczas rozwoju słuchowego.

In Ovo Elektroporacja w słuchowym pniu mózgu kurczaka

Ten protokół opisuje metody rejestrowania słuchowej odpowiedzi pnia mózgu u pourodzonych szczurzych szczeniąt. Aby zbadać rozwój funkcjonalny zewnętrznych komórek rzęsatych, opisano krok po kroku eksperymentalną procedurę rejestracji klamry krosowej całej komórki w izolowanych zewnętrznych komórkach rzęsatych.

Rejestracja słuchowej odpowiedzi pnia mózgu i zewnętrznego zacisku krosowego całych komórek rzęsatych u szczurów po urodzeniu

Audiometria odpowiedzi wywołanej pniem mózgu jest ważnym narzędziem w neurofizjologii klinicznej. Obecnie audiometria odpowiedzi wywołanej pnia mózgu jest również stosowana w naukach podstawowych i badaniach przedklinicznych obejmujących zarówno farmakologiczne, jak i genetyczne modele zwierzęce. Tutaj przedstawiamy szczegółowy opis, w jaki sposób słuchowe reakcje pnia mózgu mogą być z powodzeniem rejestrowane i analizowane u myszy.

Akwizycja i analiza danych w audiometrii odpowiedzi wywołanej pniem mózgu u myszy

Kurze zarodki, jako klasyczny model rozwojowy, są używane w naszym laboratorium do oceny kardiotoksyczności rozwojowej po ekspozycji na różne zanieczyszczenia środowiska. Metody ekspozycji i metody oceny morfologicznej/funkcjonalnej zostały opisane w niniejszym manuskrypcie.

Wykorzystanie zarodka kurzego jako potężnego narzędzia w ocenie kardiotoksyczności rozwojowej

Tutaj prezentujemy protokół uzyskiwania niekoronalnych warstw słuchowych pnia mózgu zarodka kurczaka w celu zbadania właściwości tonotopowych i trajektorii rozwojowych w obrębie jednego wycinka pnia mózgu. Przekroje te obejmują przekroje strzałkowe, poziome i poziome/poprzeczne obejmujące większe obszary tonotopowe w pojedynczej płaszczyźnie przekroju niż tradycyjne sekcje koronalne.

Krojenie embrionalnego słuchowego pnia mózgu kurczaka w celu oceny gradientów tonotopowych i mikroobwodów

Pisklę jest opłacalnym, dostępnym i szeroko dostępnym organizmem modelowym do różnych badań. W tym miejscu szczegółowo opisano szereg protokołów, aby zrozumieć mechanizmy molekularne leżące u podstaw rozwoju i regeneracji ucha wewnętrznego ptaków.

Metody in ovo i ex ovo do badania rozwoju ucha wewnętrznego ptaków

Poznaj metodę ABR do oceny słuchu u piskląt kurcząt. Nieinwazyjna technika elektrofizjologiczna pozwala badać funkcje słuchowe i wpływ czynników genetycznych na rozwój słuchu.

Ocena słuchowej odpowiedzi pnia mózgu u piskląt kurcząt

Przeglądaj więcej filmów