Name: Analizy białkomoczu, naciekania leukocytów przez nerki i odkładania się białek przez nerki u myszy MRL/lpr podatnych na toczeń (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-06-08T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 43 s
Description: Poznaj metodę oceny nefrytycznej postaci tocznia u myszy MRL/lpr poprzez analizę białkomoczu, naciekania leukocytów i odkładania białek w nerkach. Technika ta umożliwia niezawodne monitorowanie progresji choroby.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy Głównemu Ośrodku Cytometrii Przepływowej, Laboratorium Histopatologii, Centrum Obrazowania Fralin w Instytucie Politechnicznym Wirginii oraz Uniwersytetowi Stanowemu za wsparcie techniczne. Praca ta jest wspierana przez różne granty NIH i wewnętrzne.

Obecny protokół został zatwierdzony przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt (IACUC) w Virginia Tech. Ponieważ toczeń występuje częściej u samic, użyto tylko samic myszy MRL / lpr. Pobieranie próbek rozpoczęto w wieku 4 tygodni, a zakończono w 15 tygodniu. Myszy pozyskano ze źródeł komercyjnych (patrz tabela materiałów) i były hodowane i utrzymywane w określonym środowisku wolnym od patogenów, zgodnie z wytycznymi instytucjonalnymi.
1. Test na białkomocz
<ol>
	<li>Zbierz mocz, wykonując poniższe czynności.
	<ol>
		<li>Wysterylizuj kaptur, rozpylając 70% etanolu. Umieść sterylny plastikowy arkusz na powierzchni. Przygotuj końcówki, probówki o pojemności 1,5 ml i pipetę, aby zebrać około 20 μl płynu. 
		UWAGA: Końcówki i rurki muszą być sterylne i bez żadnej obróbki wstępnej.</li>
		<li>Weź klatkę i spryskaj 70% etanolem przed włożeniem jej do maski.</li>
		<li>Przytrzymaj mysz jedną ręką, a drugą ręką delikatnie masuj obszar brzuszny od góry do dołu.</li>
		<li>Użyj probówki lub pipety o pojemności 1,5 ml, aby bezpośrednio zebrać mocz lub, jeśli próbka spadnie, zbierz ją z plastikowego arkusza. Do każdej próbki używaj świeżych rękawiczek, arkuszy i końcówek. 
		UWAGA: Jeśli to nie zadziała, użyj sterylnej zlewki, aby odizolować mysz, a następnie zbierz mocz ze zlewki po oddaniu moczu przez mysz.</li>
		<li>Włóż mysz z powrotem do klatki. Wyjmij kolejną mysz i powtórz kroki 1.1.3-1.1.4. 
		UWAGA: Zawsze czyść plastikowy arkusz i zlewkę 70% etanolem po pobraniu próbki dla każdej myszy. Do uzyskania istotności statystycznej potrzeba co najmniej pięciu myszy na grupę. Próbki moczu można przechowywać w temperaturze -80 °C do czasu użycia przez okres do 12 miesięcy.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Określ ilościowo białka metodą Bradforda24.
	<ol>
		<li>Pozwól, aby próbki moczu, wzorzec albuminy i odczynnik Bradford osiągnęły temperaturę pokojową (RT), trzymając je poza zamrażarką przez 10-20 minut. 
		UWAGA: Odczynnik Bradford i wzorzec albuminy znajdują się w dostępnym na rynku zestawie (patrz Tabela materiałów). Początkowe stężenie wzorca albuminy wynosi 2 mg/ml. Seryjne rozcieńczenia (1:2 sześć razy) należy wykonać wodą.</li>
		<li>Dodać odczynnik Bradforda do 96-dołkowej płytki (200 μl/basenik), nierozcieńczonej.</li>
		<li>Odpipetować 5 μl nierozcieńczonej próbki moczu na studzienkę i kilkakrotnie użyć końcówki do pipetowania w górę i w dół, aby prawidłowo wymieszać.</li>
		<li>Dodać wzorce (400, 200, 100, 50, 25, 12,5 mg/dl) w dwóch egzemplarzach. Pozostaw kilka studzienek jako puste miejsca. 
		UWAGA: Dodawanie próbek i wzorców musi odbywać się szybko.</li>
		<li>Odstaw na 5-10 minut przy RT.</li>
		<li>Odczytać płytkę przy długości fali 595 nm w czytniku płytek zgodnie z protokołem producenta (patrz Tabela materiałów).</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Izolacja komórek nerkowych
<ol>
	<li>Poddaj mysz eutanazji za pomocą CO2 (szybkość przepływu: 30% -70% objętości / min, aby uzyskać utratę przytomności lub śmierć) w komorze, a następnie zwichnąć szyjkę macicy. Kontynuuj sekcję, aby zebrać obie nerki. Umieść półtorej nerki w lodowatym podłożu C10. Umieść drugą połowę nerki w OCT (krok 3.1.1). 
	UWAGA: C10 jest wytwarzany z RPMI 1640 uzupełnionego 10% płodową surowicą bydlęcą, 1 mM pirogronianu sodu, 1% 100x nieistotnych aminokwasów MEM, 10 mM HEPES, 55 μM 2-merkaptoetanolu i 100 U/ml penicyliny-streptomycyny (patrz Tabela materiałów).</li>
	<li>Pokroić nerki na wielkość ziarna (1-2 mm3 kawałki) i wytrawić w 5 ml buforu wytrawiającego zawierającego 1 mg/ml kolagenazy i 0,2 mg/ml DNazy I (patrz tabela materiałów) w pożywce RPMI 1640 zawierającej 10 mmol/l HEPES przez 1 godzinę z ciągłym delikatnym wstrząsaniem w temperaturze 37 °C. 
	UWAGA: Dodaj 1 ml buforu wytrawiającego do sterylnej probówki o pojemności 2 ml i użyj sterylnych nożyczek, aby posiekać nerkę.</li>
	<li>Dodaj 10 ml 1x lodowatego PBS zawierającego 10 mM kwasu etylenodiaminotetraoctowego (EDTA) i inkubuj przez 10 minut na lodzie. Następnie dwukrotnie wymieszaj zawiesinę.</li>
	<li>Przefiltrować zawiesinę komórek przez sitko 100 μM i przemyć 10 ml HBSS-full. 
	UWAGA: HBSS-full zawiera 5 mM EDTA, 0,1% BSA i 10 mM HEPES.</li>
	<li>Wirować przy 350 x g przez 10 minut w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Przygotować 30%, 37% i 70% roztwór izotonicznego perkolu (SIP). 
	UWAGA: Wymieszaj 1 część objętości 10x PBS i 9 części objętości Percollu, aby przygotować SIP (patrz Tabela Materiałów); użyj HBSS-full do rozcieńczenia SIP do 30%, 37% i 70% SIP.</li>
	<li>Zawieś komórki w 5 ml 30% SIP i załaduj 37% 5 ml (na górze) i 70% na 5 ml (na dole), tworząc gradient SIP, powoli za pomocą pipety do pasty.</li>
	<li>Wirować z Up9 w dół0 (lub hamulcem 0) przy 1000 x g przez 30 min przy RT.</li>
	<li>Zbierz leukocyty z granicy faz 37%-70% i zawieś je ponownie w 5 ml C10.</li>
	<li>Wirować przy 350 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Zawiesić osad komórkowy w 3 ml buforu FACS. Komórki są gotowe do barwienia metodą FACS. 
	UWAGA: Bufor FACS zawiera 1x PBS i 0,1% albuminy surowicy bydlęcej (BSA).</li>
	<li>Wirować przy 350 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C i odrzucić supernatant (SN), pozostawiając około 50 μl. 
	UWAGA: Aby usunąć supernatant, ostrożnie wylać lub odpipetować roztwór od ciała stałego lub użyć półautomatycznego odkurzacza do zasysania supernatantu.</li>
	<li>Dodać 50 μl bloku FcR (patrz Tabela Materiałów) na probówkę (wstępnie rozcieńczoną 1/50 w 1x PBS); wymieszać i inkubować na lodzie w ciemności przez 10 minut.</li>
	<li>Dodaj 2 ml buforu FACS do przemycia.</li>
	<li>Wirować przy 350 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C i odrzucić SN, pozostawiając około 50 μl.</li>
	<li>Dodać 20 μl odpowiedniego barwnika fluorescencyjnego (rozcieńczyć 1/100 1x PBS, patrz Tabela Materiałów) i odstawić na 15-30 minut na lód.</li>
	<li>Dodać 50 μL mieszanki przeciwciał15 na probówkę: CD138-BV711 (1/200 w 1x PBS) i CD45-AF700 (1/200 w 1x PBS) (patrz tabela materiałów).</li>
	<li>Inkubować na lodzie w ciemności przez 15-30 minut i dodać 3 ml buforu FACS.</li>
	<li>Wirować przy 350 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C i odkurzyć SN, pozostawiając około 50 μL. Zawiesić w 200 μL 1x PBS. Jest to teraz gotowe do analizy za pomocą cytometrii przepływowej.</li>
</ol>
3. Barwienie immunofluorescencyjne
<ol>
	<li>Wykonaj pobieranie próbek.
	<ol>
		<li>Zanurzyć połówkę nerki w małym plastikowym kriofordzie ze związkiem o optymalnej temperaturze skrawania (OCT) (patrz Tabela materiałów).</li>
		<li>Dodaj suchy lód do pudełka z pianką polistyrenową (patrz Tabela materiałów) i ostrożnie umieść krioformę na suchym lodzie. Upewnij się, że krioformy są umieszczone płasko. 
		UWAGA: Potrzeba 3-4 minut, aby związek OCT zestalił się i zmienił kolor na biały.</li>
		<li>Wyjmij kriomold i zawiń go w folię aluminiową. Przechowywać w temperaturze -80 °C do czasu dalszego użycia. 
		UWAGA: Można go przechowywać w temperaturze -80 °C przez co najmniej 1 rok.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wykonać cięcie i utrwalenie próbki.
	<ol>
		<li>Pociąć próbki na odcinki o wielkości 4 μm, odczekać co najmniej 2-3 godziny do wyschnięcia, a następnie utrwalić zimnym acetonem (w temperaturze 4 °C) przez 10 minut 
		UWAGA: Zachowaj ostrożność podczas używania acetonu, który wymaga specjalistycznego kaptura chemicznego.</li>
		<li>Po zamocowaniu szkiełek należy wysuszyć na powietrzu przez 0,5-1 h i przechowywać je przez krótki czas w temperaturze -20 °C lub przez długi czas w temperaturze -80 °C.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Zabarwić próbki.
	<ol>
		<li>Ponownie zamocuj szkiełka w zimnym acetonie na 5-10 minut.</li>
		<li>Pozwól sekcjom rozgrzać się do RT. Użyj pisaka PAP (patrz Tabela materiałów) wokół sekcji i pozostaw do wyschnięcia. 
		UWAGA: Można również użyć emalii do paznokci. Ten krok zapobiega unoszeniu się rozcieńczenia przeciwciał na całym szkiełku.</li>
		<li>Umieść szkiełka w 1x soli fizjologicznej buforowanej Tris (TBS) w słoiku Coplin (patrz Tabela Materiałów) na 20 minut, umieść słoik na shakerze i delikatnie wstrząśnij.</li>
		<li>Odlej 1x TBS i napełnij słoik 1x TBS, 5% BSA i 0,1% Tween 20. Inkubować przez 20 minut na shakerze, delikatnie wstrząsnąć.</li>
		<li>Wyjmij szkiełka i wytrzyj spód szkiełek do sucha. W razie potrzeby wstrząśnij szkiełkami do sucha. Dodać 100 μl sprzężonych przeciwciał25 C3-FITC (1/100) i IgG2a-PE (1/100) do sekcji (patrz tabela materiałów). Inkubować w temperaturze pokojowej w wilgotnej komorze przez 1 godzinę.</li>
		<li>Umyj sekcję 3 razy w 1x TBS, 5% BSA i 0,1% Tween 20 przez 10 minut na wytrząsarce.</li>
		<li>Wstrząśnij do sucha szkiełka i zamontuj sekcję za pomocą odczynnika zapobiegającego blaknięciu (patrz tabela materiałów), a następnie szkiełka nakrywkowego.</li>
		<li>Przechowywać szkiełka w temperaturze 4 °C do momentu wyświetlenia pod mikroskopem (np. mikroskopem konfokalnym lub mikroskopem systemu obrazowania). Określ ilościowo obrazy za pomocą oprogramowania i odejmij sygnały tła, porównując intensywność fluorescencji między regionami.</li>
		<li>W przypadku analizy obrazu za pomocą oprogramowania ImageJ (patrz tabela materiałów), obrysuj żądany obszar.</li>
		<li>Ustaw standardowe parametry, klikając Analizuj, a następnie Ustaw pomiary i Zmierz obszar, aby uzyskać wyniki.</li>
		<li>Przenieś dane uzyskane z okien miar do arkusza kalkulacyjnego. 
		UWAGA: Jako tło można wybrać mały obszar z obrazu; Nie powinien mieć żadnej fluorescencji.</li>
		<li>Po zakończeniu kliknij Analizuj, aby zmierzyć region i ponownie przenieść dane do poprzedniego arkusza kalkulacyjnego.</li>
		<li>Powtórz kroki 3.3.11-3.3.12 dla kilku regionów.</li>
		<li>Oblicz średnią fluorescencję jako skorygowaną fluorescencję komórek (CCF) = Gęstość zintegrowana - (Wybrany obszar komórki x Średnia fluorescencja tła).</li>
		<li>Obliczaj dla każdego regionu i analizuj dane za pomocą oprogramowania do tworzenia wykresów i statystyk (patrz tabela materiałów).</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Tsokos, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systemic+Lupus+Erythematosus%5BTitle%5D)+AND+%22New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Systemic Lupus Erythematosus.</a> New England Journal of Medicine. 365 (22), 2110-2121 (2011).</li>
<li>Davidson, A., Aranow, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lupus+nephritis%3A+lessons+from+murine+models%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Rheumatology%22%5BJournal%5D)">Lupus nephritis: lessons from murine models.</a> Nature Reviews Rheumatology. 6 (1), 13-20 (2010).</li>
<li>Maldonado, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+environmental+antigens+in+the+spontaneous+development+of+autoimmunity+in+MRL-lpr+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">The role of environmental antigens in the spontaneous development of autoimmunity in MRL-lpr mice.</a> Journal of Immunology. 162 (11), 6322-6330 (1999).</li>
<li>Lech, M., Anders, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+pathogenesis+of+lupus+nephritis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Society+of+Nephrology%22%5BJournal%5D)">The pathogenesis of lupus nephritis.</a> Journal of the American Society of Nephrology. 24 (9), 1357-1366 (2013).</li>
<li>Bagavant, H., Fu, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pathogenesis+of+kidney+disease+in+systemic+lupus+erythematosus%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Rheumatology%22%5BJournal%5D)">Pathogenesis of kidney disease in systemic lupus erythematosus.</a> Current Opinion in Rheumatology. 21 (5), 489-494 (2009).</li>
<li>Li, Q. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+autoantibody+clusters+that+best+predict+lupus+disease+activity+using+glomerular+proteome+arrays%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Identification of autoantibody clusters that best predict lupus disease activity using glomerular proteome arrays.</a> Journal of Clinical Investigation. 115 (12), 3428-3439 (2005).</li>
<li>Aragón, C. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Urinary+biomarkers+in+lupus+nephritis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Translational+Autoimmunity%22%5BJournal%5D)">Urinary biomarkers in lupus nephritis.</a> Journal of Translational Autoimmunity. 3, 100042(2020).</li>
<li>Mu, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+of+lupus+nephritis+by+changes+of+gut+microbiota%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiome%22%5BJournal%5D)">Control of lupus nephritis by changes of gut microbiota.</a> Microbiome. 5 (1), 73(2017).</li>
<li>Lu, T. -S., Yiao, S. -Y., Lim, K., Jensen, R. V., Hsiao, L. -L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interpretation+of+biological+and+mechanical+variations+between+the+Lowry+versus+Bradford+method+for+protein+quantification%5BTitle%5D)+AND+%22North+American+Journal+of+Medical+Sciences%22%5BJournal%5D)">Interpretation of biological and mechanical variations between the Lowry versus Bradford method for protein quantification.</a> North American Journal of Medical Sciences. 2 (7), 325-328 (2010).</li>
<li>Lamb, E. J., MacKenzie, F., Stevens, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+should+proteinuria+be+detected+and+measured%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+Clinical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">How should proteinuria be detected and measured.</a> Annals of Clinical Biochemistry. 46, Pt 3 205-217 (2009).</li>
<li>Viswanathan, G., Upadhyay, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessment+of+proteinuria%5BTitle%5D)+AND+%22Advances+in+Chronic+Kidney+Disease%22%5BJournal%5D)">Assessment of proteinuria.</a> Advances in Chronic Kidney Disease. 18 (4), 243-248 (2011).</li>
<li>Hsieh, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Predicting+outcomes+of+lupus+nephritis+with+tubulointerstitial+inflammation+and+scarring%5BTitle%5D)+AND+%22Arthritis+Care+%26+Research%22%5BJournal%5D)">Predicting outcomes of lupus nephritis with tubulointerstitial inflammation and scarring.</a> Arthritis Care & Research. 63 (6), 865-874 (2011).</li>
<li>Hill, G. S., Delahousse, M., Nochy, D., Mandet, C., Bariéty, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteinuria+and+tubulointerstitial+lesions+in+lupus+nephritis%5BTitle%5D)+AND+%22Kidney+International%22%5BJournal%5D)">Proteinuria and tubulointerstitial lesions in lupus nephritis.</a> Kidney International. 60 (5), 1893-1903 (2001).</li>
<li>Chang, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+situ+B+cell-mediated+immune+responses+and+tubulointerstitial+inflammation+in+human+lupus+nephritis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">In situ B cell-mediated immune responses and tubulointerstitial inflammation in human lupus nephritis.</a> Journal of Immunology. 186 (3), 1849-1860 (2011).</li>
<li>Schrezenmeier, E., Jayne, D., Dörner, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+B+Cells+and+plasma+cells+in+glomerular+diseases%3A+translational+perspectives%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Society+of+Nephrology%22%5BJournal%5D)">Targeting B Cells and plasma cells in glomerular diseases: translational perspectives.</a> Journal of the American Society of Nephrology. 29 (3), 741(2018).</li>
<li>Fitzgibbons, P. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Principles+of+analytic+validation+of+immunohistochemical+assays%3A+Guideline+from+the+college+of+American+pathologists+pathology+and+laboratory+quality+center%5BTitle%5D)+AND+%22Archives+of+Pathology+%26+Laboratory+Medicine%22%5BJournal%5D)">Principles of analytic validation of immunohistochemical assays: Guideline from the college of American pathologists pathology and laboratory quality center.</a> Archives of Pathology & Laboratory Medicine. 138 (11), 1432-1443 (2014).</li>
<li>Lewis, M. J., Botto, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Complement+deficiencies+in+humans+and+animals%3A+links+to+autoimmunity%5BTitle%5D)+AND+%22Autoimmunity%22%5BJournal%5D)">Complement deficiencies in humans and animals: links to autoimmunity.</a> Autoimmunity. 39 (5), 367-378 (2006).</li>
<li>Watanabe, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modulation+of+renal+disease+in+MRL%2Flpr+mice+genetically+deficient+in+the+alternative+complement+pathway+factor+B%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Modulation of renal disease in MRL/lpr mice genetically deficient in the alternative complement pathway factor B.</a> Journal of Immunology. 164 (2), 786-794 (2000).</li>
<li>Yin, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IL-10+regulates+murine+lupus%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">IL-10 regulates murine lupus.</a> Journal of Immunology. 169 (4), 2148-2155 (2002).</li>
<li>Singh, R. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+contribution+of+IL-4+and+STAT6+vs+STAT4+to+the+development+of+lupus+nephritis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Differential contribution of IL-4 and STAT6 vs STAT4 to the development of lupus nephritis.</a> Journal of Immunology. 170 (9), 4818-4825 (2003).</li>
<li>van Bavel, C. C., Fenton, K. A., Rekvig, O. P., vander Vlag, J., Berden, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glomerular+targets+of+nephritogenic+autoantibodies+in+systemic+lupus+erythematosus%5BTitle%5D)+AND+%22Arthritis+%26+Rheumatism%22%5BJournal%5D)">Glomerular targets of nephritogenic autoantibodies in systemic lupus erythematosus.</a> Arthritis & Rheumatism. 58 (7), 1892-1899 (2008).</li>
<li>Zuniga, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+IgG+subclasses+and+C-reactive+protein+in+lupus+nephritis%3A+the+relationship+between+the+composition+of+immune+deposits+and+FCgamma+receptor+type+IIA+alleles%5BTitle%5D)+AND+%22Arthritis+%26+Rheumatism%22%5BJournal%5D)">Identification of IgG subclasses and C-reactive protein in lupus nephritis: the relationship between the composition of immune deposits and FCgamma receptor type IIA alleles.</a> Arthritis & Rheumatism. 48 (2), 460-470 (2003).</li>
<li>Wang, S., Wang, F., Wang, X., Zhang, Y., Song, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Elevated+creatinine+clearance+in+lupus+nephritis+patients+with+normal+creatinine%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Medical+Sciences%22%5BJournal%5D)">Elevated creatinine clearance in lupus nephritis patients with normal creatinine.</a> International Journal of Medical Sciences. 18 (6), 1449-1455 (2021).</li>
<li>Bradford, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+rapid+and+sensitive+method+for+the+quantitation+of+microgram+quantities+of+protein+utilizing+the+principle+of+protein-dye+binding%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding.</a> Analytical Biochemistry. 72 (1), 248-254 (1976).</li>
<li>Cabana-Puig, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phenotypic+drift+in+lupus-prone+MRL%2Flpr+Mice%3A+potential+roles+of+micrornas+and+gut+microbiota%5BTitle%5D)+AND+%22Immunohorizons%22%5BJournal%5D)">Phenotypic drift in lupus-prone MRL/lpr Mice: potential roles of micrornas and gut microbiota.</a> Immunohorizons. 6 (1), 36-46 (2022).</li>
<li>Wang, S., Wang, F., Wang, X., Zhang, Y., Song, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Elevated+creatinine+clearance+in+lupus+nephritis+patients+with+normal+creatinine%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Medical+Sciences%22%5BJournal%5D)">Elevated creatinine clearance in lupus nephritis patients with normal creatinine.</a> International Journal of Medical Sciences. 18 (6), 1449-1455 (2021).</li>
<li>Kienzle, N., Young, D., Zehntner, S., Bushell, G., Sculley, T. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNaseI+treatment+is+a+prerequisite+for+the+amplification+of+cDNA+from+episomal-based+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">DNaseI treatment is a prerequisite for the amplification of cDNA from episomal-based genes.</a> Biotechniques. 20 (4), 612-616 (1996).</li>
<li>Park, J. G. -, et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immune+cell+composition+in+normal+human+kidneys%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Immune cell composition in normal human kidneys.</a> Scientific Reports. 10 (1), 15678(2020).</li>
<li>Im, K., Mareninov, S., Diaz, M. F. P., Yong, W. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+introduction+to+performing+immunofluorescence+staining%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">An introduction to performing immunofluorescence staining.</a> Methods in Molecular Biology. 1897, 299-311 (2019).</li>
<li>Okutucu, B., Dınçer, A., Habib, Ö, Zıhnıoglu, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+five+methods+for+determination+of+total+plasma+protein+concentration%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biochemical+and+Biophysical+Methods%22%5BJournal%5D)">Comparison of five methods for determination of total plasma protein concentration.</a> Journal of Biochemical and Biophysical Methods. 70 (5), 709-711 (2007).</li>
</ol>

Autorzy oświadczają, że nie występuje konflikt interesów.

LN jest główną przyczyną śmiertelności u pacjentów z TRU, a czynniki nasilające chorobę pozostają niejasne. Zastosowanie tego protokołu polega na scharakteryzowaniu funkcji nerek przy użyciu wielu metod, w tym pomiaru białkomoczu, analizy FACS izolowanych leukocytów nerkowych oraz barwienia immunofluorescencyjnego zamrożonych skrawków nerki.
Jedną z ważnych kwestii, które należy wziąć pod uwagę podczas zbierania moczu, jest to, że należy być konsekwentnym w kwestii pory dnia i miejsca zbierani...

Podstawową funkcją nerki jest eliminacja substancji toksycznych z moczem, przy jednoczesnym utrzymaniu homeostazy wody i soli1. Funkcja ta jest zagrożona u pacjentów z toczniem rumieniowatym układowym (SLE), prowadzącym do tzw. toczniowego zapalenia nerek (LN). LN jest konsekwencją ataku układu odpornościowego na nerki, co prowadzi do uporczywego zapalenia nerek, a tym samym utraty zdolności do oczyszczania krwi z odpadów i regulowania stężenia soli i płynów. To ostatecznie doprowadzi do niewydolności nerek, która może być śmiertelna. Podczas procesu nerkowego krążące limfocyty B, limfocyty T i monocyty są rekrutowane do nerki, wydzielając chemokiny, cytokiny i autoprzeciwciała tworzące kompleksy odpornościowe. To ostatecznie prowadzi do uszkodzenia komórek śródbłonka, urazów błoniastych, zaniku kanalików nerkowych i zwłóknienia2.
MRL/Mp-Faslpr (MRL/lpr) myszy podatne na toczeń to klasyczny model mysi wykazujący objawy kliniczne podobne do tocznia, które przypominają ludzki SLE3. Model ten odegrał zasadniczą rolę w zrozumieniu jednej z głównych przyczyn śmiertelności u pacjentów z TRU, toczniowego zapalenia nerek (LN)4. Zarówno w ludzkim, jak i mysim TRU, LN charakteryzuje się stopniowym stanem zapalnym wywołanym przez nerkowe odkładanie się kompleksów immunologicznych, po którym następuje aktywacja dopełniacza, rekrutacja komórek zapalnych i utrata funkcji nerek5. Odkładanie kompleksu immunologicznego jest pierwszym krokiem do indukowania produkcji chemokin i cytokin przez wewnętrzne komórki nerkowe, co rozszerza odpowiedź zapalną poprzez rekrutację komórek odpornościowych6. Obecny protokół przedstawia kilka technik śledzenia postępu choroby nerek, które analizują naciek komórek i odkładanie się kompleksu immunologicznego.
Mocz zbierany co tydzień pozwala na wykrycie i wizualizację przebiegu białkomoczu w czasie przed, w trakcie i po wystąpieniu tocznia. Białkomocz jako biomarker może determinować biologiczną progresję LN. Inne zalety tej techniki to to, że jest nieinwazyjna, opłacalna i łatwa do wdrożenia7. Kiedy nerki pracują idealnie, poziom białkomoczu jest stale niski; jednak u myszy MRL/lpr, po 8-9 tygodniu życia, obserwuje się stopniowy wzrost poziomu białkomoczu, który ostatecznie jest wystarczająco wysoki, aby spowodować niewydolność nerek8. W handlu dostępnych jest wiele pasków odczynników i odczynników kolorymetrycznych do monitorowania problemu. Jednak test Bradforda jest tani i bardzo dokładny w określaniu początku białkomoczu i przebiegu toczniowego zapalenia nerek. Ten test jest szybki, a na odczynnik nie ma wpływu obecność rozpuszczalników,, środków redukujących i czynników chelatujących metale, które mogą znajdować się w próbce9,10,11.
Jednym z ważnych aspektów do rozważenia jest infiltracja komórek w nerce. Nacieki te sprzyjają patogenezie, wyzwalając wydzielanie rozpuszczalnych czynników, takich jak cytokiny, w celu pogorszenia stanu zapalnego12. Aby lepiej zrozumieć, jakie populacje komórek są obecne w naciekach, przydatną metodą jest wyizolowanie leukocytów13. Tutaj jako przykład podaje się wykrycie naciekania limfocytów B przez nerki. Procedura rozpoczyna się od procesu trawienia z dezoksyrybonukleazą (DNazą) i kolagenazą, po którym następuje separacja gradientu gęstości, która usuwa zanieczyszczenia, czerwone krwinki i gęste granulocyty. Powodem izolacji limfocytów B (CD19+) i komórek plazmatycznych (CD138+) jest to, że nerki tocznia mogą koncentrować te komórki14. Sugeruje się, że obecność limfocytów B w małych agregatach w nerkach może wskazywać na ekspansję klonalną, a w konsekwencji na produkcję immunoglobulin (Ig). Wiadomo, że komórki plazmatyczne są również obecne w tych agregatach15. Po wyizolowaniu leukocytów można zastosować sortowanie komórek aktywowane fluorescencją (FACS) do analizy komórek będących przedmiotem zainteresowania po barwieniu różnymi przeciwciałami sprzężonymi z fluorescencją.
Immunofluorescencja to jedna z metod wykrywania immunohistochemicznego (IHC), która pozwala na fluorescencyjną wizualizację białek w próbkach tkanki nerkowej o grubości 4 μm. Inne metody wykrywania IHC zależą od charakteru analitów, składu chemicznego wiązania i innych czynników16. Immunofluorescencja to metoda szybkiej identyfikacji, która poddaje antygen działaniu jego odpowiednika przeciwciała znakowanego określonym fluorochromem (lub barwnikiem fluorescencyjnym). Po wzbudzeniu wytwarza światło, które może wykryć mikroskop fluorescencyjny. Technika ta może być wykorzystana do obserwacji osadzania się dopełniacza C3 i IgG2a17. Nadmierna aktywacja kaskady dopełniacza może być związana z niekontrolowaną odpowiedzią immunologiczną i utratą funkcji18. Immunologiczne odkładanie autoprzeciwciał przeciwko dwuniciowemu DNA (anty-dsDNA) w nerkach jest poważnym problemem19, gdzie osoby z izotypem IgG2a zostały powiązane z LN20. W szczególności przeciwciała anty-dsDNA wykazują większą patogenność i powinowactwo do materiałów jądrowych, tworząc kompleksy immunologiczne21. Gdy IgG2a jest obecny, kaskada dopełniacza, w tym C3, jest aktywowana w celu usunięcia kompleksów immunologicznych22. Markery C3 i IgG2a można oznaczać ilościowo pojedynczo lub nakładać na siebie w celu ustalenia ich korelacji.
Warto zauważyć, że pomiar kreatyniny w surowicy jest kolejną niezawodną techniką, która może być używana razem z mikroskopijnym krwiomoczem i biopsjami nerek do diagnozowania LN23. Jednak obecność białkomoczu jest silnym wskaźnikiem uszkodzenia kłębuszków nerkowych. W tym sensie, monitorowanie poziomu białkomoczu podczas tocznia może wykryć początek choroby i uzupełnić inne metody diagnozowania tocznia. Ponadto kompleksy immunologiczne zdeponowane w kłębuszkach nerkowych mogą indukować reakcję zapalną, aktywować układ dopełniacza i rekrutować więcej komórek zapalnych. Kolejnym godnym uwagi punktem tego protokołu jest infiltracja limfocytów B w nerce. To, wraz z naciekanymi limfocytami T, wzmacnia miejscowe odpowiedzi immunologiczne, które wywołują uszkodzenie narządów. Co ważne, klasyfikacja LN opiera się nie tylko na zmianach morfologicznych kłębuszków nerkowych obserwowanych w mikroskopii, ale także na złogach immunologicznych obserwowanych za pomocą immunofluorescencji. Dlatego w tym protokole oferowane są dokładne i opłacalne metody analizy czynności nerek w warunkach laboratoryjnych.

<table><tbody><tr><td>10x sól fizjologiczna buforowana trójpierścieniowo (TBS)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>J60764. K2</td><td></td></tr><tr><td>2-merkaptoetanol</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>21985-023</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Human/Mouse C3</td><td>Cedarlane</td><td>CL7632F</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Mouse CD138 BV711</td><td>Biolegend</td><td>142519</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Mouse CD45 AF700</td><td>Biolegend</td><td>103127</td><td></td></tr><tr><td>Albumina surowicy bydlęcej</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9418-100G</td><td></td></tr><tr><td>Kolagenaza D</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>11088882001</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop konfokalny LSM 880</td><td>Zeiss</td><td>LSM 880</td><td></td></tr><tr><td>Słoik z kopliny</td><td>Fisher Scientific</td><td>50-212-281</td><td></td></tr><tr><td>Cryomold</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC9511236</td><td></td></tr><tr><td>Gradient gęstości średni</td><td>GE Healthcare</td><td>17-1440-02</td><td>Percoll</td></tr><tr><td>DEPC-Woda uzdatniona</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>AM9906</td><td></td></tr><tr><td>DNase I</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D4527</td><td></td></tr><tr><td>dsDNA-EC</td><td>InvivoGen</td><td>tlrl-ecdna</td><td></td></tr><tr><td>Kwas etylenodiaminotetraoctowy</td> System obrazowania mikroskopowego <td>Fisher Scientific</td><td>S311-500</td><td>EDTA</td></tr><tr><td>EVOS M5000</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>AMF5000</td><td></td></tr><tr><td>FACS Fusion Cell sorter</td><td>BD Biosciences</td><td>FACS Fusion</td><td></td></tr><tr><td>Płodowa surowica bydlęca - premium, inaktywowana termicznie</td><td>R& Systemy D</td><td>S11150H</td><td></td></tr><tr><td>96-dołkowe płyty polistyrenowe Fisherbrand</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-565-501</td><td></td></tr><tr><td>Pryzmat graficzny</td><td>GraphPad</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Hank' s Zrównoważony roztwór soli</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>14175-079</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15630-080</td><td></td></tr><tr><td>Oprogramowanie ImageJ</td><td>National Institutes of Health</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Lactobacillus reuteri Kandler i wsp.</td><td>ATCC</td><td>23272</td><td></td></tr><tr><td>MEM Aminokwasy endogenne</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11140-050</td><td></td></tr><tr><td>MRL/MpJ-Fas lpr /J Myszy (MRL/lpr)</td><td>Jackson Lab</td><td>485</td><td></td></tr><tr><td>Szkliwo paznokci</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>Dowolny konwencjonalny sklep</td></tr><tr><td>Związek O.C.T</td><td>Tisse-Tek</td><td>4583</td><td></td></tr><tr><td>PAP długopis</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z377821</td><td></td></tr><tr><td>Jednorazowe formy do zatapiania Peel-A-Way</td><td>Polysciences</td><td>R-30</td><td></td></tr><tr><td>Penicylina-Streptomycyna</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>70011069</td><td></td></tr><tr><td>Pierce 20x TBS Bufor</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>28358</td><td></td></tr><tr><td>Pierce Coomassie Plus (Bradford) Zestaw testowy</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>23236</td><td>Albumina w standardzie w zestawie</td></tr><tr><td>ProLon Gold Anti-Blade Mountant</td><td>ThermoFisher</td><td>P36934</td><td></td></tr><tr><td>Purified Rat Anti-Mouse CD16/CD32</td><td>BD Biosciences</td><td>553141</td><td>blok FcR</td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11875-093</td><td></td></tr><tr><td>Pirogronian sodu</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11360-070</td><td></td></tr><tr><td>SpectraMax M5</td><td>Urządzenia molekularne</td><td>N/A</td><td>SoftMax Pro 6.1</td></tr><tr><td>Oprogramowanie Sitka do komórek sterylnych 100 i mikro; M</td><td>Fisher Scientific</td><td>22363549</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP337-500</td><td></td></tr><tr><td>Chlorowodorek wankomycyny</td><td>Goldbio</td><td>V-200-1</td><td></td></tr><tr><td>Zombie Aqua</td><td>Biolegend</td><td>423102</td><td>barwnik fluorescencyjny do analizy cytometrii przepływowej</td></tr></tbody></table>

analizy białkomoczu, naciekania leukocytów przez nerki i odkładania się białek przez nerki u myszy mrl/lpr podatnych na toczeń

Analyses of Proteinuria, Renal Infiltration of Leukocytes, and Renal Deposition of Proteins in Lupus-prone MRL/lpr Mice

Toczeń rumieniowaty układowy (SLE) jest chorobą autoimmunologiczną, na którą nie ma lekarstwa i charakteryzuje się uporczywym stanem zapalnym w wielu narządach, w tym w nerkach. W takich okolicznościach nerka traci zdolność do oczyszczania krwi z odpadów i regulowania stężenia soli i płynów, co ostatecznie prowadzi do niewydolności nerek. Kobiety, zwłaszcza w wieku rozrodczym, diagnozowane są dziewięciokrotnie częściej niż mężczyźni. Choroby nerek są główną przyczyną śmiertelności pacjentów z TRU. Obecny protokół opisuje szybką i prostą metodę pomiaru poziomu wydalanego białka w pobranym moczu, śledząc postęp tocznia w czasie. Ponadto przedstawiono podejście do izolacji komórek jednojądrzastych nerki w oparciu o dobór wielkości i gęstości w celu zbadania naciekania leukocytów przez nerki. Ponadto opracowano metodę immunohistochemiczną w celu scharakteryzowania odkładania się białek w kłębuszkach nerkowych i nacieku leukocytów w przestrzeni cewkowo-śródmiąższowej. Razem metody te mogą pomóc w badaniu postępu przewlekłego stanu zapalnego związanego z nerkami myszy MRL / lpr podatnych na toczeń.

Protokół wykorzystuje kilka metod do oceny toczniowego zapalenia nerek u myszy MRL/lpr. Po pierwsze, opisano procedurę badania wzrostu poziomu białkomoczu wynikającego z dysfunkcji nerek w czasie. Jak pokazano na Ryc. 1, samice myszy w grupie kontrolnej otrzymywały drogą doustną 200 µL soli fizjologicznej w buforze fosforanowym (1x PBS), natomiast grupa badawcza otrzymywała probiotyk Lactobacillus reuteri w stężeniu 109 cfu/mL, dwa razy w tygodniu. Podawanie preparatów ro...

Obecny protokół opisuje metodę śledzenia postępu tocznia u myszy. Przedstawiono dwie dodatkowe procedury w celu scharakteryzowania toczniowego zapalenia nerek w oparciu o naciek komórek i odkładanie się białek w nerkach.

Analizy białkomoczu, naciekania leukocytów przez nerki i odkładania się białek przez nerki u myszy MRL/lpr podatnych na toczeń

Systemic lupus erythematosus (SLE) is an autoimmune disorder with no known cure and is characterized by persistent inflammation in many organs, including ...

Metody te mogą pomóc w badaniu postępu przewlekłego stanu zapalnego związanego z nerkami u pacjentów z toczniem. Oferujemy niezawodną i opłacalną alternatywę, która może być stosowana do monitorowania przebiegu choroby w toczniu. Rozpocznij sterylizację okapu, rozpylając 70% etanolu i umieść sterylny plastikowy arkusz na powierzchni.Następnie przygotuj końcówki, probówki o pojemności 1,5 mililitra i pipetę, aby zebrać około 20 mikrolitrów moczu. Weź klatkę i spryskaj 70% etanolem przed umieszczeniem jej w masce. Następnie przytrzymaj mysz jedną ręką, a drugą ręką delikatnie masuj obszar brzuszny od góry do dołu.Za pomocą 1,5-mililitrowej probówki lub pipety zbierz mocz bezpośrednio. Lub jeśli próbka upuści się, zbierz ją z plastikowego arkusza. Następnie umieść mysz z powrotem w klatce.Pokrój wycięte nerki na wielkość ziarna i strawij w pięciu mililitrach buforu wytrawiającego zawierającego kolagenazę i DNazę 1 w pożywce RPMI 1640 zawierającej HEPES przez jedną godzinę z ciągłym delikatnym wstrząsaniem w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Dodać 10 mililitrów lodowatego PBS zawierającego 10 milimoli EDTA i inkubować przez 10 minut na lodzie. Następnie dwukrotnie wymieszaj zawiesinę.Później przefiltruj zawiesinę komórkową przez sitko o średnicy 100 mikrometrów i przemyj 10 mililitrami HBSS w pełni. Następnie odwirować w temperaturze 350 razy G przez 10 minut w temperaturze pokojowej. Przygotuj 30, 37 i 70% izotoniczny roztwór Percollu i dodaj warstwę 37% roztworu Percollu na wierzch 70% roztworu.Ponownie zawieś ogniwa w pięciu mililitrach 30% izotonicznego Percollu. Za pomocą pipety Pasteura powoli załaduj 37% z pięciu mililitrów na górze i 70% z pięciu mililitrów na dole, tworząc zapasowy izotoniczny gradient Percoll. Następnie odwirować z numerem dziewięć w górę i w dół numerem zero w 1000 razy G przez 30 minut w temperaturze pokojowej.Następnie zbierz leukocyty z interfejsu od 37 do 70% i ponownie zawiesij je w pięciu mililitrach C 10. Ponownie odwirować w temperaturze 350 razy G przez 10 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Następnie ponownie zawiesić osad komórkowy w trzech mililitrach buforu faksowego i odwirować w temperaturze 350 razy G przez pięć minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza.Następnie wyrzuć supernatant, pozostawiając około 50 mikrolitrów całkowitej objętości. Dodaj 50 mikrolitrów bloku receptora FC na probówkę. Następnie wymieszaj i inkubuj na lodzie w ciemności przez 10 minut.Później dodaj dwa mililitry bufora faksu do mycia. Następnie odwirować w temperaturze 350 razy G przez pięć minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza i wyrzucić supernatent, pozostawiając około 50 mikrolitrów całkowitej objętości. Następnie dodaj 20 mikrolitrów odpowiedniego barwnika fluorescencyjnego i odstaw na 15 do 30 minut na lód.Dodać 50 mikrolitrów mieszanki przeciwciał na probówkę zawierającą CD 138 brylantowy fiolet siedem 11 i CD 45 Alexa Fluor 700 i inkubować na lodzie w ciemności przez 15 do 30 minut. Następnie dodaj trzy mililitry bufora faksu. Wirować w temperaturze 350 razy G przez pięć minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza.Usunąć supernatant przez próżnię, pozostawiając około 50 mikrolitrów całkowitej objętości. Później ponownie zawiesić osad komórkowy w 200 mikrolitrach PBS. Aby pobrać próbkę, należy zanurzyć połówkę nerki w małym plastikowym kriofordzie ze związkiem o optymalnej temperaturze skrawania.Następnie dodaj suchy lód do pudełka z pianki polistyrenowej i ostrożnie umieść kriomold na suchym lodzie. Następnie wyjmij krioformę, zawiń ją w folię aluminiową i przechowuj w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza do dalszego użycia. Następnie przymocuj suche do czterech mikrometrów odcinki zimnym acetonem przez 10 minut.Po zamocowaniu szkiełek należy wysuszyć na powietrzu przez 0,5 do jednej godziny i przechowywać je przez krótki czas w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza lub przez długi czas w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza. Aby zabarwić próbki, należy ponownie zamocować szkiełka w zimnym acetonie na pięć do 10 minut i pozostawić sekcje do ogrzania do temperatury pokojowej. Następnie za pomocą pisaka narysuj hydrofobowy okrąg wokół sekcji i pozostaw do wyschnięcia.Następnie umieść szkiełka w TBS w słoiku Copeland na 20 minut i delikatnie wstrząśnij, kładąc słoik na shakerze. Następnie odlej TBS i napełnij słoik TBS 5%BSA i 0,1%TW 20. Później inkubuj słoik przez 20 minut, delikatnie potrząsając shakerem.Następnie wyjmij szkiełka i wytrzyj spód szkiełków. Dodać 100 mikrolitrów sprzężonych przeciwciał C3 fit C i IgG2 APE do sekcji i inkubować w temperaturze pokojowej w wilgotnej komorze przez godzinę. Umyj sekcję trzykrotnie w PBS 5% BSA i 0,1% TW 20 przez 10 minut na shakerze, a następnie wstrząśnij do sucha szkiełka.Zamontuj sekcję za pomocą odczynnika zapobiegającego blaknięciu, a następnie za pomocą szkiełka nakrywkowego. Następnie przechowuj szkiełka w temperaturze czterech stopni Celsjusza do momentu obejrzenia pod mikroskopem. W przypadku analizy obrazu za pomocą oprogramowania do przetwarzania obrazu J, obrysuj żądany obszar.Następnie ustaw standardowe parametry, klikając Analizuj, a następnie ustaw pomiary i zmierz obszar, aby uzyskać wyniki. Następnie przenieś dane uzyskane z okien miar do arkusza kalkulacyjnego. Po zakończeniu kliknij analizuj, aby zmierzyć region i ponownie przenieś dane do poprzedniego arkusza kalkulacyjnego.Poziomy białka w moczu myszy MRL LPR wykryto z czasem, gdy były one traktowane solą fizjologiczną buforowaną fosforanami jako grupą kontrolną i Lactobacillus reuteri jako grupą leczoną. Grupa myszy leczona L.reuteri z bardziej agresywną progresją białkomoczu niż grupa kontrolna. Analizę faksową przeprowadzono dla izolowanych leukocytów nerkowych w celu analizy komórek plazmatycznych.Ponadto myszy leczono wankomycyną lub wankomycyną wraz z dwuniciowym DNA Escherichia coli. Chociaż oczekiwano, że dwuniciowe DNA Escherichia coli wywoła naciek nerkowy, nie stwierdzono znaczącej różnicy w odsetku komórek plazmatycznych. Dopełniacz C3 i IgG2a wykryto za pomocą barwienia immunofluorescencyjnego na żeńskich odcinkach nerek MRL IPR.Porównano skuteczne czynniki środowiskowe wpływające na odkładanie się C3 i IgG2a w nerkach dla chleba dla myszy w domu zwierząt i dla chleba zakupionego od sprzedawcy. Analiza immunohistochemiczna nie wykazała żadnej różnicy między obiema grupami. Dodawanie każdej warstwy procentowego roztworu ISO 20 Percoll może być trudne, a jeśli się zmieszają, musisz zacząć od nowa.Ta procedura pomaga w cytometrze przepływowym i eksperymentach in vitter, więc nie można badać różnych typów populacji komórek nerkowych. Ta procedura pozwala nam badać nacieki limfocytów B w nerkach, a w literaturze nie ma zbyt wielu informacji.

analyses-proteinuria-renal-infiltration-leukocytes-renal-deposition

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Transfer limfocytów bm12 do biorcy C57BL/6 jest ustalonym modelem tocznia rumieniowatego układowego. Tutaj opisujemy, jak zainicjować chorobę za pomocą tego modelu i jak scharakteryzować komórki pomocnicze pęcherzyków T, komórki B centrum rozrodczego i komórki plazmatyczne za pomocą cytometrii przepływowej.

Indukowany model tocznia rumieniowatego układowego (SLE) bm12 u myszy C57BL/6

Tutaj opisujemy indukcję eksperymentalnego zespołu nerczycowego u myszy 129S1/SvImJ poprzez szybkie retrogałkowe wstrzyknięcie doksorubicyny. Leczymy również myszy z nerczycami granulkami o przedłużonym uwalnianiu zawierającymi aprotyninę, aby zahamować aktywność proteazy serynowej w moczu i zapobiec zatrzymywaniu sodu.

Indukcja zespołu nerczycowego u myszy przez zagałkowe wstrzyknięcie doksorubicyny i zapobieganie utrzymaniu objętości przez aprotyninę o przedłużonym uwalnianiu

Ten protokół opisuje pełne badanie nerek, które powinno być przeprowadzone na mysich modelach choroby kłębuszków nerkowych. Metody te pozwalają na szczegółową analizę funkcjonalną, strukturalną i mechanistyczną funkcji kłębuszków nerkowych, którą można zastosować do wszystkich mysich modeli choroby kłębuszków nerkowych.

Ocena czynności nerek w mysich modelach choroby kłębuszków nerkowych

Tutaj prezentujemy trzy metody oceny migracji i infiltracji neutrofili zarówno in vivo, jak i in vitro. Metody te mogą być wykorzystane do odkrycia obiecujących terapii ukierunkowanych na migrację neutrofili.

Wykrywanie migracji i infiltracji neutrofili u myszy

mikroRNA biorą udział w patogenezie nefropatii IgA. Opracowaliśmy niezawodną metodę wykrywania poziomów ekspresji mikroRNA w nerkach mysiego modelu nefropatii IgA (myszy HIGA). Ta nowa metoda ułatwi sprawdzenie udziału miRNA w nefropatii IgA.

Wykrywanie ekspresji mikroRNA w nerkach myszy nefropatycznych z immunoglobuliną A

Tutaj prezentujemy protokół z wykorzystaniem mikroskopii 2-fotonowej u szczurów z Monachium Wistar Fromter z powierzchniowymi kłębuszkami nerkowymi w celu ilościowego określenia wpływu przedłużonej niedrożności moczowodu na dynamikę i funkcję kłębuszków nerkowych.

Wykorzystanie mikroskopii 2-fotonowej do ilościowego określenia wpływu przewlekłej jednostronnej niedrożności moczowodu na procesy kłębuszkowe

Ten protokół zapewnia prostą, opłacalną metodę izolacji DNA do analizy zmian mikroflory jelitowej myszy podczas rozwoju choroby autoimmunologicznej.

Analiza dynamiki mikrobioty kałowej u myszy podatnych na toczeń przy użyciu prostej, opłacalnej metody izolacji DNA

Ten protokół opisuje metodę wywoływania jednostronnej niedrożności moczowodu (UUO) u myszy w celu zbadania postępu zwłóknienia tkanek w nefropatii obturacyjnej. Obejmuje zabiegi chirurgiczne, opiekę pooperacyjną i metody oceny zwłóknienia.

Model jednostronnej niedrożności moczowodu do badania zwłóknienia śródmiąższowego nerek

Tutaj prezentujemy szczegółowy protokół analizy proteomicznej całej nerki, izolowanych kanalików korowych i proteomów rdzeniowych. W badaniu porównano również regionalne proteomy w mysim modelu z cukrzycą i myszach bez cukrzycy.

Porównawcza analiza proteomiczna całej nerki, rdzenia i kanalików korowych w patogenezie cukrzycowej uszkodzenia nerek u myszy

Protokół ten opisuje procedurę przeżycia dla bezpiecznej i dobrze tolerowanej obustronnej limfadenektomii nerki u myszy.

Grzybicza limfadenektomia nerek u myszy

Poznaj metodę oceny nefrytycznej postaci tocznia u myszy MRL/lpr poprzez analizę białkomoczu, naciekania leukocytów i odkładania białek w nerkach. Technika ta umożliwia niezawodne monitorowanie progresji choroby.

Analizy białkomoczu, naciekania leukocytów przez nerki i odkładania się białek przez nerki u myszy MRL/lpr podatnych na toczeń

Przeglądaj więcej filmów