Wykrywanie i wychwytywanie w czasie rzeczywistym inwazyjnych subpopulacji komórek z kokultur

Technika ta umożliwia identyfikację komórek o różnych zdolnościach inwazyjnych pod wpływem czynników wydzielanych z hodowanych komórek zrębu. Technika ta ocenia wpływ czynników wydzielanych z hodowanych komórek zrębowych lub odpornościowych na inwazję komórek. Umożliwia również odtworzenie i analizę inwazyjnych subpopulacji komórek obecnych w heterogenicznych mieszankach komórkowych.

Technika ta może określić, które nowotwory zawierają inwazyjne subpopulacje komórek, które prowadzą do przerzutów. Przechwytywanie i analiza inwazyjnych komórek nowotworowych może pomóc w podejmowaniu decyzji dotyczących terapii. Aby rozpocząć hodowlę komórkową, przemyj przylegające kultury komórkowe o około 70% zbiegu solą fizjologiczną buforowaną 1X.

Następnie dodaj 0,05% trypsyny i roztwór EDTA, aby usunąć komórki. Zneutralizować roztwór trypsyny pożywką do hodowli komórkowych zawierającą surowicę i policzyć komórki, używając podwielokrotności zawiesiny komórkowej. Umieść wszystkie trzy sterylne komory w kapturze do hodowli tkankowych.

Zlokalizuj pokrętło na krótszym boku dolnej komory i ustaw dolną komorę tak, aby pokrętło było skierowane w stronę eksperymentatora. Dodaj 30 000 do 50 000 komórek w 90 mikrolitrach pożywki do każdej studzienki z dolnej komory, nie tworząc żadnych pęcherzyków. Użyć 5% pożywki uzupełnionej płodową surowicą bydlęcą w dwóch dolnych komorach jako pozytywnej kontroli ruchliwości komórek i użyć 0% pożywki uzupełnionej surowicą jako kontroli negatywnej.

Obróć dolną komorę o 90 stopni po pozostawieniu jej na 10 do 15 minut w okapie. Następnie umieść środkową komorę na górze, tak aby pokrętło na dolnej komorze wsunęło się w wycięcie w środkowej komorze. Popchnij komorę pionowo w dół, aż usłyszysz kliknięcie z każdego z dłuższych boków zespołu.

Dodaj 160 mikrolitrów pożywki bez surowicy do wszystkich studzienek środkowej komory. Upewnij się, że menisk w kształcie kopuły jest widoczny po napełnieniu studzienek i umieść górną komorę z elektrodami skierowanymi w dół na środkową komorę, aby wyrównać niebieskie kropki na środkowej i górnej komorze. Dociśnij komorę pionowo w dół, aż usłyszysz kliknięcie z każdego z dłuższych boków zespołu.

Dodaj od 20 do 50 mikrolitrów pożywki bez surowicy do górnej komory. Zamontuj zestaw na dwufunkcyjnym analizatorze komórek w inkubatorze do hodowli tkankowych i odczekaj 30 minut przed pomiarem tła. Otwórz oprogramowanie analizatora komórek, a następnie wybierz podstawkę, która ma być używana, a następnie kliknij kartę wiadomości i upewnij się, że jest na niej napisane Połączenia w porządku"aby upewnić się, że matryca jest dobrze umieszczona w podstawce, a elektrody są dobrze wyrównane z czujnikami.

Kliknij na zakładkę notatek z eksperymentu i wypełnij wszystkie możliwe informacje o eksperymencie. Następnie kliknij na zakładkę układu i wypełnij opis układu tablicy. Następnie kliknij kartę harmonogramu i dodaj dwa kroki z menu kroków, krok w tle z jednym zamiataniem i krok testowy z 100 przeciągnięciami.

Po 30 minutach przebywania matrycy w inkubatorze z dwufunkcyjnym analizatorem komórek, kliknij przycisk odtwarzania, aby rozpocząć pomiar tła. Po wykonaniu pomiaru tła wyjmij matrycę z kołyski i umieść ją z powrotem w kapturze do hodowli komórkowych. Następnie dodaj od 30 000 do 50 000 komórek w 100 mikrolitrach pożywki bez surowicy do każdego dołka górnej komory.

Są to komórki, które elektroda wykryje, gdy pomyślnie przejdą przez membranę. Pozostaw zespół w okapie na 30 minut przed zamontowaniem na dwufunkcyjnym analizatorze ogniw do pomiaru impedancji. Umieść tablicę z powrotem w analizatorze komórek o podwójnym przeznaczeniu i sprawdź, czy na karcie wiadomości znajduje się komunikat Połączenia w porządku".

Kliknij przycisk odtwarzania, aby rozpocząć pomiar impedancji, a następnie kliknij zakładkę wykresu, aby monitorować postęp sygnału. Jeśli punkt końcowy zostanie osiągnięty przed 25 godzinami, kliknij krok przerwania z menu rozwijanego wykonywania. Aby wyeksportować dane, kliknij wykres prawym przyciskiem myszy, wybierz polecenie kopiuj w formacie listy, a następnie wklej dane do arkusza kalkulacyjnego.

Monitoruj szybkość migracji w czasie rzeczywistym na dwufunkcyjnym analizatorze komórek, aby określić punkt zatrzymania. Po osiągnięciu tego celu należy zdemontować zestaw z dwufunkcyjnego analizatora komórek i umieścić go w kapturze do hodowli tkankowych. Przygotuj odpowiednią liczbę 1,5 mililitra probówek do mikrowirówek, aby zebrać komórki z interesujących Cię studzienek.

Umieść zespół w 10-centymetrowym naczyniu, aby pomieścić płyny po odłączeniu komór. Wciśnij elastyczne zatrzaskowe końce na dłuższym boku środkowej komory do środka, aż usłyszysz kliknięcie, a następnie zdemontuj górną komorę i odwróć ją do nowej 10-centymetrowej naczynia. Użyj podnośnika do komórek z 13-milimetrowym ostrzem, aby zebrać komórki ze wszystkich studni, w których występują te same warunki eksperymentalne.

Opłucz lub zanurz ostrze w 1X buforowanym fosforanem soli fizjologicznej, aby zebrać komórki w 1,5-mililitrowych probówkach do mikrowirówek. Następnie wiruj komórki w temperaturze 500 razy G przez pięć minut i rozmnażaj te zebrane komórki lub przeprowadź analizę punktów końcowych, taką jak sekwencjonowanie RNA pojedynczej komórki. Ocena inwazji komórek w obecności lub braku komórek zrębu wykazała, że inwazja komórek MDA-MB-231 była wzmocniona, gdy napromieniowane fibroblasty szwajcarskie-3T3 szczepu J2 umieszczono w dolnej komorze w celu wymiany czynników między dwiema liniami komórkowymi.

Co ciekawe, inwazja MDA-MB-231 nasiliła się, gdy liczba komórek 3T3 J2 została podwojona. Z drugiej strony, szybkość inwazji inwazyjnego klonu komórek MCFDCIS, DCIS-Delta Four, wydaje się być hamowana przez przesłuch z komórkami 3T3 J2, co sugeruje cenne zastosowanie trzykomorowego układu do pomiaru różnych efektów zrębu. W tym przypadku fibroblasty na inwazję komórek.

Ludzkie komórki śródbłonka żyły pępowinowej były bardziej inwazyjne w odpowiedzi na czynniki wydzielane przez komórki MDA-MB-231, w przeciwieństwie do tych wydzielanych przez komórki DCIS, co jest zgodne ze zdolnością nowotworów inwazyjnych do rekrutacji komórek śródbłonka do tworzenia naczyń krwionośnych i późniejszego rozprzestrzeniania się do krążenia. Inwazja komórek ksenoprzeszczepowych pochodzących od pacjentów z górnej komory nasiliła się w odpowiedzi na współhodowane ludzkie komórki odpornościowe szpiku kostnego. Co ciekawe, obecność 2% surowicy w dolnej komorze z komórkami odpornościowymi ludzkiego szpiku kostnego była niezbędna do inwazji ksenoprzeszczepów pochodzących od pacjentów.

Studzienki mogą być pokryte macierzą zewnątrzkomórkową, aby naśladować barierę błony podstawnej. Środki terapeutyczne mogą być dodawane do pożywek w studniach w celu monitorowania ich wpływu na inwazję.