Rozszyfrowanie molekularnego mechanizmu składania histonów za pomocą techniki kurtyny DNA

Protokół ten pokazuje, w jaki sposób technika kurtyny DNA jest wykorzystywana do badania dynamiki chromatyny, w szczególności do badania funkcji molekularnej białek opiekuńczych histonów. Wysokoprzepustowa technika obrazowania pojedynczych cząsteczek Kurtyna DNA pokonuje ograniczenia masowych eksperymentów i ułatwia obrazowanie w czasie rzeczywistym, umożliwiając szczegółową charakterystykę oddziaływań biomolekuł. Połóż czysty papier o wymiarach 5 na 35 milimetrów na środku taśmy dwustronnej.

Przymocuj taśmę do szkiełka, aby zakryć papierem dwa otwory i nano wzory. Następnie wytnij papier za pomocą czystego ostrza. Umieść szklane szkiełko nakrywkowe na wierzchu taśmy dwustronnej i przetrzyj szkiełko nakrywkowe za pomocą końcówki pipety, aby utworzyć komorę mikroprzepływową.

Umieść zmontowaną komórkę przepływową między dwoma szkiełkami mikroskopowymi i przypnij je. Piecz komórkę przepływową w piekarniku próżniowym o temperaturze 120 stopni Celsjusza przez 45 minut. Przymocuj złącze płynu do analizy opartej na chipach do każdego otwartego otworu za pomocą gorącego pistoletu do klejenia.

I połącz dwie linie rurki blokującej przynętę. Podłącz strzykawkę z blokadą przynęty zawierającą trzy mililitry wody dejonizowanej i umyj komorę. Ponownie umyj komorę trzema mililitrami buforu lipidowego za pomocą połączenia kropla po kropli.

Wstrzyknąć jeden mililitr 0,04x biotynylowanego lipidu w buforze lipidowym do komory w dwóch strzałach, z pięciominutową inkubacją na zastrzyk. Wstrzyknąć 0,025 miligrama na mililitr streptawidyny w jednym mililitrze BSA, dwoma zastrzykami i 10-minutową inkubacją na zastrzyk. Wstrzyknąć około 30 pikomolarów biotynylowanego DNA faga lambda w jednym mililitrze buforu BSA, do komory za pomocą dwóch zastrzyków i 10-minutowych inkubacji na zastrzyk.

Podłączyć strzykawkę zawierającą 10 mililitrów buforu do obrazowania do pompy strzykawkowej i usunąć pęcherzyki ze wszystkich przewodów w układzie mikroprzepływowym. Sprzęgnij przygotowaną celę przepływową z systemem mikroprzepływowym za pomocą połączenia typu drop-to-drop, aby uniknąć wstrzykiwania pęcherzyków do komory przepływowej. Zamontuj komorę przepływową i uchwyty komory przepływowej, a następnie zamontuj zespół na specjalnie zbudowanym mikroskopie fluorescencyjnym z całkowitym wewnętrznym odbiciem.

Wstrzyknij 200 mikrolitrów barwnika YOYO-1 do buforu obrazowania przez 100 mikrolitrów pętli próbki, aby wybarwić cząsteczki DNA Lambda. Uruchom oprogramowanie do obrazowania i włącz laser 488 nm, aby sprawdzić, czy kurtyny DNA są dobrze uformowane. Po usunięciu barwnika YOYO-1 wstrzyknąć wstępnie inkubowaną próbkę białka.

Gdy białka dotrą do kurtyny DNA, wyłącz pompę strzykawkową, wyłącz zawór odcinający i inkubuj przez 15 minut w celu załadowania histonów przez Abo1. Wypłukiwać niezwiązane białka Abo1 i histonów przez pięć minut. Tymczasowo wyłącz przepływ bufora, aby sprawdzić, czy białka histonowe są załadowane do DNA.

Tworzenie się kurtyny DNA sprawdzono poprzez barwienie cząsteczek DNA barwnikiem interpolującym. Zielone linie pokazane w równoległych układach wskazywały, że YOYO1 interkalowany w cząsteczki DNA był dobrze wyrównany i rozciągnięty na barierze dyfuzyjnej pod wpływem przepływu hydrodynamicznego. Gdy dimery Cy5-H3-H4 zostały wstrzyknięte do kurtyny DNA pod nieobecność Abo1, Cy5-H3-H4 nie wiązał się z DNA, co wskazuje na brak spontanicznego wiązania dimerów H3-H4 z DNA.

Kiedy Cy5-H3-H4 został wstrzyknięty z Abo1, na cząsteczkach DNA zaobserwowano czerwone fluorescencyjne punkciki, co sugeruje, że Abo1 ładuje dimery H3-H4 do DNA. Sygnały fluorescencyjne znikały przy braku przepływu bufora i pojawiały się ponownie, gdy przepływ został wznowiony, co sugeruje, że dimery H3-H4 wiążą się z DNA. Wiązanie dimerów H3-H4 z DNA potwierdził również kimograf, w którym sygnały fluorescencyjne znikały po wyłączeniu przepływu.

Niewiele fluorescencyjnych punktów pojawiło się w kurtynie DNA, zarówno pod nieobecność nukleotydu, jak i w obecności ADP, co wskazuje, że dimery H3-H4 rzadko wiążą się z DNA, zarówno w stanie Apo, jak i w obecności ADP. Analiza ilościowa pokazuje, że liczba dimerów H3-H4 związanych z DNA wzrasta w obecności ATP. Wyniki sugerują, że hydroliza ATP jest niezbędna do ładowania H3-H4 na DNA przez Abo1.

Unikanie wstrzykiwania pęcherzyków do komory przepływowej jest najbardziej krytyczne dla wszystkich etapów. Dlatego w tym protokole kładziemy nacisk na połączenia typu drop-by-drop. Test kurtyny DNA można rozszerzyć na kurtyny DNA z podwójnym wiązaniem z podwójnymi nanowzorami.

Ponadto możemy wykonać inny rodzaj kurtyny DNA z jednoniciowymi włóknami DNA, RNA lub aktyny. Kurtyna DNA umożliwia wizualizację ruchu białek na DNA i ułatwia badanie mechanizmu poszukiwania celu. Kurtynę DNA można rozszerzyć w celu badania metabolizmu DNA, w tym replikacji i transkrypcji.