Name: Rutynowe zbieranie zestawów danych krio-EM o wysokiej rozdzielczości przy użyciu transmisyjnego mikroskopu elektronowego 200 KV (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-03-16T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 49 s
Description: Poznaj protokół rutynowego zbierania danych krio-EM o wysokiej rozdzielczości przy użyciu mikroskopu elektronowego 200 KV. Naucz się przygotowywać próbki apoferrytyny i proteasomu oraz optymalizować parametry akwizycji obrazów.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

<ol><li>Wang, J., Hua, T., Liu, Z. -J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+features+of+activated+GPCR+signaling+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinions+in+Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">Structural features of activated GPCR signaling complexes.</a> Current Opinions in Structural Biology. 63, 82-89 (2020).</li>
<li>Chen, S., Gouaux, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+and+mechanism+of+AMPA+receptor+-+auxiliary+protein+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinions+in+Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">Structure and mechanism of AMPA receptor - auxiliary protein complexes.</a> Current Opinions in Structural Biology. 54, 104-111 (2019).</li>
<li>Kühlbrandt, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+and+mechanisms+of+F-Type+ATP+synthases%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Structure and mechanisms of F-Type ATP synthases.</a> Annual Review of Biochemistry. 88, 515-549 (2019).</li>
<li>Laverty, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cryo-EM+structure+of+the+human+%CE%B11%CE%B23%CE%B32+GABA+A+receptor+in+a+lipid+bilayer%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Cryo-EM structure of the human α1β3γ2 GABA A receptor in a lipid bilayer.</a> Nature. 565 (7740), 516-520 (2019).</li>
<li>Liu, F., Zhang, Z., Csanády, L., Gadsby, D. C., Chen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+structure+of+the+Human+CFTR+ion+channel%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Molecular structure of the Human CFTR ion channel.</a> Cell. 169 (1), 85-95 (2017).</li>
<li>Wrapp, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cryo-EM+structure+of+the+2019-nCoV+spike+in+the+prefusion+conformation%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Cryo-EM structure of the 2019-nCoV spike in the prefusion conformation.</a> Science. 367 (6483), 1260-1263 (2020).</li>
<li>Ke, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structures+and+distributions+of+SARS-CoV-2+spike+proteins+on+intact+virions%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Structures and distributions of SARS-CoV-2 spike proteins on intact virions.</a> Nature. 588, 498-502 (2020).</li>
<li>Yan, R., Zhang, Y., Li, Y., Xia, L., Guo, Y., Zhou, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+basis+for+the+recognition+of+SARS-CoV-2+by+full-length+human+ACE2%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Structural basis for the recognition of SARS-CoV-2 by full-length human ACE2.</a> Science. 367 (6485), 1444-1448 (2020).</li>
<li>Walls, A. C., Park, Y. -J., Tortorici, M. A., Wall, A., McGuire, A. T., Veesler, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure%2C+function%2C+and+antigenicity+of+the+SARS-CoV-2+spike+glycoprotein%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Structure, function, and antigenicity of the SARS-CoV-2 spike glycoprotein.</a> Cell. 180, 281-292 (2020).</li>
<li>Chiba, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multivalent+nanoparticle-based+vaccines+protect+hamsters+against+SARS-CoV-2+after+a+single+immunization%5BTitle%5D)+AND+%22Communications+Biology%22%5BJournal%5D)">Multivalent nanoparticle-based vaccines protect hamsters against SARS-CoV-2 after a single immunization.</a> Communications Biology. 4 (1), 597(2021).</li>
<li>Nakane, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-particle+cryo-EM+at+atomic+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Single-particle cryo-EM at atomic resolution.</a> Nature. 587, 152-156 (2020).</li>
<li>Bai, X. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Seeing+atoms+by+single-particle+Cryo-EM%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Biochemical+Sciences%22%5BJournal%5D)">Seeing atoms by single-particle Cryo-EM.</a> Trends in Biochemical Sciences. 46 (4), 253-254 (2021).</li>
<li>Koh, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-resolution+cryo-EM+at+200kV+enabled+by+Selectris-X+and+Falcon+4%5BTitle%5D)+AND+%22Microscience+Microscopy+Congress+2021%22%5BJournal%5D)">High-resolution cryo-EM at 200kV enabled by Selectris-X and Falcon 4.</a> Microscience Microscopy Congress 2021. , Abstract 212 (2021).</li>
<li>Herzik, M. A., Wu, M., Lander, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Achieving+better-than-3-%C3%85+resolution+by+single-particle+cryo-EM+at+200+keV%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Achieving better-than-3-Å resolution by single-particle cryo-EM at 200 keV.</a> Nature Methods. 14 (11), 1075-1078 (2017).</li>
<li>Herzik, M. A., Wu, M., Lander, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-resolution+structure+determination+of+sub-100+kDa+complexes+using+conventional+cryo-EM%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">High-resolution structure determination of sub-100 kDa complexes using conventional cryo-EM.</a> Nature Communications. 10 (1), 1032(2019).</li>
<li>Wu, M., Lander, G. C., Herzik, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sub-2+Angstrom+resolution+structure+determination+using+single-particle+cryo-EM+at+200+keV%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Structural+Biology+X%22%5BJournal%5D)">Sub-2 Angstrom resolution structure determination using single-particle cryo-EM at 200 keV.</a> Journal of Structural Biology X. 4, 100020-100029 (2020).</li>
<li>Mori, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((C-Glycoside+metabolism+in+the+gut+and+in+nature%3A+Identification%2C+characterization%2C+structural+analyses+and+distribution+of+C-C+bond-cleaving+enzymes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">C-Glycoside metabolism in the gut and in nature: Identification, characterization, structural analyses and distribution of C-C bond-cleaving enzymes.</a> Nature Communications. 12 (1), 6294(2021).</li>
<li>Hamdi, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((2.7+%C3%85+cryo-EM+structure+of+vitrified+M.+musculus+H-chain+apoferritin+from+a+compact+200+keV+cryo-microscope%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">2.7 Å cryo-EM structure of vitrified M. musculus H-chain apoferritin from a compact 200 keV cryo-microscope.</a> PLoS One. 15 (5), 0232540(2020).</li>
<li>Abbott, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((EMDB+web+resources%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">EMDB web resources.</a> Current Protocols in Bioinformatics. 61 (1), 1-12 (2018).</li>
<li>Punjani, A., Rubinstein, J. L., Fleet, D. J., Brubaker, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CryoSPARC%3A+algorithms+for+rapid+unsupervised+cryo-EM+structure+determination%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">CryoSPARC: algorithms for rapid unsupervised cryo-EM structure determination.</a> Nature Methods. 14 (3), 290-296 (2017).</li>
<li>Scheres, S. H. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RELION%3A+Implementation+of+a+Bayesian+approach+to+cryo-EM+structure+determination%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">RELION: Implementation of a Bayesian approach to cryo-EM structure determination.</a> Journal of Structural Biology. 180 (3), 519-530 (2012).</li>
<li>Gómez-Blanco, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+Scipion+for+stream+image+processing+at+Cryo-EM+facilities%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">Using Scipion for stream image processing at Cryo-EM facilities.</a> Journal of Structural Biology. 204 (3), 457-463 (2018).</li>
<li>Tegunov, D., Cramer, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-time+cryo-electron+microscopy+data+preprocessing+with+Warp%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Real-time cryo-electron microscopy data preprocessing with Warp.</a> Nature Methods. 16 (11), 1146-1152 (2019).</li>
<li>Lander, G. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Appion%3A+an+integrated%2C+database-driven+pipeline+to+facilitate+EM+image+processing%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">Appion: an integrated, database-driven pipeline to facilitate EM image processing.</a> Journal of Structural Biology. 166 (1), 95-102 (2009).</li>
<li>Carragher, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Current+outcomes+when+optimizing+%27standard%27+sample+preparation+for+single-particle+cryo-EM%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Microscopy%22%5BJournal%5D)">Current outcomes when optimizing 'standard' sample preparation for single-particle cryo-EM.</a> Journal of Microscopy. 276 (1), 39-45 (2019).</li>
<li>Drulyte, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Approaches+to+altering+particle+distributions+in+cryo-electron+microscopy+sample+preparation%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Crystallographica.+Section+D%2C+Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">Approaches to altering particle distributions in cryo-electron microscopy sample preparation.</a> Acta Crystallographica. Section D, Structural Biology. 74 (6), 560-571 (2018).</li>
<li>Bloch, M., Santiveri, M., Taylor, N. M. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Membrane+protein+Cryo-EM%3A+Cryo-grid+optimization+and+data+collection+with+protein+in+detergent%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Membrane protein Cryo-EM: Cryo-grid optimization and data collection with protein in detergent.</a> Methods in Molecular Biology. 2127, 227-244 (2020).</li>
<li>Cheng, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Leginon%3A+New+features+and+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Science%22%5BJournal%5D)">Leginon: New features and applications.</a> Protein Science. 30 (1), 136-150 (2021).</li>
<li>Schorb, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Software+tools+for+automated+transmission+electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Software tools for automated transmission electron microscopy.</a> Nature Methods. 16 (6), 471-477 (2019).</li>
<li>Li, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electron+counting+and+beam-induced+motion+correction+enable+near-atomic-resolution+single-particle+cryo-EM%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Electron counting and beam-induced motion correction enable near-atomic-resolution single-particle cryo-EM.</a> Nature Methods. 10 (6), 584-590 (2013).</li>
<li>Alewijnse, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Best+practices+for+managing+large+CryoEM+facilities%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">Best practices for managing large CryoEM facilities.</a> Journal of Structural Biology. 199, 225-236 (2017).</li>
<li>Baldwin, P. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Big+data+in+cryoEM%3A+automated+collection%2C+processing+and+accessibility+of+EM+data%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Big data in cryoEM: automated collection, processing and accessibility of EM data.</a> Current Opinion in Microbiology. 43, 1-8 (2018).</li>
<li>Guo, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electron-event+representation+data+enable+efficient+cryoEM+file+storage+with+full+preservation+of+spatial+and+temporal+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22International+Union+of+Crystallography+Journal%22%5BJournal%5D)">Electron-event representation data enable efficient cryoEM file storage with full preservation of spatial and temporal resolution.</a> International Union of Crystallography Journal. 7, 860-869 (2020).</li>
<li>Weis, F., Hagen, W. J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combining+high+throughput+and+high+quality+for+cryo-electron+microscopy+data+collection%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Crystallographica.+Section+D%2C+Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">Combining high throughput and high quality for cryo-electron microscopy data collection.</a> Acta Crystallographica. Section D, Structural Biology. 76 (8), 724-728 (2020).</li>
<li>Zhou, H., Chiu, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determination+of+icosahedral+virus+structures+by+electron+cryomicroscopy+at+subnanometer+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Advances+in+Protein+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Determination of icosahedral virus structures by electron cryomicroscopy at subnanometer resolution.</a> Advances in Protein Chemistry. 64, 93-124 (2005).</li>
<li>DeRosier, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Correction+of+high-resolution+data+for+curvature+of+the+Ewald+sphere%5BTitle%5D)+AND+%22Ultramicroscopy%22%5BJournal%5D)">Correction of high-resolution data for curvature of the Ewald sphere.</a> Ultramicroscopy. 81 (2), 83-98 (2000).</li>
<li>Wolf, M., DeRosier, D. J., Grigorieff, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ewald+sphere+correction+for+single-particle+electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Ultramicroscopy%22%5BJournal%5D)">Ewald sphere correction for single-particle electron microscopy.</a> Ultramicroscopy. 106 (4-5), 376-382 (2006).</li>
<li>Leong, P. A., Yu, X., Hong Zhou, Z., Jensen, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Correcting+for+the+ewald+sphere+in+high-resolution+single-particle+reconstructions%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">Correcting for the ewald sphere in high-resolution single-particle reconstructions.</a> Methods in Enzymology. 482, 369-380 (2010).</li>
<li>Zivanov, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+tools+for+automated+high-resolution+cryo-EM+structure+determination+in+RELION-3%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">New tools for automated high-resolution cryo-EM structure determination in RELION-3.</a> eLife. 7, 42166(2018).</li>
</ol>

Sagar Khavnekar nie zgłasza konfliktu interesów. Pozostali autorzy są pracownikami Thermo Fisher Scientific, oddziału MSD-EM.

Opisany protokół zakłada, że optyka zastosowanego mikroskopu TEM jest w stanie dobrze wyrównanym. W przypadku TEM 200 kV używanego w niniejszym protokole, takie wyrównanie kolumn jest wykonywane, weryfikowane i zapisywane przez doświadczonego inżyniera serwisu po zainstalowaniu mikroskopu lub jakiejkolwiek znaczącej interwencji serwisowej. Te ustawienia wyrównania można przywołać w dowolnym momencie w interfejsie użytkownika mikroskopu. Użytkownicy mogą korzystać z procedur bezpośredniego wyrównywania w interfejsie mikroskopu, aby ponownie dostosować parametry krytyczne. Niektóre ustawienia, takie jak nachylenie i przesunięcie pistoletu, są stabilne i nie muszą być codziennie regulowane przez użytkowników. Zaleca się sprawdzanie i ponowne ustawienie (jeśli jest to wymagane) nachylenia i przesunięcia pistoletu przez kierownika mikroskopu dwa razy w roku. Z drugiej strony, niektóre wyrównania są krytyczne i muszą być wyrównane przed każdym zbieraniem danych, jak opisano w powyższym protokole (takie jak obiektywny astygmatyzm i wyrównanie bez śpiączki). Jeśli funkcja Autocoma w oprogramowaniu analitycznym nie jest zbieżna, należy zweryfikować i wyregulować wyrównanie punktów obrotu pochylenia belki i/lub środka obrotu, a także potwierdzić prawidłowe wyśrodkowanie otworu C2. Następnie należy uruchomić funkcję autostygmatyzacji, ponieważ obiektywne stygmaty są również używane do korekcji śpiączki. Te dopasowania powinny być iterowane, dopóki zarówno Autostigmate, jak i Autocomafunctions nie powiodą się w pierwszej iteracji. W razie potrzeby można wybrać inny obszar (np. podporę folii węglowej bez lodu), dostosować rozmycie obrazu lub wydłużyć czas akwizycji obrazu, aby zoptymalizować stosunek sygnału do szumu w pozyskanych obrazach oraz widoczność wielu pierścieni Thon w transformacji Fouriera uzyskanych obrazów.
Nowoczesne mikroskopy kriogeniczne generują ogromne ilości danych, które często przekraczają 1 TB na zestaw danych, aby uzyskać rekonstrukcje 3D o wysokiej rozdzielczości, szczególnie w przypadku białek o niskiej symetrii. Dane i wyniki Cryo-EM są również zazwyczaj uzupełniane danymi i wynikami z metod ortogonalnych, aby w pełni zrozumieć zależności struktura-funkcja w każdym projekcie naukowym. Organizacja zebranych danych, ich transfer do potoku przetwarzania obrazu i udostępnianie wynikowej rekonstrukcji cryo-EM między współpracownikami nakłada dodatkowe wymagania na nowych użytkowników metodologii cryo-EM w celu skonfigurowania lokalnej infrastruktury IT. Oprogramowanie do zarządzania danymi, takie jak Athena, ułatwia scentralizowane przechowywanie danych uzyskanych przez dowolne podłączone urządzenie lub oprogramowanie obsługiwane przez zarejestrowanego użytkownika. Przechowywane dane i metadane są dostępne za pomocą prostego interfejsu przeglądarki internetowej dla wielu użytkowników, którzy mogą pełnić różne role w projekcie z różnymi prawami dostępu (jako właściciel, współpracownik lub osoba przeglądająca) na podstawie swoich danych logowania i definicji udostępniania danych w konfiguracji eksperymentu. Ta digitalizacja eksperymentalnych przepływów pracy zapewnia możliwość udostępniania danych i metadanych między współpracownikami bez zbędnego powielania oraz zwiększa produktywność i identyfikowalność używanych przepływów pracy. Implementacja ogólnej i konfigurowalnej struktury projektów, eksperymentów i przepływów pracy w oprogramowaniu do zarządzania danymi jest uniwersalna i pozwala na dostosowanie i integrację eksperymentów ortogonalnych przy użyciu uzupełniających się metod w jedną bazę danych projektu.
Wybór obszarów do gromadzenia danych na siatce cryo-EM ma kluczowe znaczenie dla pomyślnego pozyskiwania zestawów danych o wysokiej rozdzielczości. Siatki Cryo-EM produkowane za pomocą tradycyjnych urządzeń do zamrażania wgłębnego, takich jak Vitrobot (w pełni zautomatyzowany system witryfikacji), zazwyczaj wyświetlają gradient grubości lodu na powierzchni siatki (ilustracja 4). Może to być korzystne, ponieważ siatka zawiera obszary o różnej grubości lodu; Jednak obszary o idealnej grubości lodu do zbierania danych muszą być zidentyfikowane zgodnie z opisem w powyższym protokole. Optymalna siatka kriogeniczna powinna zawierać jak najmniej zanieczyszczeń lodem transferowym i zawierać wystarczającą ilość kwadratów siatki z nienaruszoną, dziurawą folią nośną. Nie zaleca się zbierania danych na kwadratach siatki, które mają pęknięcia lub uszkodzone obszary, ponieważ zebrane obrazy będą miały wpływ znacznie silniejszy ogólny dryf po oświetleniu wiązką elektronów w porównaniu z kwadratami siatki z nienaruszoną folią nośną. Nadmiar krystalicznego lodu może zasłaniać większość otworów foliowych i/lub zakłócać autofokus, dlatego należy również unikać takich kwadratów siatki. Kwadraty siatki z cienkim lodem zwykle wykazują duże szkliste obszary i wiele jasnych otworów foliowych, które są widoczne na zdjęciu wykonanym przy użyciu ustawień wstępnych Atlasu. Występowanie grubszego lodu w pobliżu prętów siatki jest spodziewane i niekrytyczne, ponieważ otwory foliowe w tych obszarach kwadratu siatki są wykluczone podczas procedury wyboru otworów. Obecność kilku pustych otworów w kwadracie siatki może oznaczać, że szklisty lód w otaczających otworach jest niezwykle cienki i może zawierać uszkodzone cząstki lub nie zawierać żadnych cząstek. Ogólnie rzecz biorąc, rozsądnie jest wybrać kwadraty siatki o różnych grubościach lodu w różnych regionach siatki do wstępnego badania przesiewowego i oceny, aby zrozumieć, które obszary mają najlepsze warunki do zbierania danych w wysokiej rozdzielczości i wykazują idealną gęstość cząstek i rozkład orientacji. W przypadku próbek proteasomów apoF i 20S wykorzystanych w tym badaniu, obszary z najcieńszym obserwowalnym lodem zawierają najlepsze warunki do obrazowania tych próbek w wysokiej rozdzielczości.
W przypadku automatycznego wybierania otworów we wszystkich wybranych kwadratach siatki za pomocą oprogramowania do zbierania danych, zaleca się wykonanie zadania Wykonania szablonu na reprezentatywnym otworze w każdym kwadracie siatki, aby sprawdzić i upewnić się, że do zbierania danych nie wybrano ani zbyt grubych, ani zbyt cienkich, ani nieoczekiwanie nieszklistych kwadratów. Podczas akwizycji danych za pomocą EQM można monitorować kluczowe wskaźniki jakości zebranych obrazów, takie jak dryf obrazu i dopasowanie CTF. Gromadzenie danych można następnie zoptymalizować, pomijając obszary, w których powstają obrazy o niskiej jakości. Jednak obrazy z dopasowaniami CTF o wysokiej rozdzielczości mogą nadal zawierać obrazy z cząstkami w kilku preferowanych orientacjach lub cząstkami zdenaturowanymi w zbyt cienkiej warstwie lodu. Wybieranie cząstek w czasie rzeczywistym i klasyfikacja 2D na podstawie zebranych obrazów dostarczyłyby dodatkowych informacji na temat jakości danych strukturalnych w zobrazowanych cząstkach i ujawniłyby zarówno preferowane orientacje nienaruszonych cząstek w lodzie, jak i niespójną strukturę (częściowo) zdenaturowanych cząstek. Obliczanie średnich klas może zatem pomóc w dalszym doprecyzowaniu odpowiednich regionów do gromadzenia danych, jak to zostało już zaimplementowane i pokazane w innych pakietach oprogramowania23,28.
Wybór ustawień obrazowania do akwizycji danych, takich jak powiększenie, szybkość dawki elektronów i zakres rozmycia, zależy od kilku kryteriów, takich jak rozdzielczość docelowa, wielkość białka, stężenie próbki, pożądana przepustowość mikroskopu itp. Dla kamery z bezpośrednim detektorem elektronów używanej w tych eksperymentach dozór elektronów dozowano dawkę elektronów w zakresie 4-5 e-/pix/s, dobierając odpowiedni rozmiar i intensywność SPOT, aby utrzymać równoległe oświetlenie. Jak pokazano w Tabeli 1, w ustawieniu wstępnym Otwór/Wysokość eucentryczna można użyć innego rozmiaru SPOT, aby zapewnić wystarczający stosunek sygnału do szumu na obrazie do wyśrodkowania otworów podczas zbierania danych. Powiększenie powinno być tak dobrane, aby rozmiar piksela był co najmniej 2-3 razy mniejszy niż rozdzielczość docelowa dla rekonstrukcji cryo-EM. Jednak im większe powiększenie (tj. mniejszy rozmiar piksela), tym mniejsze pole widzenia jest rejestrowane na obrazach, a na obrazie jest mniej cząstek, co ostatecznie prowadzi do dłuższego czasu zbierania danych w celu zebrania obrazów z wystarczającą ilością cząstek, aby zrekonstruować mapy 3D do wysokiej rozdzielczości. W przypadku próbki apoF użyliśmy rozmiaru piksela 0,43 A, ponieważ mieliśmy wystarczające stężenie próbki dla dużej gęstości cząstek na obrazach i dążyliśmy do rozdzielczości rekonstrukcji poniżej 2 A. W przypadku próbki proteasomu 20S użyliśmy rozmiaru piksela 0,68 A, aby pokryć większe pole widzenia na pozyskanych obrazach. Typowo dla mikroskopów TEM 200 kV obrazy krio-EM są uzyskiwane w zakresie rozogniskowania od 0,8 do 2,0 μm. Jednak dzięki poprawionemu kontrastowi i stosunkowi sygnału do szumu za pomocą filtra energii, akwizycja danych może być wykonywana znacznie bliżej ostrości, aby lepiej zachować informacje o wysokiej rozdzielczości w uzyskanych obrazach ze względu na mniejsze aberracje i odpowiednio zmniejszone zanikanie funkcji obwiedni CTF. Nie używamy również przysłony obiektywu, ponieważ przysłona może wprowadzać dodatkowe aberracje obrazu, podczas gdy kontrast obrazu jest już wystarczająco zwiększony dzięki zastosowaniu filtra energii. W przypadku próbek proteasomu apoF i 20S zastosowaliśmy ustawienia rozmycia 0,5 μm, 0,7 μm i 0,9 μm. W przypadku mniejszych białek (<200 kDa) zastosowaliśmy ustawienia rozmycia -0,5 μm, -0,7 μm i -0,9 μm, aby poprawić kontrast cząstek i ułatwić łatwiejsze wybieranie cząstek i początkowe zgrubne wyrównanie na etapie udoskonalania 3D rekonstrukcji 3D, co doprowadziło do map 3D o rozdzielczości ~2,5 A (niepublikowane wyniki).
Wykazaliśmy już, że obrazowanie z filtrem energetycznym poprawia stosunek sygnału do szumu (SNR) w obrazach krio-EM zebranych za pomocą wysokiej klasy mikroskopów TEM 300 kV11. W rzeczywistości, gdy elektrony przechodzą przez próbkę, zachodzą dwa główne typy oddziaływań: i) Elastycznie rozproszone elektrony utrzymują swoją energię i przyczyniają się do tworzenia obrazu poprzez interferencję z nierozproszoną wiązką padającą za pośrednictwem mechanizmu kontrastu fazowego ii) nieelastycznie rozproszone elektrony tracą część energii w próbce i przyczyniają się głównie do szumu na obrazach. Dlatego SNR można znacznie poprawić, filtrując nieelastycznie rozproszone elektrony, które mają niższą energię niż wiązka padająca i elektrony elastycznie rozproszone, przy użyciu wąskiej szczeliny energetycznej. Jednak bardzo ważne jest, aby użyć wystarczająco stabilnego filtra energii, takiego jak Selectris lub Selectris-X, aby móc używać bardzo wąskich (10 eV lub mniej) szczelin przez długie (12+ godzin) automatyczne pozyskiwanie danych z zestawów danych krioEM o wysokiej rozdzielczości.
Obrazy krio-EM uzyskane za pomocą mikroskopów TEM 200 kV w tych samych warunkach, co w przypadku mikroskopów TEM 300 kV, wykazują mniejszy SNR przy wysokiej rozdzielczości (szczególnie <4 A) ze względu na szybszy zanik funkcji obwiedni CTF. W związku z tym do osiągnięcia określonej rozdzielczości przy użyciu TEM 200 kV wymagana jest większa liczba cząstek (a tym samym większa liczba zebranych obrazów). Ponadto głębia ostrości (10-25 nm w zakresie rozdzielczości 2-3 A) jest również o około 20% mniejsza na obrazach 200 kV35, co oznacza, że mniej cząstek w warstwie lodu (zwykle o grubości 20-50 nm) będzie w pełni ostrych i konstruktywnie przyczyni się do wszystkich cech o wysokiej rozdzielczości obliczonej rekonstrukcji 3D, chyba że wartości rozmycia zostaną dopracowane dla każdej cząstki niezależnie w późniejszych etapach procedury rekonstrukcji 3D. W przypadku większych cząstek (takich jak wiriony dwudziestościenne lub inne zespoły makromolekularne) wielkość cząstek może przekraczać głębię ostrości w wysokich rozdzielczościach i wprowadzać błędy fazowe wynikające z płaskiego przybliżenia sfery Ewalda w standardowych algorytmach rekonstrukcji3D 36. Błędy te można usunąć za pomocą zaawansowanych algorytmów, które są już zaimplementowane w popularnych pakietach przetwarzania obrazów cryo-EM 37,28,39. Ponieważ sfera Ewalda ma większą krzywiznę w danych 200 kV niż w danych 300 kV, poprawka sfery Ewalda jest potrzebna przy stosunkowo niższych rozdzielczościach i/lub dla stosunkowo mniejszych zespołów makromolekularnych przy użyciu TEM 200 kV. Z drugiej strony, obrazy 200 kV wykazują wyższy kontrast cząstek w cienkim lodzie (20-50 nm), który jest znacznie cieńszy niż średnia droga swobodna elektronów 200-300 keV (220-280 nm). Wyższy kontrast pomaga poprawić prawidłowe globalne wyrównanie poszczególnych cząstek, szczególnie w przypadku słabo rozproszonych mniejszych białek, których struktura nie jest jeszcze znana, a model referencyjny 3D nie jest jeszcze dobrze ugruntowany.
Tutaj wykazaliśmy na przykładzie proteasomu 20S, że kontrast i jakość obrazu można podobnie poprawić za pomocą filtra energetycznego przy użyciu mikroskopu TEM 200 kV. Wykorzystując tę samą liczbę cząstek, dane zebrane za pomocą szczeliny 20 eV zostały zrekonstruowane do rozdzielczości 2,26 A w porównaniu z danymi zebranymi za pomocą w pełni otwartej szczeliny energetycznej, która została zrekonstruowana tylko do rozdzielczości 2,34 A. Najlepszą rekonstrukcję uzyskano na podstawie danych zebranych za pomocą szczeliny 10 eV, która została zrekonstruowana do rozdzielczości 2,14 A. Wyniki te są zgodne z teoretycznym przewidywaniem, że filtrowanie nieelastycznie rozproszonych elektronów zwiększa SNR w zebranych obrazach i ułatwia wyższą rozdzielczość w rekonstrukcjach krio-EM z podanej liczby cząstek, jak podsumowano w tabeli 4. Wyniki te zostały dodatkowo potwierdzone przez współczynniki B obliczone na podstawie tych zestawów danych, które wskazują na wyższą jakość obrazów w zestawach danych filtrowanych energetycznie.
Możemy zatem stwierdzić, że podczas gdy mikroskopy TEM 300 kV zapewniają najwyższą przepustowość i najwyższą możliwą rozdzielczość w rekonstrukcjach krio-EM, mikroskopy TEM 200 kV zapewniają również wysokiej jakości zestawy danych do rekonstrukcji krio-EM o wysokiej rozdzielczości. Pokazaliśmy tutaj, że jakość pozyskiwanych obrazów, a tym samym ogólny czas do ustrukturyzowania, można jeszcze bardziej poprawić, stosując TEM 200 kV wyposażony w filtr energetyczny i bezpośredni detektor elektronów. Przedstawiony Protokół opisuje wszystkie niezbędne kroki, jak rutynowo uzyskiwać dane krioelektromagnetyczne o wysokiej rozdzielczości przy użyciu tej konfiguracji i ujawniać drobne szczegóły strukturalne makromolekularnych struktur 3D, które są niezbędne do zrozumienia kluczowych relacji struktura-funkcja w biologii strukturalnej i projektowaniu leków opartych na strukturze.

Określenie struktury białka jest kluczowe dla zrozumienia architektury molekularnej, funkcji i regulacji kompleksów białkowych zaangażowanych w kluczowe procesy komórkowe, takie jak metabolizm komórkowy, transdukcja sygnału czy interakcje gospodarz-patogen. Mikroskopia krioelektronowa (cryo-EM) stała się potężną techniką zdolną do rozwiązania struktury 3D wielu białek i ich kompleksów, które były zbyt trudne dla tradycyjnych technik strukturalnych, takich jak dyfrakcja rentgenowska i spektroskopia NMR. W szczególności udowodniono, że cryo-EM jest metodą z wyboru dla białek błonowych, które nie mogą być łatwo skrystalizowane lub przygotowane w wystarczających ilościach dla tradycyjnych technik strukturalnych, a także dostarczyły nowych informacji na temat struktury i funkcji ważnych receptorów komórkowych i kanałów jonowych1,2,3,4,5. Ostatnio cryo-EM odegrał ważną rolę w walce z pandemią Covid-19, określając mechanizm infekcji SARS-CoV-2 na poziomie molekularnym, co wyjaśniło pochodzenie choroby Covid-19 i dało podstawę do szybkiego rozwoju skutecznych szczepionek i środków terapeutycznych6,7,8,9,10.
Zazwyczaj, wysokiej klasy transmisyjne mikroskopy elektronowe (TEM) 300 kV są używane do wysokorozdzielczego określania struktury biomolekuł za pomocą analizy pojedynczych cząstek krio-EM (SPA) w celu ujawnienia ich konformacji i interakcji. Niedawno technika SPA osiągnęła nową granicę, gdy powszechna próbka kriogeniczna krio-EM apo-ferrytyna została zrekonstruowana w rozdzielczości atomowej (1,2 A)11,12 przy użyciu TEM 300 kV wyposażonego w pistolet do emisji zimnego pola (E-CFEG), bezpośredni detektor elektronów i filtr energii. Przy tej rozdzielczości możliwe było jednoznaczne rozdzielenie pozycji poszczególnych atomów w strukturze, konformacji poszczególnych łańcuchów bocznych aminokwasów, a także wiązań wodorowych i innych oddziaływań, co otwiera nowe możliwości odkrywania nowych celów leków w oparciu o strukturę i optymalizacji istniejących kandydatów na leki.
Mikroskopy TEM 200 kV średniej klasy są często używane do badania przesiewowego próbek i optymalizacji próbek przed ostatecznym zebraniem danych o wysokiej rozdzielczości za pomocą wysokiej klasy mikroskopów TEM, szczególnie w większych obiektach krio-EM. Zazwyczaj zobrazowane próbki mogą być rozdzielone w zakresie rozdzielczości 3-4 A, który jest wystarczający do przejścia do wysokiej klasy TEM 300 kV w celu końcowego zebrania danych. W związku z tym gromadzenie danych za pomocą TEM 200 kV często nie jest dalej optymalizowane w celu uzyskania wyników o najwyższej możliwej rozdzielczości. Co więcej, wiele interesujących pytań biologicznych można już odpowiedzieć i opublikować w tych rozdzielczościach, ponieważ wszystkie łańcuchy boczne aminokwasów są już rozwiązane, a zajętość miejsc wiązania ligandów może być również wiarygodnie określona13. Wykazano już, że TEM 200 kV mogą osiągać rozdzielczości powyżej 3 A dla wielu próbek14,15,16,17,18. Obrazy wykonane przy napięciu 200 kV wykazują z natury wyższy kontrast obrazowanych cząstek, co może nawet ułatwić dokładniejsze początkowe ustawienie cząstek pomimo bardziej stłumionego sygnału o wysokiej rozdzielczości w porównaniu z obrazami TEM 300 kV. Należy zauważyć, że osiągnięta rozdzielczość zrekonstruowanych map krio-EM jest również ograniczona elastycznością strukturalną i niejednorodnością konformacyjną obrazowanych próbek, co ma wpływ zarówno na rekonstrukcje 200 kV, jak i 300 kV. W rzeczywistości znacznie więcej rekonstrukcji krio-EM uzyskanych przy użyciu systemów 300 kV zostało rozdzielonych w zakresie rozdzielczości 3-4 A niż w wyższych rozdzielczościach19. Ponieważ mikroskopy TEM 200 kV są mniej złożone i mieszczą się w mniejszych pomieszczeniach, mikroskopy te stanowią dobrą, tańszą opcję do określania struktury makrocząsteczek biologicznych za pomocą cryo-EM, przy jednoczesnym zachowaniu automatyzacji długich zbiorów danych z wielu próbek przechowywanych w systemie automatycznego ładowania mikroskopów.
Zbiór danych cryo-EM do wyznaczania struktur w wysokiej rozdzielczości wymaga dokładnego wyrównania optyki mikroskopu. Wyrównanie kolumn przebiega systematycznie od źródła elektronów w dół do układu soczewek kondensatora, soczewki obiektywu i filtra energii z detektorem elektronów. Pełna sekwencja wyrównań nie jest zazwyczaj wymagana. W razie potrzeby użytkownik jest prowadzony przez półautomatyczne procedury z odpowiednim opisem każdego kroku w kontekstowym oknie pomocy przez całą procedurę osiowania w interfejsie użytkownika mikroskopu (panel sterowania Bezpośrednie wyrównanie). Gdy mikroskop jest w pełni wyrównany, optyka elektronowa pozostaje stabilna, a ustawienie nie musi być zmieniane przez co najmniej kilka miesięcy. Tylko najbardziej czułe dopasowania, takie jak równoległe oświetlenie płaszczyzny próbki, obiektywny astygmatyzm i wyrównanie bez komy, muszą zostać dopracowane tuż przed rozpoczęciem zbierania każdego zestawu danych. Jakość zebranych danych może być następnie monitorowana podczas zbierania danych za pomocą różnych pakietów oprogramowania, takich jak EPU Quality Monitor, cryoSPARC Live20, Relion21, Scipion22, WARP23 lub Appion24.
Oprócz dokładnego ustawienia mikroskopu, wysoka jakość dobrze oczyszczonych próbek przy minimalnej niejednorodności konformacyjnej i kompozycyjnej jest również warunkiem wstępnym do zbierania zestawów danych o wysokiej rozdzielczości i rozwiązywania struktur o wysokiej rozdzielczości. Więcej szczegółów na temat typowych protokołów, częstych wyzwań i możliwych środków zaradczych można znaleźć w innych recenzjach poświęconych temu tematowi25,26,27. Zasadniczo kluczowe znaczenie ma znalezienie obszarów na danej siatce krio-EM, które mają wystarczająco cienki lód, aby zachować informacje o wysokiej rozdzielczości, a poszczególne cząstki są gęsto rozmieszczone w losowych orientacjach bez nakładania się. Jednak typowe siatki kriogeniczne mają niejednolitą grubość lodu, dlatego ważne jest, aby znaleźć i wybrać optymalne obszary do obrazowania. Różne sposoby szacowania grubości lodu na siatce są dostępne w pakietach oprogramowania dedykowanych do automatycznego zbierania zbiorów danych cryo-EM, takich jak EPU 2, Leginon28, lub SerialEM29.
Pojawienie się szybkich i czułych bezpośrednich detektorów elektronów umożliwiło gromadzenie obrazów w wielu frakcjach w postaci filmów, które umożliwiły kompensację ruchów wywołanych wiązką i spowodowały znaczny wzrost jakości i ilości danych używanych do przetwarzania obrazów i końcowej rekonstrukcji 3D30. Jednocześnie automatyzacja i gromadzenie danych o wysokiej przepustowości zapewniają ogromne zbiory danych z tysiącami obrazów/filmów, które stanowią wyzwanie w zakresie przechowywania i dostępu do danych. Przyjęty model z dużymi obiektami cryo-EM obsługującymi dziesiątki do setek użytkowników wymaga w szczególności zorganizowanego zarządzania danymi z odpowiednim śledzeniem i udostępnianiem danych w ustalonych potokach cryo-EM31,32.
To badanie opisuje protokół rutynowego zbierania zestawów danych krio-EM o wysokiej rozdzielczości za pomocą mikroskopu TEM 200 kV Glacios. Opisano niezbędne ustawienia optyki mikroskopu wraz z procedurami oceny próbek krio-EM i wyboru odpowiednich obszarów do zbierania danych o wysokiej rozdzielczości. Organizacja zebranych danych i powiązanych metadanych z informacjami o próbce jest zademonstrowana w Athena - platformie zarządzania danymi, która ułatwia przegląd informacji o próbkach i zebranych danych. Korzystając z próbki apo-ferrytyny na myszy, udało się uzyskać rekonstrukcję 3D w rozdzielczości 1,6 A13. Korzystając z opisanego protokołu, zrekonstruowaliśmy również mapę gęstości 3D proteasomu 20S z Thermoplasma acidophilum w rozdzielczości 2,1 A.

<table><tbody><tr><td>Pierścienie AutoGrid</td><td>Thermo Fisher Scientific 1036173</td><td></td><td>Pakiet 100 pierścieni AutoGrid do standardowych siatek EM.</td></tr><tr><td>C-Clip</td><td>Thermo Fisher Scientific 1036171</td><td></td><td>Pakiet 100 klipsów zabezpieczających standardowe siatki EM wewnątrz pierścieni AutoGrid.</td></tr><tr><td>Platforma zarządzania danymi</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>1160939</td><td>Część podstawowej konfiguracji Glacios; zawiera oprogramowanie Athena</td></tr><tr><td>Monitor jakości EPU</td><td>Oprogramowanie Thermo Fisher Scientific</td><td>1179770</td><td></td></tr><tr><td>Oprogramowanie EPU</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>1025080</td><td>Część konfiguracji podstawowej Glacios</td></tr><tr><td>Ethane 3.5</td><td>Westfalen</td><td>A06010110</td><td>Etan używany do wytwarzania ciekłego etanu (czystość co najmniej N35, tj. 99,95% obj.)</td></tr><tr><td>Falcon 4 200kV</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>1166936</td><td>Bezpośredni detektor elektronów</td></tr><tr><td>Glacios</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>1149551</td><td>200 kV TEM</td></tr><tr><td>GloQube Plus Glow Discharge System do siatek TEM i modyfikacji powierzchni</td><td>Quorum</td><td>N/A</td><td>dostępny również za pośrednictwem Thermo Fisher Scientific (PN 1160602)</td></tr><tr><td>Siatki QuantiFoil</td><td>Quantifoil</td><td>N/A</td><td>R-2/1, siatka 300 mesh; siatka z folii węglowej</td></tr><tr><td>Relion</td><td>MRC Laboratory of Molecular Biology</td><td>N/A</td><td>oprogramowanie open source: https://relion.readthedocs.io/en/release-3.1/</td></tr> <tr><td>Selectris z Falcon 4 dla 200 kV</td><td>Thermo Fisher Filtr</td><td>energii 1191753</td><td></td></tr> naukowej <tr><td>Selectris X z Falcon 4 dla 200 kV</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>1191755</td><td>Filtr energetyczny</td></tr><tr><td>UltrAuFoil kratki</td><td>Quantifoil</td><td>N/A</td><td>R-1.2/1.2, siatka 300; kratki ze złotej folii</td></tr><tr><td>Vitrobot Mk. IV</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>1086439</td><td>Automatyczny system witryfikacji</td></tr><tr><td>Bibuła filtracyjna Whatman 595</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>AA00420S</td><td></td></tr></tbody></table>

rutynowe zbieranie zestawów danych krio-em o wysokiej rozdzielczości przy użyciu transmisyjnego mikroskopu elektronowego 200 kv

Routine Collection of High-Resolution cryo-EM Datasets Using 200 KV Transmission Electron Microscope

Mikroskopia krioelektronowa (cryo-EM) została ustanowiona jako rutynowa metoda określania struktury białek w ciągu ostatniej dekady, biorąc pod uwagę coraz większą część publikowanych danych strukturalnych. Ostatnie postępy w technologii TEM i automatyzacji zwiększyły zarówno szybkość gromadzenia danych, jak i jakość pozyskiwanych obrazów, jednocześnie obniżając wymagany poziom wiedzy specjalistycznej do uzyskiwania map kriogenicznych w rozdzielczości poniżej 3 A. Podczas gdy większość takich struktur o wysokiej rozdzielczości została uzyskana przy użyciu najnowocześniejszych systemów krio-TEM 300 kV, struktury o wysokiej rozdzielczości można również uzyskać za pomocą systemów krio-TEM 200 kV, zwłaszcza gdy są wyposażone w filtr energetyczny. Ponadto automatyzacja ustawiania mikroskopu i gromadzenia danych z oceną jakości obrazu w czasie rzeczywistym zmniejsza złożoność systemu i zapewnia optymalne ustawienia mikroskopu, co skutkuje zwiększoną wydajnością wysokiej jakości obrazów i ogólną przepustowością gromadzenia danych. Protokół ten demonstruje zastosowanie najnowszych osiągnięć technologicznych i funkcji automatyzacji w kriotransmisyjnym mikroskopie elektronowym 200 kV i pokazuje, jak zbierać dane do rekonstrukcji map 3D, które są wystarczające do budowy modeli atomowych de novo. Koncentrujemy się na najlepszych praktykach, krytycznych zmiennych i typowych problemach, które należy wziąć pod uwagę, aby umożliwić rutynowe gromadzenie takich zestawów danych krioelektromagnetycznych o wysokiej rozdzielczości. W szczególności szczegółowo omówiono następujące zasadnicze tematy: i) automatyzacja ustawiania mikroskopów, ii) wybór odpowiednich obszarów do pozyskiwania danych, iii) optymalne parametry optyczne dla wysokiej jakości i wysokoprzepustowego gromadzenia danych, iv) dostrajanie filtrów energetycznych dla obrazowania bez strat oraz v) zarządzanie danymi i ocena jakości. Zastosowanie najlepszych praktyk i poprawa osiągalnej rozdzielczości za pomocą filtra energetycznego zostanie zademonstrowana na przykładzie apo-ferrytyny, która została zrekonstruowana do 1,6 A, oraz proteasomu Thermoplasma acidophilum 20S zrekonstruowanego do rozdzielczości 2,1-A przy użyciu TEM 200 kV wyposażonego w filtr energetyczny i bezpośredni detektor elektronów.

Mapy krio-EM makromolekuł o wysokiej rozdzielczości można również uzyskać za pomocą mikroskopów TEM 200 kV. Protokół ten przedstawia najlepsze praktyki w zakresie ustawiania dokładnych wyrównań optyki, schematów akwizycji danych i wyboru obszarów obrazowania, które są niezbędne do pomyślnego zbierania zestawów danych o wysokiej rozdzielczości przy użyciu TEM 200 kV.

Rutynowe zbieranie zestawów danych krio-EM o wysokiej rozdzielczości przy użyciu transmisyjnego mikroskopu elektronowego 200 KV

Cryo-electron microscopy (cryo-EM) has been established as a routine method for protein structure determination during the past decade, taking an ...

Cryo-EM stał się standardową techniką określania struktury białek i ich kompleksów. W tym protokole opisano najlepsze praktyki uzyskiwania zestawów danych Cryo-EM o wysokiej rozdzielczości z mikroskopów TEM średniego zasięgu 200 kV. Cryo-EM może określać strukturę białka w warunkach zbliżonych do natywnych w roztworze dla wielu stanów konformacyjnych i funkcjonalnych jednocześnie, co jest nieuchwytne dla innych technik strukturalnych.Uzyskane informacje strukturalne mogą być wykorzystane do wyjaśnienia molekularnych mechanizmów funkcjonowania białek, a także do projektowania leków w oparciu o strukturę. Na przykład niedawna publikacja na temat struktury włókienek amyloidowych ujawniła wiele miejsc wiązania ważnego liganda. Jednak w tym protokole używamy standardowych próbek apoferrytyny i proteasomu, aby zademonstrować krytyczne kroki w uzyskiwaniu danych Cryo-EM o wysokiej rozdzielczości.Obsługa Cryo-TEM stała się łatwiejsza w ostatnich latach, zwłaszcza dzięki wprowadzeniu zaawansowanych funkcji automatyzacji. Jednak w przypadku pierwszej sesji radzimy odbyć szkolenie z bardziej doświadczonymi użytkownikami. Od tego momentu postęp w technice jest stosunkowo szybki.Procedurę zademonstruje Adrian Koh, który jest starszym naukowcem ds. zastosowań w Thermo Fisher Scientific. Włóż automatyczne siatki do kasety automatycznego ładowacza w warunkach ciekłego azotu. Włóż kasetę z automatycznymi kratkami do kapsuły transferowej chłodzonej ciekłym azotem.Następnie włóż kapsułkę do mikroskopu i kliknij przycisk Dock w interfejsie użytkownika mikroskopu, aby załadować kasetę z kapsuły do automatycznego podajnika mikroskopu. Kliknij przycisk Inwentaryzacja, aby sprawdzić obecność automatycznych siatek w załadowanej kasecie. Następnie kliknij przyciski Załaduj i Rozładuj, aby wstawić automatyczne siatki do kolumny obrazowania TEM.Wybierz zakładkę Atlas i kliknij przycisk Nowa sesja, aby otworzyć nową sesję. Wypełnij dane, takie jak nazwa sesji i miejsce przechowywania danych, a następnie kliknij przycisk Zastosuj. Wybierz interesujące Cię siatki, zaznaczając pole wyboru obok odpowiedniego numeru siatki.Kliknij przycisk Start, aby rozpocząć w pełni zautomatyzowane zbieranie atlasów wszystkich wybranych siatek. Po zakończeniu zbierania kliknij na etykiety siatki, aby przejrzeć pozyskane atlasy. Wybierz kartę EPU i przejdź do Nowa sesja, aby utworzyć nową sesję w lewym panelu.Wybierz opcję Nowa sesja, aby użyć aktualnie ustawionych ustawień optycznych. Wpisz nazwę sesji. Wybierz ręczny typ sesji, aby mieć kontrolę nad wyborem poszczególnych dołków i kwadratów siatki wybranych do zbierania danych w dalszej części protokołu.Wybierz szybszy tryb akwizycji, aby używać zmiany obrazu bez aberracji do zbierania danych. Następnie wprowadź lokalizację, w której chcesz zapisać metadane. Kliknij przycisk Zastosuj, aby utworzyć nową sesję.Wybierz zadanie wyboru kwadratu w lewym panelu, aby wyświetlić zebrany atlas siatki. Zidentyfikuj kwadraty siatki z nienaruszoną folią nośną bez uszkodzeń, cienkim szklistym lodem i otworami w folii, znikomym zanieczyszczeniem lodem krystalicznym w kwadracie siatki i minimalnym gradientem jasności na kwadracie siatki i w poszczególnych otworach foliowych. Wybierz kwadraty siatki do zbierania danych w pełnym atlasie lub na obrazach kafelków o wysokiej jakości.Kliknij prawym przyciskiem myszy interesujący Cię kwadrat siatki i wybierz całe zadanie wyboru. Kliknij przycisk Auto eucentryczny, aby automatycznie przejść do pierwszego wybranego kwadratu siatki. Dostosuj wysokość eucentryczną i uzyskaj kwadratowy obraz siatki, aby znaleźć otwory foliowe.Kliknij przycisk Znajdź, aby znaleźć otwory foliowe na obrazie. Kliknij przycisk Usuń otwory, aby zamknąć przycisk paska siatki i odznaczyć otwory w pobliżu prętów siatki. Dostosuj limity w histogramie jasności filtra lodu, aby usunąć wszystkie otwory ze zbyt grubym lodem i wszystkie puste otwory.Kliknij prawym przyciskiem myszy otwór w kwadratowym obrazie siatki i wybierz tutaj przenieś etap do lokalizacji. Wybierz zadanie definicji szablonu w lewym panelu. Kliknij przycisk Pobierz, aby uzyskać cały obraz.Ustaw wartości opóźnienia po przesunięciu obrazu na 0,5 sekundy i opóźnienia po przesunięciu sceny na pięć sekund. Kliknij przycisk Znajdź i wyśrodkuj otwór, aby wyśrodkować otwór na obrazie. Wybierz przycisk Dodaj obszar akwizycji i kliknij obraz, aby wybrać miejsce w wyśrodkowanym otworze, w którym zostanie wykonana akwizycja obrazu w dużym powiększeniu.Wybierz przycisk Dodaj obszar automatycznego ustawiania ostrości i kliknij na obraz, aby wybrać miejsce na folii nośnej obok wyśrodkowanego otworu, w którym zostanie wykonane autofokus obrazu. Kliknij zielony obszar akwizycji, aby ustawić sekwencję wartości rozmycia na liście rozmycia w górnej części okna oprogramowania. Po ustawieniu ustawień specyficznych dla autofokusa wybierz opcję Po wyśrodkowaniu, aby automatycznie ustawić ostrość na początku każdego zestawu AFIS.Wybierz opcję Obiektyw obiektywowy, aby uzyskać szybsze automatyczne ustawianie ostrości i zmniejszyć dryf sceny. Kliknij przycisk Przygotuj wszystkie kwadraty w zadaniu wyboru otworu, aby automatycznie ustawić zbieranie danych i wszystkie inne wybrane kwadraty siatki zgodnie z ustawieniami użytymi w tym pierwszym kwadracie siatki. Wybierz zadanie definicji szablonu, uzyskaj nowy obraz, przenieś scenę do czystego obszaru na folii węglowej, klikając prawym przyciskiem myszy i wybierz opcję menu przenieś etap tutaj.Wybierz kartę Auto Functions (Funkcje automatyczne). Po ustawieniu żądanego rozmycia i iteracji przełącz się na ustawienie wstępne automatycznego ustawiania ostrości i kliknij start Przycisk, aby uruchomić funkcję automatycznego ustawiania ostrości. Wybierz zadanie Autostigmate, przełącz się na ustawienie Thon Ring i naciśnij przycisk Start.Wybierz zadanie Autocoma i naciśnij przycisk Start. Przenieś stół montażowy do obszaru z podzielonym kwadratem siatki. Potwierdź przezroczystość obszaru, wykonując pojedynczy obraz z autofokusem.Otwórz interfejs użytkownika Sherpa i wybierz aplikację Filtr energii. Kliknij przycisk Wyśrodkuj i opcję zerowej straty, aby wyśrodkować szczelinę filtra energii o zerowej stracie. Kliknij przycisk Dostrój w opcji izochromatyczności.Kliknij opcję Dostrój powiększenie i dostrój zniekształcenia w zniekształceniach geometrycznych i chromatycznych. Przejdź do zakładki EPU, wybierz zadanie Automated Acquisition i kliknij przycisk Start Run, aby rozpocząć w pełni automatyczne zbieranie danych. Rysunek przedstawia siatki Cryo-EM wyświetlające gradient grubości lodu na powierzchni siatki.Siatki wyłączone z dalszych badań to zła siatka z grubym lodem i wygięta siatka ze złym lodem i zanieczyszczeniem, podczas gdy dopuszczalne siatki to te z dobrym gradientem lodu i typową siatką z dobrym cienkim lodem i małym gradientem lodu. Rysunek przedstawia ostateczny render 3D zrekonstruowanej mapy Cryo-EM apoferrytyny. Wysoka stabilność i symetria sprawiają, że jest to optymalna próbka wzorcowa do obrazowania Cryo-EM o wysokiej rozdzielczości i przetwarzania obrazu.Polerowanie bayesowskie, udoskonalanie CTF i poprawka sfery Ewalda zaowocowały uzyskaniem mapy o rozdzielczości 1,63 angstrema. Rysunek przedstawia szczegółowy widok zrekonstruowanej mapy Cryo-EM apoferrytyny na poziomie łańcucha bocznego poszczególnych aminokwasów. Gęstość łańcuchów bocznych aminokwasów jest dobrze rozdzielona, a model atomowy może być jednoznacznie zbudowany w obrębie mapy.Na zdjęciu przedstawiono dwa różne zestawy danych o różnych wartościach rozmycia zebrane z tej samej siatki Cryo-EM z podobnymi kwadratami siatki z całkowicie otwartą szczeliną i szczeliną 10 elektronowoltów, co wskazuje, że szczelina 10 elektronowoltów znacznie poprawia kontrast obrazu. Rysunek poniżej przedstawia przegląd mapy Cryo-EM proteasomu 20S z segmentowanymi podjednostkami stosowanymi jako standardowa próbka Cryo-EM. Powiększony widok z dopasowanym modelem atomowym reprezentuje stabilny rdzeń katalityczny kompleksu proteasomu o symetrii D7.Protokół składa się z dwóch kluczowych kroków. Po pierwsze, szukanie obszarów z cienkim szklistym lodem zawierającym jednorodne cząstki. A po drugie, ustawienie równoległego oświetlenia do pozyskiwania danych.Dzięki rekonstrukcjom białek o wysokiej rozdzielczości, które osiągają rozdzielczość od dwóch do trzech angstremów, jesteś w stanie lepiej zrozumieć molekularne mechanizmy choroby i poprawić wyniki leków. Wcześniej krystalizacja była konieczna, jeśli chciało się badać strukturalne podstawy zjawisk biologicznych. Dziś, dzięki Cryo-EM, nie jest to już konieczne.Dzięki Cryo-EM umożliwiamy naukowcom badanie szerszego zakresu zjawisk biologicznych na poziomie strukturalnym.

routine-collection-high-resolution-cryo-em-datasets-using-200-kv

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemia

Prezentujemy wykonanie niskokosztowego stopnia kriogenicznego, zaprojektowanego tak, aby pasował do większości mikroskopów światła odbitego. Ten zbudowany w laboratorium stopień kriogeniczny umożliwia efektywne i niezawodne obrazowanie korelacyjne pomiędzy kriomikroskopią świetlną a kriomikroskopią elektronową.

Budowa niskokosztowego stolika do kriomikroskopii świetlnej na potrzeby skorelowanej mikroskopii świetlnej i elektronowej

Ten artykuł opisuje metodologię mikroskopii krioelektronowej, która jest używana do uzyskiwania wysokiej jakości mikroskopowych obrazów makrocząsteczek w ich stanie zbliżonym do natywnego. Metoda ta pozwala uzyskać obrazy nadające się do dalszego przetwarzania komputerowego przy użyciu podejścia pojedynczej cząstki, opracowanego w celu wygenerowania rekonstrukcji 3D makrocząsteczki.

Co robić, a czego nie robić w mikroskopii krioelektronowej: podstawa przygotowania próbek i gromadzenia wysokiej jakości danych do makromolekularnej rekonstrukcji 3D

Przedstawiono instrument i metody do przygotowania objętości próbek o rozmiarach nanolitrów do transmisyjnej mikroskopii elektronowej. Nie są wymagane żadne etapy papierowego blottingu, co pozwala uniknąć szkodliwych konsekwencji, jakie może to mieć dla białek, znacznie zmniejszając utratę próbki i umożliwiając analizę lizatu pojedynczej komórki do wizualnej proteomiki.

Zminiaturyzowane przygotowanie próbki do transmisyjnej mikroskopii elektronowej

Rosnące zapotrzebowanie na gromadzenie danych na dużą skalę w kriogenicznej tomografii elektronowej wymaga wysokoprzepustowych procedur akwizycji obrazów. Opisano tutaj protokół, który wdraża najnowsze osiągnięcia zaawansowanych strategii akwizycji mających na celu maksymalizację efektywności czasowej i przepustowości gromadzenia danych tomograficznych.

Strategie optymalizacji pozyskiwania danych z kriogenicznej tomografii elektronowej

Określanie struktury kompleksów makromolekularnych za pomocą cryoEM stało się rutyną dla niektórych klas białek i kompleksów. W tym miejscu podsumowano ten proces (przygotowanie próbki, badanie przesiewowe, pozyskiwanie i przetwarzanie danych), a czytelnicy są kierowani do dalszych szczegółowych zasobów i zmiennych, które mogą ulec zmianie w przypadku trudniejszych próbek.

Mikroskopia krioelektronowa pojedynczych cząstek: od próbki do struktury

Ten manuskrypt przedstawia metodę ręcznego zamrażania próbek biologicznych do kriogenicznej mikroskopii elektronowej z pojedynczymi cząstkami.

Ręczne zamrażanie próbek biologicznych metodą blot and plunge do kriogenicznej mikroskopii elektronowej pojedynczych cząstek

Mikroskopia krioelektronowa pojedynczych cząstek wymaga odpowiedniego pakietu oprogramowania i przyjaznego dla użytkownika potoku do wysokowydajnej automatycznej akwizycji danych. W tym miejscu przedstawiamy zastosowanie w pełni zautomatyzowanego pakietu oprogramowania do akwizycji obrazu, Latitude-S, oraz praktycznego potoku do gromadzenia danych o zeszklonych biomolekułach w warunkach niskich dawek.

Przyjazne dla użytkownika, wysokowydajne i w pełni zautomatyzowane oprogramowanie do akwizycji danych do mikroskopii krioelektronowej pojedynczych cząstek

Ten artykuł opisuje, jak efektywnie wykorzystać trzy platformy przetwarzania cryo-EM, tj. cryoSPARC v3, RELION-3 i Scipion 3, aby stworzyć pojedynczy i solidny przepływ pracy mający zastosowanie do różnych zestawów danych o pojedynczych cząstkach do określania struktury w wysokiej rozdzielczości.

Solidny przebieg przetwarzania w mikroskopii krioelektronowej jednocząsteczkowej (cryo-EM) z cryoSPARC, RELION, i Scipion

Obecny protokół opisuje zdalne pozyskiwanie danych za pomocą tomografii krioelektronowej o wysokiej rozdzielczości za pomocą Tomo5 oraz późniejsze przetwarzanie danych i uśrednianie subtomogramowe za pomocą emClarity. Apoferrytyna jest używana jako przykład do zilustrowania szczegółowych procesów krok po kroku w celu uzyskania struktury krio-ET o rozdzielczości 2,86 A.

Tomografia krioelektronowa: zdalne zbieranie danych i uśrednianie subtomogramu

Obecny protokół opisuje uogólniony i łatwy do wdrożenia schemat zbierania danych o pojedynczych cząstkach w eksperymentach kriogenicznych. Taka procedura jest szczególnie przydatna do uzyskania wysokiej jakości mapy EM dla próbek cierpiących na odchylenie preferencyjnej orientacji ze względu na przyleganie do granicy faz powietrze-woda.

Zbieranie danych Cryo-EM z pojedynczymi cząstkami z pochyleniem stolika przy użyciu Leginon

Poznaj protokół rutynowego zbierania danych krio-EM o wysokiej rozdzielczości przy użyciu mikroskopu elektronowego 200 KV. Naucz się przygotowywać próbki apoferrytyny i proteasomu oraz optymalizować parametry akwizycji obrazów.

Rutynowe zbieranie zestawów danych krio-EM o wysokiej rozdzielczości przy użyciu transmisyjnego mikroskopu elektronowego 200 KV

Przeglądaj więcej filmów