Izolacja pierwotnego mikrogleju myszy przez sortowanie komórek aktywowanych magnetycznie w zwierzęcych modelach demielinizacji
5 kwietnia 2022
Tutaj prezentujemy protokół izolacji i oczyszczania pierwotnego mikrogleju w zwierzęcych modelach chorób demielinizacyjnych, wykorzystując kolumnowe sortowanie komórek aktywowane magnetycznie.
Protokół ten pomaga wyizolować mikroglej z mikrowypreparowanych zmian demielinizacyjnych w mózgu dorosłej myszy w celu zbadania cech mikrogleju in vivo. Ta technika oszczędza czas i ma mniejsze wymagania zarówno dla eksperymentatorów, jak i sprzętu. Metoda ta pomaga wyizolować mikroglej z mózgu zwierzęcia, zwłaszcza tych mikrowypreparowanych tkanek w różnych stanach chorobowych.
Rozpocznij od mikrowypreparowania zmian oznaczonych neutralnym barwnikiem wokół ciała modzelowatego pod mikroskopem stereoskopowym. Odwirować wypreparowaną tkankę 300 razy g przez 30 sekund, aby pobrać próbkę na dno probówki. Podgrzej mieszankę enzymatyczną jeden i mieszankę enzymów dwie do 37 stopni Celsjusza w inkubatorze.
Następnie dodaj 1 950 mikrolitrów podgrzanego enzymu, wymieszaj jedną do jednej próbki i traw w inkubatorze w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez pięć minut. Dodaj 30 mikrolitrów podgrzanego enzymu, wymieszaj dwa i delikatnie wymieszaj. Po strawieniu dodaj cztery mililitry zimnego PBS do probówki i delikatnie wstrząśnij.
Odwirować próbki tkanek w temperaturze 300 razy g przez 10 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza i powoli i całkowicie odsysać supernatant. Delikatnie zawiesić osad komórkowy za pomocą 1 550 mikrolitrów zimnego PBS. Dodaj 450 mikrolitrów zimnego roztworu do usunięcia zanieczyszczeń i dobrze je wymieszaj.
Użyj pipety o pojemności 1 000 mikrolitrów, aby bardzo powoli i delikatnie nałożyć mieszaninę dwoma mililitrami zimnego PBS. Odwiruj mieszaninę, a następnie poszukaj trzech warstw. Użyj pipety o pojemności 1 000 mikrolitrów, aby całkowicie zassać dwie górne warstwy i napełnij probówkę do pięciu mililitrów buforem ładującym na zimno.
Delikatnie odwróć rurkę trzy razy. Następnie, po odwirowaniu i aspiracji supernatantu, ponownie zawieś osad komórkowy z 90 mikrolitrami buforu ładującego i dodaj 10 mikrolitrów kulek CD11b. Dobrze wymieszaj i inkubuj przez 15 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza.
Po inkubacji dodać jeden mililitr buforu ładującego i umyć komórki, delikatnie pipetując płyn w górę iw dół za pomocą pipety o pojemności 1 000 mikrolitrów. Odwirować komórki w temperaturze 300 razy g przez 10 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza i całkowicie odessać supernatant w celu usunięcia niezwiązanych kulek. Ponownie zawiesić komórki w 500 mikrolitrach bufora ładującego i umieścić kolumnę MS wraz z jej separatorem w celu pozytywnej selekcji w polu magnetycznym.
Przepłukać kolumnę 500 mikrolitrami buforu ładującego w celu ochrony komórek i zapewnienia wydajności sortowania magnetycznego w oparciu o protokół producenta. Nałożyć zawiesinę komórek na kolumnę MS i odrzucić przepływowy przepływ zawierający nieoznakowane komórki. Dodać 500 mikrolitrów buforu załadowczego, aby umyć kolumnę i usunąć ją z separatora.
Umieść kolumnę na 15-mililitrowej probówce wirówkowej i dodaj jeden mililitr bufora ładującego do kolumny. Na koniec popchnij tłok na dno kolumny, aby wypłukać magnetycznie oznaczone komórki. Przedstawiono tutaj schematyczne przedstawienie strategii bramkowania stosowanej w analizie cytometrii przepływowej mikrogleju wyizolowanego ze zmian demielinizacyjnych dorosłych myszy przed i po sortowaniu komórek aktywowanym magnetycznie.
Obrazy graficzne reprezentują wysokość rozproszenia do przodu i wysokość rozproszenia bocznego dla wyboru komórek, obszar rozproszenia do przodu i wysokość rozproszenia do przodu dla wyboru pojedynczych komórek oraz CD11b-FITC i CD45-APC dla wyboru komórek szpikowych i mikrogleju. Udział mikrogleju znacznie wzrósł po sortowaniu komórek aktywowanym magnetycznie. Obraz graficzny przedstawia strategię bramkowania stosowaną w analizie cytometrii przepływowej dla żywych i martwych pojedynczych komórek po sortowaniu komórek aktywowanych magnetycznie.
W tym przypadku do wybrania żywych komórek wykorzystano 7-aminoaktynomycynę D i wysokość rozrzutu bocznego. Przystępując do tego zabiegu należy pamiętać o precyzyjnym mikrowypreparowaniu zmian demielinizacyjnych pod mikroskopem stereoskopowym na podstawie neutralnych czerwonych oznaczeń.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejsze badanie przedstawia protokół izolacji i oczyszczania pierwotnej mikroglei z ognisk demielinizacyjnych w mózgach dorosłych myszy. Dzięki zastosowaniu kolumnowego sortowania komórek aktywowanego magnetycznie, metoda ta umożliwia badanie charakterystyki mikroglei in vivo, optymalizując jednocześnie zapotrzebowanie na czas i zasoby.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neuronauka
- Biologia komórki
- Neuropatologia
Wstęp
- Mikroglej odgrywa kluczową rolę w procesach neurozapalnych oraz w chorobach ośrodkowego układu nerwowego.
- Zrozumienie funkcji tych komórek w stanach demielinizacyjnych jest niezbędne dla poznania mechanizmów rozwoju chorób.
- Skuteczne techniki izolacji są wymagane do badania mikrogleju charakteryzującego się specyficznymi stanami patologicznymi.
- Przedstawiona metoda koncentruje się na zwiększeniu wydajności izolacji tych komórek.
Cel badania
- Opracowanie niezawodnego protokołu izolacji mikrogleju z wybranych obszarów mózgu.
- Ułatwienie badania zachowania mikrogleju oraz jego roli w kontekście chorób demielinizacyjnych.
- Optymalizacja wykorzystania zasobów podczas procesu izolacji.
Zastosowane metody
- Mikrosekcja tkanki z ognisk demielinizacji pod stereomikroskopem.
- Wykorzystanie kolumnowego sortowania komórek aktywowanego magnetycznie do izolacji mikrogleju.
- Procedura obejmuje trawienie tkanki, wirowanie oraz delikatne resuspensowanie w celu efektywnej izolacji komórek.
- Kluczowe etapy obejmują przygotowanie enzymów, wielokrotne sekwencje wirowania oraz ostrożne obchodzenie się z próbkami mikrogleju.
Główne wyniki
- Protokół ten znacząco zwiększa proporcję izolowanych mikroglejów.
- Analiza cytometryczna potwierdziła skuteczne sortowanie komórek mieloidalnych oraz specyficzną identyfikację mikroglejów.
- W celu oceny żywotności komórek i potwierdzenia prawidłowego sortowania przeprowadzono barwienie żywe-martwe.
- Metoda ta umożliwia bardziej kompleksowe zrozumienie odpowiedzi mikroglejów w warunkach demielinizacyjnych.
Wnioski
- Niniejsze badanie przedstawia skuteczną metodę izolacji mikrogleju, co ułatwi przyszłe badania nad jego rolą w chorobach neurologicznych.
- Technika izolacji przyczynia się do poszerzenia wiedzy na temat zachowania mikrogleju in vivo, co czyni ją przydatną w różnych modelach chorób.
- Niniejszy protokół może usprawnić badania ukierunkowane na interwencje terapeutyczne celujące w funkcje mikrogleju w chorobach neurodegeneracyjnych.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Wydajna izolacja pierwotnych mikroglejów z tkanki mózgu myszy poddanej demielinizacji umożliwia precyzyjne badanie wrodzonych odpowiedzi immunologicznych w modelach OUN istotnych dla przebiegu chorób. Możliwość ta wspiera ograniczanie ryzyka mechanistycznego oraz walidację celów terapeutycznych w ramach programów badawczych nad chorobami neurozapalnymi i demielinizacyjnymi. Preparaty mikrogleju o wysokiej czystości zapewniają ciągłość translacyjną od etapu odkryć po badania przedkliniczne w portfolio neuroimmunologii.
Zastosowania strategiczne w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Umożliwia badanie stanów aktywacji mikrogleju oraz heterogeniczności fenotypowej w tkankach OUN istotnych dla przebiegu choroby.
- Wspiera funkcjonalną walidację celów terapeutycznych poprzez zachowanie charakterystyki molekularnej mikrogleju z ognisk patologicznych.
- Ułatwia ograniczanie ryzyka mechanistycznego w przypadku celów neurozapalnych poprzez izolację komórek pierwotnych z modeli in vivo.
Przesiewy i opracowanie testów
- Zapewnia zwalidowane pierwotne mikrogleje do dalszych analiz funkcjonalnych i screeningu związków.
- Poprawia powtarzalność i standaryzację testów poprzez dostarczanie wysokiej czystości i żywotnych populacji komórek.
- Umożliwia ilościowe odczyty z cytometrii przepływowej w celu oceny tożsamości i żywotności komórek, co wspiera opracowanie wiarygodnych testów.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Jest zgodne z modelami istotnymi dla danej choroby w celu translacyjnego odkrywania biomarkerów w stanach demielinizacyjnych.
- Zapewnia ciągłość od etapu odkryć in vivo do walidacji przedklinicznej poprzez zachowanie molekularnych profili mikrogleju.
- Wspiera decyzje o rozwoju projektu w oparciu o analizę ryzyka, umożliwiając bezpośrednie badanie odpowiedzi mikrogleju w patologicznych środowiskach OUN.
Integracja potoku i przepływu pracy
Niniejszy protokół wpisuje się w continuum badań od etapu odkryć do fazy przedklinicznej w zakresie chorób neurozapalnych i demielinizacyjnych.
- Biologia odkrywcza: Wspiera testowanie hipotez dotyczących aktywacji i heterogeniczności mikrogleju w zmianach OUN.
- Screening: Dostarcza powtarzalne, wysokoczyste populacje mikrogleju do analiz funkcjonalnych i fenotypowych.
- Analityka: Umożliwia ilościową analizę cytometryczną toku w celu oceny tożsamości komórek, ich żywotności oraz przesunięć populacyjnych.
- Badania translacyjne: Zachowuje istotne dla przebiegu choroby cechy molekularne na potrzeby badań nad biomarkerami i mechanizmami.
- Zastosowania w skali przedsiębiorstwa: Ustanawia zestandaryzowany schemat izolacji pierwotnych komórek odpornościowych OUN w różnych modelach.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorczy
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność prognostyczną w walidacji celów neuroimmunologicznych i badaniach mechanistycznych.
- Wartość operacyjna: Usprawnia izolację komórek, obniżając wymagania dotyczące sprzętu i specjalistycznej wiedzy.
- Wartość strategiczna: Poprawia jakość decyzji go/no-go poprzez umożliwienie bezpośredniego badania pierwotnej mikroglei z modeli chorobowych.
- Wpływ na portfolio: Redukuje ryzyko biologiczne na późnych etapach i wspiera priorytetyzację dostosowaną do ryzyka w projektach badawczych nad neurozapaleniem.
Uwagi dotyczące implementacji
- Wymagana jest biegłość w mikrodyssekcji oraz w obchodzeniu się z tkanką OUN pod stereomikroskopem.
- Konieczny jest dostęp do aparatury do magnetycznej separacji komórek oraz do cytometrii przepływowej w celu walidacji.
- W celu zapewnienia powtarzalności niezbędna jest standaryzacja przetwarzania tkanek i strategii bramkowania pomiędzy zespołami.
- Możliżna jest konieczność adaptacji metody dla różnych regionów OUN lub modeli chorób w celu zachowania czystości i żywotności komórek.
- Kluczowe dla zachowania charakterystyki molekularnej jest dokładne zidentyfikowanie zmian chorobowych oraz staranna obsługa próbek.
FAQ dotyczące biofarmacji
Chapters in this video
0:04
Introduction
0:42
Mice Dissection and Tissue Dissociation
1:35
Debris Removal and Magnetic Separation of Microglial Cells
3:26
Results: Gating Strategy Used in Flow Cytometry Analysis Before and After MACS and Gating Strategy for Living/Dead Single Cells After MACS
4:27
Conclusion
