Name: Wykrywanie i wychwytywanie w czasie rzeczywistym inwazyjnych subpopulacji komórek z kokultur (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-03-30T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min
Description: Poznaj metodę wykrywania inwazyjnych subpopulacji komórek w czasie rzeczywistym przy użyciu analizy impedancji elektrycznej. Technika ta pozwala ocenić wpływ komórek mezenchymalnych i immunologicznych na inwazję nowotworową oraz pozyskać komórki do dalszych badań.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Chcielibyśmy podziękować dr Alanie Welms, Huntsman Cancer Institute, University of Utah, za dostarczenie nam ksenoprzeszczepów pochodzących od pacjentów (HCI-010). Prace te były wspierane przez granty NIH R01CA205632, R21CA226542, a częściowo przez grant od Agilent Technologies.

Badanie zostało zrecenzowane i uznane za "zwolnione" przez Institutional Review Board of Georgetown University (IRB # 2002-022). Świeżo pobrane tkanki szpiku kostnego pobrano z wyrzuconych filtrów do pobierania zdrowego ludzkiego szpiku kostnego, które zostały pozbawione elementów pozwalających na identyfikację.
1. Nowy projekt komory (<silna klasa="xfig">Rysunek 2)
<ol>
	<li>Otwórz nową dwukomorową płytkę analizatora komórek. Odłóż na bok górną komorę z elektrodami.</li>
	<li>Za pomocą frezarki ogolić 2 mm dolnych studzienek w kształcie litery U płytki analizatora komórek.</li>
	<li>Przymocuj membranę polieterosulfonową (PES) o wymiarach 2 cm x 7 cm z porami o wielkości porów 0,2 μm do dna ogolonych studzienek za pomocą kleju zabezpieczonego promieniami UV. Odczekaj 30 minut, aby upewnić się, że klej jest całkowicie utwardzony i obojętny.</li>
	<li>Za pomocą frezarki wytnij dwie podłużne szczeliny (1,5 mm x 5,6 mm) po bokach, aby zatrzasnąć się w grzbietach nowo wyprodukowanej trzeciej komory.</li>
	<li>Za pomocą frezarki utwórz trzecią komorę poliwęglanową, która odwzorowuje całkowite wymiary płytki analizatora komórek; 72 mm x 18 mm (tabela materiałów).</li>
	<li>Utwórz studzienki o głębokości 4,8 mm i średnicy 4,75 mm, aby odtworzyć 16-dołkową konstrukcję płytki analizatora komórek. Pozwala to na uzyskanie 90 μl objętości na studzienkę.</li>
	<li>Po bokach utwórz dwa trójkątne grzbiety, tak aby komora zablokowała się w oryginalnych szczelinach utworzonych w kroku 1.4. Pozioma część trójkąta wynosi 1,5 mm, pionowa 1,4 mm, a przeciwprostokątna 2,052 mm.</li>
	<li>Utwórz pokrętło na krótszym boku o średnicy 50,8 mm i wysokości 1,397 mm, aby pasowało do wycięcia oryginalnej płytki (<silna klasa = "xfig">Rysunek 2, środek).</li>
	<li>Użyj gumowej podkładki o grubości 0.9 mm do każdej studzienki, aby zapewnić uszczelnione dopasowanie.</li>
</ol>
2. Hodowla komórkowa (MDA-MB-231, DCIS, DCIS-Δ4, J2-fibroblasty)
<ol>
	<li>Przemyć przylegające kultury komórkowe (~70% konfluencji) 1x solą fizjologiczną buforowaną fosforanami (PBS).</li>
	<li>Dodaj 0,05% roztwór trypsyny-EDTA, aby usunąć komórki.</li>
	<li>Zneutralizować roztwór trypsyny pożywką do hodowli komórkowych zawierającą surowicę i policzyć komórki, używając podwielokrotności zawiesiny komórkowej. 
	UWAGA: Konkretne podłoża do hodowli komórkowych można znaleźć w Tabeli 1.</li>
</ol>
3. Dysocjacja ksenoprzeszczepu pochodząca od pacjenta
<ol>
	<li>Pokrój świeży kawałek guza (1cm2) na drobną papkę za pomocą sterylnego skalpela.</li>
	<li>Umieścić w stożkowej probówce o pojemności 50 ml z 20 ml pożywki DMEM F12 uzupełnionej 3 mg / ml trypsyny i 2 mg / ml kolagenazy.</li>
	<li>Inkubować w wytrząsarce termicznej (150 obr./min) w temperaturze 37 °C przez 20 min.</li>
	<li>Wirować probówkę o masie 500 x g przez 5 minut; usunąć supernatant.</li>
	<li>Dodać 20 μl DMEM F12 + 2% FBS, aby przepłukać komórki; wirować w temperaturze 300 x g przez 5 minut i usunąć supernatant. Powtórz pranie jeszcze dwa razy.</li>
	<li>Ponownie zawiesić w 1 ml pożywki PDX (Tabela 1), aby policzyć komórki.</li>
</ol>
4. Ekstrakcja komórek szpiku kostnego
<ol>
	<li>Przepłukać filtr zbiorczy szpiku kostnego (BM) 25 ml 1x PBS. 
	UWAGA: W tym badaniu PBS został dodany do używanego filtra zbiorczego BM ze szpitala w celu zebrania pozostałego BM w filtrze.</li>
	<li>Powoli dodaj przepłukany BM do stożkowej probówki o pojemności 50 ml z 25 ml pożywki o gradiencie gęstości, uważając, aby warstwy były jak najbardziej oddalone.</li>
	<li>Wirować z prędkością 800 x g przez 20 min w temperaturze 18 °C</li>
	<li>Odsysić górne warstwy po odwirowaniu (tłuszcz/osocze) i przenieść 5 ml białej warstwy powyżej pożywki o gradiencie gęstości, która zawiera komórki BM, do stożkowej probówki o pojemności 15 ml. 
	UWAGA: Alternatywnie, zanurz pipetę o pojemności 5 ml w górnej warstwie, aż dotknie środkowej warstwy (BM) i bardzo powoli odpipetuj środkową warstwę, nie przesuwając pipety.</li>
	<li>Napełnij stożkową probówkę o pojemności 15 ml 1x PBS (~10 ml) i wiruj z prędkością 300 x g przez 15 minut.</li>
	<li>Usunąć supernatant; pozostała biała osadka to BM.</li>
	<li>Jeśli w osadzie zaobserwuje się czerwone krwinki, dodaj 5 ml roztworu do lizy RBC (tabela materiałów) i pozostaw na 5 minut w temperaturze pokojowej (RT). Wirować w 300 x g przez 5 minut i usunąć supernatant.</li>
	<li>Dodaj 10 ml 1x PBS, aby umyć komórki, wirować w 300 x g przez 5 minut i usunąć supernatant. Powtarzać lizę RBC (krok 4.7), aż osadek stanie się biały.</li>
</ol>
5. Sadzenie i składanie komórek
<ol>
	<li>Umieść wszystkie trzy sterylne komory w kapturze do hodowli tkankowych.</li>
	<li>Znajdź pokrętło na krótszym boku dolnej komory. Ustaw dolną komorę tak, aby pokrętło było skierowane w stronę eksperymentatora.</li>
	<li>Dodaj 30 000-50 000 komórek w 90 μl pożywki do każdego dołka dolnej komory. Unikaj tworzenia się bąbelków. Są to komórki zrębowe, które dostarczą wydzielanych czynników, ale nie zostaną wykryte przez elektrody górnej komory.</li>
	<li>Stosować 5% pożywki wzbogaconej płodową surowicą bydlęcą w dwóch studzienkach dolnej komory jako pozytywną kontrolę ruchliwości komórek. Stosować pożywkę 0% uzupełnioną surowicą jako kontrolę negatywną.</li>
	<li>Pozostaw dolną komorę z komórkami na 10-15 minut w okapie, aby się uspokoiła. 
	UWAGA: Ten krok jest zalecany, jeśli komórki przylegają lub rosną w zawiesinie.</li>
	<li>Obróć dolną komorę o 90° i umieść środkową komorę na górze, tak aby pokrętło na dolnej komorze wsunęło się w wycięcie w środkowej komorze. 
	UWAGA: Pokrętło na dolnej komorze i niebieska kropka na środkowej komorze znajdują się na przeciwległych końcach zespołu.</li>
	<li>Dociśnij pionowo w dół, aż usłyszysz kliknięcie z każdego z dłuższych boków zespołu.</li>
	<li>Dodać 160 μl pożywki bez surowicy do wszystkich studzienek środkowej komory.</li>
	<li>Upewnij się, że menisk w kształcie kopuły jest widoczny po napełnieniu studzienek; w przeciwnym razie dostosuj końcową objętość w oparciu o kalibrację pipety. Unikaj tworzenia się bąbelków.</li>
	<li>Umieść górną komorę z elektrodami skierowanymi w dół na środkową komorę, upewniając się, że niebieskie kropki są wyrównane na środkowej i górnej komorze.</li>
	<li>Dociśnij pionowo w dół, aż usłyszysz kliknięcie z każdego z dłuższych boków zespołu.</li>
	<li>Do górnej komory dodać 25-50 μl podłoża bez surowicy.</li>
	<li>Zamontuj zestaw na dwufunkcyjnym analizatorze komórek w inkubatorze do hodowli tkankowych i odczekaj 30 minut przed pomiarem tła. 
	UWAGA: Ten czas jest niezbędny do zrównoważenia macierzy i może być wykorzystany do przygotowania linii komórkowych, które mają zostać dodane do górnej komory.</li>
	<li>Zmierzyć tło (patrz sekcja 6) i umieścić zestaw z powrotem w kapturze do hodowli tkankowych.</li>
	<li>Dodaj 30 000-50 000 komórek w 100 μl pożywki bez surowicy do każdego dołka górnej komory. Są to komórki, które elektroda wykryje po pomyślnej migracji przez membranę. 
	UWAGA: Aby osiągnąć maksymalną odpowiedź, zaleca się hodowlę komórek w pożywce bez surowicy lub o niskiej zawartości surowicy przez 6-18 godzin przed wykonaniem testu.</li>
	<li>Pozostaw zespół w okapie na 30 minut przed zamontowaniem na dwufunkcyjnym analizatorze ogniw do pomiaru impedancji.</li>
</ol>
6. Pomiar tła i impedancji
<ol>
	<li>Umieść macierz w podstawce w dwufunkcyjnym analizatorze komórek.</li>
	<li>Otwórz oprogramowanie analizatora komórek i wybierz podstawkę, która ma być używana.</li>
	<li>Kliknij kartę Wiadomość i upewnij się, że jest na niej napisane Połączenia OK, aby upewnić się, że matryca jest dobrze umieszczona w podstawce, a elektrody są dobrze wyrównane z czujnikami.</li>
	<li>Kliknij zakładkę Notatki z eksperymentu i podaj jak najwięcej informacji o eksperymencie.</li>
	<li>Kliknij zakładkę Układ i wypełnij opis układu tablicy.</li>
	<li>Kliknij kartę Harmonogram i dodaj dwa kroki z menu Kroki: krok w tle (jedno przeciągnięcie) i krok testowy ze 100 przebiegami - przemiatanie co 15 minut, w sumie 25 godzin.</li>
	<li>Po 30 minutach przebywania matrycy w inkubatorze z dwufunkcyjnym analizatorem komórek, kliknij przycisk Odtwórz, aby rozpocząć pomiar tła. Pojawi się okno z prośbą o wybranie folderu, w którym chcesz zapisać dane.</li>
	<li>Po wykonaniu pomiaru tła wyjmij matrycę z kołyski i umieść ją z powrotem w kapturze do hodowli komórkowych.</li>
	<li>Dodaj komórki do górnej komory zgodnie z opisem w kroku 5.13 i trzymaj zespół w kapturze do hodowli tkankowej przez 30 minut, aby komórki się ustabilizowały.</li>
	<li>Umieść tablicę z powrotem w analizatorze komórek o podwójnym przeznaczeniu i sprawdź kartę Komunikat pod kątem komunikatu Połączenia OK.</li>
	<li>Kliknij przycisk Play, aby rozpocząć pomiar impedancji.</li>
	<li>Kliknij zakładkę Wykres, aby monitorować postęp sygnału.</li>
	<li>Jeśli punkt końcowy zostanie osiągnięty przed 25 godzinami, kliknij krok Przerwij z menu rozwijanego Wykonaj.</li>
	<li>Aby wyeksportować dane, kliknij wykres prawym przyciskiem myszy, wybierz polecenie Kopiuj w formacie listy, a następnie wklej dane do arkusza kalkulacyjnego. 
	UWAGA: Dane można wyeksportować jako indeks komórki lub indeks komórki delta. Do eksportu można również wybrać informacje o wykresie i/lub układzie.</li>
</ol>
7. Oddziaływanie i kolekcja komórek
<ol>
	<li>Monitoruj szybkość migracji w czasie rzeczywistym na dwufunkcyjnym analizatorze komórek, aby określić punkt zatrzymania (6-18 godzin). 
	UWAGA: Punkt zatrzymania zależy od szybkości inwazji komórki i od tego, kiedy zostanie osiągnięty wyraźny sygnał inwazji z kontroli negatywnej.</li>
	<li>Po osiągnięciu tego celu odmontuj zestaw z dwufunkcyjnego analizatora komórek i umieść go w kapturze do hodowli tkankowych.</li>
	<li>Przygotuj odpowiednią liczbę probówek do mikrowirówek o pojemności 1,5 ml w celu zebrania komórek z interesujących nas studzienek.</li>
	<li>Umieść zestaw w naczyniu o średnicy 10 cm, aby pomieścić płyny po odłączeniu komór.</li>
	<li>Wciśnij elastyczne zatrzaskowe końce na dłuższym boku środkowej komory do środka, aż usłyszysz kliknięcie.</li>
	<li>Zdemontuj górną komorę i odwróć ją do nowego naczynia o średnicy 10 cm.</li>
	<li>Użyj podnośnika komórkowego z ostrzem 13 mm, aby zebrać komórki ze wszystkich studzienek, w których występują te same warunki eksperymentalne (tj. typ komórki, leczenie farmakologiczne itp.). 
	UWAGA: Zaprojektuj konfigurację tak, aby miała co najmniej dwie studzienki dla każdego warunku eksperymentalnego, aby osiągnąć statystycznie istotną zmianę w stosunku do kontroli ujemnych.</li>
	<li>Opłucz lub zanurz ostrze w 1x soli fizjologicznej buforowanej fosforanem, aby zebrać komórki w probówkach do mikrowirówek o pojemności 1,5 ml.</li>
	<li>Wiruj komórki w temperaturze 500 x g przez 5 minut.</li>
	<li>Rozmnażać pobrane komórki (patrz punkt 8) lub przeprowadzić analizę punktu końcowego, taką jak sekwencjonowanie RNA pojedynczej komórki 
	UWAGA: W przypadku masowego sekwencjonowania RNA należy użyć zestawu do ekstrakcji RNA o niskiej liczbie komórek.</li>
</ol>
8. 3D propagacja i pobieranie komórek
UWAGA: Ze względu na małą liczbę zebranych komórek, umieść komórki w 3D za pomocą macierzy zewnątrzkomórkowej (ECM), aby zwiększyć żywotność. To powiedziawszy, hodowla 2D jest również opcją w tym momencie, zwłaszcza jeśli użyte komórki pochodzą z ustalonych linii komórkowych.
<ol>
	<li>Rozmrozić podwielokrotność matrycy błony podstawnej w temperaturze 4 °C przez noc. Utrzymuj matrycę błony podstawnej na lodzie, aż będzie gotowa do użycia.</li>
	<li>Dodać 25 μl zimnej matrycy membrany podstawnej do osadu zebranych żywych komórek i delikatnie pipetować w górę i w dół, aby wymieszać. Unikaj tworzenia się bąbelków.</li>
	<li>Dodaj mieszaninę macierzy błony komórkowej i podstawnej na dno małego dołka do hodowli tkankowej (tj. na 96-dołkowej płytce), tworząc kopułę. Staraj się nie dotykać ścian studni. Inkubować w temperaturze 37 °C przez 20 minut, a następnie delikatnie dodawać kroplami 100 μl pożywki.</li>
	<li>Aby pobrać komórki, odessać pożywkę i dodać 100 μl dypazy do każdej studzienki.</li>
	<li>Inkubować w temperaturze pokojowej przez 10 minut, od czasu do czasu pipetując w górę i w dół.</li>
	<li>Przenieść komórki i rozpuszczoną matrycę błony podstawnej do probówki mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml. Dodać 1 ml 1x PBS, wirować w 300 x g przez 5 minut i usunąć supernatant. Powtórz pranie raz.</li>
	<li>Odessać supernatant. Podziel komórki w osadzie lub przeprowadź analizę punktu końcowego.</li>
</ol>

<ol><li>Friedl, P., Gilmour, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Collective+cell+migration+in+morphogenesis%2C+regeneration+and+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Collective cell migration in morphogenesis, regeneration and cancer.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 10 (7), 445-457 (2009).</li>
<li>Boyden, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+chemotactic+effect+of+mixtures+of+antibody+and+antigen+on+polymorphonuclear+leucocytes%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Experimental+Medicine%22%5BJournal%5D)">The chemotactic effect of mixtures of antibody and antigen on polymorphonuclear leucocytes.</a> The Journal of Experimental Medicine. 115 (3), 453-466 (1962).</li>
<li>Xu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+review+of+impedance+measurements+of+whole+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biosensors+%26+Bioelectronics%22%5BJournal%5D)">A review of impedance measurements of whole cells.</a> Biosensors & Bioelectronics. 77, 824-836 (2016).</li>
<li>Stylianou, D. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+single-chain+antibody+targeting+of+the+ligand-binding+domain+in+the+anaplastic+lymphoma+kinase+receptor%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">Effect of single-chain antibody targeting of the ligand-binding domain in the anaplastic lymphoma kinase receptor.</a> Oncogene. 28 (37), 3296-3306 (2009).</li>
<li>Abassi, Y. A., Wang, X., Xu, X. Real time electronic cell sensing system and applications for cytotoxcity profiling and compound assays. United States Patent. , 20050213374 1-88 (2013).</li>
<li>Abassi, Y. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Label-free%2C+real-time+monitoring+of+IgE-mediated+mast+cell+activation+on+microelectronic+cell+sensor+arrays%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunological+Methods%22%5BJournal%5D)">Label-free, real-time monitoring of IgE-mediated mast cell activation on microelectronic cell sensor arrays.</a> Journal of Immunological Methods. 292 (1-2), 195-205 (2004).</li>
<li>Morton, C. L., Houghton, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishment+of+human+tumor+xenografts+in+immunodeficient+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Establishment of human tumor xenografts in immunodeficient mice.</a> Nature Protocols. 2 (2), 247-250 (2007).</li>
<li>DeRose, Y. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor+grafts+derived+from+women+with+breast+cancer+authentically+reflect+tumor+pathology%2C+growth%2C+metastasis+and+disease+outcomes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Tumor grafts derived from women with breast cancer authentically reflect tumor pathology, growth, metastasis and disease outcomes.</a> Nature Medicine. 17 (11), 1514-1520 (2011).</li>
<li>Sharif, G. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+AIB1+isoform+alters+enhancer+access+and+enables+progression+of+early-stage+triple-negative+breast+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">An AIB1 isoform alters enhancer access and enables progression of early-stage triple-negative breast cancer.</a> Cancer Research. 81 (16), 4230-4241 (2021).</li>
<li>Caileau, R., Olive, M., Cruciger, Q. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+human+breast+carcinoma+cell+lines+of+metastatic+origin%3A+preliminary+characterization%5BTitle%5D)+AND+%22In+Vitro%22%5BJournal%5D)">Long-term human breast carcinoma cell lines of metastatic origin: preliminary characterization.</a> In Vitro. 14 (11), 911-915 (1978).</li>
<li>Sharif, G. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+growth+density+modulates+cancer+cell+vascular+invasion+via+Hippo+pathway+activity+and+CXCR2+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">Cell growth density modulates cancer cell vascular invasion via Hippo pathway activity and CXCR2 signaling.</a> Oncogene. 34 (48), 5879-5889 (2015).</li>
<li>Miller, F. R., Santner, S. J., Tait, L., Dawson, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MCF10DCIS.com+xenograft+model+of+human+comedo+ductal+carcinoma+in+situ%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+National+Cancer+Institute%22%5BJournal%5D)">MCF10DCIS.com xenograft model of human comedo ductal carcinoma in situ.</a> Journal of the National Cancer Institute. 92 (14), 1185-1186 (2000).</li>
<li>Winkler, J., Abisoye-Ogunniyan, A., Metcalf, K. J., zenaa, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Concepts+of+extracellular+matrix+remodelling+in+tumour+progression+and+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Concepts of extracellular matrix remodelling in tumour progression and metastasis.</a> Nature Communications. 11 (1), 1-19 (2020).</li>
<li>Nkosi, D., Sun, L., Duke, L. C., Meckes, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epstein-Barr+virus+LMP1+manipulates+the+content+and+functions+of+extracellular+vesicles+to+enhance+metastatic+potential+of+recipient+cells%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathogens%22%5BJournal%5D)">Epstein-Barr virus LMP1 manipulates the content and functions of extracellular vesicles to enhance metastatic potential of recipient cells.</a> PLoS Pathogens. 16 (12), 1009023(2020).</li>
<li>Eisenberg, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanistic+modeling+of+the+effects+of+myoferlin+on+tumor+cell+invasion%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Mechanistic modeling of the effects of myoferlin on tumor cell invasion.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (50), 20078-20083 (2011).</li>
</ol>

Uniwersytet Georgetown złożył wniosek patentowy związany z niektórymi podejściami opisanymi w tym manuskrypcie. G.M.S., A.W., L.D. i M.P są wymienieni jako wynalazcy w tej aplikacji i deklarują to jako potencjalny konflikt interesów.

Zmodyfikowaliśmy konstrukcję dwukomorowej matrycy, aby zawierała trzecią komorę do monitorowania inwazji komórek w czasie rzeczywistym w obecności komórek zrębowych. Zaobserwowaliśmy wyraźny wpływ współhodowanych fibroblastów na inwazyjne i nieinwazyjne komórki nowotworowe, co wskazuje, że macierz może być wykorzystana do rozróżnienia subpopulacji komórek rakowych, które reagują inaczej na czynniki wytwarzane przez współhodowane komórki zrębu. Macierz została również wykorzystana do monitorowania inwazji komórek śródbłon...

Inwazja komórek to ważny proces, który pozwala komórkom przekraczać bariery błony podstawnej w odpowiedzi na sygnały środowiskowe dostarczane przez komórki zrębu. Jest to kluczowy krok na kilku etapach rozwoju odpowiedzi immunologicznej, gojenia się ran, naprawy tkanek i nowotworów złośliwych, które mogą rozwijać się od miejscowych zmian do nowotworów inwazyjnych i przerzutowych1. Testy opracowane wcześnie w celu pomiaru potencjału inwazyjnego populacji komórek zazwyczaj generują pojedynczy pomiar końcowy lub wymagają wstępnego znakowania komórek inwazyjnych2. Integracja technik mikroelektroniki i mikrofluidyki jest obecnie rozwijana w celu wykrywania różnych aspektów biologii komórki, takich jak żywotność, ruch i przyczepienie, za pomocą impedancji elektrycznej żywych komórek na mikroelektrodach3,4. Pomiar impedancji pozwala na bezznacznikową, nieinwazyjną i ilościową ocenę stanu komórek3. Poniżej opisujemy trzykomorową tablicę opartą na projekcie systemu analizy komórkowej w czasie rzeczywistym (RTCA), który został opracowany przez Abassi et al.5. Trzykomorowa matryca pozwala na ocenę współhodowanych komórek pod kątem inwazji komórkowej i odzyskiwania komórek inwazyjnych w celu dodatkowych analiz lub ekspansji.
W systemie analizatora komórek, komórki przenikają przez zewnątrzkomórkową matrycę pokrytą porowatą membraną i docierają do międzypalcowej matrycy elektrod umieszczonej po przeciwnej stronie bariery. Ponieważ komórki inwazyjne z czasem nadal przyczepiają się i zajmują ten układ elektrod, impedancja elektryczna zmienia się równolegle. Obecny system składa się z 16-dołkowej płytki do inwazji i migracji komórek (CIM) z dwiema komorami. Przyrząd RTCA-DP (dual purpose) (zwany dalej analizatorem ogniw dwufunkcyjnych) zawiera czujniki do pomiaru impedancji oraz zintegrowane oprogramowanie do analizy i przetwarzania danych impedancji. Wartości impedancji na linii podstawowej zależą od siły jonowej mediów w studzienkach i zmieniają się, gdy ogniwa przyczepiają się do elektrod. Zmiany impedancji zależą od liczby ogniw, ich morfologii i stopnia, w jakim ogniwa przyczepiają się do elektrod. Pomiar studzienek z pożywką przed dodaniem komórek jest uważany za sygnał tła. Tło jest odejmowane od pomiarów impedancji po osiągnięciu równowagi z ogniwami przyczepiającymi się i rozchodzącymi na elektrodach. Niemianowany parametr stanu ogniw na elektrodzie, określany jako indeks ogniwa (CI), oblicza się w następujący sposób: CI = (impedancja po równowadze - impedancja w przypadku braku ogniw) / nominalna wartość impedancji6. Gdy porównuje się szybkości migracji różnych linii komórkowych, Delta CI może być używana do porównywania stanu komórek niezależnie od różnicy w przyłączeniu, która jest reprezentowana w pierwszych kilku pomiarach.
Nowo zaprojektowana trójkomorowa tablica bazuje na istniejącym projekcie i wykorzystuje górną komorę z dwufunkcyjnego systemu analizatora komórek, który zawiera elektrody. Zmodyfikowane komory środkowe i dolne są przystosowane do dopasowania zespołu do dwufunkcyjnego analizatora celowego do pomiaru i analizy impedancji za pomocą zintegrowanego oprogramowania. Dwa główne postępy, które nowy projekt zapewnia w stosunku do istniejącej dwukomorowej płytki CIM (zwanej odtąd płytką analizatora komórek) to: i) zdolność do odzyskiwania, a następnie analizowania inwazyjnych subpopulacji komórek, które są obecne w heterogenicznych mieszankach komórkowych oraz ii) opcja oceny wpływu czynników wydzielanych z kokulturowanych komórek zrębowych lub odpornościowych na inwazję komórek (<silna klasa = "xfig">Rysunek 1).
Ta technologia może być przydatna do badania subpopulacji komórek o różnych zdolnościach inwazyjnych. Obejmuje to a) inwazyjne komórki rakowe, które atakują otaczające tkanki lub naczynia krwionośne i limfatyczne lub wynaczyniają w miejscach wysiewu przerzutów w odległych narządach, (b) komórki układu odpornościowego, które atakują tkanki w celu zwalczania patogenów lub chorych komórek, (c) komórki śródbłonka, które atakują tkanki, tworząc nowe naczynia krwionośne podczas reorganizacji tkanek lub gojenia się ran, a także (d) komórki zrębu z mikrośrodowiska guza, które wspierają i atakują wraz z komórkami rakowymi. Podejście to pozwala na włączenie przesłuchów zrębowych, które mogą modulować ruchliwość i inwazję komórek. Przedstawione tutaj studia wykonalności wykorzystują tę zmodyfikowaną matrycę skoncentrowaną na inwazji komórek rakowych i interakcji ze zrębem jako systemie modelowym, w tym inwazji śródbłonka w odpowiedzi na zróżnicowane sygnały z komórek rakowych. Podejście to można ekstrapolować w celu wyizolowania komórek rakowych i innych typów komórek, takich jak subpopulacje komórek odpornościowych, fibroblasty lub komórki śródbłonka. Przetestowaliśmy inwazyjne i nieinwazyjne ustalone linie komórkowe raka piersi jako dowód zasadności. Wykorzystaliśmy również komórki z inwazji ksenoprzeszczepu pochodzącego od pacjenta (PDX) w odpowiedzi na komórki odpornościowe z ludzkiego szpiku kostnego, aby wykazać możliwość wykorzystania w przyszłości również w klinicznych warunkach diagnostycznych. PDX to tkanki nowotworowe pacjenta, które są wszczepiane do modelu myszy z obniżoną odpornością lub humanizowanym, aby umożliwić badanie wzrostu, progresji i opcji leczenia dla pierwotnego pacjenta7,8.

<table><tbody><tr><td>0,05% Trypsyna-EDTA</td><td>Thermofisher</td><td>25300-054</td><td></td></tr><tr><td>Klej</td><td>Norland Klej optyczny</td><td>NOA63</td><td></td></tr><tr><td>Albumina surowicy bydlęcej (BSA)</td><td>Sigma</td><td>A9418</td><td></td></tr><tr><td>Podnośnik komórek</td><td>Sarstedt</td><td>83.1832</td><td></td></tr><tr><td>Toksyna z Vibrio cholerae</td><td>Thermofisher</td><td>12585-014</td><td></td></tr><tr><td>Płytka</td> <td>CIMAgilent</td><td>5665817001</td><td>Płytka analizatora komórek</td></tr><tr><td>Kolagenaza z Clostridium histolyticum</td><td>Sigma</td><td>C0130</td><td></td></tr><tr><td>Dispase</td><td>StemCell</td><td>7913</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Thermofisher</td><td>11995-065</td><td></td></tr><tr><td>DMEM-F12</td><td>Thermofisher</td><td>11875-093</td><td></td></tr><tr><td>Płodowa surowica bydlęca (FBS), inaktywowana termicznie</td><td>Omega Scientific</td><td>FB-12</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Thermofisher</td><td>15630106</td><td></td></tr><tr><td>Surowica dla koni (HS)</td><td>Gibco</td><td>16050-122</td><td></td></tr><tr><td>Ludzki EGF</td><td>Peprotech</td><td>AF-100-15</td><td></td></tr><tr><td>Ludzkie komórki śródbłonka żyły pępowinowej (HUVEC)</td><td>LONZA (RRID:CVCL_2959)</td><td>C-2517A</td><td></td></tr><tr><td>HUVEC media</td><td>LONZA</td><td>CC-3162</td><td></td></tr><tr><td>Hydrokortyzon</td><td>Sigma</td><td>H4001</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Insulina Transferyna Selen Etanoloamina (ITSX) (100x)</td> <td>Thermofisher</td> 51500056 <td></td></tr><tr><td>Insulina, ludzka rekombinant, roztwór</td><td>Sigma</td><td>C8052</td><td></td></tr><tr><td>J2 Fibroblasty Komórka</td><td>macierzysta (RRID: CVCL_W667)</td> <td>100-0353</td><td></td></tr><tr><td>LymphoPrep</td><td>Stemcell</td><td>7851</td><td>Pożywka o gradinie gęstości do izolacji komórek jednojądrzastych</td></tr><tr><td>Matrigel</td><td>Corning</td><td>354230</td><td></td></tr><tr><td>Matryca MCFDCIS.com błony podstawnej (DCIS)</td><td>RRID:CVCL_5552</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ogniwa MDA-MB-231</td><td>RRID:CVCL_0062</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Frezarka</td><td></td><td></td><td>Bridgeport Seria 1 Pionowa</td></tr><tr><td>sól fizjologiczna buforowana fosforanami (1x)</td><td>Thermofisher</td><td>10010049</td><td></td></tr><tr><td>Polieterosulfon ( PES) membrana</td><td>Sterlitech</td><td>PCTF029030</td><td></td></tr><tr><td>roztwór do lizy RBC</td><td>Stemcell</td><td>7800</td><td></td></tr><tr><td>RNeasy Micro Kit</td><td>Qiagen</td><td>74004</td><td></td></tr><tr><td>Analizator RTCA DP</td><td>Agilent</td><td>3X16</td><td>Dwufunkcyjny analizator komórek</td></tr><tr><td>Trypsyna</td><td>Sigma</td><td>T4799</td><td></td></tr></tbody></table>

wykrywanie i wychwytywanie w czasie rzeczywistym inwazyjnych subpopulacji komórek z kokultur

Real-Time Detection and Capture of Invasive Cell Subpopulations from Co-Cultures

Inwazja i przerzutowe rozprzestrzenianie się komórek rakowych są główną przyczyną zgonów z powodu raka. Testy opracowane wcześnie w celu pomiaru potencjału inwazyjnego populacji komórek nowotworowych zazwyczaj generują pojedynczy pomiar końcowy, który nie rozróżnia subpopulacji komórek nowotworowych o różnym potencjale inwazyjnym. Ponadto mikrośrodowisko guza składa się z różnych rezydentnych komórek zrębowych i odpornościowych, które zmieniają i uczestniczą w inwazyjnym zachowaniu komórek rakowych. Inwazja do tkanek odgrywa również rolę w subpopulacjach komórek odpornościowych, odpierając mikroorganizmy lub eliminując chore komórki z miąższu i komórek śródbłonka podczas przebudowy tkanek i angiogenezy. Analiza komórkowa w czasie rzeczywistym (RTCA), która wykorzystuje bioczujniki impedancyjne do monitorowania inwazji komórek, była dużym krokiem naprzód w stosunku do pomiaru inwazji w punkcie końcowym: zapewnia ciągłe pomiary w czasie, a tym samym może ujawnić różnice w szybkościach inwazji, które są tracone w teście końcowym. Korzystając z obecnej technologii RTCA, rozszerzyliśmy macierze dwukomorowe, dodając kolejną komorę, która może zawierać komórki zrębu i/lub komórki odpornościowe i umożliwia pomiar szybkości inwazji pod wpływem czynników wydzielanych ze współhodowanych komórek zrębowych lub odpornościowych w czasie. Poza tym unikalna konstrukcja pozwala na odłączenie komór w dowolnym momencie i wyizolowanie najbardziej inwazyjnej komórki nowotworowej lub innych subpopulacji komórek, które są obecne w heterogenicznych mieszankach badanych izolatów nowotworowych. Te najbardziej inwazyjne komórki nowotworowe i inne subpopulacje komórkowe napędzają złośliwą progresję do choroby przerzutowej, a ich charakterystyka molekularna jest ważna dla dogłębnych badań mechanistycznych, rozwoju sond diagnostycznych do ich wykrywania i oceny podatności. W związku z tym włączenie leków mało- lub wielkocząsteczkowych może być wykorzystane do przetestowania potencjału terapii ukierunkowanych na subpopulacje raka i/lub komórek zrębu w celu zahamowania (np. komórek rakowych) lub wzmocnienia (np. komórek odpornościowych) inwazyjnego zachowania.

Przy użyciu nowo zaprojektowanej macierzy trójkomorowej przetestowano inwazję komórek w obecności lub w nieobecności komórek zrębu, takich jak fibroblasty. Inwazja komórek MDA-MB-231 została nasilona po wysianiu napromieniowanych fibroblastów Swiss 3T3 (szczep J2) w dolnej komorze, co umożliwiło wymianę czynników między obiema liniami komórkowymi. Co ciekawe, inwazja MDA-MB-231 wzrosła przy dwukrotnym zwiększeniu liczby komórek 3T3-J2 (Rysunek 3A). Z drugiej strony, tempo inwazji inwazyjnego...

Opisujemy podejście do wykrywania i przechwytywania inwazyjnych subpopulacji komórek w czasie rzeczywistym. Projekt eksperymentalny wykorzystuje analizę komórkową w czasie rzeczywistym poprzez monitorowanie zmian impedancji elektrycznej komórek. Można wychwycić inwazyjne komórki nowotworowe, immunologiczne, śródbłonkowe lub zrębowe w złożonych tkankach i ocenić wpływ kokultur.

Wykrywanie i wychwytywanie w czasie rzeczywistym inwazyjnych subpopulacji komórek z kokultur

Invasion and metastatic spread of cancer cells are the major cause of death from cancer. Assays developed early on to measure the invasive potential of ...

Technika ta umożliwia identyfikację komórek o różnych zdolnościach inwazyjnych pod wpływem czynników wydzielanych z hodowanych komórek zrębu. Technika ta ocenia wpływ czynników wydzielanych z hodowanych komórek zrębowych lub odpornościowych na inwazję komórek. Umożliwia również odtworzenie i analizę inwazyjnych subpopulacji komórek obecnych w heterogenicznych mieszankach komórkowych.Technika ta może określić, które nowotwory zawierają inwazyjne subpopulacje komórek, które prowadzą do przerzutów. Przechwytywanie i analiza inwazyjnych komórek nowotworowych może pomóc w podejmowaniu decyzji dotyczących terapii. Aby rozpocząć hodowlę komórkową, przemyj przylegające kultury komórkowe o około 70% zbiegu solą fizjologiczną buforowaną 1X.Następnie dodaj 0,05% trypsyny i roztwór EDTA, aby usunąć komórki. Zneutralizować roztwór trypsyny pożywką do hodowli komórkowych zawierającą surowicę i policzyć komórki, używając podwielokrotności zawiesiny komórkowej. Umieść wszystkie trzy sterylne komory w kapturze do hodowli tkankowych.Zlokalizuj pokrętło na krótszym boku dolnej komory i ustaw dolną komorę tak, aby pokrętło było skierowane w stronę eksperymentatora. Dodaj 30 000 do 50 000 komórek w 90 mikrolitrach pożywki do każdej studzienki z dolnej komory, nie tworząc żadnych pęcherzyków. Użyć 5% pożywki uzupełnionej płodową surowicą bydlęcą w dwóch dolnych komorach jako pozytywnej kontroli ruchliwości komórek i użyć 0% pożywki uzupełnionej surowicą jako kontroli negatywnej.Obróć dolną komorę o 90 stopni po pozostawieniu jej na 10 do 15 minut w okapie. Następnie umieść środkową komorę na górze, tak aby pokrętło na dolnej komorze wsunęło się w wycięcie w środkowej komorze. Popchnij komorę pionowo w dół, aż usłyszysz kliknięcie z każdego z dłuższych boków zespołu.Dodaj 160 mikrolitrów pożywki bez surowicy do wszystkich studzienek środkowej komory. Upewnij się, że menisk w kształcie kopuły jest widoczny po napełnieniu studzienek i umieść górną komorę z elektrodami skierowanymi w dół na środkową komorę, aby wyrównać niebieskie kropki na środkowej i górnej komorze. Dociśnij komorę pionowo w dół, aż usłyszysz kliknięcie z każdego z dłuższych boków zespołu.Dodaj od 20 do 50 mikrolitrów pożywki bez surowicy do górnej komory. Zamontuj zestaw na dwufunkcyjnym analizatorze komórek w inkubatorze do hodowli tkankowych i odczekaj 30 minut przed pomiarem tła. Otwórz oprogramowanie analizatora komórek, a następnie wybierz podstawkę, która ma być używana, a następnie kliknij kartę wiadomości i upewnij się, że jest na niej napisane Połączenia w porządku"aby upewnić się, że matryca jest dobrze umieszczona w podstawce, a elektrody są dobrze wyrównane z czujnikami.Kliknij na zakładkę notatek z eksperymentu i wypełnij wszystkie możliwe informacje o eksperymencie. Następnie kliknij na zakładkę układu i wypełnij opis układu tablicy. Następnie kliknij kartę harmonogramu i dodaj dwa kroki z menu kroków, krok w tle z jednym zamiataniem i krok testowy z 100 przeciągnięciami.Po 30 minutach przebywania matrycy w inkubatorze z dwufunkcyjnym analizatorem komórek, kliknij przycisk odtwarzania, aby rozpocząć pomiar tła. Po wykonaniu pomiaru tła wyjmij matrycę z kołyski i umieść ją z powrotem w kapturze do hodowli komórkowych. Następnie dodaj od 30 000 do 50 000 komórek w 100 mikrolitrach pożywki bez surowicy do każdego dołka górnej komory.Są to komórki, które elektroda wykryje, gdy pomyślnie przejdą przez membranę. Pozostaw zespół w okapie na 30 minut przed zamontowaniem na dwufunkcyjnym analizatorze ogniw do pomiaru impedancji. Umieść tablicę z powrotem w analizatorze komórek o podwójnym przeznaczeniu i sprawdź, czy na karcie wiadomości znajduje się komunikat Połączenia w porządku".Kliknij przycisk odtwarzania, aby rozpocząć pomiar impedancji, a następnie kliknij zakładkę wykresu, aby monitorować postęp sygnału. Jeśli punkt końcowy zostanie osiągnięty przed 25 godzinami, kliknij krok przerwania z menu rozwijanego wykonywania. Aby wyeksportować dane, kliknij wykres prawym przyciskiem myszy, wybierz polecenie kopiuj w formacie listy, a następnie wklej dane do arkusza kalkulacyjnego.Monitoruj szybkość migracji w czasie rzeczywistym na dwufunkcyjnym analizatorze komórek, aby określić punkt zatrzymania. Po osiągnięciu tego celu należy zdemontować zestaw z dwufunkcyjnego analizatora komórek i umieścić go w kapturze do hodowli tkankowych. Przygotuj odpowiednią liczbę 1,5 mililitra probówek do mikrowirówek, aby zebrać komórki z interesujących Cię studzienek.Umieść zespół w 10-centymetrowym naczyniu, aby pomieścić płyny po odłączeniu komór. Wciśnij elastyczne zatrzaskowe końce na dłuższym boku środkowej komory do środka, aż usłyszysz kliknięcie, a następnie zdemontuj górną komorę i odwróć ją do nowej 10-centymetrowej naczynia. Użyj podnośnika do komórek z 13-milimetrowym ostrzem, aby zebrać komórki ze wszystkich studni, w których występują te same warunki eksperymentalne.Opłucz lub zanurz ostrze w 1X buforowanym fosforanem soli fizjologicznej, aby zebrać komórki w 1,5-mililitrowych probówkach do mikrowirówek. Następnie wiruj komórki w temperaturze 500 razy G przez pięć minut i rozmnażaj te zebrane komórki lub przeprowadź analizę punktów końcowych, taką jak sekwencjonowanie RNA pojedynczej komórki. Ocena inwazji komórek w obecności lub braku komórek zrębu wykazała, że inwazja komórek MDA-MB-231 była wzmocniona, gdy napromieniowane fibroblasty szwajcarskie-3T3 szczepu J2 umieszczono w dolnej komorze w celu wymiany czynników między dwiema liniami komórkowymi.Co ciekawe, inwazja MDA-MB-231 nasiliła się, gdy liczba komórek 3T3 J2 została podwojona. Z drugiej strony, szybkość inwazji inwazyjnego klonu komórek MCFDCIS, DCIS-Delta Four, wydaje się być hamowana przez przesłuch z komórkami 3T3 J2, co sugeruje cenne zastosowanie trzykomorowego układu do pomiaru różnych efektów zrębu. W tym przypadku fibroblasty na inwazję komórek.Ludzkie komórki śródbłonka żyły pępowinowej były bardziej inwazyjne w odpowiedzi na czynniki wydzielane przez komórki MDA-MB-231, w przeciwieństwie do tych wydzielanych przez komórki DCIS, co jest zgodne ze zdolnością nowotworów inwazyjnych do rekrutacji komórek śródbłonka do tworzenia naczyń krwionośnych i późniejszego rozprzestrzeniania się do krążenia. Inwazja komórek ksenoprzeszczepowych pochodzących od pacjentów z górnej komory nasiliła się w odpowiedzi na współhodowane ludzkie komórki odpornościowe szpiku kostnego. Co ciekawe, obecność 2% surowicy w dolnej komorze z komórkami odpornościowymi ludzkiego szpiku kostnego była niezbędna do inwazji ksenoprzeszczepów pochodzących od pacjentów.Studzienki mogą być pokryte macierzą zewnątrzkomórkową, aby naśladować barierę błony podstawnej. Środki terapeutyczne mogą być dodawane do pożywek w studniach w celu monitorowania ich wpływu na inwazję.

real-time-detection-capture-invasive-cell-subpopulations-from-co

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Badania nad rakiem

Ten film opisuje 3D kokulturę komórek raka piersi z monocytami w celu zbadania ich interakcji w środowisku opartym na ekstrakcie z macierzy zewnątrzkomórkowej (ECME). Ta metoda pomaga w badaniu określonych cech, takich jak degradacja kolagenu, rekrutacja komórek odpornościowych i inwazja komórek.

Współkultura 3D z bezpośrednią interakcją: współhodowla komórek rakowych z monocytami w celu zbadania ich interakcji

Ten film opisuje metodę przestrzennego rozdzielania trzech subpopulacji komórek białaczkowych: zawieszonych komórek białaczkowych swobodnie unoszących się w pożywce, jasnych komórek białaczkowych przylegających do powierzchni monowarstwy komórek mezenchymalnych zrębu oraz komórek białaczkowych ciemnych fazowo, które wyemigrowały pod monowarstwę mezenchymalnych komórek zrębu z kohodowli 2D.

Żniwa subpopulacji białaczkowej: metoda przestrzennego oddzielania subpopulacji komórek białaczkowych od kokultury 2D

Bakterie wytwarzają wydzielane związki, które mogą wpływać na fizjologię swoich mikrobiologicznych sąsiadów. W tym miejscu opisujemy badanie przesiewowe kokultury, które umożliwia wykrywanie takich chemicznie zapośredniczonych interakcji międzygatunkowych poprzez mieszanie mikroorganizmów glebowych z fluorescencyjnymi transkrypcyjnymi szczepami reporterowymi Bacillus subtilis na podłożach stałych.

Wykorzystanie kokultury do wykrywania interakcji międzygatunkowych o podłożu chemicznym

Tutaj prezentujemy protokół izolacji i hodowli pojedynczych komórek za pomocą platformy mikroprzepływowej, który wykorzystuje nową koncepcję projektowania mikrostudzienek, aby umożliwić wysokowydajną izolację pojedynczych komórek i długoterminową hodowlę klonalną.

Platforma mikroprzepływowa do wysokowydajnej izolacji i hodowli pojedynczych komórek

Urządzenie do mikroskopii fotooptycznej in situ zostało opracowane do monitorowania wielkości pojedynczych komórek bezpośrednio w zawiesinie komórki. Pomiar w czasie rzeczywistym odbywa się poprzez sprzężenie sondy fotooptycznej z możliwością sterylizacji z automatyczną analizą obrazu. Zmiany morfologiczne pojawiają się w zależności od stanu wzrostu i warunków uprawy.

In Situ Mikroskopia do określania w czasie rzeczywistym morfologii pojedynczych komórek w bioprocesach

Ten raport opisuje metodę opartą na chipie mikroprzepływowym, która pozwala na przeprowadzenie eksperymentu z pojedynczą hodowlą komórkową, w którym można uzyskać wysokowydajne parowanie i mikroskopową analizę wielu pojedynczych komórek.

Ustanawianie kokultur opartych na pojedynczych komórkach w sposób deterministyczny za pomocą chipa mikroprzepływowego

Rak jest chorobą śmiertelną ze względu na jego zdolność do dawania przerzutów do różnych narządów. Określenie zdolności komórek nowotworowych do migracji i inwazji w różnych warunkach leczenia ma kluczowe znaczenie dla oceny strategii terapeutycznych. Protokół ten przedstawia metodę oceny zdolności przerzutowych linii komórkowej raka glejaka w czasie rzeczywistym.

Oparty na impedancji pomiar migracji i inwazji komórek rakowych w czasie rzeczywistym

Ten protokół obrazowania żywych komórek bakteryjnych pozwala na wizualizację interakcji między wieloma gatunkami bakterii na poziomie pojedynczej komórki w czasie. Obrazowanie poklatkowe pozwala na obserwację każdego gatunku bakterii w monokulturze lub kokulturze w celu zbadania interakcji międzygatunkowych w wielogatunkowych społecznościach bakteryjnych, w tym ruchliwości i żywotności poszczególnych komórek.

Kinetyczna wizualizacja jednokomórkowych międzygatunkowych interakcji bakteryjnych

Przedstawione podejście jednocześnie ocenia inwazję komórek rakowych w testach sferoidalnych 3D i cytotoksyczność limfocytów T. Sferoidy są generowane w odlewie wielodołkowym z agarozy bez rusztowań. Kohodowla i osadzanie w macierzy kolagenu typu I są wykonywane w tym samym urządzeniu, które pozwala monitorować inwazję komórek rakowych i cytotoksyczność za pośrednictwem limfocytów T.

Monitorowanie inwazji komórek nowotworowych i cytotoksyczności limfocytów T w hodowli 3D

W dobie immunoterapii i profilowania genomu pojedynczej komórki, biologia nowotworów wymaga nowatorskich narzędzi in vitro i obliczeniowych do badania interfejsu nowotworowo-immunologicznego we właściwym kontekście czasoprzestrzennym. Opisujemy protokoły wykorzystania kokultur mikroprzepływowych immunologicznych z nowotworami w warunkach 2D i 3D, kompatybilnych z dynamicznym, wieloparametrycznym monitorowaniem funkcji komórkowych.

Mikroprzepływowe modele kohodowli do analizy odpowiedzi immunologicznej w mikrośrodowiskach nowotworowych in vitro

Tutaj szczegółowo opisujemy prosty, szybki i niezawodny protokół wspomagany wieloparametryczną cytometrią przepływową i nowotworem na chipie, aby monitorować i charakteryzować etapy składające się na cykl rak-odporność. Rzeczywiście, dogłębne zrozumienie wzajemnych zależności między rakiem a komórkami odpornościowymi dostarcza kluczowych informacji, które pozwalają przechytrzyć nowotwory i kierować opieką kliniczną.

Systemy kohodowli in vitro w celu odtworzenia cyklu rak-odporność

Poznaj metodę wykrywania inwazyjnych subpopulacji komórek w czasie rzeczywistym przy użyciu analizy impedancji elektrycznej. Technika ta pozwala ocenić wpływ komórek mezenchymalnych i immunologicznych na inwazję nowotworową oraz pozyskać komórki do dalszych badań.

Wykrywanie i wychwytywanie w czasie rzeczywistym inwazyjnych subpopulacji komórek z kokultur

Przeglądaj więcej filmów