Izolacja pierwotnego mikrogleju myszy przez sortowanie komórek aktywowanych magnetycznie w zwierzęcych modelach demielinizacji
April 5th, 2022
Tutaj prezentujemy protokół izolacji i oczyszczania pierwotnego mikrogleju w zwierzęcych modelach chorób demielinizacyjnych, wykorzystując kolumnowe sortowanie komórek aktywowane magnetycznie.
Protokół ten pomaga wyizolować mikroglej z mikrowypreparowanych zmian demielinizacyjnych w mózgu dorosłej myszy w celu zbadania cech mikrogleju in vivo. Ta technika oszczędza czas i ma mniejsze wymagania zarówno dla eksperymentatorów, jak i sprzętu. Metoda ta pomaga wyizolować mikroglej z mózgu zwierzęcia, zwłaszcza tych mikrowypreparowanych tkanek w różnych stanach chorobowych.
Rozpocznij od mikrowypreparowania zmian oznaczonych neutralnym barwnikiem wokół ciała modzelowatego pod mikroskopem stereoskopowym. Odwirować wypreparowaną tkankę 300 razy g przez 30 sekund, aby pobrać próbkę na dno probówki. Podgrzej mieszankę enzymatyczną jeden i mieszankę enzymów dwie do 37 stopni Celsjusza w inkubatorze.
Następnie dodaj 1 950 mikrolitrów podgrzanego enzymu, wymieszaj jedną do jednej próbki i traw w inkubatorze w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez pięć minut. Dodaj 30 mikrolitrów podgrzanego enzymu, wymieszaj dwa i delikatnie wymieszaj. Po strawieniu dodaj cztery mililitry zimnego PBS do probówki i delikatnie wstrząśnij.
Odwirować próbki tkanek w temperaturze 300 razy g przez 10 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza i powoli i całkowicie odsysać supernatant. Delikatnie zawiesić osad komórkowy za pomocą 1 550 mikrolitrów zimnego PBS. Dodaj 450 mikrolitrów zimnego roztworu do usunięcia zanieczyszczeń i dobrze je wymieszaj.
Użyj pipety o pojemności 1 000 mikrolitrów, aby bardzo powoli i delikatnie nałożyć mieszaninę dwoma mililitrami zimnego PBS. Odwiruj mieszaninę, a następnie poszukaj trzech warstw. Użyj pipety o pojemności 1 000 mikrolitrów, aby całkowicie zassać dwie górne warstwy i napełnij probówkę do pięciu mililitrów buforem ładującym na zimno.
Delikatnie odwróć rurkę trzy razy. Następnie, po odwirowaniu i aspiracji supernatantu, ponownie zawieś osad komórkowy z 90 mikrolitrami buforu ładującego i dodaj 10 mikrolitrów kulek CD11b. Dobrze wymieszaj i inkubuj przez 15 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza.
Po inkubacji dodać jeden mililitr buforu ładującego i umyć komórki, delikatnie pipetując płyn w górę iw dół za pomocą pipety o pojemności 1 000 mikrolitrów. Odwirować komórki w temperaturze 300 razy g przez 10 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza i całkowicie odessać supernatant w celu usunięcia niezwiązanych kulek. Ponownie zawiesić komórki w 500 mikrolitrach bufora ładującego i umieścić kolumnę MS wraz z jej separatorem w celu pozytywnej selekcji w polu magnetycznym.
Przepłukać kolumnę 500 mikrolitrami buforu ładującego w celu ochrony komórek i zapewnienia wydajności sortowania magnetycznego w oparciu o protokół producenta. Nałożyć zawiesinę komórek na kolumnę MS i odrzucić przepływowy przepływ zawierający nieoznakowane komórki. Dodać 500 mikrolitrów buforu załadowczego, aby umyć kolumnę i usunąć ją z separatora.
Umieść kolumnę na 15-mililitrowej probówce wirówkowej i dodaj jeden mililitr bufora ładującego do kolumny. Na koniec popchnij tłok na dno kolumny, aby wypłukać magnetycznie oznaczone komórki. Przedstawiono tutaj schematyczne przedstawienie strategii bramkowania stosowanej w analizie cytometrii przepływowej mikrogleju wyizolowanego ze zmian demielinizacyjnych dorosłych myszy przed i po sortowaniu komórek aktywowanym magnetycznie.
Obrazy graficzne reprezentują wysokość rozproszenia do przodu i wysokość rozproszenia bocznego dla wyboru komórek, obszar rozproszenia do przodu i wysokość rozproszenia do przodu dla wyboru pojedynczych komórek oraz CD11b-FITC i CD45-APC dla wyboru komórek szpikowych i mikrogleju. Udział mikrogleju znacznie wzrósł po sortowaniu komórek aktywowanym magnetycznie. Obraz graficzny przedstawia strategię bramkowania stosowaną w analizie cytometrii przepływowej dla żywych i martwych pojedynczych komórek po sortowaniu komórek aktywowanych magnetycznie.
W tym przypadku do wybrania żywych komórek wykorzystano 7-aminoaktynomycynę D i wysokość rozrzutu bocznego. Przystępując do tego zabiegu należy pamiętać o precyzyjnym mikrowypreparowaniu zmian demielinizacyjnych pod mikroskopem stereoskopowym na podstawie neutralnych czerwonych oznaczeń.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Przegląd
To badanie przedstawia protokół izolacji i oczyszczania pierwotnych mikrogleju z ognisk demielinizacji w mózgach dorosłych myszy. Metoda ta wykorzystuje kolumnową selekcję komórek aktywowanych magnetycznie, ułatwiając badanie właściwości mikrogleju in vivo, jednocześnie optymalizując wymagania czasowe i zasobowe.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neuronauki
- Biologia komórki
- Neuropatologia
Tło
- Mikroglej odgrywa krytyczne role w neurozapaleniu i chorobach układu nerwowego.
- Zrozumienie ich funkcji w warunkach demielinizujących jest niezbędne do zrozumienia mechanizmów chorobowych.
- Potrzebne są skuteczne techniki izolacji do badania mikrogleju charakteryzującego się określonymi stanami patologicznymi.
- Przedstawiona metoda koncentruje się na poprawie wydajności izolacji tych komórek.
Cel badania
- Opracowanie niezawodnego protokołu izolacji mikrogleju z określonych obszarów mózgu.
- Ułatwienie badania zachowania mikrogleju i ich ról w kontekście chorób demielinizujących.
- Optymalizacja wykorzystania zasobów podczas procesu izolacji.
Stosowane metody
- Mikrodyseksja tkanki z ognisk demielinizacji pod stereomikroskopem.
- Wykorzystanie kolumnowej selekcji komórek aktywowanych magnetycznie do izolacji mikrogleju.
- Kroki obejmują trawienie tkanki, wirowanie i delikatne ponowne zawieszenie w celu efektywnej izolacji komórek.
- Kluczowe kroki obejmują przygotowanie enzymów, wielokrotne sekwencje wirowania i ostrożne postępowanie z próbkami mikrogleju.
Główne wyniki
- Protokół znacząco poprawia proporcję izolowanego mikrogleju.
- Analiza cytometrii przepływowej wykazała pomyślne sortowanie komórek mieloidalnych i szczegółową identyfikację mikrogleju.
- Wykonano barwienie komórek żywych i martwych, aby ocenić żywotność komórek i potwierdzić pomyślne sortowanie.
- Metoda umożliwia bardziej kompleksowe zrozumienie odpowiedzi mikrogleju w warunkach demielinizujących.
Wnioski
- To badanie pokazuje efektywną metodę izolacji mikrogleju, ułatwiając przyszłe badania nad ich rolą w chorobach neurologicznych.
- Technika izolacji przyczynia się do poszerzenia wiedzy na temat zachowania mikrogleju in vivo, czyniąc ją stosowną dla różnych modeli chorobowych.
- Ten protokół może poprawić badania ukierunkowane na interwencje terapeutyczne ukierunkowane na funkcjonowanie mikrogleju w chorobach neurodegeneracyjnych.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
Efficient isolation of primary microglia from demyelinated mouse brain tissue enables precise investigation of innate immune responses in disease-relevant CNS models. This capability supports mechanistic de-risking and target validation for neuroinflammatory and demyelinating disease pipelines. High-purity microglial preparations facilitate translational continuity from discovery through preclinical research in neuroimmunology portfolios.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables interrogation of microglial activation states and phenotypic heterogeneity in disease-relevant CNS tissue.
- Supports functional target validation by preserving molecular characteristics of microglia from pathological lesions.
- Facilitates mechanistic de-risking for neuroinflammatory targets by isolating primary cells from in vivo models.
Screening & Assay Development
- Provides validated primary microglia for downstream functional assays and compound screening.
- Improves assay reproducibility and standardization by delivering high-purity, viable cell populations.
- Enables quantitative flow cytometry readouts for cell identity and viability, supporting robust assay development.
Translational & Preclinical Research
- Aligns with disease-relevant models for translational biomarker discovery in demyelinating conditions.
- Maintains continuity from in vivo discovery to preclinical validation by preserving microglial molecular profiles.
- Supports risk-adjusted advancement decisions by enabling direct study of microglial responses in pathological CNS environments.
Pipeline & Workflow Integration
This protocol integrates into the discovery-to-preclinical continuum for neuroinflammatory and demyelinating disease research.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing on microglial activation and heterogeneity in CNS lesions.
- Screening: Delivers reproducible, high-purity microglia for functional and phenotypic assays.
- Analytics: Enables quantitative flow cytometry analysis of cell identity, viability, and population shifts.
- Translational Research: Preserves disease-relevant molecular features for biomarker and mechanistic studies.
- Enterprise Reuse: Establishes a standardized workflow for isolating primary CNS immune cells across models.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in neuroimmune target validation and mechanistic studies.
- Operational Value: Streamlines cell isolation with lower equipment and expertise requirements.
- Strategic Value: Enhances go/no-go decision quality by enabling direct study of primary microglia from disease models.
- Portfolio Impact: Reduces late-stage biological risk and supports risk-adjusted prioritization in neuroinflammation pipelines.
Implementation Considerations
- Requires proficiency in microdissection and handling of CNS tissue under a stereomicroscope.
- Needs access to magnetic-activated cell sorting instrumentation and flow cytometry for validation.
- Demands cross-team standardization of tissue processing and gating strategies for reproducibility.
- Adaptation may be needed for different CNS regions or disease models to maintain cell purity and viability.
- Careful lesion identification and sample handling are critical to preserve molecular characteristics.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:04
Introduction
0:42
Mice Dissection and Tissue Dissociation
1:35
Debris Removal and Magnetic Separation of Microglial Cells
3:26
Results: Gating Strategy Used in Flow Cytometry Analysis Before and After MACS and Gating Strategy for Living/Dead Single Cells After MACS
4:27
Conclusion
