Analizy białkomoczu, naciekania leukocytów przez nerki i odkładania się białek przez nerki u myszy MRL/lpr podatnych na toczeń

Metody te mogą pomóc w badaniu postępu przewlekłego stanu zapalnego związanego z nerkami u pacjentów z toczniem. Oferujemy niezawodną i opłacalną alternatywę, która może być stosowana do monitorowania przebiegu choroby w toczniu. Rozpocznij sterylizację okapu, rozpylając 70% etanolu i umieść sterylny plastikowy arkusz na powierzchni.

Następnie przygotuj końcówki, probówki o pojemności 1,5 mililitra i pipetę, aby zebrać około 20 mikrolitrów moczu. Weź klatkę i spryskaj 70% etanolem przed umieszczeniem jej w masce. Następnie przytrzymaj mysz jedną ręką, a drugą ręką delikatnie masuj obszar brzuszny od góry do dołu.

Za pomocą 1,5-mililitrowej probówki lub pipety zbierz mocz bezpośrednio. Lub jeśli próbka upuści się, zbierz ją z plastikowego arkusza. Następnie umieść mysz z powrotem w klatce.

Pokrój wycięte nerki na wielkość ziarna i strawij w pięciu mililitrach buforu wytrawiającego zawierającego kolagenazę i DNazę 1 w pożywce RPMI 1640 zawierającej HEPES przez jedną godzinę z ciągłym delikatnym wstrząsaniem w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Dodać 10 mililitrów lodowatego PBS zawierającego 10 milimoli EDTA i inkubować przez 10 minut na lodzie. Następnie dwukrotnie wymieszaj zawiesinę.

Później przefiltruj zawiesinę komórkową przez sitko o średnicy 100 mikrometrów i przemyj 10 mililitrami HBSS w pełni. Następnie odwirować w temperaturze 350 razy G przez 10 minut w temperaturze pokojowej. Przygotuj 30, 37 i 70% izotoniczny roztwór Percollu i dodaj warstwę 37% roztworu Percollu na wierzch 70% roztworu.

Ponownie zawieś ogniwa w pięciu mililitrach 30% izotonicznego Percollu. Za pomocą pipety Pasteura powoli załaduj 37% z pięciu mililitrów na górze i 70% z pięciu mililitrów na dole, tworząc zapasowy izotoniczny gradient Percoll. Następnie odwirować z numerem dziewięć w górę i w dół numerem zero w 1000 razy G przez 30 minut w temperaturze pokojowej.

Następnie zbierz leukocyty z interfejsu od 37 do 70% i ponownie zawiesij je w pięciu mililitrach C 10. Ponownie odwirować w temperaturze 350 razy G przez 10 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Następnie ponownie zawiesić osad komórkowy w trzech mililitrach buforu faksowego i odwirować w temperaturze 350 razy G przez pięć minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza.

Następnie wyrzuć supernatant, pozostawiając około 50 mikrolitrów całkowitej objętości. Dodaj 50 mikrolitrów bloku receptora FC na probówkę. Następnie wymieszaj i inkubuj na lodzie w ciemności przez 10 minut.

Później dodaj dwa mililitry bufora faksu do mycia. Następnie odwirować w temperaturze 350 razy G przez pięć minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza i wyrzucić supernatent, pozostawiając około 50 mikrolitrów całkowitej objętości. Następnie dodaj 20 mikrolitrów odpowiedniego barwnika fluorescencyjnego i odstaw na 15 do 30 minut na lód.

Dodać 50 mikrolitrów mieszanki przeciwciał na probówkę zawierającą CD 138 brylantowy fiolet siedem 11 i CD 45 Alexa Fluor 700 i inkubować na lodzie w ciemności przez 15 do 30 minut. Następnie dodaj trzy mililitry bufora faksu. Wirować w temperaturze 350 razy G przez pięć minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza.

Usunąć supernatant przez próżnię, pozostawiając około 50 mikrolitrów całkowitej objętości. Później ponownie zawiesić osad komórkowy w 200 mikrolitrach PBS. Aby pobrać próbkę, należy zanurzyć połówkę nerki w małym plastikowym kriofordzie ze związkiem o optymalnej temperaturze skrawania.

Następnie dodaj suchy lód do pudełka z pianki polistyrenowej i ostrożnie umieść kriomold na suchym lodzie. Następnie wyjmij krioformę, zawiń ją w folię aluminiową i przechowuj w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza do dalszego użycia. Następnie przymocuj suche do czterech mikrometrów odcinki zimnym acetonem przez 10 minut.

Po zamocowaniu szkiełek należy wysuszyć na powietrzu przez 0,5 do jednej godziny i przechowywać je przez krótki czas w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza lub przez długi czas w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza. Aby zabarwić próbki, należy ponownie zamocować szkiełka w zimnym acetonie na pięć do 10 minut i pozostawić sekcje do ogrzania do temperatury pokojowej. Następnie za pomocą pisaka narysuj hydrofobowy okrąg wokół sekcji i pozostaw do wyschnięcia.

Następnie umieść szkiełka w TBS w słoiku Copeland na 20 minut i delikatnie wstrząśnij, kładąc słoik na shakerze. Następnie odlej TBS i napełnij słoik TBS 5%BSA i 0,1%TW 20. Później inkubuj słoik przez 20 minut, delikatnie potrząsając shakerem.

Następnie wyjmij szkiełka i wytrzyj spód szkiełków. Dodać 100 mikrolitrów sprzężonych przeciwciał C3 fit C i IgG2 APE do sekcji i inkubować w temperaturze pokojowej w wilgotnej komorze przez godzinę. Umyj sekcję trzykrotnie w PBS 5% BSA i 0,1% TW 20 przez 10 minut na shakerze, a następnie wstrząśnij do sucha szkiełka.

Zamontuj sekcję za pomocą odczynnika zapobiegającego blaknięciu, a następnie za pomocą szkiełka nakrywkowego. Następnie przechowuj szkiełka w temperaturze czterech stopni Celsjusza do momentu obejrzenia pod mikroskopem. W przypadku analizy obrazu za pomocą oprogramowania do przetwarzania obrazu J, obrysuj żądany obszar.

Następnie ustaw standardowe parametry, klikając Analizuj, a następnie ustaw pomiary i zmierz obszar, aby uzyskać wyniki. Następnie przenieś dane uzyskane z okien miar do arkusza kalkulacyjnego. Po zakończeniu kliknij analizuj, aby zmierzyć region i ponownie przenieś dane do poprzedniego arkusza kalkulacyjnego.

Poziomy białka w moczu myszy MRL LPR wykryto z czasem, gdy były one traktowane solą fizjologiczną buforowaną fosforanami jako grupą kontrolną i Lactobacillus reuteri jako grupą leczoną. Grupa myszy leczona L.reuteri z bardziej agresywną progresją białkomoczu niż grupa kontrolna. Analizę faksową przeprowadzono dla izolowanych leukocytów nerkowych w celu analizy komórek plazmatycznych.

Ponadto myszy leczono wankomycyną lub wankomycyną wraz z dwuniciowym DNA Escherichia coli. Chociaż oczekiwano, że dwuniciowe DNA Escherichia coli wywoła naciek nerkowy, nie stwierdzono znaczącej różnicy w odsetku komórek plazmatycznych. Dopełniacz C3 i IgG2a wykryto za pomocą barwienia immunofluorescencyjnego na żeńskich odcinkach nerek MRL IPR.

Porównano skuteczne czynniki środowiskowe wpływające na odkładanie się C3 i IgG2a w nerkach dla chleba dla myszy w domu zwierząt i dla chleba zakupionego od sprzedawcy. Analiza immunohistochemiczna nie wykazała żadnej różnicy między obiema grupami. Dodawanie każdej warstwy procentowego roztworu ISO 20 Percoll może być trudne, a jeśli się zmieszają, musisz zacząć od nowa.

Ta procedura pomaga w cytometrze przepływowym i eksperymentach in vitter, więc nie można badać różnych typów populacji komórek nerkowych. Ta procedura pozwala nam badać nacieki limfocytów B w nerkach, a w literaturze nie ma zbyt wielu informacji.