Name: Usunięcie oczu u żywych larw danio pręgowanego w celu zbadania zależnego od unerwienia wzrostu i rozwoju układu wzrokowego (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-02-11T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min
Description: Poznaj metodę jednostronnego usunięcia oka u larw Danio rerio w celu badania wpływu wejścia siatkówkowego na rozwój wzgórza wzrokowego. Protokół umożliwia porównanie unerwionych i zdenerwowanych płatów w tym samym zwierzęciu.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Finansowanie tej pracy było głównie wspierane przez fundusze start-upowe z Reed College do KLC, fundusze Helen Stafford Research Fellowship dla OLH oraz stypendium Reed College Science Research Fellowship dla YK. Projekt ten rozpoczął się w laboratorium Steve'a Wilsona jako współpraca z działem HR, który był wspierany przez stypendium Wellcome Trust (2009-2014). Dziękujemy Máté Vardze, Steve'owi Wilsonowi i innym członkom laboratorium Wilsona za wstępne dyskusje na temat tego projektu, a szczególnie dziękujemy Florencii Cavodeassi i Kate Edwards, które jako pierwsze nauczyły KLC, jak montować zarodki w agarozie i przeprowadzać sekcje mózgu danio pręgowanego. Dziękujemy również Grecie Glover i Jayowi Ewingowi za pomoc w montażu naszego wolframowego urządzenia do ostrzenia igieł.

<ol><li>Butler, A. B., Hodos, W. Optic tectum. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aButler%2C+AB+%22Comparative+Vertebrate+Neuroanatomy%3A+Evolution+and+Adaptation%22">Comparative Vertebrate Neuroanatomy: Evolution and Adaptation</a>. , John Wiley & Sons, Inc. 311-340 (2005).</li>
<li>Cang, J., Feldheim, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Developmental+mechanisms+of+topographic+map+formation+and+alignment%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Developmental mechanisms of topographic map formation and alignment.</a> Annual Review of Neuroscience. 36 (1), 51-77 (2013).</li>
<li>Basso, M. A., Bickford, M. E., Cang, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unraveling+circuits+of+visual+perception+and+cognition+through+the+superior+colliculus%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Unraveling circuits of visual perception and cognition through the superior colliculus.</a> Neuron. 109 (6), 918-937 (2021).</li>
<li>Burrill, J. D., Easter, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+the+retinofugal+projections+in+the+embryonic+and+larval+zebrafish+%28Brachydanio+rerio%29%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Comparative+Neurology%22%5BJournal%5D)">Development of the retinofugal projections in the embryonic and larval zebrafish (Brachydanio rerio).</a> The Journal of Comparative Neurology. 346 (4), 583-600 (1994).</li>
<li>Nona, S. Regeneration in the goldfish visual system. Webvision: The Organization of the Retina and Visual System. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://webvision.med.utah.edu/book/part-x-repair-and-regeneration-in-the-visual-system/regeneration-in-the-goldfish-visual-system/">https://webvision.med.utah.edu/book/part-x-repair-and-regeneration-in-the-visual-system/regeneration-in-the-goldfish-visual-system/</a> (2021).</li>
<li>Sauve, Y., Gaillard, F. Regeneration in the visual system of adult mammals. Webvision: The Organization of the Retina and Visual System. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://webvision.med.utah.edu/book/part-x-repair-and-regeneration-in-the-visual-system/regeneration-in-the-visual-system-of-adult-mammals/">https://webvision.med.utah.edu/book/part-x-repair-and-regeneration-in-the-visual-system/regeneration-in-the-visual-system-of-adult-mammals/</a> (2021).</li>
<li>Cerveny, K. L., Varga, M., Wilson, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Continued+growth+and+circuit+building+in+the+anamniote+visual+system%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Neurobiology%22%5BJournal%5D)">Continued growth and circuit building in the anamniote visual system.</a> Developmental Neurobiology. 72 (3), 328-345 (2012).</li>
<li>Lindsey, B. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Midbrain+tectal+stem+cells+display+diverse+regenerative+capacities+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Midbrain tectal stem cells display diverse regenerative capacities in zebrafish.</a> Scientific Reports. 9 (1), 4420(2019).</li>
<li>Soares, D., Yamamoto, Y., Strickler, A. G., Jeffery, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+lens+has+a+specific+influence+on+optic+nerve+and+tectum+development+in+the+blind+cavefish+Astyanax%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">The lens has a specific influence on optic nerve and tectum development in the blind cavefish Astyanax.</a> Developmental Neuroscience. 26 (5-6), 308-317 (2004).</li>
<li>White, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+experimental+study+of+the+relationship+between+the+size+of+the+eye+and+the+size+of+the+optic+tectum+in+the+brain+of+the+developing+teleost%2C+Fundulus+heteroclitus%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Zoology%22%5BJournal%5D)">An experimental study of the relationship between the size of the eye and the size of the optic tectum in the brain of the developing teleost, Fundulus heteroclitus.</a> Journal of Experimental Zoology. 108 (3), 439-469 (1948).</li>
<li>Raymond, P., Easter, S., Burnham, J., Powers, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Postembryonic+growth+of+the+optic+tectum+in+goldfish.+II.+Modulation+of+cell+proliferation+by+retinal+fiber+input%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Postembryonic growth of the optic tectum in goldfish. II. Modulation of cell proliferation by retinal fiber input.</a> The Journal of Neuroscience. 3 (5), 1092-1099 (1983).</li>
<li>Sato, Y., Yano, H., Shimizu, Y., Tanaka, H., Ohshima, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optic+nerve+input-dependent+regulation+of+neural+stem+cell+proliferation+in+the+optic+tectum+of+adult+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Neurobiology%22%5BJournal%5D)">Optic nerve input-dependent regulation of neural stem cell proliferation in the optic tectum of adult zebrafish.</a> Developmental Neurobiology. 77 (4), 474-482 (2017).</li>
<li>Hall, Z. J., Tropepe, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visual+experience+facilitates+BDNF-dependent+adaptive+recruitment+of+new+neurons+in+the+postembryonic+optic+tectum%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Visual experience facilitates BDNF-dependent adaptive recruitment of new neurons in the postembryonic optic tectum.</a> The Journal of Neuroscience. 38 (8), 2000-2014 (2018).</li>
<li>Nusslein-Volhard, C., Dahm, R. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aNusslein-Volhard%2C+C+%22Zebrafish%22">Zebrafish</a>. , Oxford University Press. (2002).</li>
<li>Cold Spring Harbor Protocols. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Marc%27s+modified+Ringer%27s+%28MMR%29+%2810X%2C+pH+7.4%29%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Protocols%22%5BJournal%5D)">Marc's modified Ringer's (MMR) (10X, pH 7.4).</a> Cold Spring Harbor Protocols. , (2009).</li>
<li>Turner, K. J., Bracewell, T. G., Hawkins, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anatomical+dissection+of+zebrafish+brain+development%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Development%22%5BJournal%5D)">Anatomical dissection of zebrafish brain development.</a> Brain Development. 1082, 197-214 (2014).</li>
<li>Brady, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+technique+for+making+very+fine%2C+durable+dissecting+needles+by+sharpening+tungsten+wire+electrolytically%5BTitle%5D)+AND+%22Bulletin+of+the+World+Health+Organization%22%5BJournal%5D)">A simple technique for making very fine, durable dissecting needles by sharpening tungsten wire electrolytically.</a> Bulletin of the World Health Organization. 32 (1), 143-144 (1965).</li>
<li>ZFIN Tricaine recipe. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://zfin.atlassian.net/wiki/spaces/prot/pages/362220023/TRICAINE">https://zfin.atlassian.net/wiki/spaces/prot/pages/362220023/TRICAINE</a> (2018).</li>
<li>Zhang, L., Leung, Y. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microdissection+of+zebrafish+embryonic+eye+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Microdissection of zebrafish embryonic eye tissues.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (40), e2028(2010).</li>
<li>ZFIN protocols. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://zfin.atlassian.net/wiki/spaces/prot/overview">https://zfin.atlassian.net/wiki/spaces/prot/overview</a> (2021).</li>
<li>Engerer, P., Plucinska, G., Thong, R., Trovò, L., Paquet, D., Godinho, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+subcellular+structures+in+the+living+zebrafish+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Imaging subcellular structures in the living zebrafish embryo.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (110), e53456(2016).</li>
<li>ImageJ with batteries included. Fiji. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://figi.sc/">https://figi.sc/</a> (2021).</li>
<li>O'Brien, J., Hayder, H., Peng, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+quantification+and+analysis+of+cell+counting+procedures+using+ImageJ+plugins%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Automated quantification and analysis of cell counting procedures using ImageJ plugins.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (117), e54719(2016).</li>
<li>Poggi, L., Vitorino, M., Masai, I., Harris, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Influences+on+neural+lineage+and+mode+of+division+in+the+zebrafish+retina+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Influences on neural lineage and mode of division in the zebrafish retina in vivo.</a> The Journal of Cell Biology. 171 (6), 991-999 (2005).</li>
<li>Karlstrom, R. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrafish+mutations+affecting+retinotectal+axon+pathfinding%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Zebrafish mutations affecting retinotectal axon pathfinding.</a> Development. 123 (1), 427-438 (1996).</li>
<li>Harvey, B. M., Baxter, M., Granato, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optic+nerve+regeneration+in+larval+zebrafish+exhibits+spontaneous+capacity+for+retinotopic+but+not+tectum+specific+axon+targeting%5BTitle%5D)+AND+%22PLOS+ONE%22%5BJournal%5D)">Optic nerve regeneration in larval zebrafish exhibits spontaneous capacity for retinotopic but not tectum specific axon targeting.</a> PLOS ONE. 14 (6), 0218667(2019).</li>
<li>Robles, E., Filosa, A., Baier, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Precise+lamination+of+retinal+axons+generates+multiple+parallel+input+pathways+in+the+tectum%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Precise lamination of retinal axons generates multiple parallel input pathways in the tectum.</a> Journal of Neuroscience. 33 (11), 5027-5039 (2013).</li>
<li>Vargas, M. E., Barres, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Why+Is+Wallerian+degeneration+in+the+CNS+so+slow%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Why Is Wallerian degeneration in the CNS so slow.</a> Annual Review of Neuroscience. 30 (1), 153-179 (2007).</li>
<li>Hughes, A. N., Appel, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglia+phagocytose+myelin+sheaths+to+modify+developmental+myelination%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Microglia phagocytose myelin sheaths to modify developmental myelination.</a> Nature Neuroscience. 23 (9), 1055-1066 (2020).</li>
<li>de Calbiac, H., Dabacan, A., Muresan, R., Kabashi, E., Ciura, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Behavioral+and+physiological+analysis+in+a+zebrafish+model+of+epilepsy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Behavioral and physiological analysis in a zebrafish model of epilepsy.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (176), e58837(2021).</li>
<li>Adams, S. L., Zhang, T., Rawson, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effect+of+external+medium+composition+on+membrane+water+permeability+of+zebrafish+%28Danio+rerio%29+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Theriogenology%22%5BJournal%5D)">The effect of external medium composition on membrane water permeability of zebrafish (Danio rerio) embryos.</a> Theriogenology. 64 (7), 1591-1602 (2005).</li>
<li>Fredj, N. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synaptic+activity+and+activity-dependent+competition+regulates+axon+arbor+maturation%2C+growth+arrest%2C+and+territory+in+the+retinotectal+projection%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Synaptic activity and activity-dependent competition regulates axon arbor maturation, growth arrest, and territory in the retinotectal projection.</a> Journal of Neuroscience. 30 (32), 10939-10951 (2010).</li>
<li>Alberio, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+light-gated+potassium+channel+for+sustained+neuronal+inhibition%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">A light-gated potassium channel for sustained neuronal inhibition.</a> Nature Methods. 15 (11), 969-976 (2018).</li>
<li>Kay, J. N., Finger-Baier, K. C., Roeser, T., Staub, W., Baier, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retinal+ganglion+cell+genesis+requires+lakritz%2C+a+zebrafish+atonal+homolog%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Retinal ganglion cell genesis requires lakritz, a zebrafish atonal homolog.</a> Neuron. 30 (3), 725-736 (2001).</li>
<li>Gnuegge, L., Schmid, S., Neuhauss, S. C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+the+activity-deprived+zebrafish+mutant+macho+reveals+an+essential+requirement+of+neuronal+activity+for+the+development+of+a+fine-grained+visuotopic+map%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Analysis of the activity-deprived zebrafish mutant macho reveals an essential requirement of neuronal activity for the development of a fine-grained visuotopic map.</a> The Journal of Neuroscience. 21 (10), 3542-3548 (2001).</li>
<li>Jeffery, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Astyanax+surface+and+cave+fish+morphs%5BTitle%5D)+AND+%22EvoDevo%22%5BJournal%5D)">Astyanax surface and cave fish morphs.</a> EvoDevo. 11 (1), 14(2020).</li>
<li>Sieger, D., Peri, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Animal+models+for+studying+microglia%3A+The+first%2C+the+popular%2C+and+the+new%5BTitle%5D)+AND+%22Glia%22%5BJournal%5D)">Animal models for studying microglia: The first, the popular, and the new.</a> Glia. 61 (1), 3-9 (2013).</li>
<li>Svahn, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+ramified+microglia+from+early+macrophages+in+the+zebrafish+optic+tectum%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Neurobiology%22%5BJournal%5D)">Development of ramified microglia from early macrophages in the zebrafish optic tectum.</a> Developmental Neurobiology. 73 (1), 60-71 (2013).</li>
<li>Herzog, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+clearance+of+cellular+debris+by+microglia+limits+secondary+neuronal+cell+death+after+brain+injury+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Rapid clearance of cellular debris by microglia limits secondary neuronal cell death after brain injury in vivo.</a> Development. 146 (9), (2019).</li>
<li>Chen, J., Poskanzer, K. E., Freeman, M. R., Monk, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live-imaging+of+astrocyte+morphogenesis+and+function+in+zebrafish+neural+circuits%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Live-imaging of astrocyte morphogenesis and function in zebrafish neural circuits.</a> Nature Neuroscience. 23 (10), 1297-1306 (2020).</li>
</ol>

Autorzy nie mają do ujawnienia żadnych konfliktów interesów.

Techniki opisane w niniejszej pracy ilustrują jedno z wielu podejść do badania rozwoju układu wzrokowego kręgowców u danio pręgowanego. Inni badacze opublikowali metody preparowania siatkówki embrionalnej i przeprowadzania analiz ekspresji genów19 lub wizualizacji aktywności neuronalnej w tektum wzrokowym30. W artykule przedstawiono podejście do zbadania, w jaki sposób zróżnicowane wejście siatkówki może wpływać na zachowanie komórek w tektum optycznym.
<p class="jove_c...

Celem tej metody jest zbadanie, w jaki sposób dopływ bodźców z siatkówki wpływa na wzrost i rozwój wzgórza optycznego, czyli centrum przetwarzania bodźców wzrokowych w mózgu danio pręgowanego. Poprzez usunięcie jednego oka i następujące po tym porównanie obu stron wzgórza optycznego, możliwe jest zaobserwowanie i znormalizowanie zmian w obrębie tego ośrodka u jednego osobnika, co umożliwia porównania między wieloma okazami. Nowoczesne podejścia molekularne w połączeniu z tą techniką pozwolą na uzyskanie wiedzy na temat mechanizmów leżących u podstaw wzrostu i rozwoju układu wzrokowego, a także degeneracji i regeneracji aksonów.
Układy sensoryczne – wzrok, słuch i somatosensoryka – zbierają informacje z organów zewnętrznych i przekazują je do ośrodkowego układu nerwowego, tworząc w śródmózgowiu „mapy” świata zewnętrznego1,2. Wzrok jest dominującą modalnością sensoryczną u niemal wszystkich kręgowców, w tym u wielu ryb. Siatkówka, będąca tkanką nerwową w oku, zbiera informacje za pomocą obwodu neuronalnego składającego się głównie z fotoreceptorów, komórek dwubiegunowych oraz komórek zwojowych siatkówki (RGCs), które są neuronami projekcyjnymi siatkówki. Komórki RGCs posiadają długie aksony, które prowadzą przez wewnętrzną powierzchnię siatkówki do główki nerwu wzrokowego, gdzie łączą się w pęczki i biegną wspólnie przez mózg, kończąc ostatecznie w ośrodku przetwarzania wizualnego w grzbietowej części śródmózgowia. Struktura ta u ryb i innych kręgowców niebędących ssakami nazywana jest tekton wzrokowym i jest homologiczna do wzgórka górnego u ssaków3.
Tectum opticum jest obustronnie symetryczną, wielowarstwową strukturą w grzbietowej części śródmózgowia. U rybek zebra oraz większości innych ryb każdy płat tectum opticum otrzymuje bodźce wzrokowe wyłącznie z oka przeciwległego, tak że lewy nerw wzrokowy kończy się w prawym płacie tectum, a prawy nerw wzrokowy w lewym płacie tectum4 (Rycina 1). Podobnie jak jego ssaczy odpowiednik – wzgórze górne – tectum opticum integruje informacje wzrokowe z innymi bodźcami sensorycznymi, w tym ze słuchu i somatosensacji, kontrolując zmiany uwagi wzrokowej oraz ruchy gałek ocznych, takie jak sakady1,5,6. Jednak w przeciwieństwie do ssaczego wzgórza górnego, tectum opticum nieustannie generuje nowe neurony i glej z wyspecjalizowanej niszy komórek macierzystych znajdującej się w pobliżu przyśrodkowej i guzowej krawędzi płatów tectum, zwanej strefą proliferacji tectum7. Utrzymanie proliferujących progenitorów w tectum opticum i innych obszarach ośrodkowego układu nerwowego przyczynia się częściowo do niezwykłej zdolności regeneracyjnej udokumentowanej u rybek zebra8.
Poprzednie prace badające mózgi ryb ślepych lub jedookich wykazały, że wielkość wzgórza optycznego jest bezpośrednio proporcjonalna do ilości otrzymywanej innowacji siatkówkowej9,10,11. U dorosłych ryb jaskiniowych, których oczy degenerują się we wczesnej embriogenezie, wzgórze optyczne jest wyraźnie mniejsze niż u blisko spokrewnionych, widzących ryb powierzchniowych9. Degeneracji oczu u ryb jaskiniowych można zapobiec, zastępując endogenny soczewkę soczewką z ryby powierzchniowej podczas embriogenezy. Gdy te jedooke ryby jaskiniowe osiągają wiek dorosły, zinnerwowany płat wzgórza zawiera około 10% więcej komórek niż płat niezinnerwowany9. Podobnie u larw ryb killifish, które inkubowano z zastosowaniem preparatów chemicznych w celu wygenerowania oczu o różnych rozmiarach u tego samego osobnika, strona wzgórza z większą ilością innowacji była większa i zawierała więcej neuronów10. Dowody z eksperymentów polegających na zmiażdżeniu nerwu wzrokowego u dorosłych złotych rybek wskazują, że innowacja promuje proliferację, a proliferacja komórek wzgórza zmniejsza się po przerwaniu innowacji11.
Potwierdzając i rozszerzając te klasyczne badania, kilka niedawnych raportów dostarcza danych sugerujących, że proliferacja w odpowiedzi na unerwienie jest modulowana, przynajmniej częściowo, przez szlak BDNF-TrkB12,13. Wiele pytań dotyczących wzrostu i rozwoju wzgórza optycznego pozostaje otwartych, w tym kwestie takie jak: w jaki sposób rozwijający się system sensoryczny radzi sobie z urazami i degeneracją aksonów, jakie sygnały komórkowe i molekularne umożliwiają regulację wzrostu wzgórza optycznego przez dopływ sygnałów z siatkówki, kiedy mechanizmy te stają się aktywne oraz czy związana z unerwieniem proliferacja i różnicowanie umożliwiają siatkówce i tkance docelowej koordynację tempa wzrostu i zapewnienie dokładnego mapowania retinotopowego. Ponadto istnieją znacznie szersze pytania dotyczące rozwoju zależnego od aktywności, które można rozpoznać, badając system wzrokowy rybek zebrafish za pomocą metod chirurgicznych, takich jak ta opisana poniżej.
Aby zbadać komórkowe i molekularne mechanizmy, poprzez które aktywność neuronalna, w szczególności wynikająca z bodźców wzrokowych, wpływa na przeżycie i proliferację komórek, opisane podejście bezpośrednio porównuje unerwione i odnerwione płaty tekta (Rysunek 1) w obrębie pojedynczych larw zebrafish. Metoda ta pozwala na udokumentowanie degeneracji aksonów RGC w tekcie optycznym oraz potwierdzenie, że liczba komórek mitotycznych koreluje z unerwieniem.
<img alt="Schemat usunięcia oka larwy zebrafish, widoki boczny i grzbietowy, unerwienie, badanie rozwojowe." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63509/63509fig01.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1: Szkice larw zebrafish przed i po jednostronnym usunięciu oka. (A) Rysunek larwy w 5 dpf widzianej pod mikroskopem stereologicznym. Każda larwa jest zatopiona w agarozie o niskiej temperaturze topnienia i zorientowana bokiem, przed użyciem igły wolframowej z ostrym, zakrzywionym końcem do wybrania oka skierowanego ku górze (w tym przykładzie oka lewego). (B) Rysunek widoku grzbietowego larwy w 9 dpf po zabiegu przedstawionym w punkcie A. Przedstawiono jedynie trzy silnie uproszczone aksony RGC z prawego oka, które ulegają defasykulacji i łączą się z neuronami w lewym płacie tekta. Skróty: dpf = dni po zapłodnieniu; dps = dni po operacji; RGC = komórki zwojowe siatkówki. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63509/63509fig01large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>

<table><tbody><tr><td>Sprzęt i materiały:</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pudełka hodowlane</td><td>Aquaneering</td><td>ZHCT100</td><td></td></tr><tr><td>Smar wysokopróżniowy Dow Corning</td><td>Sigma lub równoważny dostawca</td><td>Z273554</td><td></td></tr><tr><td>Kolby Erlenmeyera (125 ml)</td><td></td><td></td><td>Do wytwarzania zmodyfikowanych Pierścieni Marca (MMR) z antybiotykami do inkubacji pooperacyjnej.</td></tr><tr><td>Cienkie kleszcze - Dumont #5</td><td>Fine Science Tools (FST)</td><td>11252-20</td><td></td></tr><tr><td>Szklane pipety Pasteura</td><td>DWK Lifescience</td><td>63A53 i 63A53WT</td><td>Do pipetowania zarodków i larw.</td></tr><tr><td>Szkiełka podstawowe do mikroskopii</td><td>VWR lub ich odpowiednik</td><td>48311-703</td><td>Standardowe szkiełka mikroskopowe można zamawiać u wielu różnych dostawców laboratoryjnych.</td></tr><tr><td>Wyroby szklane, w tym butelki z podziałką i cylindry z podziałką Do</td><td></td><td></td><td>wytwarzania i przechowywania roztworów.</td></tr><tr><td>2-częściowa żywica epoksydowa</td><td>ACE Hardware lub inny równoważny dostawca kleju Gorilla Glue lub równoważna</td><td>strzykawka 0,85 uncji</td><td>https://www.acehardware.com/departments/paint-and-supplies/tape-glues-and-adhesives/glues-and-epoxy/1590793</td></tr><tr><td>probówka do mikrowirówek (1,7 ml)</td><td>VWR lub równoważny dostawca</td><td>22234-046</td><td></td></tr><tr><td>Niklowany uchwyt na szpilki (długość 17 cm)</td><td>Fine Science Tools (FST)</td><td>26018-17</td><td>Do trzymania drutu wolframowego podczas ostrzenia i wykonywania operacji/sekcji.</td></tr><tr><td>Sitko do herbaty z siatki nylonowej lub odpowiednik</td><td>Ali Express lub odpowiednik</td><td></td><td>Do zbierania ikry danio pręgowanego po tarle; https://www.aliexpress.com/item/1005002219569756.html</td></tr><tr><td>Spinacz</td><td></td><td></td> do papieru <td>Do urządzenia do ostrzenia igieł wolframowych.</td></tr><tr><td>Szalki Petriego 100 mm</td><td>Fischer Dostawca naukowy lub równoważny</td><td>50-190-0267</td><td></td></tr><tr><td>Szalki Petriego 35 mm</td><td>Fischer Dostawca naukowy lub równoważny</td><td>08-757-100A Pompa</td><td></td></tr><tr><td>do pipet</td><td>SP Bel-Art lub równoważna</td><td>F37898-0000</td><td></td></tr><tr><td>Wodorotlenek potasu (KOH)</td><td>Sigma</td><td>909122</td><td>Do urządzenia do ostrzenia igieł wolframowych. Przygotuj 10% w/v roztwór KOH w okapie, dodając granulki do wody dejonizowanej.</td></tr><tr><td>Zasilacz (zmienne napięcie)</td><td></td><td></td> <td>Do urządzenia do ostrzenia igieł wolframowych. Sprawdzi się każdy zasilacz o zmiennym napięciu (nawet taki używany do elektroforezy żelowej).</td></tr><tr><td>Sylgard 184 Zestaw elastomerów</td><td>Dow Corning</td><td>3097358</td><td></td></tr><tr><td>Drut wolframowy (średnica 0,125 mm)</td><td>World Precision Instruments (WPI)</td><td>TGW0515</td><td>Ostrzyć w celu usunięcia oka i wypreparowania larw.</td></tr><tr><td>Blok grzewczy o zmiennej temperaturze</td><td>Lab Depot lub równoważny dostawca</td><td>BSH1001 lub BSH1002</td><td>Ustaw na 40-42 &deg; C wyprzedza eksperymenty.</td></tr><tr><td>Szklany słoik z szerokim otworem i pokrywką (np. Czysty słoik z dżemem lub salsą)</td><td></td><td></td><td>Do urządzenia do ostrzenia igieł wolframowych.</td></tr><tr><td>Przewody z przewodami</td><td></td><td></td> zaciskowymi krokodylkowymi <td>Do urządzenia do ostrzenia igieł wolframowych.</td></tr><tr><td>< silne>mikroskopy: </td><td></td><td></td><td></td></tr> mikroskop <tr><td>preparacyjny</td><td></td><td></td><td>Każdy typ będzie działał, ale preferowane jest regulowane światło przechodzące na lustrzanej podstawie.</td></tr><tr><td>Zalecany jest laserowy skaningowy mikroskop</td><td></td><td></td> konfokalny <td>High NA, soczewka obiektywowa zanurzająca się w wodzie 20-25x. Używane jest tutaj oprogramowanie do sterowania mikroskopem i przechwytywania obrazu (NIS-Elements firmy Nikon), ale każdy mikroskop konfokalny będzie działał.</td></tr><tr><td>Odczynniki do operacji i sekcji: </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dwuwodny chlorek wapnia</td><td>Sigma</td><td>C7902</td><td>do zmodyfikowanych pierścieni Marca (MMR) i pożywki zarodkowej (E3).</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma</td><td>H7006</td><td>do zmodyfikowanych dzwonków Marca (MMR).</td></tr><tr><td>Agaroza o niskiej temperaturze topnienia</td><td>Invitrogen</td><td>16520-050</td><td>Zrobić 1% w pożywce zarodkowej (E3) lub zmodyfikowanych pierścieniach Marca (MMR).</td></tr><tr><td>Chlorek magnezu sześciowodny</td><td>Sigma</td><td>1374248</td><td>Do pożywki zarodkowej (E3).</td></tr><tr><td>Siarczan magnezu</td><td>Sigma</td><td>M7506</td><td>do zmodyfikowanych dzwonków Marca (MMR).</td></tr><tr><td>Paraformaldehydowa</td><td>mikroskopia elektronowa Sciences</td><td>19210</td><td>Rozcieńczyć 8% (w/v) materiału z 2x skoncentrowanym PBS (rozcieńczonym z 10x PBS stock).</td></tr><tr><td>Penicylina/Streptomycyna</td><td>Sigma</td><td>P4333-20ML</td><td>Rozcieńczyć w stosunku 1:100 w zmodyfikowanych dzwonkach Marca.</td></tr><tr><td>Tabletki z solą fizjologiczną buforowaną fosforanami (PBS)</td><td>Diagnostyka BioSystems</td><td>DMR E404-01</td><td>Przygotować 10x bulion w wodzie dejonizowanej, autoklawać i przechowywać w temperaturze pokojowej. Rozcieńczyć do 1x stężenia roboczego.</td></tr><tr><td>Chlorek potasu</td><td>Sigma</td><td>P3911</td><td>do zmodyfikowanych pierścieni Marca (MMR) i pożywki dla zarodków (E3).</td></tr><tr><td>Chlorek sodu</td><td>Sigma</td><td>S9888</td><td>do zmodyfikowanych pierścieni Marca (MMR) i pożywki zarodkowej (E3).</td></tr><tr><td>Wodorotlenek sodu</td><td>Sigma</td><td>S5881 Wykonaj</td><td>10 M i użyj do dostosowania pH MMR do 7,4.</td></tr><tr><td>Sacharoza</td><td>Sigma</td><td>S9378</td><td></td></tr><tr><td>Tricaine-S</td><td>Pentair</td><td>100G #TRS1</td><td>Przepis:</td></tr> <tr><td>https://zfin.atlassian.net/wiki/spaces/prot/pages/362220023/TRICAINEOdczynniki do immunohistochemii:</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Alexafluor 568 oznaczone Przeciwciało drugorzędowe do wykrywania króliczej IgG</td><td>Invitrogen</td><td>A-11011</td><td>Stosować w rozcieńczeniu 1:500 dla całego montażu immunohistochemia.</td></tr><tr><td>DAPI lub ToPro3</td><td>Invitrogen</td><td>1306 lub T3605</td><td>Uzupełnić roztwory o stężeniu 1 mg/ml w DMSO; rozcieńczenie 1:5 000 do barwienia przeciwstawnego.</td></tr><tr><td>Dimetylosulfotlenek (DMSO)</td><td>Sigma</td><td>D8418</td><td>Składnik buforu immunoblokowego.</td></tr><tr><td>Metanol (MeOH)</td><td>Sigma</td><td>34860</td><td>Mieszanie MeOH z roztworami wodnymi, takimi jak PBST, jest egzotermiczne. Przygotuj roztwory MeOH/PBST co najmniej kilka godzin wcześniej lub schłodzić je na lodzie przed użyciem.</td></tr><tr><td>Normalna surowica kozia</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>50-062Z</td><td>Składnik buforu immunoblokowego. Może być podawany w objętościach 1-10 ml i przechowywany w temperaturze -20 °C.</td></tr><tr><td>Przeciwciało pierwszorzędowe do wykrywania fosfohistonu H3</td><td>Millipore</td><td>06-570</td><td>Stosować w rozcieńczeniu 1:300 do całkowitej immunohistochemii.</td></tr><tr><td>Pierwszorzędowe przeciwciało do wykrywania białka czerwonej fluorescencji (RFP; wykrywa pochodne dsRed)</td><td>MBL International</td><td>PM005</td><td>Stosować w rozcieńczeniu 1:500 do całkowitej immunohistochemii.</td></tr><tr><td>Proteinaza K (PK)</td><td>Sigma</td><td>P2308-10MG</td><td>Uzupełnić 10 mg/ml roztworów podstawowych w PBS i stosować w 10 &mikro; g/ml.</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma</td><td>T8787</td><td>Przydatny do przygotowania 20% (v/v) roztworu podstawowego w PBS.</td></tr><tr><td>Software do analizy danych</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ImageJ (Fidżi)</td><td></td><td></td><td>Darmowe oprogramowanie do analizy obrazu; https://imagej.net/software/fiji/</td></tr> <tr><td>RStudio</td><td></td><td></td><td>Freeware do analizy statystycznej i wizualizacji danych; https://www.rstudio.com/products/rstudio/download/</td></tr> <tr><td>Adobe Photoshop lub GIMP</td><td></td><td></td><td>Do komponowania figur często używa się zastrzeżonego oprogramowania do przetwarzania obrazów (Adobe Photoshop i Illustrator). Darmową alternatywą jest Gnu Image Manipulation Program (GIMP; https://www.gimp.org/)</td></tr><tr><td>Zebrafish breins. W tym badaniu wykorzystano szczepy AB, TU, Tg[atoh7:RFP].</td><td></td><td></td><td>Dostępne w&nbsp; Międzynarodowe Centra Zasobów Zebra w USA (https://zebrafish.org/home/guide.php) lub w Europie (https://www.ezrc.kit.edu/). Specjalistyczne szczepy transgeniczne, które nie zostały jeszcze zdeponowane w żadnym z centrów zasobów, można zamówić w poszczególnych laboratoriach po publikacji.</td></tr></tbody></table>

usunięcie oczu u żywych larw danio pręgowanego w celu zbadania zależnego od unerwienia wzrostu i rozwoju układu wzrokowego

Eye Removal in Living Zebrafish Larvae to Examine Innervation-dependent Growth and Development of the Visual System

Danio pręgowany wykazuje niezwykłe zdolności do wzrostu i regeneracji przez całe życie. Na przykład wyspecjalizowane nisze komórek macierzystych powstałe podczas embriogenezy wspierają ciągły wzrost całego układu wzrokowego, zarówno w oku, jak i w mózgu. Skoordynowany wzrost między siatkówką a tektum nerwu wzrokowego zapewnia dokładne mapowanie siatkówki w miarę dodawania nowych neuronów w oczach i mózgu. Aby odpowiedzieć na pytanie, czy aksony siatkówki dostarczają kluczowych informacji dla regulacji zachowań tektalnych komórek macierzystych i progenitorowych, takich jak przeżycie, proliferacja i/lub różnicowanie, konieczne jest porównanie unerwionych i odnerwionych płatów tektalnych u tego samego zwierzęcia i między zwierzętami. 
Chirurgiczne usunięcie jednego oka z żywych larw danio pręgowanego, a następnie obserwacja tektum optycznego osiąga ten cel. Załączony film pokazuje, jak znieczulać larwy, elektrolitycznie ostrzyć igły wolframowe i używać ich do usunięcia jednego oka. Następnie pokazano, jak wypreparować mózgi z utrwalonych larw danio pręgowanego. Wreszcie, film zawiera przegląd protokołu immunohistochemicznego i demonstrację sposobu montowania barwionych zarodków w agarozie o niskiej temperaturze topnienia do mikroskopii.

Aby potwierdzić, czy usunięcie oka było całkowite, oraz ocenić zmiany w obrębie wzgórza optycznego, przeprowadzono zabiegi chirurgiczne u szczepu Tg[atoh7:RFP], w którym wszystkie komórki zwojowe siatkówki (RGC) są znakowane białkiem RFP skierowanym do błony, a tym samym znakowane są wszystkie aksony wychodzące z siatkówki i tworzące nerw wzrokowy24. Choć wykorzystanie tego szczepu nie jest absolutnie konieczne, umożliwia ono bezpośrednią obserwację i wizualizację zakończeń nerwu wzrokowe...

Artykuł wyjaśnia, jak chirurgicznie usunąć oczy z żywych larw danio pręgowanego, co jest pierwszym krokiem w kierunku zbadania, jak wejście siatkówki wpływa na wzrost i rozwój tektum nerwu wzrokowego. Ponadto artykuł zawiera informacje na temat znieczulenia, fiksacji i preparacji larw, a następnie immunohistochemii i obrazowania konfokalnego.

Usunięcie oczu u żywych larw danio pręgowanego w celu zbadania zależnego od unerwienia wzrostu i rozwoju układu wzrokowego

Zebrafish exhibit remarkable life-long growth and regenerative abilities. For example, specialized stem cell niches established during embryogenesis ...

Moje laboratorium jest zainteresowane zrozumieniem, w jaki sposób oko i mózg rosną razem. Ta technika pozwala nam zbadać, w jaki sposób wkład siatkówkowy wpływa na wzrost i rozwój mózgu. Chirurgiczne usunięcie jednego oka z żywej larwy danio pręgowanego, a następnie obserwacja tektum nerwu wzrokowego pozwala nam porównać unerwione i odnerwione płaty tektalne u tego samego zwierzęcia i między zwierzętami.Połączenie tej techniki z nowoczesnymi podejściami molekularnymi może dać nowy wgląd w mechanizmy leżące u podstaw rozwoju, regeneracji i degeneracji neuronów. Aby rozpocząć, podłącz przewody katody i anody do zasilania. Przymocuj zacisk krokodylkowy na końcu drutu katodowego do częściowo wyprostowanego spinacza do papieru i włóż spinacz do papieru do roztworu wodorotlenku potasu, mocując go z boku słoika.Przymocuj zacisk krokodylkowy drutu anodowego do szyjki uchwytu igły. Ustaw zasilanie na około 20 V i zanurz drut wolframowy w roztworze wodorotlenku potasu, wyciągając drut z roztworu pod kątem, aby elektrolitycznie naostrzyć drut w cienką końcówkę. Sprawdź końcówkę igły pod mikroskopem preparacyjnym, aby upewnić się, że jest wystarczająco ostra.Zakrzywiona końcówka igły powstaje, gdy ostra igła jest wygięta, delikatnie dotykając jej szalki Petriego. W dniu zabiegu użyj szklanej pipety pastwiskowej o szerokim otworze, aby przenieść od 10 do 15 larw na 35-milimetrową szalkę Petriego wypełnioną świeżym E3. Dodaj trzy do pięciu kropli środka znieczulającego do larwy. Aby ustalić, czy larwy są odpowiednio znieczulone, poszukaj braku reakcji na dotyk.Dodaj jeszcze dwie do trzech kropli środka znieczulającego, jeśli larwy nadal reagują na dotyk po trzech minutach i ponownie oceń. Aby unieruchomić larwę do operacji, należy umieścić jedną larwę w szklanej pipecie pastwiskowej o wąskim otworze, zawierającej tylko niewielką ilość E3. Następnie należy pobrać około 200 mikrolitrów stopionej 1% agarozy o niskiej temperaturze topnienia lub LMP do pipety zawierającej larwę i wymieszać, aby upewnić się, że larwa jest zawieszona w agarozie LMP. Umieść pokrywkę 35-milimetrowej szalki Petriego skierowaną do góry pod mikroskopem preparacyjnym, a następnie wypryskaj larwę i agarozę na odwróconą pokrywę szalki Petriego.Rozłóż agarozę tak, aby larwa znajdowała się w środku kropli. Za pomocą igły wolframowej szybko, ale delikatnie manewruj larwą tak, aby była boczna z jednym okiem skierowanym do góry. Poczekaj kilka minut, aż agaroza stężeje.Podążając za krawędzią oczodołu, użyj końcówki cienkiej, elektrolitycznie zaostrzonej igły wolframowej, aby przekłuć skórę wokół oka. Następnie wsunąć krawędź igły pod oko od skroniowo-brzusznej strony oka. Użyj kontrolowanego nacisku, aby uwolnić oko z oczodołu.Naciskaj oko grzbietowo i przednią stroną igły, ostatecznie przecinając nerw wzrokowy i uwalniając oko. Alternatywnie możesz użyć bardzo cienkich kleszczy chirurgicznych do usunięcia oka, ściskając nerw wzrokowy i popychając oko z przyśrodkowego na boczny. Po udanym usunięciu oka przykryj agarozę roztworem MMR, uwolnij każdą larwę z agarozy, delikatnie przesuwając igłą wolframową wokół głowy, a następnie wokół ciała, jednocześnie stabilizując pokrywkę szalki Petriego za pomocą kleszczy.Po operacjach umieść larwę w roztworze MMR uzupełnionym antybiotykami do następnego dnia, a następnie zwróć larwę do E3 i hoduj ją do punktu końcowego eksperymentu. Po ostatecznym znieczuleniu larw utrwalij je 4% paraformaldehydem. Zawieś utrwalone larwy w kropelkach PBS na płytce uszczelniającej pod mikroskopem preparacyjnym.Zabezpiecz je bocznie, umieszczając dwie szpilki wolframowe przez strunę grzbietową, z których jedna powinna znajdować się z tyłu pigmentowanego obszaru pokrywającego obszar AGM, a druga w linii z końcem przedłużenia żółtka. Usuń oko za pomocą ostrej igły wolframowej i cienkich kleszczyków. Czasami możliwe jest wbicie igły przez szczękę w przeciwną stronę i usunięcie drugiego oka.Użyj igły wolframowej, aby podrapać od skroniowej do brzusznej strony ucha. Wykonując tę samą czynność w ruchu, przyłóż igłę do tyłu szczęki i delikatnie pociągnij do przodu, aż ucho i szczęka zostaną usunięte. Usuń drugie oko i ucho, wbijając igłę w szczękę.Użyj kleszczy, aby wyciągnąć narządy brzuszne i pozostałe żółtko. Na koniec wykonaj płytkie nacięcie w grzbietowej skórze czaszki w pobliżu połączenia tylnego mózgu z rdzeniem kręgowym. Podnieś skórę kleszczami i pociągnij ją do przodu i wokół kresomózgowia.Usuń pozostałą tkankę za pomocą kleszczy. Odpiąć larwę i przenieść do PBS do 1,5-mililitrowej probówki wirówkowej. Zamocuj szkiełko z komorą w pokrywie 100-milimetrowej szalki Petriego za pomocą smaru próżniowego.Przenieś wybarwioną immunologicznie i przetworzoną larwę na płytkę studzienkową lub szkiełko wgłębieniowe, aby wyświetlić je pod mikroskopem preparacyjnym. Zamontuj larwę na szkiełku komorowym w kolumnach agarozowych 1% LMP. Używając szklanki obok pipety, umieść jedną larwę na szkiełku komorowym, osadzając jak najmniej PBS.Przykryj larwę stopioną i ciepłą agarozą 1% LMP za pomocą tej samej pipety. Pipetować agarozę LMP do kolumny, a następnie ustawić larwę tak symetrycznie, jak to możliwe, z widoczną powierzchnią grzbietową. Po usunięciu oka obserwowano postępujące zwyrodnienia aksonów siatkówki w tektum nerwu wzrokowego neuropil.Dwa dni po operacji aksony oznaczone RFP wykazywały cechy szybkiego zwyrodnienia Wallera, takie jak blabbing i fragmentacja. Dodatnie punkty RFP odnotowano zarówno wewnątrz, jak i na zewnątrz neuropilu po prawej stronie tectum, jak wskazano strzałkami. W ciągu czterech dni po operacji fragmentaryczne aksony i szczątki aksonów oznaczone RFP zostały znacznie zmniejszone w prawym płacie tektalnym, co wskazuje na stosunkowo szybki klirens umierających i degenerujących się aksonów.Mózg odsłonięto poprzez preparację oczu, szczęki, uszu i jarmułki skóry i tkanek łącznych. Idealnie byłoby, gdyby mózg pozostał nienaruszony podczas tej procedury. Jednak części przedniej części mózgu, zwłaszcza opuszka węchowa, zostały prawdopodobnie uszkodzone lub całkowicie usunięte po usunięciu osłonki czaszki ze skóry lub szczęki.Co więcej, czasami boczna półka tectum zostaje przecięta podczas przekłuwania lub szczypania skóry, aby ściągnąć ją z mózgu. Nie ma dwóch identycznych próbek. Musisz więc być w stanie dokonać subtelnych adaptacji poprzez usunięcie oka i sekcję mózgu, jeśli zajdzie taka potrzeba.Pacjenci i ostre narzędzia są niezbędne do osiągnięcia sukcesu. Technika ta może być kontynuowana za pomocą podejść komórkowych i molekularnych, takich jak obrazowanie żywych komórek in vivo lub sekwencjonowanie RNA, aby uzyskać nowy wgląd w molekularne i komórkowe mechanizmy wzrostu i rozwoju tektum nerwu wzrokowego.

eye-removal-living-zebrafish-larvae-to-examine-innervation-dependent

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia rozwojowa

W tym filmie demonstrujemy metodę analizy rozwijającego się mózgu kręgowca w żywych embrionach danio pręgowanego z rozdzielczością pojedynczej komórki przy użyciu mikroskopii konfokalnej. Obejmuje ona sposób, w jaki wstrzykujemy substancje do embrionu danio pręgowanego w stadium jednej komórki, a następnie montujemy i obrazujemy rozwijający się mózg.

Obrazowanie na żywo embrionalnego mózgu rybki zebrafish przy użyciu mikroskopii konfokalnej

Rozwój soczewki wiąże się z interakcjami z innymi tkankami. Kilka mutantów oka u danio pręgowanego charakteryzuje się nienaturalnie małym rozmiarem soczewki. W niniejszym opracowaniu prezentujemy eksperyment z transplantacji soczewki, mający na celu ustalenie, czy fenotyp ten wynika z przyczyn wewnętrznych, czy z wadliwych interakcji z tkankami otaczającymi soczewkę.

Transplantacja soczewki u rybek zebrafish i jej zastosowanie w analizie mutantów oka

VisioTracker to zautomatyzowany system do ilościowej analizy sprawności wzrokowej larw i niewielkich osobników dorosłych ryb, oparty na rejestracji ruchów gałek ocznych. Charakteryzuje się on pełną kontrolą nad właściwościami bodźców wzrokowych oraz analizą w czasie rzeczywistym, co umożliwia prowadzenie wysokoprzepustowych badań w takich dziedzinach jak rozwój i funkcje układu wzrokowego, farmakologia, badania obwodów neuronalnych oraz integracja sensoromotoryczna.

VisioTracker, innowacyjne zautomatyzowane podejście do analizy okulomotorycznej

Źródło: Schramm, P. et al. Obrazowanie in vivo w pełni aktywnej tkanki mózgowej u wybudzonych larw danio pręgowanego i osobników młodocianych poprzez usunięcie czaszki i skóry. J. Vis. Exp. (2021)Ten film pokazuje obrazowanie in vivo neuronów móżdżku u transgenicznych larw danio pręgowanego, które wyrażają białka fluorescencyjne w neuronach Purkinjego. Proces polega na znieczuleniu larw, unieruchomieniu ich w agarozie i ostrożnym usunięciu pigmentowanej skóry w celu zwiększenia penetracji...

Obrazowanie in vivo mózgu larw danio pręgowanego w celu wizualizacji neuronów móżdżku

Prezentujemy metodę analizy elektroretinograficznej (ERG) larw danio pręgowanego z wykorzystaniem technik mikromanipulacji i elektroretinografii. Jest to prosta i nieskomplikowana metoda oznaczania funkcji wzrokowych larw danio pręgowanego in vivo.

Elektroretinogram Analiza odpowiedzi wzrokowej u larw danio pręgowanego

Mikroskopia fluorescencyjna z lekkim arkuszem jest doskonałym narzędziem do obrazowania rozwoju embrionalnego. Pozwala na nagrywanie długich filmów poklatkowych żywych zarodków w warunkach zbliżonych do fizjologicznych. Demonstrujemy jego zastosowanie do obrazowania rozwoju oka danio pręgowanego w szerokich skalach czasoprzestrzennych i przedstawiamy potok do fuzji i dekonwolucji zestawów danych multiview.

Wykorzystanie mikroskopii fluorescencyjnej arkuszy świetlnych do obrazowania rozwoju oka danio pręgowanego

Kombinacja zaawansowanych technik optycznych laserowej mikroskopii skaningowej z wzbudzeniem fluorescencji wielofotonowej o długich falach została zaimplementowana do przechwytywania wysokiej rozdzielczości, trójwymiarowego obrazowania w czasie rzeczywistym migracji grzebieni nerwowych w zarodkach zebry pręgowanego Tg(sox10:EGFP) i Tg(foxd3:GFP).

Wielofotonowe obrazowanie poklatkowe w celu wizualizacji rozwoju w czasie rzeczywistym: wizualizacja migrujących komórek grzebienia nerwowego w zarodkach danio pręgowanego

Tutaj prezentujemy protokół, który upraszcza pomiar odpowiedzi elektroretinogramu wywołanego światłem od larw danio pręgowanego. Nowatorska elektroda w kształcie stożka z końcówką gąbki może pomóc w łatwiejszym do osiągnięcia badaniu rozwoju wzrokowego u larw danio pręgowanego za pomocą elektroretinogramu ERG, zapewniając wiarygodne wyniki i obniżając koszty.

Zapis elektroretinogramu u larw danio pręgowanego przy użyciu nowatorskiej elektrody gąbczastej w kształcie stożka

Ten protokół opisuje podejście do etykietowania in toto i wielowymiarowego obrazowania wczesnego rozwoju oczu danio pręgowanego. Opisujemy znakowanie, osadzanie i obrazowanie czterowymiarowe (4D) za pomocą laserowej skaningowej mikroskopii konfokalnej oraz rozważania dotyczące optymalizacji pozyskiwania zestawów danych do analizy mechanizmów morfogenezy panewki wzrokowej.

4-wymiarowe obrazowanie morfogenezy kubka wzrokowego danio pręgowanego

Tutaj prezentujemy metodę obrazowania embrionalnego mózgu danio pręgowanego in vivo, aż do stadium larwalnego i młodocianego. Ta mikroinwazyjna procedura, zaadaptowana z podejść elektrofizjologicznych, zapewnia dostęp do szczegółów komórkowych i subkomórkowych dojrzałego neuronu i może być połączona z badaniami optogenetycznymi i neurofarmakologicznymi w celu scharakteryzowania funkcji mózgu i interwencji farmakologicznej.

Obrazowanie in vivo w pełni aktywnej tkanki mózgowej u wybudzonych larw i osobników młodocianych danio pręgowanego poprzez usunięcie czaszki i skóry

Tutaj dostępny jest protokół do obrazowania poklatkowego morfogenezy oka za pomocą dostępnego na rynku mikroskopu lightsheet i stacji roboczej do przetwarzania obrazu w celu analizy uzyskanych danych. Protokół ten szczegółowo opisuje procedury znieczulenia zarodka, zatopienia w agarozie o niskiej temperaturze topnienia, zawieszenia w komorze obrazowania, ustawienia parametrów obrazowania i wreszcie analizy danych obrazowania za pomocą oprogramowania do analizy obrazu.

Wizualizacja morfogenezy oka za pomocą mikroskopii Lightsheet przy użyciu transgenicznego danio pręgowanego rx3:GFP

Poznaj metodę jednostronnego usunięcia oka u larw Danio rerio w celu badania wpływu wejścia siatkówkowego na rozwój wzgórza wzrokowego. Protokół umożliwia porównanie unerwionych i zdenerwowanych płatów w tym samym zwierzęciu.

Usunięcie oczu u żywych larw danio pręgowanego w celu zbadania zależnego od unerwienia wzrostu i rozwoju układu wzrokowego

Przeglądaj więcej filmów