Ocena słuchowej odpowiedzi pnia mózgu u piskląt kurcząt

Protokół ten łączy klinicznie istotną metodologię z dobrze ugruntowanym modelem badań na zwierzętach. Pomoże odpowiedzieć na pytania dotyczące rozwoju i wydoskonalenia słuchu oraz funkcjonalnych zmian w słuchu po manipulacji genetycznej. Technika ta jest nieinwazyjna, więc nie wymaga operacji i może być łączona z dodatkowymi eksperymentami.

Ponadto wykonanie zajmuje tylko około godziny. Ta metoda może być stosowana na każdym małym gatunku ptaków. Tak więc fizjologia porównawcza jest stosunkowo łatwa.

ABR kurczaka może również ocenić wpływ manipulacji genetycznej na funkcjonalny słuch. Zacznij od zdobycia zapłodnionych jaj kurzych z białego leghornu. Następnie wysiaduj jajo w temperaturze 38 stopni Celsjusza i wilgotności 50% przez 21 dni przed pożądaną datą testu.

Po wykluciu się z jaja zważ zwierzę, delikatnie umieszczając je w dużej łodzi wagowej. Po wstrzyknięciu znieczulenia umieść zwierzę z powrotem w inkubatorze. Następnie sprawdź, czy szyja jest bezwładna i uszczypnij palec u nogi zwierzęcia za pomocą kleszczy.

W następnym kroku określ płeć kurczaka za pomocą piór skrzydeł. Później nałóż krem do depilacji za pomocą aplikatora z bawełnianą końcówką na głowę i szyję, szczególnie w pobliżu otworu ucha ptaka. Teraz użyj chusteczek nasączonych 70% alkoholem izopropylowym, aby zetrzeć pióra, pozostały krem do depilacji oraz skórę głowy i szyi.

Wysterylizuj również elektrody podskórne i sondę doodbytniczą za pomocą chusteczki nasączonej 70% alkoholem izopropylowym. Umieść zwierzę w izolacji akustycznej i elektrycznie ekranowanej komorze, zapewniając, że w otoczeniu występuje minimalny hałas elektryczny i akustyczny, aby uzyskać najlepsze nagrania. Użyj poduszki grzewczej, aby utrzymać temperaturę ciała zwierzęcia.

Teraz włóż sondę doodbytniczą i przymocuj głowę zwierzęcia na miejscu lub oprzyj dziób o przedmiot, aby uniknąć niepożądanego ruchu. Następnie upewnij się, że komora kontroli temperatury utrzymuje temperaturę zwierzęcia w zakresie od 37 do 41 stopni Celsjusza. Użyj trzech elektrod igłowych ze stali nierdzewnej z chlorkiem srebra jako elektrod referencyjnych, aktywnych i wspólnych elektrod uziemiających.

Umieść każdą elektrodę podskórnie od dwóch do trzech milimetrów w głowie, ale nie na tyle głęboko, aby przeniknąć do czaszki, a następnie wysuń elektrodę ze skóry, odsłaniając końcówkę. W przypadku nagrywania jednokanałowego umieść aktywną elektrodę nad czaszką na linii środkowej aż do kanału słuchowego. Umieść elektrodę odniesienia za uchem, w którym będzie dostarczany bodziec, a elektrodę masową umieść za uchem przeciwległym na szyi.

Teraz sprawdź impedancję elektrody. Upewnij się, że całkowita impedancja elektrody nie przekracza pięciu kiloomów. Utrzymuj również impedancję międzyelektrodową poniżej trzech kiloomów.

W przypadku nagrywania ABR, w zależności od sprzętu i oprogramowania do akwizycji, należy skalibrować prawidłowe poziomy dźwięku dla używanych częstotliwości bodźców. Teraz przesuń aparat przetwornika dźwięku w kierunku aktywnego ucha zwierzęcia i umieść go na płytkiej głębokości dwóch milimetrów w przewodzie słuchowym. Na koniec sprawdź, co się dzieje ze zwierzęciem podczas testów.

Jeśli wyniki wyglądają nieprawidłowo lub nie ma ich wcale, zmień położenie przetwornika dźwięku w przewodzie słuchowym. Najpierw otwórz oprogramowanie, aby pobrać nagrania ABR. Ustaw górną i dolną granicę odrzucania artefaktów na około 25 mikrowoltów, tak aby zwierzę, ruch lub hałas podczas przemiatania wykluczyły to przemiatanie z analizy.

Zbierz co najmniej 1024 przebiegi, aby uzyskać uśrednioną odpowiedź, którą można wykonać w dwóch nagraniach po 512 przebiegów każde. Dzięki temu odpowiedź jest wywołana bodźcem i powtarzalna. W ustawieniach wzmacniacza w oprogramowaniu ustaw wzmocnienie na 100 000, filtr dolnoprzepustowy na 3 000 Hz, a filtr górnoprzepustowy na 100 Hz.

Ustaw częstotliwość prezentacji bodźca w zakresie od 10 do 20 bodźców na sekundę, a czas trwania bodźca kliknięcia na 100 mikrosekund. Następnie ustaw częstotliwość próbkowania na 40 kiloherców, 25 mikrosekund, aby uzyskać dane o najlepszej rozdzielczości i ustaw polaryzację bodźca na naprzemienną. Jeśli rejestrujesz 512 przemiatań, połącz dwa oddzielne testy, aby utworzyć średnią przemiatania 1 024 i kontynuuj nagrywanie z coraz niższą intensywnością, aż nie będzie można już zidentyfikować wywołanego potencjału.

Zmniejsz intensywność bodźca o kroki co pięć decybeli poziomu ciśnienia akustycznego, aby znaleźć najniższą intensywność bodźca, która wywołuje wywołaną reakcję. Zdefiniuj próg ABR jako najniższą intensywność bodźca, która wywołuje wykrywalną reakcję wywołaną. Po eutanazji i odcięciu głowy zwierzęcia oraz eksperymencie poprzez oczyszczenie poduszki grzewczej, sondy doodbytniczej i elektrod chlorku srebra chusteczkami nasączonymi 70% alkoholem izopropylowym, upewnij się, że wszystkie nabyte ślady zostały zachowane.

Ta liczba reprezentuje kliknięcie ABR. Szczytowe opóźnienie fali I zwiększa się o około 0,3 milisekundy na każde 20 decybeli spadku intensywności bodźca. Fala I prezentowała również największą amplitudę piku i najniższą zmienność opóźnienia piku spośród wszystkich szczytów formy falowej.

Wykres przedstawia wybuch tonu wywołany ABR. Najlepszą odpowiedź zaobserwowano przy częstotliwości 1 000 Hz. Rysunek pokazuje, że jeśli temperatura ciała nie jest utrzymywana, funkcje intensywności opóźnień ABR są bardzo zmienne i często niedokładne.

Rysunek pokazuje, że ABR zarejestrowane od piskląt w wieku poniżej trzech godzin, oznaczonych jako P1, mają znacznie wydłużone opóźnienia szczytowe i zmniejszone amplitudy pików w porównaniu ze starszymi pisklętami, oznaczonymi jako P2. Na rysunku porównano ślady kliknięć poziomu ciśnienia akustycznego 75 decybeli u tego samego zwierzęcia z różnymi rozmieszczeniami elektrod referencyjnych. Szczytowa amplituda fali II dla umiejscowienia wyrostka sutkowatego wystąpiła jedną milisekundę po szczycie fali II dla umiejscowienia szyi. Ta różnica czasu prawdopodobnie odzwierciedla miejsca generowania neuronów ABR w stosunku do umieszczenia elektrody.

Odpowiedzi między oboma uszami były podobne, z niewielkimi zmianami amplitudy szczytów, prawdopodobnie spowodowanymi ustawieniem słuchawek. Opóźnienie lewego i prawego ucha, które jest równe, wspiera równie zdrowe funkcjonowanie zarówno uszu, jak i półkul pnia mózgu u piskląt. Prawidłowe rozmieszczenie przetwornika dźwięku może odróżnić dobre wyniki od ich braku.

ABR kurczaka powinien być wytrzymały z dobrym stosunkiem sygnału do szumu. Wszystkie pytania, na które odniesiono się w badaniach ABR na innych gatunkach ptaków, można zastosować do kurczaka. Również badania nad fizjologią molekularną na embrionalnych kurczakach mogą obejmować tę metodologię in vivo.