Preimplantacyjne badania genetyczne w kierunku aneuploidii na półprzewodnikowej platformie sekwencjonowania nowej generacji

Protokół ten przedstawia procedurę od amplifikacji pojedynczej komórki do końcowych danych sprawozdawczych w preimplantacyjnych testach genetycznych pod kątem aneuploidii na platformie sekwencjonowania nowej generacji opartej na półprzewodnikach. Ta procedura może pomóc widzom w dobrym zrozumieniu eksperymentalnego przepływu pracy sekwencjonowania PGT-A i odtworzeniu tej techniki w laboratorium diagnostycznym z platformą NGS opartą na półprzewodnikach. Zacznij od odpipetowania 25 mikrolitrów produktów amplifikacji całego genomu i przeniesienia ich do 1,5-mililitrowej probówki wirówkowej wstępnie załadowanej 25 mikrolitrami wody wolnej od nukleaz.

Odwiruj i wymieszaj kulki oczyszczające DNA. Porcję 50 mikrolitrów tego roztworu do każdej probówki z próbką. Wirować i odwirowywać krótko przez pięć sekund.

Ustaw probówkę na pięć minut w temperaturze pokojowej w celu przeprowadzenia procesu wiązania DNA. Włóż 1.5-mililitrową probówkę wirówkową do stojaka magnetycznego. Następnie poczekaj, aż wszystkie kulki magnetyczne zostaną przyciągnięte do bocznej ścianki rurki.

Ostrożnie przenieś supernatant do nowej 1,5-mililitrowej probówki wirówkowej. Unikaj pipetowania kulek. Zgodnie z pierwotną objętością próbki.

Odpipetować 30 mikrolitrów kulek magnetycznych, wirować i krótko wirować przez pięć sekund. Ustaw probówkę na pięć minut w temperaturze pokojowej w celu przeprowadzenia procesu wiązania DNA. Włóż 1.5-milimetrowe probówki wirówkowe do stojaka magnetycznego.

Następnie poczekaj, aż wszystkie koraliki magnetyczne zostaną przyciągnięte do bocznej ścianki rurki. Ostrożnie usunąć i wyrzucić supernatant. Unikaj pipetowania kulek.

Odpipetuj 300 mikrolitrów 70% etanolu do 1,5 mililitrowej probówki wirówkowej. Następnie delikatnie obróć rurkę dwukrotnie pod kątem 180 stopni i przesuń koraliki wzdłuż ścianki rurki, aby dokładnie umyć. Odpipetować i odrzucić supernatant.

Unikaj pipetowania kulek. Powtórz procedurę prania raz. Umieść nową płytkę wzmacniającą w systemie po zakończeniu programu czyszczenia.

Włóż probówki zbiorcze, z których każda jest wstępnie napełniona roztworem łamającym 150 mikrolitrów dwa do wirnika, a następnie umieść mostek na probówkach zbiorczych. Dodaj olej reakcyjny do połowy probówki, a roztwór do rozbijania emulgatora do jednej trzeciej probówki. Umieścić nowy filtr do przygotowania szablonu na stojaku na probówki z portalem na próbki skierowanym do góry.

Wirować roztwór przez pięć sekund i krótko odwirowywać przez pięć sekund. Następnie przenieść roztwór do portalu próbki filtra po trzykrotnym odpipetowaniu 800 mikrolitrów. Odwirować probówkę, aby zmniejszyć ilość pęcherzyków przed ostatnim wstrzyknięciem.

Unikaj wstrzykiwania powietrza do filtra. Wstrzyknąć 200 mikrolitrów oleju reakcyjnego dwa, po zmieszaniu roztworu. Obrócić sample portal filtra w dół i wymienić przyrząd myjący na filtr.

Włóż igłę do próbki do środkowego otworu pokrywy wirnika, a następnie dociśnij igłę do dna. Kliknij przycisk Uruchom na ekranie i wybierz program zgodnie z odpowiednim zestawem. Następnie wybierz opcję Wspomagane, aby sprawdzić wszystkie kroki.

Klikaj przycisk Dalej, aż rozpocznie się uruchamianie. Bieg potrwa około 4,5 godziny. Wybierz pozycję Dalej po zakończeniu programu.

System rozpocznie 10-minutowy proces wirowania. Po odwirowaniu kliknij przycisk Otwórz pokrywę i przenieś probówki zbiorcze na stojaki. Jeśli procedura nie przejdzie do następnego kroku w ciągu 15 minut, naciśnij ostatnie wirowanie, aby ponownie odwirować.

Usunąć sklarowany osad z probówki zbiorczej, pozostawiając w niej 100 mikrolitrów roztworu. Wymieszaj pozostałą próbkę przez pipetowanie i przenieś próbkę do nowej probówki wirówkowej o pojemności 1,5 mililitra oznaczonej OT. Podczas pipetowania supernatantu należy unikać dotykania dna probówki wzdłuż boków. Odpipetować 100 mikrolitrów wody wolnej od nukleaz do każdej probówki zbiorczej i przenieść roztwór do probówki OT przemytej przez wielokrotne pipetowanie.

Dodaj 600 mikrolitrów wody wolnej od nukleaz do probówki OT, aby uzyskać całkowitą objętość jednego mililitra. Wirować przez 30 sekund w wirówce przy 15 500 razy G przez osiem minut. Delikatnie usunąć supernatant, pozostawiając 100 mikrolitrów roztworu w probówce OT.

Użyj końcówki, aby całkowicie wyrzucić warstwę oleju. Dodaj 900 mikrolitrów wody wolnej od nukleaz, wiruj przez 30 sekund i wiruj przy 15 500 razy G przez osiem minut. Usunąć supernatant do momentu, aż pozostanie 20 mikrolitrów roztworu i dodać roztwór do ponownego zaparcia matrycy, aby uzyskać objętość 100 mikrolitrów.

Następnie wirować przez 30 sekund i krótko wirować przez dwie sekundy. Przejdź do następnego kroku w ciągu 12 godzin od przetworzenia próbki Załaduj 100 mikrolitrów rozcieńczonej biblioteki, 130 mikrolitrów kulek C1, 300 mikrolitrów trzech x roztworu do mycia matryc i 300 mikrolitrów roztworu do stopienia do ośmiu pasków studzienki. Zainstaluj osiem pasków dołka na module wzbogacającym, załaduj końcówkę pipetującą i ustaw probówkę wirówkową o pojemności 200 mikrolitrów w pozycji do pobierania.

Kliknij Start, aby uruchomić program. Pobrać pipetę z 55 mikrolitrów roztworu próbki i wstrzyknąć ją do otworu na próbkę w chipie. Ustaw chip na wirówce.

Trzymaj wycięcie skierowane na zewnątrz, a sample portal wewnątrz. Następnie zrównoważ go innym zużytym chipem i wiruj przez 10 minut. Przygotuj roztwór ładujący zgodnie z opisem w manuskrypcie tekstowym.

Wdmuchnij 100 mikrolitrów powietrza do spieniającego się roztworu. Kilkakrotnie pipetować roztwór, aż bąbelki znajdą się w gęstym, pieniącym się stanie i utrzymać objętość piany na poziomie około 250 mikrolitrów. Umieść wiór na stole po odwirowaniu.

Wstrzyknąć 100 mikrolitrów piany do otworu na próbkę i usunąć wytłaczany roztwór do portalu wyjściowego. Następnie krótko odwiruj chip przez 30 sekund. Powtórz ten proces raz.

Wstrzyknąć dwukrotnie 100 mikrolitrów w 50% buforze myjącym i usunąć wytłaczany roztwór w portalu zewnętrznym po każdym wstrzyknięciu. Następnie trzykrotnie wstrzyknąć 100 mikrolitrów w 50% buforze do wyżarzania i usunąć wytłaczany roztwór w portalu wyjściowym po każdym wstrzyknięciu. Wstrzyknąć 65 mikrolitrów w 50% buforze reakcji enzymatycznej, unikając pęcherzyków i usunąć wytłaczany roztwór w portalu wyjściowym.

Ustabilizuj załadowany chip w temperaturze pokojowej przez pięć minut i zainstaluj chip na portalu chipowym sekwencera. Wybierz Planowany program, sprawdź informacje i rozpocznij uruchamianie. Reprezentatywna seria uzyskała łącznie 17,6 gigabajta danych, a całkowita szybkość ładowania cząstki kuli jonowej wyniosła 88% w całkowitych studniach chipa.

Mapa cieplna potwierdziła równomierne obciążenie próbki na całkowitej powierzchni chipa. 77% wszystkich odczytów było użytecznych. Wszystkie studnie załadowane przez ISP wykazały 100% wzbogacenie szablonów, z czego 78% było klonalnych.

Spośród wszystkich szablonów klonalnych 97% zostało zakwalifikowanych jako biblioteka ostateczna. Średnia długość odczytu wynosiła 177 par zasad, podczas gdy mediana i tryb wynosiły odpowiednio 176 i 174 pary zasad. Szczytowa liczba tyminy, cytozyny i adeniny w matrycach wynosiła około 76 powyżej kwalifikowanej linii odcięcia wynoszącej 50.

We wszystkich adresowalnych studniach z żywymi dostawcami internetowymi 99,5% zakwalifikowano jako bibliotekę zbudowaną, a 20% bibliotek poliklonalnych i niskiej jakości zostało odfiltrowanych, podczas gdy 76,6% dostawców usług internetowych zostało zakwalifikowanych do dalszej analizy. Wynik wariancji liczby kopii z pojedynczej próbki przedstawiał trisomię mozaiki 182,16 par megazasad P 16,3 do Q 35,2 na chromosomie czwartym i 33-punktowy segment monosomii par megazasad 13 Q 11,1 do Q 13,33 na chromosomie 22. Podczas przeprowadzania selekcji fragmentów odstępy czasu między etapami powinny być modyfikowane w zależności od wielkości próbek w tej samej partii, aby zapobiec nadmiernej ekspozycji i jej brakowi w przypadku próbek z przodu i z tyłu.