Name: Rozszyfrowanie molekularnego mechanizmu składania histonów za pomocą techniki kurtyny DNA (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-03-09T14:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 32 s
Description: Odkryj technikę kurtyny DNA do badania dynamiki chromatyny i interakcji białek z DNA w czasie rzeczywistym. Ta metoda umożliwia szczegółową analizę funkcji chaperonów histonowych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy doceniają życzliwe wsparcie dla Abo1 i Cy5-H3-H4 przez profesora Ji-Joon Song, Carol Cho, Ph.D. i Juwon Jang, Ph.D., w KAIST, Korea Południowa. Praca ta jest wspierana przez grant Narodowej Fundacji Badawczej (NRF-2020R1A2B5B01001792), wewnętrzny fundusz badawczy (1.210115.01) Narodowego Instytutu Nauki i Technologii w Ulsan oraz Instytut Nauk Podstawowych (IBS-R022-D1).

1. Przygotowanie komory przepływowej
<ol>
	<li>Przygotuj oczyszczoną szkiełko z topionej krzemionki zawierające wzory nano-rowów zgodnie z wcześniej opublikowanym raportem25.
	<ol>
		<li>Wywierć dwa otwory o średnicy 1 mm w oczyszczonym szkiełku z topionej krzemionki (<klasa silna = "xfig" >Rysunek 1A) za pomocą wiertła z powłoką diamentową (patrz tabela materiałów).</li>
		<li>Umieść 250 nm grubego aluminium (Al) na szkiełku za pomocą DC sputter32 (patrz Tabela Materiałów) z 10 mTorr argonu.</li>
		<li>Warstwę poli(metakrylanu metylu 950K) (PMMA) o grubości 310 nm o grubości 310 nm (PMMA) (patrz tabela materiałów) pod prędkością 4 000 obr./min przez 1 minutę i piec na płycie grzejnej w temperaturze 180 °C przez 3 minuty.</li>
		<li>Narysuj wzory nanorowów na warstwie PMMA między dwoma otworami za pomocą litografii wiązką elektronów (ebeam) 33 z prądem 0,724 nA przy 80 kV. 
		UWAGA: Architektura i wymiary wzorów nano-rowów są pokazane w Rysunek 1A.</li>
		<li>Usunąć PMMA wystawiony na działanie wiązki elektromagnetycznej, mocząc szkiełka w roztworze rozwijającym (stosunek 1:3 ketonu metylowo-izobutylowego i izopropanolu, patrz tabela materiałów) przez 2 minuty.</li>
		<li>Wytrawianie warstw Al za pomocą indukcyjnie sprzężonego plazmowo-reaktywnego wytrawiania jonowego (ICP-RIE) przy użyciu chloru (Cl2) i trichlorku boru (BCl 3). 
		UWAGA: Te dwa gazy mogą usunąć Al z obszarów narażonych na działanie wiązki elektromagnetycznej.</li>
		<li>Wydrąż nano-rowy na zjeżdżalniach, używając tetrafluorku siarki (SF4), tetrafluorometanu (CF4) i tlenu (O2) (patrz tabela materiałów).</li>
		<li>Usuń pozostałą warstwę Al, mocząc szkiełka w wytrawiaczu Al (wywoływacz AZ 300 MIF, patrz Tabela Materiałów) przez 10 minut.</li>
		<li>Po wytworzeniu przepłukać szkiełka wodą dejonizowaną i sonikować w acetonie przez 30 minut za pomocą sonikatora typu kąpielowego.</li>
		<li>Szkiełka należy czyścić w 2% roztworze Hellmanex III (patrz Tabela Materiałów) przez co najmniej 1 dzień z mieszaniem magnetycznym.</li>
		<li>Sonikować szkiełka w acetonie przez 30 minut i 1 M NaOH przez kolejne 30 minut.</li>
		<li>Przepłukać szkiełka wodą dejonizowaną i osuszyć gazowym azotem (N2).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Połóż czysty papier (5 mm x 35 mm) na środku taśmy dwustronnej. Przymocuj taśmę do szkiełka, aby zakryć papierem dwa otwory i nanowzory.</li>
	<li>Wytnij papier za pomocą czystego ostrza (<silna klasa="xfig">Rysunek 1A).</li>
	<li>Umieść szklane szkiełko nakrywkowe na wierzchu taśmy dwustronnej i przetrzyj szkiełko nakrywkowe za pomocą końcówki pipety, aby utworzyć komorę mikroprzepływową (<silna klasa = "xfig">Rysunek 1A).</li>
	<li>Umieść zmontowaną komórkę przepływową między dwoma szkiełkami mikroskopowymi i przypnij je.</li>
	<li>Piecz komórkę przepływową w piekarniku próżniowym o temperaturze 120 °C przez 45 minut.</li>
	<li>Podłącz złącze płynu (Nanoport) do analiz opartych na chipach (patrz Tabela materiałów) do każdego otwartego otworu za pomocą gorącego pistoletu do klejenia i połącz dwie linie rurki Luer lock.</li>
	<li>Podłączyć strzykawkę typu Luer lock zawierającą 3 ml wody dejonizowanej i umyć komorę.</li>
	<li>Przemyć komorę 3 ml buforu lipidowego (20 mM Tris-HCl, pH 8,0 i 100 mM NaCl) za pomocą złącza kropla. 
	UWAGA: Połączenie typu drop-by-drop łączy wszystkie strzykawki z komorą przepływową, aby uniknąć wstrzykiwania pęcherzyków powietrza do komory.</li>
	<li>Wstrzyknąć 1 ml 0,04x biotynylowanego lipidu w buforze lipidowym do komory w dwóch strzałach z 5-minutową inkubacją na zastrzyk. 
	UWAGA: Przygotowanie 1x biotynylowanego zapasu lipidowego jest opisane w wcześniej opublikowanym raporcie34.</li>
	<li>Przemyć komorę 3 ml buforu lipidowego i inkubować przez 20 minut, aby dwuwarstwa lipidowa dojrzała na powierzchni szkiełka.</li>
	<li>Dodać 1 ml buforu BSA (40 mM Tris-HCl, pH 8,0, 50 mM NaCl, 2 mM MgCl2 i 0,2 mg/ml BSA) i inkubować przez 5 minut w celu pasywacji powierzchni szkiełka. 
	UWAGA: Ten krok może zmniejszyć niespecyficzne wiązanie białek z powierzchnią szkiełka.</li>
	<li>Wstrzyknąć 0,025 mg/ml streptawidyny do 1 ml buforu BSA za pomocą dwóch zastrzyków i 10 minut inkubacji na zastrzyk.</li>
	<li>Wypłukać pozostałą streptawidynę 3 ml buforu BSA.</li>
	<li>Wstrzyknąć ~ 300 pM (30 μL) biotynylowanego DNA faga lambda w 1 ml buforu BSA do komory z dwoma strzałami i 10 minutami inkubacji na zastrzyk. 
	UWAGA: Przygotowanie biotynylowanego DNA lambda opisano we wcześniej opublikowanym raporcie34.</li>
</ol>
2. Podłączanie komory przepływowej do systemu mikroprzepływowego i ładowanie jej do mikroskopu
<ol>
	<li>Przygotuj bufor obrazowania Abo1 (50 mM Tris-HCl, pH 8,0, 100 mM NaCl, 1 mM DTT, 1 mM ATP, 2 mM MgCl2, 1,6% glukozy i 0,1x gloksy, patrz tabela materiałów). 
	UWAGA: Gloxy to system oczyszczania tlenu, który zmniejsza fotowybielanie barwników fluorescencyjnych. Przygotowanie 100x bulionu gloksy z oksydazą glukozową i katalazą jest opisane w Reference35.</li>
	<li>Podłączyć strzykawkę zawierającą 10 ml buforu do obrazowania do pompy strzykawkowej i usunąć pęcherzyki ze wszystkich przewodów w układzie mikroprzepływowym.</li>
	<li>Połącz przygotowaną komorę przepływową z systemem mikroprzepływowym za pomocą połączenia typu kropla-kropla, aby uniknąć wstrzykiwania pęcherzyków do komory przepływowej (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 1B).</li>
	<li>Zmontuj komorę przepływową i uchwyty komory przepływowej, a następnie zamontuj zespół na specjalnie zbudowanym mikroskopie TIRF (<silna klasa="xfig">Rysunek 1C). 
	UWAGA: Gdy komórka przepływowa zostanie umieszczona pod mikroskopem, ostrożnie ustaw wysokość soczewki obiektywu. Komora przepływowa nie może dotykać soczewki obiektywu. Może to spowodować uszkodzenie obiektywu.</li>
	<li>Upuść pasujący indeks oleju na środek komory przepływowej i umieść wykonany na zamówienie pryzmat gołębi (patrz Tabela materiałów) na kropli oleju.</li>
</ol>
3. Składanie histonów przez Abo1 za pomocą kurtyny DNA
<ol>
	<li>Zmieszać 5 nM Abo1 i 12,5 nM dimeru histonów H3-H4 znakowanego Cy5 (Cy5-H3-H4) (patrz tabela materiałów) w 150 μl buforu do obrazowania. Wszystkie białka zostały przygotowane zgodnie z wcześniej opublikowanym raportem17.</li>
	<li>Inkubować mieszaninę na lodzie przez 15 min. 
	UWAGA: Aby uniknąć fotowybielania Cy5, inkubację należy przeprowadzać w ciemności.</li>
	<li>Wstrzyknąć ~20 pM (2 μL) barwnika YOYO-1 do buforu obrazowania przez 100 μl pętli próbki w celu wybarwienia cząsteczek DNA lambda.</li>
	<li>Uruchom oprogramowanie do obrazowania (patrz Tabela materiałów) i włącz laser 488 nm, aby sprawdzić, czy kurtyny DNA są dobrze uformowane. 
	UWAGA: Jeśli kurtyny DNA są dobrze uformowane, cząsteczki DNA, które są barwione YOYO-1, są pokazane jako wyrównane linie na barierze w obecności przepływu. Rozciągnięte linie odsuwają się i rozpraszają od bariery, gdy przepływ jest wyłączony.</li>
	<li>Wstrzyknij 2 ml buforu o wysokiej zawartości soli (200 mM NaCl i 40 mM MgCl2), aby wyeliminować barwnik YOYO-1 z DNA.</li>
	<li>Po usunięciu barwnika YOYO-1 wstrzyknąć wstępnie inkubowaną próbkę białka.</li>
	<li>Gdy białka dotrą do kurtyny DNA, wyłącz pompę strzykawkową, wyłącz zawór odcinający i inkubuj 15 minut w celu załadowania histonów przez Abo1.</li>
	<li>Wypłukać niezwiązane białka Abo1 i histonowe przez 5 minut.</li>
	<li>Włączyć zawór odcinający i wznowić wtrysk przepływowy.</li>
	<li>Włącz laser 637 nm i zobrazuj białka fluorescencyjne, gdy przepływ buforowy jest włączony.</li>
	<li>Tymczasowo wyłącz przepływ bufora, aby sprawdzić, czy białka histonowe są załadowane do DNA (<silna klasa = "xfig">Rysunek 2C).</li>
	<li>Zbierz obrazy kurtyn DNA za pomocą programu do akwizycji obrazu (patrz Tabela materiałów). 
	UWAGA: Kiedy przepływ buforu przejściowo ustaje, DNA wydostaje się z ulotnego pola całkowitego wewnętrznego odbicia, a znakowane fluorescencyjnie białka związane z DNA znikają.</li>
</ol>
4. Analiza danych
<ol>
	<li>Przekształć obrazy wykonane przez program do akwizycji obrazów do formatu TIFF jako sekwencje obrazów. 
	UWAGA: Wszystkie dane zostały przeanalizowane przy użyciu Image J (NIH) zgodnie z opisem w Reference20.</li>
	<li>Wybierz pojedynczą cząsteczkę DNA z sekwencji obrazu i narysuj kymograf. 
	UWAGA: Kymograf może pokazać zmianę intensywności fluorescencji każdego białka histonowego związanego z pojedynczą cząsteczką DNA w funkcji czasu.</li>
	<li>Utwórz profil intensywności fluorescencji z kimografu i dopasuj go do wielu funkcji Gaussa.</li>
	<li>Zbierz środkowe współrzędne pików z profilu intensywności fluorescencji. Na tym etapie można uzyskać minimalną intensywność fluorescencji histonów.</li>
	<li>Podzielić wszystkie szczytowe intensywności zebrane z profili przez minimalną intensywność. Na tym etapie szacuje się liczbę dimerów H3-H4 związanych z DNA.</li>
	<li>Wykonaj kroki 4.2-4.5 dla innych cząsteczek DNA.</li>
	<li>Utwórz histogram dla rozkładu powiązań dimerów H3-H4 o rozmiarze przedziału 1 kbp. Liczba analizowanych cząsteczek wynosi co najmniej 300.</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Jako technika obrazowania pojedynczych cząsteczek, kurtyna DNA jest szeroko stosowana do badania reakcji metabolicznych DNA43. Kurtyna DNA to system hybrydowy, który łączy płynność lipidów, mikrofluidykę i TIRFM. W przeciwieństwie do innych technik jednocząsteczkowych, kurtyna DNA umożliwia wysokoprzepustową wizualizację interakcji białko-DNA w czasie rzeczywistym. Dlatego technika kurtyny DNA jest odpowiednia do badania mechanizmu stojącego za interakcjami molekularnymi, w tym asocjacją specyficz...

eukariotyczne DNA jest upakowane w strukturę wyższego rzędu znaną jako chromatyna1,2. Nukleosom jest podstawową jednostką chromatyny, która składa się z około 147 pz DNA owiniętego wokół histonów rdzenia oktamerycznego3,4. Chromatyna odgrywa kluczową rolę w komórkach eukariotycznych; na przykład zwarta struktura chroni DNA przed czynnikami endogennymi i zagrożeniami egzogennymi5. Struktura chromatyny zmienia się dynamicznie w zależności od fazy cyklu komórkowego i bodźców środowiskowych, a zmiany te kontrolują dostęp białek podczas transakcji DNA, takich jak replikacja, transkrypcja i naprawa6. Dynamika chromatyny jest również ważna dla stabilności genomu i informacji epigenetycznej.
Chromatyna jest dynamicznie regulowana przez różne czynniki, w tym modyfikacje ogona histonu i organizatory chromatyny, takie jak remodelery chromatyny, białka grupy polycomb i białka opiekuńcze histonów7. Białka opiekuńcze histonów koordynują montaż i demontaż nukleosomów poprzez osadzanie lub odłączanie histonów rdzeniowych8,9. Defekty w białkach opiekuńczych histonów wywołują niestabilność genomu i powodują zaburzenia rozwojowe oraz raka9,10. Różne białka opiekuńcze histonów nie wymagają chemicznego zużycia energii, takiego jak hydroliza ATP, do składania lub demontażu nukleosomów9,11,12,13. Niedawno naukowcy poinformowali, że ATPazy AAA+ zawierające bromodomenę (ATPaza związana z różnorodną aktywnością komórkową) odgrywają rolę w dynamice chromatyny jako białka opiekuńcze histonów14,15,16,17. Ludzki ATAD2 (białko 2 zawierające domenę AAA z rodziny ATPazy) wspomaga dostęp do chromatyny w celu zwiększenia ekspresji genów18. Jako koregulator transkrypcji, ATAD2 reguluje chromatynę onkogennych czynników transkrypcyjnych14, a nadekspresja ATAD2 jest związana ze złym rokowaniem w wielu typach raka19. Yta7, homolog Saccharomyces cerevisiae (S. cerevisiae) ATAD2, zmniejsza gęstość nukleosomów w chromatynie15. W przeciwieństwie do tego, Abo1, homolog Schizosaccharomyces pombe (S. pombe) ATAD2, zwiększa gęstość nukleosomów16. Korzystając z unikalnej techniki obrazowania pojedynczych cząsteczek, kurtyna DNA, czy Abo1 przyczynia się do składania lub rozkładu nukleosomów, jest adresowana17,20.
Tradycyjnie, właściwości biochemiczne biomolekuł były badane za pomocą masowych eksperymentów, takich jak test przesunięcia mobilności elektroforetycznej (EMSA) lub koimmunoprecypitacji (co-IP), w których badana jest duża liczba cząsteczek i charakteryzowane są ich średnie właściwości21,22. W eksperymentach masowych podstany molekularne są zasłonięte efektem średniej zespołowej, a sondowanie interakcji biomolekularnych jest ograniczone. W przeciwieństwie do tego, techniki jednocząsteczkowe omijają ograniczenia eksperymentów masowych i umożliwiają szczegółową charakterystykę oddziaływań biomolekularnych. W szczególności techniki obrazowania pojedynczych cząsteczek są szeroko stosowane do badania interakcji DNA-białko i białko-białko23. Jedną z takich technik jest kurtyna DNA, unikalna technika obrazowania pojedynczych cząsteczek oparta na mikrofluidyce i mikroskopii fluorescencyjnej całkowitego wewnętrznego odbicia (TIRFM)24,25. W kurtynie DNA setki pojedynczych cząsteczek DNA są zakotwiczone w dwuwarstwie lipidowej, która umożliwia dwuwymiarowy ruch cząsteczek DNA dzięki płynności lipidów. Po zastosowaniu przepływu hydrodynamicznego cząsteczki DNA poruszają się wzdłuż przepływu na dwuwarstwie i utknęły w barierze dyfuzyjnej, gdzie są wyrównywane i rozciągane. Podczas gdy DNA jest barwione środkami interkalującymi, wstrzykiwane są białka znakowane fluorescencyjnie, a TIRFM służy do wizualizacji interakcji białko-DNA w czasie rzeczywistym na poziomie pojedynczej cząsteczki23. Platforma kurtyny DNA ułatwia obserwację ruchów białek, takich jak dyfuzja, translokacja i zderzenie26,27,28. Co więcej, kurtyna DNA może być używana do mapowania białek w DNA o zdefiniowanych pozycjach, orientacjach i topologiach lub stosowana do badania separacji faz białek i kwasów nukleinowych29,30,31.
W tej pracy technika kurtyny DNA jest używana do dostarczenia dowodów na funkcję białek opiekuńczych poprzez bezpośrednią wizualizację określonych białek. Co więcej, ze względu na to, że kurtyna DNA jest platformą o wysokiej przepustowości, ułatwia gromadzenie danych w zakresie wystarczającym do uzyskania wiarygodności statystycznej. W tym miejscu opisano, jak szczegółowo przeprowadzić test kurtynowy DNA w celu zbadania molekularnej roli Abo1 S. pombe zawierającej bromodomenę AAA+.

<table><tbody><tr><td>1 ml strzykawka typu luer-lock</td><td>BecktonDickinson</td><td>301321</td><td></td></tr> 1 <tr><td>'x 3' szkło ślizgowe z topionej silki</td><td>G. Finkenbeiner</td><td></td><td>1 cal x 3 cale prostokątne i grubości 10</td></tr><tr><td>mm strzykawka luer-lock 10 ml</td><td>BecktonDickinson</td><td>302149</td><td></td></tr><tr><td>18:1 (&Delta; 9-Cis) PC (DOPC)</td><td>Avanti</td><td>850375</td><td>Jest to składnik biotynylowanego zapasu lipidowego</td></tr><tr><td>18:1 Biotinyl cap PE</td><td>Avanti</td><td>870273</td><td>Jest to składnik biotynylowanego lipidu</td></tr><tr><td>18:1 PEG2000 PE</td><td>Avanti</td><td>880130</td><td>Jest to składnik biotynylowanej</td></tr><tr><td>strzykawki typu luer-lock 3 ml</td><td>BecktonDickinson</td><td>302832</td><td></td></tr><tr><td>6-drogowy zawór do wstrzykiwania próbek</td><td>IDEX</td><td>MX series II</td><td></td></tr><tr><td>950K PMMA</td><td>All-resist</td><td>671.04</td><td></td></tr><tr><td>Aceton</td><td>SAMCHUN</td><td>A1759</td><td></td></tr><tr><td>Hydrat soli disodowej adenozyno5'-trifosforanu (ATP)</td><td>Sigma</td><td>A2383</td><td></td></tr><tr><td>Aluminium (Al)</td><td>TASCO, Korea Południowa</td><td>LT50AI414</td><td>Średnica 4 cale, grubość 1/4 cala</td></tr><tr><td>Filtr odśrodkowy Amicon Ultra, MWCO 10 kDa</td><td>Millipore</td><td>Z648027</td><td></td></tr><tr><td>Ampicillin</td><td>Mbcell</td><td>MB-A4128</td><td>Antybiotyki</td></tr><tr><td>AZ 300 MIF wywoływacz</td><td>Merck</td><td>10454110521</td><td>Służy do usuwania aluminium</td></tr><tr><td>Ostrze</td><td>DORCO</td><td>DN52</td><td>12 mm x 6 m</td></tr><tr><td>Trichlorek boru (BCl3)</td><td>UNIONGAS</td><td></td><td>Czystość: >99,99%</td></tr><tr><td>Albumina surowicy bydlęcej (BSA)</td><td>Sigma</td><td>A7030</td><td></td></tr><tr><td>Katalaza</td><td>Sigma</td><td>C40-1g</td><td>Jest to składnik 100x kolby gloxy</td></tr><tr><td>Chlor (Cl2)</td><td>UNIONGAS</td><td></td><td>Czystość: >99.99%</td></tr><tr><td>Przezroczysta taśma dwustronna</td><td></td><td>3M 313770</td><td></td></tr><tr><td>D-(+)-glukoza</td><td>Sigma</td><td>G7528</td><td></td></tr><tr><td>Napylacz DC</td><td>Sorona</td><td>SRM-120</td><td>Służy do osadzania aluminium na szkiełku</td></tr><tr><td>Wiertło z powłoką diamentową</td><td>Eurotool</td><td>DIB-211.00</td><td>Służy do wykonywania otworów w szkiełku krzemionkowym z fusced</td></tr><tr><td>DL-Dithiothreitol (DTT)</td><td>Sigma</td><td>D0632</td><td></td></tr><tr><td>Dove-prism</td><td>Korea Electro-Optics Co., Ltd.</td><td>1906-106</td><td>Wykonany na zamówienie pryzmat gołębia z topionej krzemionki z powłoką antyrefleksyjną</td></tr><tr><td>Wiertło</td><td>Dremel</td><td>Dremel 3000</td><td>Służy do wykonywania otworów w szkiełku krzemionkowym</td></tr><tr><td>Elektronowa litografia fasoli</td><td>Nanobeam Ltd.</td><td>NB3</td><td></td></tr><tr><td>Kwas etyleno-diamino-tetraoctowy (EDTA)</td><td>Sigma</td><td>EDS-1KG</td><td></td></tr><tr><td>Złączki palcowe</td><td>IDEX</td><td>F-300</td><td>Jest połączony z "PFA Tubing Natural" w celu utworzenia rurki typu luer-lock</td></tr><tr><td>Nakrętka męska bez kołnierza</td><td>IDEX</td><td>P-235</td><td>Jest połączony z "PFA Tubing Natural" w celu utworzenia rurki luer-lock</td></tr><tr><td>Liofilizator, HyperCOOL</td><td>Labogene</td><td>HC3110</td><td>Używany do liofilizacji płynnych białek</td></tr><tr><td>Oksydaza glukozowa</td><td>Sigma</td><td>G2133-50KU</td><td>Jest to składnik 100x zapasu gloxy</td></tr><tr><td>Chlorowodorek guanidyny</td><td>Acros Organics</td><td>364790025</td><td></td></tr><tr><td>strzykawka</td><td>Hamilton Company</td><td>80065</td><td>Ta strzykawka służy do wstrzykiwania próbki</td></tr><tr><td>Hellmanex III</td><td>Sigma</td><td>Z805939</td><td></td></tr><tr><td>HiLoad 26/600 SuperdexTM 200 pg</td><td>Cytiva</td><td>28-9893-36</td><td>Używany do FPLC (bez rozmiaru)</td></tr> <tr><td>Mieszadło z gorącą płytą</td><td>Corning</td><td>PC-420D</td><td></td></tr><tr><td>Kwas solny</td><td>Sigma</td><td>H1759</td><td>Używany do Tris-HCl</td></tr><tr><td>Olej dopasowany do indeksu</td><td>ZEISS</td><td>444970-9000-000</td><td></td></tr><tr><td>Indukcyjnie sprzężone plazmowo-reaktywne trawienie jonowe</td><td>Top Technology Ltd.</td><td>FabStar</td><td></td></tr><tr><td>Izopropyl &beta;-D-1-tiogalaktopiranozyd (IPTG)</td><td>Glentham Life Sciences</td><td>GC6586-100g</td><td>Służy do indukcji aktywności &beta;-galaktozydazy</td></tr><tr><td>Lambda DNA</td><td>NEB</td><td>N0311</td><td></td></tr><tr><td>LB bulion</td><td>BD difco</td><td>244610</td><td>Pożywka do wzrostu komórek E.coli</td></tr><tr><td>Luer adapter 10-32</td><td>IDEX</td><td>P-659</td><td>To łączy luer-lock strzykawka i rurka</td></tr><tr><td>Sześciowodny chlorek magnezu</td><td>Fisher Bioresole</td><td>BP214</td><td></td></tr><tr><td>Keton metylowo-izobutylowy (MIBK)</td><td>KAYAKU ZAAWANSOWANE MATERIAŁY</td><td></td><td>Używany do opracowywania roztworu</td></tr><tr><td>Mikroskop (Eclipse Ti2)</td><td>Nikon</td><td>Eclipse Ti2</td><td>Odwrócony mikroskop fluorescencyjny</td></tr><tr><td>Szkiełko nakrywkowe mikroskopu</td><td>MARIENFELD</td><td>101142</td><td>22 x 50 mm (nr 1)</td></tr><tr><td>Szkiełko mikroskopowe</td><td>DURAN GROUP</td><td>DU.2355013</td><td>Szkiełko szkiełkowe szlifowane 45&deg;, gładkie 26 x 76 mm</td></tr><tr><td>Nanoport</td><td>IDEX</td><td>N-333-01</td><td></td></tr><tr><td>Soczewka obiektywu</td><td>Nikon</td><td>CFI Plan Apochromat VC 60XC WI</td><td>Rodzaj zanurzenia: woda, powiększenie: 60x, korekcja: 18, odległość robocza: 0,29 (0,31-0,28)</td></tr><tr><td>One Shot BL21 (DE3)pLysS Chemicznie kompetentny E. coli</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>C6060-03</td><td>Właściwa komórka do nadekspresji białek</td></tr><tr><td>Tlen (O2)</td><td>NOBLEGAS, Korea</td><td></td><td>Południowa Czystość: >99,99%</td></tr> <tr><td>rurki PFA naturalne</td><td>IDEX</td><td>1512L</td><td>Jest połączony z "złączkami palcowymi" w celu utworzenia rurki typu luer-lock</td></tr><tr><td>Fluorek fenylometylosulfonylu (PMSF)</td> <td>Roche</td><td>11359061001</td><td>Inhibitor</td></tr> <tr><td>proteazySephacryl S-200 Wysoka rozdzielczość</td><td>Cytiva</td><td>17-0584-01</td><td>Używany do FPLC (wykluczenie rozmiaru)</td></tr> <tr><td>Zawór odcinający</td><td>IDEX</td><td>P-732</td><td></td></tr><tr><td>Octan sodu</td><td>Sigma</td><td>791741</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek sodu (NaCl)</td><td>Sigma</td><td>S3014</td><td></td></tr><tr><td>Wodorotlenek sodu (NaOH)</td><td>Sigma</td><td>s5881</td><td></td></tr><tr><td>Rurki z membraną molekularną Spectra/Por, MWCO 6-8 kDa</td><td>Spectrum laboratories</td><td>132660</td><td></td></tr><tr><td>Streptawidyna</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>S888</td><td></td></tr><tr><td>Tetrafluorek siarki (SF4)</td><td>NOBLEGAS, Korea</td><td></td><td>Południowa Czystość: >99.99%</td></tr><tr><td>Pompa strzykawkowa</td><td>KD Scientific</td><td>78-8210</td><td></td></tr><tr><td>Tetrafluorometan (CF4)</td><td>NOBLEGAS, Korea</td><td></td> Południowa<td>Czystość: > 99,99%</td></tr><tr><td>TritonX-100</td><td>Sigma</td><td>T9284</td><td></td></tr><tr><td>Baza Trizma</td><td>Sigma</td><td>T1503</td><td>Używana do Tris-HCl</td></tr><tr><td>TSKgel SP-5PW</td><td>TOSOH</td><td>14715</td><td>Używana do FPLC (wymiana jonowa)</td></tr> <tr><td>Montaż złączki</td><td>IDEX</td><td>P-760</td><td>Łączy rurki</td></tr><tr><td>Mocznik</td><td>Sigma</td><td>U5378</td><td></td></tr><tr><td>Piec próżniowy</td><td>Jeio Tech</td><td>OV-11</td><td></td></tr><tr><td>YOYO-1</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Y3601</td><td>Ten barwnik interkalacyjny jest rozcieńczany w DMSO&</td></tr><tr><td>beta;-merkaptoetanolu (BME)</td><td>Sigma</td><td>M6250</td><td></td></tr></tbody></table>

rozszyfrowanie molekularnego mechanizmu składania histonów za pomocą techniki kurtyny dna

Deciphering Molecular Mechanism of Histone Assembly by DNA Curtain Technique

Chromatyna to struktura wyższego rzędu, która zawiera eukariotyczne DNA. Chromatyna ulega dynamicznym zmianom w zależności od fazy cyklu komórkowego i w odpowiedzi na bodźce środowiskowe. Zmiany te są niezbędne dla integralności genomu, regulacji epigenetycznej i reakcji metabolicznych DNA, takich jak replikacja, transkrypcja i naprawa. Składanie chromatyny ma kluczowe znaczenie dla dynamiki chromatyny i jest katalizowane przez białka opiekuńcze histonów. Pomimo szeroko zakrojonych badań, mechanizmy, za pomocą których białka opiekuńcze histonów umożliwiają składanie chromatyny, pozostają nieuchwytne. Co więcej, globalne cechy nukleosomów zorganizowanych przez opiekuńcze histony są słabo poznane. Aby rozwiązać te problemy, w niniejszej pracy opisano unikalną technikę obrazowania pojedynczych cząsteczek o nazwie kurtyna DNA, która ułatwia badanie molekularnych szczegółów składania nukleosomów przez opiekuńcze histony. Kurtyna DNA to technika hybrydowa, która łączy płynność lipidów, mikrofluidykę i mikroskopię fluorescencyjną z całkowitym wewnętrznym odbiciem (TIRFM), aby zapewnić uniwersalną platformę do obrazowania w czasie rzeczywistym różnych interakcji białko-DNA. Za pomocą kurtyny DNA bada się funkcję opiekuńczą histonów Abo1, ATPazy AAA+ zawierającej bromodomenę Schizosaccharomyces pombe, a także ujawnia się mechanizm molekularny leżący u podstaw składania histonów Abo1. Kurtyna DNA zapewnia unikalne podejście do badania dynamiki chromatyny.

Niniejsza praca opisuje procedurę przygotowania komory przepływowej do analizy zasłony DNA (DNA curtain assay) (Rycina 1A). Analiza zasłony DNA ułatwiła badanie procesu składania dimerów histonowych H3-H4 na DNA przez białko Abo1. Najpierw sprawdzono formowanie zasłony DNA poprzez barwienie cząsteczek DNA barwnikiem interkalującym YOYO-1. Zielone linie pojawiły się w równoległych szeregach, co wskazuje, że YOYO-1 zinterkalował do cząsteczek DNA, które zostały odpowiednio wyrównane i rozciągn...

Kurtyna DNA, wysokoprzepustowa technika obrazowania pojedynczych cząsteczek, stanowi platformę do wizualizacji w czasie rzeczywistym różnych interakcji białko-DNA. Niniejszy protokół wykorzystuje technikę kurtyny DNA do zbadania biologicznej roli i mechanizmu molekularnego Abo1, ATPazy AAA + zawierającej bromodomenę Schizosaccharomyces pombe.

Rozszyfrowanie molekularnego mechanizmu składania histonów za pomocą techniki kurtyny DNA

Chromatin is a higher-order structure that packages eukaryotic DNA. Chromatin undergoes dynamic alterations according to the cell cycle phase and in ...

Protokół ten pokazuje, w jaki sposób technika kurtyny DNA jest wykorzystywana do badania dynamiki chromatyny, w szczególności do badania funkcji molekularnej białek opiekuńczych histonów. Wysokoprzepustowa technika obrazowania pojedynczych cząsteczek Kurtyna DNA pokonuje ograniczenia masowych eksperymentów i ułatwia obrazowanie w czasie rzeczywistym, umożliwiając szczegółową charakterystykę oddziaływań biomolekuł. Połóż czysty papier o wymiarach 5 na 35 milimetrów na środku taśmy dwustronnej.Przymocuj taśmę do szkiełka, aby zakryć papierem dwa otwory i nano wzory. Następnie wytnij papier za pomocą czystego ostrza. Umieść szklane szkiełko nakrywkowe na wierzchu taśmy dwustronnej i przetrzyj szkiełko nakrywkowe za pomocą końcówki pipety, aby utworzyć komorę mikroprzepływową.Umieść zmontowaną komórkę przepływową między dwoma szkiełkami mikroskopowymi i przypnij je. Piecz komórkę przepływową w piekarniku próżniowym o temperaturze 120 stopni Celsjusza przez 45 minut. Przymocuj złącze płynu do analizy opartej na chipach do każdego otwartego otworu za pomocą gorącego pistoletu do klejenia.I połącz dwie linie rurki blokującej przynętę. Podłącz strzykawkę z blokadą przynęty zawierającą trzy mililitry wody dejonizowanej i umyj komorę. Ponownie umyj komorę trzema mililitrami buforu lipidowego za pomocą połączenia kropla po kropli.Wstrzyknąć jeden mililitr 0,04x biotynylowanego lipidu w buforze lipidowym do komory w dwóch strzałach, z pięciominutową inkubacją na zastrzyk. Wstrzyknąć 0,025 miligrama na mililitr streptawidyny w jednym mililitrze BSA, dwoma zastrzykami i 10-minutową inkubacją na zastrzyk. Wstrzyknąć około 30 pikomolarów biotynylowanego DNA faga lambda w jednym mililitrze buforu BSA, do komory za pomocą dwóch zastrzyków i 10-minutowych inkubacji na zastrzyk.Podłączyć strzykawkę zawierającą 10 mililitrów buforu do obrazowania do pompy strzykawkowej i usunąć pęcherzyki ze wszystkich przewodów w układzie mikroprzepływowym. Sprzęgnij przygotowaną celę przepływową z systemem mikroprzepływowym za pomocą połączenia typu drop-to-drop, aby uniknąć wstrzykiwania pęcherzyków do komory przepływowej. Zamontuj komorę przepływową i uchwyty komory przepływowej, a następnie zamontuj zespół na specjalnie zbudowanym mikroskopie fluorescencyjnym z całkowitym wewnętrznym odbiciem.Wstrzyknij 200 mikrolitrów barwnika YOYO-1 do buforu obrazowania przez 100 mikrolitrów pętli próbki, aby wybarwić cząsteczki DNA Lambda. Uruchom oprogramowanie do obrazowania i włącz laser 488 nm, aby sprawdzić, czy kurtyny DNA są dobrze uformowane. Po usunięciu barwnika YOYO-1 wstrzyknąć wstępnie inkubowaną próbkę białka.Gdy białka dotrą do kurtyny DNA, wyłącz pompę strzykawkową, wyłącz zawór odcinający i inkubuj przez 15 minut w celu załadowania histonów przez Abo1. Wypłukiwać niezwiązane białka Abo1 i histonów przez pięć minut. Tymczasowo wyłącz przepływ bufora, aby sprawdzić, czy białka histonowe są załadowane do DNA.Tworzenie się kurtyny DNA sprawdzono poprzez barwienie cząsteczek DNA barwnikiem interpolującym. Zielone linie pokazane w równoległych układach wskazywały, że YOYO1 interkalowany w cząsteczki DNA był dobrze wyrównany i rozciągnięty na barierze dyfuzyjnej pod wpływem przepływu hydrodynamicznego. Gdy dimery Cy5-H3-H4 zostały wstrzyknięte do kurtyny DNA pod nieobecność Abo1, Cy5-H3-H4 nie wiązał się z DNA, co wskazuje na brak spontanicznego wiązania dimerów H3-H4 z DNA.Kiedy Cy5-H3-H4 został wstrzyknięty z Abo1, na cząsteczkach DNA zaobserwowano czerwone fluorescencyjne punkciki, co sugeruje, że Abo1 ładuje dimery H3-H4 do DNA. Sygnały fluorescencyjne znikały przy braku przepływu bufora i pojawiały się ponownie, gdy przepływ został wznowiony, co sugeruje, że dimery H3-H4 wiążą się z DNA. Wiązanie dimerów H3-H4 z DNA potwierdził również kimograf, w którym sygnały fluorescencyjne znikały po wyłączeniu przepływu.Niewiele fluorescencyjnych punktów pojawiło się w kurtynie DNA, zarówno pod nieobecność nukleotydu, jak i w obecności ADP, co wskazuje, że dimery H3-H4 rzadko wiążą się z DNA, zarówno w stanie Apo, jak i w obecności ADP. Analiza ilościowa pokazuje, że liczba dimerów H3-H4 związanych z DNA wzrasta w obecności ATP. Wyniki sugerują, że hydroliza ATP jest niezbędna do ładowania H3-H4 na DNA przez Abo1.Unikanie wstrzykiwania pęcherzyków do komory przepływowej jest najbardziej krytyczne dla wszystkich etapów. Dlatego w tym protokole kładziemy nacisk na połączenia typu drop-by-drop. Test kurtyny DNA można rozszerzyć na kurtyny DNA z podwójnym wiązaniem z podwójnymi nanowzorami.Ponadto możemy wykonać inny rodzaj kurtyny DNA z jednoniciowymi włóknami DNA, RNA lub aktyny. Kurtyna DNA umożliwia wizualizację ruchu białek na DNA i ułatwia badanie mechanizmu poszukiwania celu. Kurtynę DNA można rozszerzyć w celu badania metabolizmu DNA, w tym replikacji i transkrypcji.

deciphering-molecular-mechanism-histone-assembly-dna-curtain

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemia

Metoda Hi-C umożliwia bezstronną, genomową identyfikację oddziaływań chromatyny (1). Hi-C łączy ligację bliskościową z sekwencjonowaniem masowo równoległym. Wynikowe dane mogą być wykorzystane do badania architektury genomowej w wielu skalach: wstępne wyniki pozwoliły zidentyfikować takie cechy jak terytoria chromosomowe, segregacja chromatyny otwartej i zamkniętej oraz struktura chromatyny w skali megabazy.

Hi-C: Metoda badania trójwymiarowej architektury genomów.

Pakiet oprogramowania 3DNA jest popularnym i wszechstronnym narzędziem bioinformatycznym umożliwiającym analizę, konstrukcję i wizualizację trójwymiarowych struktur kwasów nukleinowych. Niniejszy artykuł przedstawia szczegółowe protokoły dla wybranych nowych i popularnych funkcji dostępnych w 3DNA, które można zastosować zarówno do pojedynczych struktur, jak i zespołów struktur powiązanych.

Analiza i budowanie struktur kwasów nukleinowych przy użyciu programu 3DNA

Ten film opisuje metodę wizualizacji montażu kondensatów białek fuzyjnych na cząsteczkach DNA w określonych loci za pomocą obrazowania pojedynczych cząsteczek. Kondensaty te powstają w wyniku oddziaływań LCD-LCD i LCD-DBD, które pozwalają na rekrutację polimerazy RNA II i zwiększoną transkrypcję genów.

Obrazowanie pojedynczych cząsteczek w celu wizualizacji łączenia kondensatów białek fuzyjnych na zasłonach DNA

Przedstawiono metodę rekonstytucji modelowych macierzy nukleosomalnych z rekombinowanych histonów rdzeniowych i tandemowo powtarzanego DNA do pozycjonowania nukleosomów.  Opisujemy również, w jaki sposób eksperymenty z prędkością sedymentacji w ultrawirówce analitycznej i mikroskopia sił atomowych (AFM) są wykorzystywane do monitorowania stopnia nasycenia macierzy nukleosomalnej po rekonstytucji.

Składanie macierzy nukleosomalnych z rekombinowanych histonów rdzenia i pozycjonowania nukleosomów DNA

Ukierunkowane uszkodzenie DNA można osiągnąć poprzez przywiązanie czynnika uszkadzającego DNA do oligonukleotydu tworzącego triplex (TFO). Za pomocą zmodyfikowanych TFO, asocjacji białek specyficznych dla uszkodzenia DNA i modyfikacji topologii DNA można badać w komórkach ludzkich poprzez wykorzystanie zmodyfikowanych testów immunoprecypitacji chromatyny i testów superzwijania DNA opisanych w niniejszym dokumencie.

Narzędzia do badania roli architektonicznego białka HMGB1 w przetwarzaniu zniekształcających helisę, specyficznych dla miejsca wiązań międzyniciowych DNA

Tutaj prezentujemy protokół charakteryzujący cząstki nukleosomów na poziomie pojedynczej cząsteczki za pomocą technik obrazowania statycznej i poklatkowej mikroskopii sił atomowych (AFM). Opisana metoda funkcjonalizacji powierzchni pozwala na uchwycenie struktury i dynamiki nukleosomów w wysokiej rozdzielczości w nanoskali.

Badanie struktury i dynamiki nukleosomów za pomocą obrazowania mikroskopowego sił atomowych

Tutaj opisujemy użycie metody obrazowania pojedynczych cząsteczek, Zasłon DNA, do badania biofizycznego mechanizmu gromadzenia się kondensatów EWS-FLI1 na DNA.

Obrazowanie pojedynczych cząsteczek kondensatów EWS-FLI1 składających się na DNA

Interakcja zależnego od ATP czynnika remodelującego chromatynę z ligandem DNA jest opisana za pomocą spektroskopii CD. Indukowane zmiany konformacyjne na promotorze genu analizowane przez wygenerowane piki można wykorzystać do zrozumienia mechanizmu regulacji transkrypcji.

Spektroskopia CD do badania interakcji DNA-białko

Ten protokół opisuje metodę Capture Hi-C używaną do charakteryzowania organizacji 3D docelowych regionów genomowych o rozmiarach mega w wysokiej rozdzielczości, w tym granic topologicznie asojacujących domen (TADs) i interakcji chromatyny dalekiego zasięgu między regulatorowymi i innymi elementami sekwencji DNA.

Rozszyfrowywanie organizacji chromatyny 3D w wysokiej rozdzielczości za pomocą Capture Hi-C

Ten artykuł przedstawia szczegółową procedurę eksperymentalną odtwarzania nukleosomów DNA dla siły korelacji pojedynczej cząsteczki i mikroskopii fluorescencyjnej. Dalej opisano kilka dalszych eksperymentów, które można przeprowadzić w celu wizualizacji zachowania wiązania białek oddziałujących z chromatyną i analizy zmian właściwości fizycznych nukleosomów.

Składanie nukleosomów in situ do mikroskopii korelacyjnej i fluorescencyjnej pojedynczej cząsteczki

Odkryj technikę kurtyny DNA do badania dynamiki chromatyny i interakcji białek z DNA w czasie rzeczywistym. Ta metoda umożliwia szczegółową analizę funkcji chaperonów histonowych.

Rozszyfrowanie molekularnego mechanizmu składania histonów za pomocą techniki kurtyny DNA

Przeglądaj więcej filmów