Rutynowe zbieranie zestawów danych krio-EM o wysokiej rozdzielczości przy użyciu transmisyjnego mikroskopu elektronowego 200 KV
16 marca 2022
Mapy krio-EM makromolekuł o wysokiej rozdzielczości można również uzyskać za pomocą mikroskopów TEM 200 kV. Protokół ten przedstawia najlepsze praktyki w zakresie ustawiania dokładnych wyrównań optyki, schematów akwizycji danych i wyboru obszarów obrazowania, które są niezbędne do pomyślnego zbierania zestawów danych o wysokiej rozdzielczości przy użyciu TEM 200 kV.
Cryo-EM stał się standardową techniką określania struktury białek i ich kompleksów. W tym protokole opisano najlepsze praktyki uzyskiwania zestawów danych Cryo-EM o wysokiej rozdzielczości z mikroskopów TEM średniego zasięgu 200 kV. Cryo-EM może określać strukturę białka w warunkach zbliżonych do natywnych w roztworze dla wielu stanów konformacyjnych i funkcjonalnych jednocześnie, co jest nieuchwytne dla innych technik strukturalnych.
Uzyskane informacje strukturalne mogą być wykorzystane do wyjaśnienia molekularnych mechanizmów funkcjonowania białek, a także do projektowania leków w oparciu o strukturę. Na przykład niedawna publikacja na temat struktury włókienek amyloidowych ujawniła wiele miejsc wiązania ważnego liganda. Jednak w tym protokole używamy standardowych próbek apoferrytyny i proteasomu, aby zademonstrować krytyczne kroki w uzyskiwaniu danych Cryo-EM o wysokiej rozdzielczości.
Obsługa Cryo-TEM stała się łatwiejsza w ostatnich latach, zwłaszcza dzięki wprowadzeniu zaawansowanych funkcji automatyzacji. Jednak w przypadku pierwszej sesji radzimy odbyć szkolenie z bardziej doświadczonymi użytkownikami. Od tego momentu postęp w technice jest stosunkowo szybki.
Procedurę zademonstruje Adrian Koh, który jest starszym naukowcem ds. zastosowań w Thermo Fisher Scientific. Włóż automatyczne siatki do kasety automatycznego ładowacza w warunkach ciekłego azotu. Włóż kasetę z automatycznymi kratkami do kapsuły transferowej chłodzonej ciekłym azotem.
Następnie włóż kapsułkę do mikroskopu i kliknij przycisk Dock w interfejsie użytkownika mikroskopu, aby załadować kasetę z kapsuły do automatycznego podajnika mikroskopu. Kliknij przycisk Inwentaryzacja, aby sprawdzić obecność automatycznych siatek w załadowanej kasecie. Następnie kliknij przyciski Załaduj i Rozładuj, aby wstawić automatyczne siatki do kolumny obrazowania TEM.
Wybierz zakładkę Atlas i kliknij przycisk Nowa sesja, aby otworzyć nową sesję. Wypełnij dane, takie jak nazwa sesji i miejsce przechowywania danych, a następnie kliknij przycisk Zastosuj. Wybierz interesujące Cię siatki, zaznaczając pole wyboru obok odpowiedniego numeru siatki.
Kliknij przycisk Start, aby rozpocząć w pełni zautomatyzowane zbieranie atlasów wszystkich wybranych siatek. Po zakończeniu zbierania kliknij na etykiety siatki, aby przejrzeć pozyskane atlasy. Wybierz kartę EPU i przejdź do Nowa sesja, aby utworzyć nową sesję w lewym panelu.
Wybierz opcję Nowa sesja, aby użyć aktualnie ustawionych ustawień optycznych. Wpisz nazwę sesji. Wybierz ręczny typ sesji, aby mieć kontrolę nad wyborem poszczególnych dołków i kwadratów siatki wybranych do zbierania danych w dalszej części protokołu.
Wybierz szybszy tryb akwizycji, aby używać zmiany obrazu bez aberracji do zbierania danych. Następnie wprowadź lokalizację, w której chcesz zapisać metadane. Kliknij przycisk Zastosuj, aby utworzyć nową sesję.
Wybierz zadanie wyboru kwadratu w lewym panelu, aby wyświetlić zebrany atlas siatki. Zidentyfikuj kwadraty siatki z nienaruszoną folią nośną bez uszkodzeń, cienkim szklistym lodem i otworami w folii, znikomym zanieczyszczeniem lodem krystalicznym w kwadracie siatki i minimalnym gradientem jasności na kwadracie siatki i w poszczególnych otworach foliowych. Wybierz kwadraty siatki do zbierania danych w pełnym atlasie lub na obrazach kafelków o wysokiej jakości.
Kliknij prawym przyciskiem myszy interesujący Cię kwadrat siatki i wybierz całe zadanie wyboru. Kliknij przycisk Auto eucentryczny, aby automatycznie przejść do pierwszego wybranego kwadratu siatki. Dostosuj wysokość eucentryczną i uzyskaj kwadratowy obraz siatki, aby znaleźć otwory foliowe.
Kliknij przycisk Znajdź, aby znaleźć otwory foliowe na obrazie. Kliknij przycisk Usuń otwory, aby zamknąć przycisk paska siatki i odznaczyć otwory w pobliżu prętów siatki. Dostosuj limity w histogramie jasności filtra lodu, aby usunąć wszystkie otwory ze zbyt grubym lodem i wszystkie puste otwory.
Kliknij prawym przyciskiem myszy otwór w kwadratowym obrazie siatki i wybierz tutaj przenieś etap do lokalizacji. Wybierz zadanie definicji szablonu w lewym panelu. Kliknij przycisk Pobierz, aby uzyskać cały obraz.
Ustaw wartości opóźnienia po przesunięciu obrazu na 0,5 sekundy i opóźnienia po przesunięciu sceny na pięć sekund. Kliknij przycisk Znajdź i wyśrodkuj otwór, aby wyśrodkować otwór na obrazie. Wybierz przycisk Dodaj obszar akwizycji i kliknij obraz, aby wybrać miejsce w wyśrodkowanym otworze, w którym zostanie wykonana akwizycja obrazu w dużym powiększeniu.
Wybierz przycisk Dodaj obszar automatycznego ustawiania ostrości i kliknij na obraz, aby wybrać miejsce na folii nośnej obok wyśrodkowanego otworu, w którym zostanie wykonane autofokus obrazu. Kliknij zielony obszar akwizycji, aby ustawić sekwencję wartości rozmycia na liście rozmycia w górnej części okna oprogramowania. Po ustawieniu ustawień specyficznych dla autofokusa wybierz opcję Po wyśrodkowaniu, aby automatycznie ustawić ostrość na początku każdego zestawu AFIS.
Wybierz opcję Obiektyw obiektywowy, aby uzyskać szybsze automatyczne ustawianie ostrości i zmniejszyć dryf sceny. Kliknij przycisk Przygotuj wszystkie kwadraty w zadaniu wyboru otworu, aby automatycznie ustawić zbieranie danych i wszystkie inne wybrane kwadraty siatki zgodnie z ustawieniami użytymi w tym pierwszym kwadracie siatki. Wybierz zadanie definicji szablonu, uzyskaj nowy obraz, przenieś scenę do czystego obszaru na folii węglowej, klikając prawym przyciskiem myszy i wybierz opcję menu przenieś etap tutaj.
Wybierz kartę Auto Functions (Funkcje automatyczne). Po ustawieniu żądanego rozmycia i iteracji przełącz się na ustawienie wstępne automatycznego ustawiania ostrości i kliknij start Przycisk, aby uruchomić funkcję automatycznego ustawiania ostrości. Wybierz zadanie Autostigmate, przełącz się na ustawienie Thon Ring i naciśnij przycisk Start.
Wybierz zadanie Autocoma i naciśnij przycisk Start. Przenieś stół montażowy do obszaru z podzielonym kwadratem siatki. Potwierdź przezroczystość obszaru, wykonując pojedynczy obraz z autofokusem.
Otwórz interfejs użytkownika Sherpa i wybierz aplikację Filtr energii. Kliknij przycisk Wyśrodkuj i opcję zerowej straty, aby wyśrodkować szczelinę filtra energii o zerowej stracie. Kliknij przycisk Dostrój w opcji izochromatyczności.
Kliknij opcję Dostrój powiększenie i dostrój zniekształcenia w zniekształceniach geometrycznych i chromatycznych. Przejdź do zakładki EPU, wybierz zadanie Automated Acquisition i kliknij przycisk Start Run, aby rozpocząć w pełni automatyczne zbieranie danych. Rysunek przedstawia siatki Cryo-EM wyświetlające gradient grubości lodu na powierzchni siatki.
Siatki wyłączone z dalszych badań to zła siatka z grubym lodem i wygięta siatka ze złym lodem i zanieczyszczeniem, podczas gdy dopuszczalne siatki to te z dobrym gradientem lodu i typową siatką z dobrym cienkim lodem i małym gradientem lodu. Rysunek przedstawia ostateczny render 3D zrekonstruowanej mapy Cryo-EM apoferrytyny. Wysoka stabilność i symetria sprawiają, że jest to optymalna próbka wzorcowa do obrazowania Cryo-EM o wysokiej rozdzielczości i przetwarzania obrazu.
Polerowanie bayesowskie, udoskonalanie CTF i poprawka sfery Ewalda zaowocowały uzyskaniem mapy o rozdzielczości 1,63 angstrema. Rysunek przedstawia szczegółowy widok zrekonstruowanej mapy Cryo-EM apoferrytyny na poziomie łańcucha bocznego poszczególnych aminokwasów. Gęstość łańcuchów bocznych aminokwasów jest dobrze rozdzielona, a model atomowy może być jednoznacznie zbudowany w obrębie mapy.
Na zdjęciu przedstawiono dwa różne zestawy danych o różnych wartościach rozmycia zebrane z tej samej siatki Cryo-EM z podobnymi kwadratami siatki z całkowicie otwartą szczeliną i szczeliną 10 elektronowoltów, co wskazuje, że szczelina 10 elektronowoltów znacznie poprawia kontrast obrazu. Rysunek poniżej przedstawia przegląd mapy Cryo-EM proteasomu 20S z segmentowanymi podjednostkami stosowanymi jako standardowa próbka Cryo-EM. Powiększony widok z dopasowanym modelem atomowym reprezentuje stabilny rdzeń katalityczny kompleksu proteasomu o symetrii D7.
Protokół składa się z dwóch kluczowych kroków. Po pierwsze, szukanie obszarów z cienkim szklistym lodem zawierającym jednorodne cząstki. A po drugie, ustawienie równoległego oświetlenia do pozyskiwania danych.
Dzięki rekonstrukcjom białek o wysokiej rozdzielczości, które osiągają rozdzielczość od dwóch do trzech angstremów, jesteś w stanie lepiej zrozumieć molekularne mechanizmy choroby i poprawić wyniki leków. Wcześniej krystalizacja była konieczna, jeśli chciało się badać strukturalne podstawy zjawisk biologicznych. Dziś, dzięki Cryo-EM, nie jest to już konieczne.
Dzięki Cryo-EM umożliwiamy naukowcom badanie szerszego zakresu zjawisk biologicznych na poziomie strukturalnym.
Przegląd
Ten protokół opisuje najlepsze praktyki w uzyskiwaniu wysokiej rozdzielczości danych cryo-EM przy użyciu mikroskopow TEM 200 kV. Skłania się ku dokładnym ustawieniom optyki, schematom akwizycji danych i wyborowi obszaru obrazu.
Kluczowe komponenty badania
Obszar nauki
- Cryo-Mikroskopia Elektronowa
- Biologia Strukturalna
Tło
- Cryo-EM jest standardową techniką do określania struktur białek.
- Umożliwia badanie białek w warunkach niemalże naturalnych.
- Ta metoda może jednocześnie uchwycić wiele stanów konformacyjnych i funkcjonalnych.
- Ostatnie postępy sprawiły, że obsługa Cryo-TEM stała się łatwiejsza.
Cel badania
- Aby pokazać kluczowe kroki w uzyskiwaniu danych Cryo-EM o wysokiej rozdzielczości.
- Aby zapewnić protokół dla użycia standardowych próbek takich jak apoferrityna i proteasomy.
- Aby ułatwić projektowanie leków oparte na strukturze poprzez szczegółowe informacje strukturalne.
Zastosowane metody
- Użycie auto siatek i warunków z ciekłym azotem do przygotowania próbek.
- Automatyczne zbieranie atlasów z wybranych siatek.
- Ręczne wybieranie kwadratów siatki do zbierania danych.
- Wykorzystanie zaawansowanych funkcji automatyzacji dla efektywnej akwizycji danych.
Główne wyniki
- Udana akwizycja danych o wysokiej rozdzielczości z mikroskopow TEM 200 kV.
- Identyfikacja optymalnych kwadratów siatki do obracania.
- Demonstracja automatycznych i ręcznych technik zbierania danych.
- Ustanowienie niezawodnego protokołu dla przyszłych badań.
Wnioski
- Protokół zapewnia kompleksowy przewodnik po uzyskiwaniu danych Cryo-EM o wysokiej rozdzielczości.
- Trening z doświadczonymi użytkownikami jest zalecany dla początkujących.
- Postępy w automatyzacji zwiększają efektywność operacji Cryo-EM.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
High-resolution cryo-EM using 200 kV TEM systems enables routine atomic-level protein structure determination, expanding access beyond specialized 300 kV platforms. Automation and real-time quality assessment streamline data acquisition, supporting rapid, reproducible generation of structural insights for early-stage drug discovery. This capability strengthens predictive confidence at the target validation and lead identification inflection points across biopharma portfolios.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables elucidation of molecular mechanisms underlying protein function and disease relevance.
- Supports structure-based drug design by providing atomic-resolution maps for target interrogation.
- Facilitates functional target validation through direct visualization of conformational and binding states.
- Reduces reliance on crystallization, broadening the range of tractable targets.
Screening & Assay Development
- Delivers validated structural templates for downstream screening and assay development workflows.
- Standardizes imaging parameters and data quality, ensuring reproducibility across experiments.
- Enables quantitative assessment of ligand binding and conformational changes.
- Supports scalable, automated data collection for high-throughput structural screening.
Translational & Preclinical Research
- Aligns structural outputs with disease-relevant models for translational biomarker development.
- Provides continuity from discovery through preclinical validation by enabling mechanistic de-risking.
- Improves risk-adjusted advancement decisions by clarifying structure-function relationships.
Pipeline & Workflow Integration
This protocol positions 200 kV cryo-EM as a core capability from early discovery through preclinical research, bridging target validation, lead identification, and mechanistic de-risking.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by resolving protein structures in near-native states.
- Screening: Provides reproducible, quantitative structural data for compound evaluation and assay readiness.
- Analytics: Enables high-resolution measurements and statistical comparison of structural conditions and ligand interactions.
- Translational Research: Connects atomic-level insights to disease models and biomarker strategies.
- Enterprise Reuse: Establishes a standardized, automated workflow adaptable across diverse protein targets and research programs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in target validation.
- Operational Value: Enhances standardization, reproducibility, and throughput via automation and real-time quality control.
- Strategic Value: Enables more informed go/no-go decisions and capital-efficient portfolio management.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of structurally validated targets.
Implementation Considerations
- Requires expertise in cryo-EM operation and data interpretation, with initial training recommended.
- Needs access to 200 kV TEM systems equipped with energy filters and direct electron detectors.
- Demands robust data management and quality assessment infrastructure for high-throughput workflows.
- Standardization of imaging parameters and automation protocols is critical for cross-team reproducibility.
- Adaptation to specific protein targets may require optimization of sample preparation and imaging conditions.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:04
Introduction
1:27
Grid Loading, Mapping, and Selection of Best Cryo-EM Grids for Data Collection
2:36
Setting up a Data Collection Session in the Single Particle Analysis Software
5:44
Final Microscope Alignments Before Starting Data Collection
7:15
Results: Gallery of Grids, Cryo-EM Reconstruction of Apo-Ferritin, and Effect of Energy Filtering on Cryo-EM Images
8:56
Conclusion
