Trójwymiarowa charakterystyka miejsc kontaktu między organellami w hepatocytach przy użyciu mikroskopii elektronowej o przekroju szeregowym
June 9th, 2022
Prosty i wszechstronny protokół do pozyskiwania trójwymiarowych szczegółów miejsc kontaktu błony między organellami w hepatocytach z wątroby lub komórek w innych tkankach.
Protokół ten umożliwia rekonstrukcję 3D organelli w prosty i solidny sposób, a jednocześnie jest dostępny dla laboratoriów, które obecnie nie dysponują specjalistycznymi mikroskopami elektronowymi objętościowymi. Technika ta jest niezwykle elastyczna, zapewniając doskonałą rozdzielczość X/Y, a jednocześnie jest w stanie w razie potrzeby ponownie obrazować próbki. Jest również kompatybilny z tomografią wychylną, gdy wymagana jest bardzo wysoka rozdzielczość Z.
Technika ta pozwala na badanie morfologii organelli w kontekście między organellami. Dlatego można go rozszerzyć o badanie wszelkich stanów patologicznych z wadami organelli. Takie podejście może zapewnić wgląd w interakcje organelli i zdarzenia związane z transportem komórkowym.
Metoda ta może być również stosowana do innych tkanek, modeli organoidów i systemów hodowli komórkowych, oprócz hepatocytów. Nowi użytkownicy mogą uznać cięcie seryjne i odbiór bez strat. Zaleca się, aby być biegłym w regularnym ultracienkim cięciu przed zastosowaniem tego protokołu do cennej próbki.
Zacznij od ostrożnego przycięcia tkanki zatopionej w żywicy za pomocą żyletki z próbką zablokowaną w adapterze do przycinania. Przenieś arkę próbki wraz z uchwytem i próbką do ramienia próbki mikrotomu i ustaw arkę próbki tak, aby zakres ruchu arki przebiegał od góry do dołu. Umieść i zablokuj nóż diamentowy w uchwycie noża, upewniając się, że kąt cięcia noża jest odpowiednio ustawiony
.Bezpiecznie zablokuj uchwyt noża w scenie. Wyłącz oświetlenie sceny w dół, włącz oświetlenie sceny w górę, ostrożnie przesuwaj nóż w kierunku preparatu, ciągle regulując kąt boczny noża, nachylenie próbki i obrót próbki, regulując odpowiednie pokrętła, aż powierzchnia bloku zrówna się z krawędzią noża. Ustaw górną i dolną część okienka tnącego ramienia próbki i pozostaw próbkę tuż poniżej krawędzi noża.
Napełnij łódkę z nożem czystą, podwójnie destylowaną wodą i upewnij się, że powierzchnia wody jest równa z krawędzią noża i lekko wklęsła. Następnie rozpocznij wycinanie sekcji. Przerwać cięcie zaraz po tym, jak próbka przejdzie przez krawędź noża.
Użyj pustej siatki slotów, aby oszacować liczbę sekcji do zebrania na każdej siatce. Używając rzęsy w każdej ręce, delikatnie przełam wstążkę na mniejsze wstążki, które zmieszczą się na długości siatki szczeliny. Zanotuj w pamięci ich względne położenie w próbce.
Za pomocą szklanego pręta aplikatora najedź kroplą chloroformu na sekcje, aby je spłaszczyć. Podnieś pierwszą pustą siatkę szczeliny za pomocą pierwszych ponumerowanych kleszczyków i delikatnie zanurz ją w Triton X-100, a następnie dwa razy w wodzie destylowanej. Użyj kawałka bibuły filtracyjnej, aby usunąć nadmiar wody z krawędzi kleszczy.
Za pomocą kleszczy delikatnie opuść około 2/3 siatki szczelinowej pokrytej formvarem do wody łodzi z nożem. Upewnij się, że strona formvar jest skierowana w dół, a długa prawa krawędź szczeliny znajduje się na powierzchni wody i jest równoległa do krawędzi wody. Delikatnie odchyl siatkę w wodzie w kierunku wstęg, tak aby po skoku powrotnym sekcje dryfowały w kierunku siatki.
Kontynuuj to w coraz mniejszych falach, aż prawa krawędź wstążki zrówna się z prawą krawędzią szczeliny. Następnie, ostatnim machnięciem, delikatnie podnieś siatkę do góry, aby podnieść sekcje do siatki szczeliny. Umieść kilka granulek wodorotlenku sodu pod pokrywką szalki Petriego, aby zapewnić środowisko wolne od dwutlenku węgla.
Następnie ostrożnie odpipetuj 40-mikrolitrowe krople cytrynianu ołowiu Reynoldsa na parafilm, po jednej kropli na każdą siatkę. Odwróć każdą siatkę na kroplę cytrynianu ołowiu i pozostaw chronioną pokrywką szalki Petriego na 7 do 10 minut. Podczas barwienia siatek umieść pięć około 300 mikrolitrów kropli wody destylowanej na każdą siatkę na parafilmie.
Pod koniec inkubacji cytrynianu ołowiu przenieść każdą siatkę do kropli wody destylowanej, aby myć przez jedną minutę bez wdychania bezpośrednio na siatkę. Powtórz to jeszcze cztery razy. Użyj ponumerowanych kleszczy krzyżowych, aby podnieść pierwszą siatkę.
Dotknij krawędzi siatki, aby przefiltrować bibułę, aby odprowadzić większość wody i pozostaw do wyschnięcia w kleszczach na co najmniej 20 minut. Powtórz to dla każdej siatki. Przy małym powiększeniu obserwuj kolejność, położenie i położenie sekcji szeregowych.
Przejdź do środkowej sekcji serii na siatce. Przejrzyj przykład i zidentyfikuj obszar zainteresowania. Następnie obserwuj próbkę w pożądanym powiększeniu.
Rozważ zebranie serii w nieco mniejszym powiększeniu, ponieważ sekcje często nie są idealnie wyrównane, a obrazy mogą wymagać późniejszego przycięcia. Następnie wykonaj zdjęcia referencyjne przy mniejszych powiększeniach. Pomoże to docenić kontekst obszaru zainteresowania, jego przybliżoną lokalizację przy różnych powiększeniach w stosunku do granic sekcji oraz cechy charakterystyczne w próbce.
Użyj ich, aby oznaczyć interesujący Cię region w innych sekcjach. Do odwoływania się do ekranu użyj szpachli samoprzylepnej wielokrotnego użytku, naklejek lub kawałka papieru do projektora przyklejonego do ekranu, aby umieścić tymczasowe znaczniki na ekranie. Umożliwi to rutynowe ponowne wyobrażenie sobie tych samych cech obszaru zainteresowania w środku obrazu w całym zbiorze danych.
Otwórz stos obrazów, określ pomiary wokseli i wybierz kartę Segmentacja, aby rozpocząć segmentację. Kliknij przycisk Nowy w panelu edytora segmentacji, aby zdefiniować nowe obiekty na liście materiałów. Kliknij prawym przyciskiem myszy, aby zmienić kolor obiektu i kliknij dwukrotnie, aby zmienić nazwę obiektu.
W przypadku segmentacji ręcznej wybierz narzędzie do segmentacji poniżej listy materiałów i wybierz domyślne narzędzie pędzla, aby podświetlić piksele. Obraz z mikroskopii elektronowej dwóch przeciwstawnych hepatocytów jest pokazany tutaj. Obrazowanie w większym powiększeniu pozwala na obserwację szczegółów morfologicznych różnych organelli z rozdzielczością nanometrową.
Reprezentatywny obraz przedstawia segmentowaną wersję tego samego tomogramu, pokazano tutaj ślad retikulum endoplazmatycznego, mitochondriów oraz kontakty międzybłonowe między ER a mitochondriami różnych przestrzeni. Reprezentatywny obraz przedstawia pochylony orto-plasterek pokryty śladami segmentacji i jego względnym położeniem w całym mitochondrium. Pokazano tutaj rekonstrukcję 3D segmentowanych organelli i kontaktów retikulum endoplazmatycznego z mitochondriami pod różnymi kątami.
Ponieważ protokół ten jest kompatybilny z tomografią wychylną, gdy wymagana jest bardzo wysoka rozdzielczość Z, pomaga w rozwiązywaniu małych lub fałdowych struktur. Technika ta doskonale nadaje się do wstępnej oceny relacji przestrzennych między różnymi organellami, a zatem jest szczególnie przydatna w postępującej dziedzinie kontaktów błonowych w homeostazie błonowej.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Przegląd
To badanie opisuje kompleksowy protokół pozyskiwania trójwymiarowych rekonstrukcji miejsc kontaktu błon między organellami w hepatocytach. Ta metoda jest solidna i dostępna, co sprawia, że nadaje się do laboratoriów bez wyspecjalizowanych mikroskopow elektronowych.
Kluczowe komponenty badania
Obszar badań
- Biologia komórki
- Badania interakcji organelli
- Techniki mikroskopowe
Tło
- Rozumienie morfologii organelli jest kluczowe w biologii komórkowej.
- Miejsca kontaktu błon są kluczowe dla interakcji komórkowych i transportu.
- Ta metoda pozwala na elastyczność w obrazowaniu różnych tkanek i modeli organoidalnych.
Stosowane metody
- Rekonstrukcja 3D i cięcie szeregowe
- Hepatocyty i inne tkanki
- Mikroskopia elektronowa i tomografia nachylona
Główne wyniki
- Wykazano skuteczne 3D wizualizacje interakcji organelli.
- Przedstawiono protokół, który można rozszerzyć do badania patologicznych stanów.
- Pozwolono na ponowne obrazowanie próbek, aby uchwycić szczegółową morfologię organelli.
Wnioski
- To badanie przedstawia nowatorskie podejście do badania interakcji organelli.
- Wyniki mają znaczące implikacje dla zrozumienia procesów komórkowych i chorób.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
Three-dimensional ultrastructural mapping of interorganelle contact sites in hepatocytes enables mechanistic de-risking and target validation for metabolic and organelle-related disease research. Serial section electron microscopy provides high-resolution spatial context, supporting predictive confidence in early discovery and translational studies. This capability is critical for portfolio teams seeking to understand organelle interactions and their implications for cellular homeostasis and disease mechanisms.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables interrogation of organelle morphology and spatial relationships in disease-relevant systems.
- Supports mechanistic de-risking by visualizing interorganelle contact sites at nanometer resolution.
- Facilitates functional target validation by mapping contact site architecture in hepatocytes.
- Provides predictive confidence for prioritizing targets linked to organelle dysfunction.
Screening & Assay Development
- Prepares validated 3D models of organelle contacts for downstream phenotypic screening.
- Standardizes imaging workflows for reproducible ultrastructural quantification.
- Enables quantitative assessment of contact site morphology for assay development.
- Supports reliable evaluation of compound effects on organelle interactions.
Translational & Preclinical Research
- Aligns with disease-relevant models by enabling analysis of hepatocyte architecture in metabolic disorders.
- Provides continuity from discovery through preclinical validation of organelle-targeted interventions.
- Supports risk-adjusted advancement by clarifying structural biomarkers of organelle dysfunction.
- Delivers predictive de-risking for translational research on membrane contact sites.
Pipeline & Workflow Integration
This method integrates into the discovery continuum from early mechanistic studies to preclinical model validation, supporting both hypothesis testing and translational continuity.
- Discovery Biology: Enables hypothesis-driven mapping of organelle interactions and contact site dynamics.
- Screening: Provides reproducible, quantitative 3D outputs for comparative analysis of experimental conditions.
- Analytics: Delivers high-resolution measurements and segmentation data for statistical evaluation of contact site features.
- Translational Research: Bridges discovery and preclinical studies by supporting biomarker alignment in disease models.
- Enterprise Reuse: Offers a flexible, accessible workflow adaptable to diverse tissues, organoids, and cell systems.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in organelle-targeted research.
- Operational Value: Standardizes 3D imaging and segmentation for reproducibility and scalability across projects.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions and capital efficiency by clarifying structural underpinnings of disease.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of targets and models based on robust ultrastructural evidence.
Implementation Considerations
- Requires proficiency in ultra-thin sectioning and serial section handling for optimal results.
- Needs access to transmission electron microscopy and digital 3D reconstruction software.
- Demands cross-team standardization of imaging and segmentation protocols.
- Adaptable to various tissues, organoid models, and cell culture systems beyond hepatocytes.
- First-time users may face challenges in serial sectioning and sample preservation.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Introduction
1:08
Trimming and Serial Sectioning of Embedded Samples
4:12
Grid Staining
5:26
Imaging Acquisition by TEM
6:52
Segmentation and 3D Reconstruction
7:31
Results: Segmentation and 3D Reconstruction Reviewing the Morphology of Endoplasmic Reticulum and the Associated ER-Mitochondria Contacts
8:34
Conclusion
