Name: Trójwymiarowa charakterystyka miejsc kontaktu między organellami w hepatocytach przy użyciu mikroskopii elektronowej o przekroju szeregowym (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-06-09T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 12 s
Description: Poznaj trójwymiarową rekonstrukcję miejsc kontaktowych między organellami w hepatocytach przy użyciu mikroskopii elektronowej o przekroju szeregowym. Ta metoda umożliwia badanie morfologii organelli i ich interakcji w kontekście patologicznym.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy Joannie Hanley, Rebecce Fiadeiro i Ani Straatman-Iwanowskiej za fachową pomoc techniczną. Dziękujemy również członkom laboratorium Stefana i Ianowi J. White'owi za pomocne dyskusje. J.J.B. jest wspierany przez MRC Laboratory of Molecular Cell Biology na UCL, kod nagrody MC_U12266B. C.J.S. jest wspierany przez MRC z funduszy MRC dla MRC Laboratory of Molecular Cell Biology University Unit na UCL, kod grantu MC_UU_00012/6. Projekt P.G. jest finansowany przez Europejską Radę ds. Badań Naukowych, kod grantu ERC-2013-StG-337057.

Autorzy nie mają do ujawnienia żadnych konfliktów interesów.

Dostępna technika vEM do wizualizacji struktury organelli i interakcji w 3D jest opisana w tym protokole. Morfologia kontaktów międzyorganellowych w hepatocytach została przedstawiona jako studium przypadku. Jednak podejście to zostało również zastosowane do zbadania wielu innych próbek i obszarów badawczych, w tym interakcji komórek Schwanna i śródbłonka w nerwach obwodowych45, biogenezy ciała Weibel Palade w komórkach śródbłonka46, wydzielania ładunku w komórkach nerki<su...

Od czasu ich wynalezienia w latach 30-tych, mikroskopy elektronowe pozwalają naukowcom na wizualizację składników strukturalnych komórek i tkanek1,2. Większość badań dostarczyła informacji 2D, ponieważ budowanie modeli 3D wymaga żmudnego zbierania sekcji seryjnych, ręcznego fotografowania, obróbki negatywów, ręcznego śledzenia oraz tworzenia i składania modeli 3D z tafli szkła, plastiku lub styropianu3,4. Prawie 70 lat później nastąpił znaczny postęp w wielu aspektach procesu, od wydajności mikroskopu, zbierania przekrojów seryjnych, zautomatyzowanego obrazowania cyfrowego, zaawansowanego oprogramowania i sprzętu do rekonstrukcji, wizualizacji i analizy 3D, po alternatywne podejścia do tego, co obecnie określa się zbiorczo jako objętość EM (vEM). Uważa się, że te techniki vEM dostarczają informacji ultrastrukturalnych 3D w rozdzielczościach nanometrowych w skalach mikronowych i obejmują transmisyjną mikroskopię elektronową (TEM) oraz nowsze techniki skaningowej mikroskopii elektronowej (SEM); Zobacz recenzje5,6,7,8.
Na przykład, skupiona wiązka jonów SEM (FIB-SEM) wykorzystuje skupioną wiązkę jonów wewnątrz SEM do mielenia powierzchni bloku pomiędzy sekwencyjnymi skanami obrazowania SEM powierzchni bloku, umożliwiając wielokrotne automatyczne mielenie/obrazowanie próbki i tworzenie zestawu danych 3D do rekonstrukcji9,10. W przeciwieństwie do tego, seryjna powierzchnia bloku SEM (SBF-SEM) wykorzystuje ultramikrotom wewnątrz SEM do usunięcia materiału z powierzchni bloku przed obrazowaniem11,12, podczas gdy tomografia matrycowa jest procesem nieniszczącym, który wymaga zbierania odcinków seryjnych na szkiełkach nakrywkowych, płytkach lub taśmie, przed skonfigurowaniem zautomatyzowanego przepływu pracy obrazowania obszaru zainteresowania w sekwencyjnych sekcjach w SEM w celu wygenerowania zestawu danych 3D13. Podobnie jak tomografia matrycowa, TEM odcinka szeregowego (ssTEM) wymaga pobrania skrawków fizycznych przed obrazowaniem; jednak te sekcje są zbierane w siatkach TEM i obrazowane w TEM14,15,16. ssTEM można rozszerzyć, wykonując tomografię wychylenia17,18,19. Szeregowa tomografia wychylna zapewnia najlepszą rozdzielczość w zakresie x, y i z, i chociaż była używana do rekonstrukcji całych komórek20, jest dość trudna. Protokół ten koncentruje się na praktycznych aspektach ssTEM jako najbardziej dostępnej techniki vEM dostępnej dla wielu laboratoriów EM, które mogą obecnie nie mieć dostępu do specjalistycznych narzędzi do sekcji lub vEM, ale skorzystałyby na generowaniu danych 3D vEM.
Seryjna ultramikrotomia do rekonstrukcji 3D była wcześniej uważana za wyzwanie. Trudno było ciąć proste wstęgi o równej grubości przekroju, być w stanie ułożyć i podnieść wstęgi o odpowiednim rozmiarze, we właściwej kolejności, na siatki z wystarczającym wsparciem, ale bez pasków siatki zasłaniających obszary zainteresowania, a co najważniejsze, bez utraty sekcji, ponieważ niekompletna seria może uniemożliwić pełną rekonstrukcję 3D21. Jednak ulepszenia komercyjnych ultramikrotomów, noże do cięcia i przycinania diamentów22,23, przezroczyste folie nośne elektronów na siatkach21,24, oraz kleje wspomagające przyleganie sekcji i konserwację wstążki13,21 to tylko niektóre z postępów, które nastąpiły na przestrzeni lat, dzięki czemu technika ta stała się bardziej rutynowa w wielu laboratoriach. Po zebraniu odcinków seryjnych, obrazowanie seryjne w TEM jest proste i może dostarczyć obrazy EM o subnanometrowych rozmiarach px w x i y, umożliwiając badanie struktur subkomórkowych w wysokiej rozdzielczości - potencjalny wymóg dla wielu pytań badawczych. Przedstawione tutaj studium przypadku demonstruje zastosowanie ssTEM i rekonstrukcji 3D w badaniu kontaktów retikulum endoplazmatycznego (ER) z organellami w hepatocytach wątroby, gdzie po raz pierwszy zaobserwowano kontakty ER-organelle 25,26.
Będąc w sąsiedztwie z otoczką jądrową, ER nawiązuje również bliskie kontakty z wieloma innymi organellami komórkowymi, w tym lizosomami, mitochondriami, kropelkami lipidów i błoną plazmatyczną27. Kontakty ER-organelle są zaangażowane w metabolizm lipidów28, fosfoinozytyd i sygnalizacja wapnia29, regulacja autofagii i reakcja na stres30,31. Kontakty ER-organelle i inne kontakty międzyorganellowe są wysoce dynamicznymi strukturami, które reagują na komórkowe potrzeby metaboliczne i sygnały zewnątrzkomórkowe. Wykazano, że różnią się morfologicznie pod względem wielkości i kształtu oraz odległości między błonami organelli32,33. Uważa się, że te różnice ultrastrukturalne prawdopodobnie odzwierciedlają ich różny skład i funkcję białek/lipidów34,35. Jednak zdefiniowanie kontaktów międzyorganellowych i ich analiza jest nadal trudnym zadaniem36. W związku z tym do dalszych badań wymagany jest wiarygodny, ale prosty protokół do badania i charakteryzowania kontaktów międzyorganelli.
Ponieważ kontakty ER-organelle mogą wynosić od 10 do 30 nm w separacji membrana-membrana, złotym standardem identyfikacji był historycznie TEM. Cienkoczęściowy TEM ujawnił specyficzną lokalizację subdomen dla rezydentnych białek ER w różnych kontaktach błonowych37. Tradycyjnie, ujawniało to kontakty ER-organelle z rozdzielczością nm, ale często przedstawiało tylko widok 2D tych interakcji. Jednak podejścia vEM ujawniają ultrastrukturalną prezentację i kontekst tych miejsc kontaktu w 3D, umożliwiając pełną rekonstrukcję kontaktów i dokładniejszą klasyfikację kontaktów (punktowe vs. rurowe vs. cysternalne) oraz kwantyfikację38,39. Oprócz tego, że są pierwszym typem komórki, w którym zaobserwowano kontakty ER-organella25,26, hepatocyty mają rozbudowany system innych kontaktów międzyorganelli, które odgrywają istotną rolę w ich architekturze i fizjologii28,40. Jednak nadal brakuje dokładnej charakterystyki morfologicznej ER-organelli i innych kontaktów międzyorganowych w hepatocytach. W związku z tym sposób, w jaki tworzą się i przebudowują kontakty międzyorganellowe podczas regeneracji i naprawy, ma szczególne znaczenie dla biologii hepatocytów i funkcji wątroby.

<table><tbody><tr><td>0,22 &mikro; m filtr strzykawkowy</td><td>Sarstedt</td><td>83.1826.001</td><td></td></tr><tr><td>Tace aluminiowe</td><td>Agar Scientific</td><td>AGG3912</td><td></td></tr><tr><td>Amira v6</td><td>ThermoFisher</td><td></td><td>https://www.thermofisher.com</td></tr><tr><td>Chloroform</td><td>Fisher</td><td>C/4960/PB08</td><td></td></tr><tr><td>DDSA/Dodecenyl Bezwodnik bursztynowy</td><td>TAAB</td><td>T027</td><td>Składnik Epon</td></tr><tr><td>Nóż diamentowy</td><td>DiaTOME</td><td>ultra 45&deg;</td><td></td></tr><tr><td>DMP-30/2,4,6-tri (dimetyloaminometylo)fenol</td><td>TAAB</td><td>D032</td><td>Składnik Epon</td></tr><tr><td>Pęseta Dumont N5</td><td>Agar Scientific</td><td>AGT5293</td><td></td></tr><tr><td>Fidżi</td><td></td><td></td><td>https://imagej.net/</td></tr> <tr><td>Fidżi Wtyczka</td><td></td><td></td> TrakEM2 <td>https://imagej.net/</td></tr> <tr><td>Roztwór formaldehydu 36%</td><td>TAAB</td><td>F003</td><td></td></tr><tr><td>Formvar powlekana siatka szczelinowa</td><td>Domowa</td><td></td><td>alternatywa: EMS diasum (FF2010-Cu)</td></tr> <tr><td>Szklana butelka z prętem aplikatora</td><td>Medisca</td><td>6258</td><td></td></tr><tr><td>Fiolki szklane</td><td>Fisher Scientific</td><td>15364769</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór aldehydu gluteraldehydu 25%</td><td>TAAB</td><td>G011</td><td></td></tr><tr><td>MNA/bezwodnik metylowo-nadic</td><td>TAAB</td><td>M011</td><td>Składnik Epon</td></tr><tr><td>Tetratlenek osmu 2% roztwór</td><td>TAAB</td><td>O005</td><td></td></tr><tr><td>Żelazocyjanek potasu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P-8131</td><td></td></tr><tr><td>Tlenek propylenu</td><td>Fisher Scientific</td><td>E/0050/PB08</td><td></td></tr><tr><td>Klej wielokrotnego użytku</td><td>Blue Tack</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Reynolds Cytrynian ołowiu</td><td>TAAB</td><td>L037</td><td>Barwnik przekrojowy</td></tr><tr><td>Kakodylan sodu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C-0250</td><td>do zrobić 0,1 M Bufor Caco</td></tr><tr><td>Super Glue</td><td>RS Components</td><td>918-6872</td><td>Klej cyjanoakrylowy, Krok 1.3</td></tr><tr><td>TAAB 812 Żywica</td><td>TAAB</td><td>T023</td><td>Składnik Epon</td></tr><tr><td>Kwas garbnikowy</td><td>TAAB</td><td>T046</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T9284</td><td></td></tr><tr><td>Dwuskładnikowa żywica epoksydowa</td><td>RS Components</td><td>132-605</td><td>Alternatywa: Krok 2.13</td></tr><tr><td>Ultramikrotom</td><td>Leica</td><td>UC7</td><td></td></tr><tr><td>Wibracyjny mikrotom</td><td>Leica</td><td></td><td>100 &micro; m grube plastry, 0,16 mm/s cięcie przy amplitudzie 1 mm .</td></tr><tr><td>Weldwood Original Contact cement</td><td>DAP</td><td>107</td><td>Klej kontaktowy: Krok 3.1.4</td></tr></tbody></table>

trójwymiarowa charakterystyka miejsc kontaktu między organellami w hepatocytach przy użyciu mikroskopii elektronowej o przekroju szeregowym

Three-dimensional Characterization of Interorganelle Contact Sites in Hepatocytes using Serial Section Electron Microscopy

Transmisyjna mikroskopia elektronowa od dawna uważana jest za złoty standard w wizualizacji ultrastruktury komórkowej. Jednak analiza jest często ograniczona do dwóch wymiarów, co utrudnia pełne opisanie trójwymiarowej (3D) ultrastruktury i funkcjonalnego związku między organellami. Objętościowa mikroskopia elektronowa (vEM) opisuje zbiór technik, które umożliwiają badanie ultrastruktury komórkowej w 3D w rozdzielczościach mezoskalowych, mikroskalowych i nanoskalowych. 
Ten protokół zapewnia przystępną i solidną metodę pozyskiwania danych vEM za pomocą transmisji sekcji szeregowej EM (TEM) i obejmuje techniczne aspekty przetwarzania próbek aż do cyfrowej rekonstrukcji 3D w jednym, prostym przepływie pracy. Aby zademonstrować przydatność tej techniki, przedstawiono ultrastrukturalny związek 3D między retikulum endoplazmatycznym a mitochondriami i ich miejscami kontaktu w hepatocytach wątroby. Kontakty międzyorganellowe odgrywają istotną rolę w przenoszeniu jonów, lipidów, składników odżywczych i innych małych cząsteczek między organellami. Jednak pomimo ich początkowego odkrycia w hepatocytach, wciąż jest wiele do nauczenia się o ich cechach fizycznych, dynamice i funkcjach. 
Kontakty międzyorganelle mogą wykazywać różne morfologie, różniące się odległością dwóch organelli od siebie (zazwyczaj ~10-30 nm) i zasięgiem miejsca kontaktu (od kontaktów punktowych do większych kontaktów 3D przypominających cysternę). Badanie bliskich kontaktów wymaga obrazowania w wysokiej rozdzielczości, a TEM z odcinka seryjnego dobrze nadaje się do wizualizacji ultrastruktury 3D kontaktów międzyorganellowych podczas różnicowania hepatocytów, a także zmian w architekturze hepatocytów związanych z chorobami metabolicznymi.

W tej technice obszary zainteresowania są wybierane na podstawie celu badań biologicznych i identyfikowane przed przycinaniem i sekcjonowaniem zatopionej tkanki. Podobnie wielkość powierzchni bloku może być podyktowana pytaniem badawczym; w tym przypadku próbka została przycięta tak, aby powierzchnia bloku wynosiła około 0,3 mm x 0,15 mm (Rysunek 4A). Pozwoliło to na przygotowanie dwóch siatek po 9 sekcji seryjnych na każdą siatkę, co dostarczyło 18 sekcji seryjnych i objęło objętość tkanki ...

Prosty i wszechstronny protokół do pozyskiwania trójwymiarowych szczegółów miejsc kontaktu błony między organellami w hepatocytach z wątroby lub komórek w innych tkankach.

Trójwymiarowa charakterystyka miejsc kontaktu między organellami w hepatocytach przy użyciu mikroskopii elektronowej o przekroju szeregowym

Transmission electron microscopy has been long considered to be the gold standard for the visualization of cellular ultrastructure. However, analysis is ...

Protokół ten umożliwia rekonstrukcję 3D organelli w prosty i solidny sposób, a jednocześnie jest dostępny dla laboratoriów, które obecnie nie dysponują specjalistycznymi mikroskopami elektronowymi objętościowymi. Technika ta jest niezwykle elastyczna, zapewniając doskonałą rozdzielczość X/Y, a jednocześnie jest w stanie w razie potrzeby ponownie obrazować próbki. Jest również kompatybilny z tomografią wychylną, gdy wymagana jest bardzo wysoka rozdzielczość Z.Technika ta pozwala na badanie morfologii organelli w kontekście między organellami. Dlatego można go rozszerzyć o badanie wszelkich stanów patologicznych z wadami organelli. Takie podejście może zapewnić wgląd w interakcje organelli i zdarzenia związane z transportem komórkowym.Metoda ta może być również stosowana do innych tkanek, modeli organoidów i systemów hodowli komórkowych, oprócz hepatocytów. Nowi użytkownicy mogą uznać cięcie seryjne i odbiór bez strat. Zaleca się, aby być biegłym w regularnym ultracienkim cięciu przed zastosowaniem tego protokołu do cennej próbki.Zacznij od ostrożnego przycięcia tkanki zatopionej w żywicy za pomocą żyletki z próbką zablokowaną w adapterze do przycinania. Przenieś arkę próbki wraz z uchwytem i próbką do ramienia próbki mikrotomu i ustaw arkę próbki tak, aby zakres ruchu arki przebiegał od góry do dołu. Umieść i zablokuj nóż diamentowy w uchwycie noża, upewniając się, że kąt cięcia noża jest odpowiednio ustawiony.Bezpiecznie zablokuj uchwyt noża w scenie. Wyłącz oświetlenie sceny w dół, włącz oświetlenie sceny w górę, ostrożnie przesuwaj nóż w kierunku preparatu, ciągle regulując kąt boczny noża, nachylenie próbki i obrót próbki, regulując odpowiednie pokrętła, aż powierzchnia bloku zrówna się z krawędzią noża. Ustaw górną i dolną część okienka tnącego ramienia próbki i pozostaw próbkę tuż poniżej krawędzi noża.Napełnij łódkę z nożem czystą, podwójnie destylowaną wodą i upewnij się, że powierzchnia wody jest równa z krawędzią noża i lekko wklęsła. Następnie rozpocznij wycinanie sekcji. Przerwać cięcie zaraz po tym, jak próbka przejdzie przez krawędź noża.Użyj pustej siatki slotów, aby oszacować liczbę sekcji do zebrania na każdej siatce. Używając rzęsy w każdej ręce, delikatnie przełam wstążkę na mniejsze wstążki, które zmieszczą się na długości siatki szczeliny. Zanotuj w pamięci ich względne położenie w próbce.Za pomocą szklanego pręta aplikatora najedź kroplą chloroformu na sekcje, aby je spłaszczyć. Podnieś pierwszą pustą siatkę szczeliny za pomocą pierwszych ponumerowanych kleszczyków i delikatnie zanurz ją w Triton X-100, a następnie dwa razy w wodzie destylowanej. Użyj kawałka bibuły filtracyjnej, aby usunąć nadmiar wody z krawędzi kleszczy.Za pomocą kleszczy delikatnie opuść około 2/3 siatki szczelinowej pokrytej formvarem do wody łodzi z nożem. Upewnij się, że strona formvar jest skierowana w dół, a długa prawa krawędź szczeliny znajduje się na powierzchni wody i jest równoległa do krawędzi wody. Delikatnie odchyl siatkę w wodzie w kierunku wstęg, tak aby po skoku powrotnym sekcje dryfowały w kierunku siatki.Kontynuuj to w coraz mniejszych falach, aż prawa krawędź wstążki zrówna się z prawą krawędzią szczeliny. Następnie, ostatnim machnięciem, delikatnie podnieś siatkę do góry, aby podnieść sekcje do siatki szczeliny. Umieść kilka granulek wodorotlenku sodu pod pokrywką szalki Petriego, aby zapewnić środowisko wolne od dwutlenku węgla.Następnie ostrożnie odpipetuj 40-mikrolitrowe krople cytrynianu ołowiu Reynoldsa na parafilm, po jednej kropli na każdą siatkę. Odwróć każdą siatkę na kroplę cytrynianu ołowiu i pozostaw chronioną pokrywką szalki Petriego na 7 do 10 minut. Podczas barwienia siatek umieść pięć około 300 mikrolitrów kropli wody destylowanej na każdą siatkę na parafilmie.Pod koniec inkubacji cytrynianu ołowiu przenieść każdą siatkę do kropli wody destylowanej, aby myć przez jedną minutę bez wdychania bezpośrednio na siatkę. Powtórz to jeszcze cztery razy. Użyj ponumerowanych kleszczy krzyżowych, aby podnieść pierwszą siatkę.Dotknij krawędzi siatki, aby przefiltrować bibułę, aby odprowadzić większość wody i pozostaw do wyschnięcia w kleszczach na co najmniej 20 minut. Powtórz to dla każdej siatki. Przy małym powiększeniu obserwuj kolejność, położenie i położenie sekcji szeregowych.Przejdź do środkowej sekcji serii na siatce. Przejrzyj przykład i zidentyfikuj obszar zainteresowania. Następnie obserwuj próbkę w pożądanym powiększeniu.Rozważ zebranie serii w nieco mniejszym powiększeniu, ponieważ sekcje często nie są idealnie wyrównane, a obrazy mogą wymagać późniejszego przycięcia. Następnie wykonaj zdjęcia referencyjne przy mniejszych powiększeniach. Pomoże to docenić kontekst obszaru zainteresowania, jego przybliżoną lokalizację przy różnych powiększeniach w stosunku do granic sekcji oraz cechy charakterystyczne w próbce.Użyj ich, aby oznaczyć interesujący Cię region w innych sekcjach. Do odwoływania się do ekranu użyj szpachli samoprzylepnej wielokrotnego użytku, naklejek lub kawałka papieru do projektora przyklejonego do ekranu, aby umieścić tymczasowe znaczniki na ekranie. Umożliwi to rutynowe ponowne wyobrażenie sobie tych samych cech obszaru zainteresowania w środku obrazu w całym zbiorze danych.Otwórz stos obrazów, określ pomiary wokseli i wybierz kartę Segmentacja, aby rozpocząć segmentację. Kliknij przycisk Nowy w panelu edytora segmentacji, aby zdefiniować nowe obiekty na liście materiałów. Kliknij prawym przyciskiem myszy, aby zmienić kolor obiektu i kliknij dwukrotnie, aby zmienić nazwę obiektu.W przypadku segmentacji ręcznej wybierz narzędzie do segmentacji poniżej listy materiałów i wybierz domyślne narzędzie pędzla, aby podświetlić piksele. Obraz z mikroskopii elektronowej dwóch przeciwstawnych hepatocytów jest pokazany tutaj. Obrazowanie w większym powiększeniu pozwala na obserwację szczegółów morfologicznych różnych organelli z rozdzielczością nanometrową.Reprezentatywny obraz przedstawia segmentowaną wersję tego samego tomogramu, pokazano tutaj ślad retikulum endoplazmatycznego, mitochondriów oraz kontakty międzybłonowe między ER a mitochondriami różnych przestrzeni. Reprezentatywny obraz przedstawia pochylony orto-plasterek pokryty śladami segmentacji i jego względnym położeniem w całym mitochondrium. Pokazano tutaj rekonstrukcję 3D segmentowanych organelli i kontaktów retikulum endoplazmatycznego z mitochondriami pod różnymi kątami.Ponieważ protokół ten jest kompatybilny z tomografią wychylną, gdy wymagana jest bardzo wysoka rozdzielczość Z, pomaga w rozwiązywaniu małych lub fałdowych struktur. Technika ta doskonale nadaje się do wstępnej oceny relacji przestrzennych między różnymi organellami, a zatem jest szczególnie przydatna w postępującej dziedzinie kontaktów błonowych w homeostazie błonowej.

three-dimensional-characterization-interorganelle-contact-sites

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Badania nad śródbłonkiem sinusoidalnym wątroby (SECs) muszą być prowadzone z wykorzystaniem komórek pierwotnych pobranych od zwierząt, ponieważ nie istnieją linie komórkowe tego typu. Metoda ta opiera się na trawieniu wątroby i centryfugacji różnicowej w celu oczyszczenia SECs do późniejszej hodowli i przeprowadzania eksperymentów.

In vivo endocytoza w wątrobie z następującą puryfikacją komórek wątroby poprzez perfuzję wątroby

Ten protokół jest ukierunkowany na konkretne komórki w tkance do obrazowania w rozdzielczości nanoskali za pomocą skaningowego mikroskopu elektronowego (SEM). Duża liczba seryjnych odcinków materiału biologicznego zatopionego w żywicy jest najpierw obrazowana w mikroskopie świetlnym w celu identyfikacji celu, a następnie w sposób hierarchiczny w SEM.

Multimodalne hierarchiczne obrazowanie odcinków szeregowych w celu znalezienia określonych celów komórkowych w dużych objętościach

Przedstawiamy protokół do badania rozkładu mitochondriów i retikulum endoplazmatycznego w całych komórkach po modyfikacji genetycznej za pomocą korelacyjnej mikroskopii elektronowej światła i objętości, w tym barwienia peroksydazą askorbinianową 2 i peroksydazy chrzanowej, seryjnego cięcia komórek z i bez genu docelowego w tej samej sekcji oraz seryjnego obrazowania za pomocą mikroskopii elektronowej.

Obrazowanie mitochondriów i retikulum endoplazmatycznego za pomocą korelacyjnej mikroskopii świetlnej i objętościowej

Prezentowany tutaj jest protokół izolacji hepatocytów myszy z wątroby dorosłych myszy przy użyciu zmodyfikowanej techniki perfuzji kolagenazy. Opisano również długoterminową hodowlę hepatocytów w warstwie kolagenowej 3D, a także znakowanie immunologiczne składników cytoszkieletu w celu zbadania tworzenia kanałów żółciowych i ich odpowiedzi na leczenie.

Izolacja i hodowla kanapkowa kolagenu 3D pierwotnych hepatocytów myszy w celu zbadania roli cytoszkieletu w tworzeniu kanałów żółciowych in vitro

Tutaj opisujemy prostą i przystępną strategię wizualizacji, kwantyfikacji i mapowania komórek odpornościowych w utrwalonych w formalinie odcinkach tkanki nowotworowej zatopionej w parafinie. Metodologia ta łączy istniejące techniki obrazowania i analizy cyfrowej w celu rozszerzenia możliwości multipleksowania i analizy wieloparametrowej testów obrazowania.

Wizualizacja, kwantyfikacja i mapowanie populacji komórek odpornościowych w mikrośrodowisku guza

Potrzeba nowych podejść do badania miejsc kontaktu z błoną (MCS) wzrosła ze względu na rosnące zainteresowanie badaniem tych struktur komórkowych i ich składników. W tym miejscu przedstawiamy protokół, który integruje wcześniej dostępne technologie mikroskopowe w celu identyfikacji i ilościowego określenia kompleksów białkowych wewnątrz organelli i między organellami, które znajdują się w MCS.

Wizualizacja i kwantyfikacja endogennych interakcji białek wewnątrz organelli w miejscach kontaktu ER-mitochondria za pomocą testów ligacji zbliżeniowej

Protokół ten opisuje wytwarzanie szybkich i powtarzalnych endodermalnych organoidów wątrobowych (eHEPO). Dzięki temu protokołowi eHEPO mogą być produkowane w ciągu 2 tygodni i rozwijać się w dłuższej perspektywie (ponad 1 rok) bez utraty swojego zróżnicowania i funkcjonalności.

Wytwarzanie funkcjonalnych endodermalnych organoidów wątroby

Tomografia krio-STEM umożliwia wizualizację organelli nienaruszonych komórek bez osadzania, cięcia lub innych inwazyjnych przygotowań. Uzyskana rozdzielczość 3D mieści się obecnie w zakresie kilku nanometrów, przy polu widzenia kilku mikrometrów i dostępnej grubości rzędu 1 μm.

Wizualizacja organelli in situ za pomocą tomografii krio-STEM

Tutaj prezentujemy protokół do zoptymalizowanej korelacyjnej mikroskopii świetlno-elektronowej opartej na endogennym, fluorescencyjnym znakowaniu jako narzędzie do badania lokalizacji rzadkich białek w odniesieniu do ultrastruktury komórkowej. O sile tego podejścia świadczy ultrastrukturalna lokalizacja endogennego LC3 w wygłodzonych komórkach bez leczenia bafilomycyną.

Ultrastrukturalna lokalizacja endogennego LC3 za pomocą korelacyjnej mikroskopii świetlno-elektronowej na przekroju

Ten protokół opisuje, jak zrekonstruować grzebienie mitochondrialne, aby uzyskać obrazowanie 3D z wysoką dokładnością, wysoką rozdzielczością i wysoką przepustowością.

Trójwymiarowa technika wizualizacji ultrastrukturalnych zmian mitochondrialnych w komórkach raka trzustki

Protokół ten oferuje kompleksowy pipeline obrazowania umożliwiający wizualizację i modelowanie morfologii komórek wątrobowych gwiaździstych w nienaruszonej tkance wątroby. Podejście to łączy znakowanie fluorescencyjne fibroblastów z wykorzystaniem genetyki myszy, przygotowanie tkanek in situ oparte na perfuzji wątroby oraz zmodyfikowaną metodę oczyszczania tkanek iDISCO, aby uzyskać optyczną przezroczystość.

Mapowanie morfologii komórek gwiaździstych wątroby wątroby w myszych modelach włóknienia wątroby

Poznaj trójwymiarową rekonstrukcję miejsc kontaktowych między organellami w hepatocytach przy użyciu mikroskopii elektronowej o przekroju szeregowym. Ta metoda umożliwia badanie morfologii organelli i ich interakcji w kontekście patologicznym.

Trójwymiarowa charakterystyka miejsc kontaktu między organellami w hepatocytach przy użyciu mikroskopii elektronowej o przekroju szeregowym (Wideo) | JoVE Journal

Trójwymiarowa charakterystyka miejsc kontaktu między organellami w hepatocytach przy użyciu mikroskopii elektronowej o przekroju szeregowym

Przeglądaj więcej filmów